CN106119382B - 自动化微生物分子检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域，特别涉及一种自动化微生物分子检测方法及其应用。该检测方法，包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均在多孔板内通过人机互交的形式由机械臂自动完成；试样预处理步骤将核酸裂解液移进行抽滤得到核酸初提液的步骤；靶标基因定量检测步骤之前还包括富集步骤。本方法将现有技术中由手工完成的试样预处理步骤整合进整体自动化流程，有利于实现微生物分子检测全过程的自动化控制，适合在土壤检测、植物检测、食品检测中应用。

Description

自动化微生物分子检测方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域，特别涉及一种自动化微生物分子检测方法及其应用。
背景技术
微生物分子检测技术是基于微生物特异靶标分子进行的一种微生物检测技术。微生物，特别是有害微生物，在进行正常新陈代谢的同时，会合成一些独特的、能够表征自身特征的化合物，如黄曲霉毒素等。这些化合物的合成途径具有特异性，其中一些关键控制基因往往是独一无二的，其基因拷贝数能够直接反映微生物个体的数量，因此，利用微生物中特异的靶标基因进行微生物定量检测已成为国内外公认的有效方法之一。
荧光定量PCR法通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。利用其对各种食品中各类微生物的检测已获得我国各级政府和各类食品检测机构的认可，如2007年国家质量监督检验检疫总局发布的食品中致病菌检测方法-实时PCR法(SN/T 1870-2007)等。
虽然国内外研究人员在微生物靶标基因研究已获得重大成果，已完成了沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶澡弧菌等致病菌的靶标微生物筛选和检测方法的建立。但迄今为止，基于荧光定量PCR法的微生物分子检测并未在全国各检验检测机构获得广泛应用，主要原因如下：
1.检测流程复杂：对特定样本进行微生物分子检测，其流程主要包括样本处理、核酸提纯和靶基因定量检测。以固态食品为例，样本处理主要目标是将微生物富集和微生物细胞裂解；核酸提纯包括核酸结合、核酸盐洗、核酸洗脱等步骤；靶基因定量手工操作主要是荧光定量PCR体系配制，由于体系成分复杂，体系配制工作量较大。以上操作包括各种试剂的移加、加热、振摇、离心等，步骤多达50步以上，每个研究人员每天工作8小时，最多只能完成12个样品操作。
2.操作难度大：由于检测流程复杂，每一步骤的遗漏均会使得检测结果无效，且由于分子检测移液微量，精准度要求高，这加大了一线检测人员的操作难度。此外，手工操作往往存在人为误差，难以实现结果一致性，往往造成同样标准方法，不同检测人员做出的结果不同，使得操作人员在上岗前需进行大量的培训，大大增加检测结构的人力成本。
3.分析成本高：现今分子检测试剂大多来源于美国等国外试剂公司，每个样品分析试剂成本均在100元以上。国内一些分子检测试剂产家，其产品价格虽然低一些，但由于在实际使用中的复杂性，且现今还没有统一的质量标准，很难被市场所接受。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种自动化微生物分子检测方法，实现试样预处理、核酸提纯、检测整个过程的全程自动化。
本发明解决所述技术问题的方案是：一种自动化微生物分子检测方法，包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成；
试样预处理步骤包括：(1)在待测试样中添加细胞裂解液；(2)根据需要进行加热和/或振荡处理得到核酸裂解液；(3)将核酸裂解液移进行抽滤得到核酸初提液；
核酸提纯步骤包括：(1)在核酸初提液中加入高盐溶液和可与核酸特异结合的磁性粒子，振摇后施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(2)加入盐洗液，振摇洗脱去除磁性粒子结合的盐粒子，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(3)加入乙醇，振摇洗脱去除磁性粒子结合的其它杂质，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体，并室温干燥；(4)加入核酸洗脱液，振摇洗脱吸附在磁性粒子上的核酸，施加磁场吸附磁性粒子，移取全部液体得到高纯核酸；
靶标基因定量检测步骤包括：(1)在高纯核酸中加入靶标基因PCR扩增上下游引物、PCR扩增缓冲液、检测探针，依次进行解链、退火、延伸进行靶基因的PCR扩增；(2)于每延伸结束时进行荧光检测，通过荧光值计算靶标基因拷贝数，继而计算出待分析试样中靶标微生物的克隆数。
作为改进，所述试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤均在多孔板内进行。
作为改进，所述试样预处理步骤中，加热温度控制在4-99℃，振荡频率控制在10-100rpm。
作为改进，所述试样预处理步骤中，核酸裂解液呈现透明、无肉眼可见的微小颗粒后再将其进行抽滤。
作为进一步改进，所述抽滤步骤为：(1)取一块多孔板；(2)在多孔板外罩上围护结构；(3)在围护结构顶部盖上过滤多孔板使围护结构组成密闭空间，过滤多孔板的反应孔内设置有滤膜和连通反应孔内外空间的通道；(4)将围护结构组成密闭空间抽真空使其形成负压，过滤多孔板内的核酸裂解液透过滤膜滴入位于其下方的多孔板。
过滤多孔板与普通的多孔板之间的区别在于：过滤多孔板的反应孔内开设有通道，在通道处覆盖有滤膜，反应孔内的试样在负压的作用下能透过滤膜流到反应孔之外。
作为再进一步改进，所述滤膜的孔径为0.2-10μm。
作为进一步改进，所述的高盐溶液为6M盐酸胍,所述的盐洗液为6M盐酸胍加等体积乙醇组成的混合液，所述的核酸洗脱液为10mM Tris-HCL。
作为进一步改进，所述的检测方法还包括富集步骤，富集步骤位于靶标基因定量检测步骤之前。
作为再进一步改进，所述的富集步骤为：(1)在多孔板的反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样进行磁性粒子吸附操作，之后去除液体；(2)将其他反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样定量地移入步骤(1)的反应孔内，进行磁性粒子吸附操作后去除液体；(3)重复步骤(1)-(2)，直至磁性粒子吸附的靶标核酸达到可分析的量为止。
本发明还申请保护该自动化微生物分子检测方法在土壤检测、植物检测、食品检测中的应用。
本检测设备将手工完成的试样预处理单元整合进整套装置，不仅适合检测液态的试样，还适合土壤、食品、药品等固体试样的自动化检测。待分析的试样、试剂等放置在设备固定位置后，通过电脑一键式控制，利用机械臂替代人手完成试样预处理、核酸提纯和靶基因荧光检测操作步骤，并按需自动调取设备中已有数据库中靶基因检测程序和定量标准曲线；最后自动计算获得待分析样品中靶标微生物的克隆数。而且检测前无需增菌处理，检测过程无人为误差，可基本防止假阴性和假阳性。
需要着重说明的是：现有技术中的自动化微生物分子检测技术均不涉及样品的预处理步骤，即样品预处理必须由人工手工完成。究其原因，对于大批量需要待测的试样，将试样注入多孔板后，现有技术中的多孔板震荡仪不适宜与其他精密仪器配合，因为多孔板震荡仪在震荡后常常有各种位移误差。所以，如何实现核酸裂解液在多孔板上的固液分离，是自动化微生物分子检测技术发展的技术瓶颈。本方案采用可随时搭设的抽滤装置，采用围护结构、过滤多孔板、多孔板之间的配合，过滤多孔板设置有滤膜，在负压作用下，试样溶液从过滤多孔板内被吸至多孔板，实现多个试样的一次性高效分离。而且由于过滤多孔板中滤膜的参与，使试样溶液的分离效果优于离心机的分离效果。
对于痕量试样，如果一个多孔板反应孔内的核酸粗提液所含的靶标核酸达不到被检出的含量，现有技术中的自动化检测设备尚未有解决的办法。这成为自动化微生物分子检测设备发展的瓶颈。本申请的富集步骤可以对1个或多个试样的核酸进行富集，通过在装有磁性粒子的多孔板中多次进行“加入试样--磁性粒子吸附—移除液体”的操作，使靶标核酸达到可被检出的含量，从而实现痕量靶标微生物的原态检测。
具体实施方式
实施例1
一种自动化微生物分子检测方法，包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成，机械臂包括移液机械臂和多孔板抓手机械臂，机械臂用于试样和试剂在各步骤之间的移运或用于试样和试剂在各步骤内的移运。移液机械臂的头部有多通道移液枪，能够对试样和试剂的进行吸取和加液操作，试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤均在多孔板内进行。
试样预处理步骤包括：(1)在待测试样中添加细胞裂解液；(2)根据需要进行加热和/或振荡处理得到核酸裂解液，加热温度控制在4-99℃，振荡频率控制在10-100rpm；(3)当核酸裂解液呈现透明、无肉眼可见的微小颗粒后再将其进行抽滤，得到核酸初提液。
抽滤步骤为：(1)取一块多孔板；(2)在多孔板外罩上围护结构；(3)在围护结构顶部盖上过滤多孔板使围护结构组成密闭空间，过滤多孔板的反应孔内设置有滤膜和连通反应孔内外空间的通道，滤膜的孔径为0.2-10μm；(4)将围护结构组成密闭空间抽真空使其形成负压，过滤多孔板内的核酸裂解液透过滤膜滴入位于其下方的多孔板。
核酸提纯步骤包括：(1)在核酸初提液中加入高盐溶液和可与核酸特异结合的磁性粒子，高盐溶液为6M盐酸胍，振摇后施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(2)加入盐洗液，盐洗液为6M盐酸胍加等体积乙醇组成的混合液，振摇洗脱去除磁性粒子结合的盐粒子，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(3)加入乙醇，振摇洗脱去除磁性粒子结合的其它杂质，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体，并室温干燥；(4)加入核酸洗脱液，核酸洗脱液为10mM Tris-HCL，振摇洗脱吸附在磁性粒子上的核酸，施加磁场吸附磁性粒子，移取全部液体得到高纯核酸；
靶标基因定量检测步骤包括：(1)在高纯核酸中加入靶标基因PCR扩增上下游引物、PCR扩增缓冲液、检测探针，依次进行解链、退火、延伸进行靶基因的PCR扩增；(2)于每延伸结束时进行荧光检测，通过荧光值计算靶标基因拷贝数，继而计算出待分析试样中靶标微生物的克隆数。
由于一个多孔板反应孔的体积有限，不能放置足够多的试样。如果一个反应孔内的试样产生的核酸不足以被检出，则提纯后的高纯核酸还需要进入富集步骤，富集步骤位于靶标基因定量检测步骤之前。
富集步骤为：(1)在多孔板的反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样进行磁性粒子吸附操作，之后去除液体；(2)将其他反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样定量地移入步骤(1)的反应孔内，进行磁性粒子吸附操作后去除液体；(3)重复步骤(1)-(2)，直至磁性粒子吸附的靶标核酸达到可分析的量为止。
本自动化微生物分子检测方法特别适合在土壤检测、植物检测、食品检测中应用。
以处理土壤为例，该方法获得的高纯核酸，其OD260/OD280在1.8-2.0之间，表明核酸纯度高，无蛋白残留；OD260/OD230在1.8-2.0之间，表明核酸纯度高，无腐殖酸等杂质残留。其它已有核酸提取方法的试剂盒两者在1.2或以下。
以植物叶片为例，该方法获得的高纯核酸，其OD260/OD280在1.8-2.0之间，表明核酸纯度高，无蛋白残留；OD260/OD230在1.8-2.0之间，表明核酸纯度高，无多糖、酚类等杂质残留。其它已有核酸提取方法的试剂盒两者在1.2或以下。

Claims (9)

1.一种自动化微生物分子检测方法，其特征在于：包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成；
试样预处理步骤包括：(1)在待测试样中添加细胞裂解液；(2)根据需要进行加热和/或振荡处理得到核酸裂解液；(3)将核酸裂解液移进行抽滤得到核酸初提液；
所述抽滤步骤为：(1)取一块多孔板；(2)在多孔板外罩上围护结构；(3)在围护结构顶部盖上过滤多孔板使围护结构组成密闭空间，过滤多孔板的反应孔内设置有滤膜和连通反应孔内外空间的通道；(4)将围护结构组成密闭空间抽真空使其形成负压，过滤多孔板内的核酸裂解液透过滤膜滴入位于其下方的多孔板；
核酸提纯步骤包括：(1)在核酸初提液中加入高盐溶液和可与核酸特异结合的磁性粒子，振摇后施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(2)加入盐洗液，振摇洗脱去除磁性粒子结合的盐粒子，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(3)加入乙醇，振摇洗脱去除磁性粒子结合的其它杂质，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体，并室温干燥；(4)加入核酸洗脱液，振摇洗脱吸附在磁性粒子上的核酸，施加磁场吸附磁性粒子，移取全部液体得到高纯核酸；
靶标基因定量检测步骤包括：(1)在高纯核酸中加入靶标基因PCR扩增上下游引物、PCR扩增缓冲液、检测探针，依次进行解链、退火、延伸进行靶基因的PCR扩增；(2)于每延伸结束时进行荧光检测，通过荧光值计算靶标基因拷贝数，继而计算出待分析试样中靶标微生物的克隆数。
2.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤均在多孔板内进行。
3.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述试样预处理步骤中，加热温度控制在4-99℃，振荡频率控制在10-100rpm。
4.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述试样预处理步骤中，核酸裂解液呈现透明、无肉眼可见的微小颗粒后再将其进行抽滤。
5.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述滤膜的孔径为0.2-10μm。
6.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述的高盐溶液为6M盐酸胍,所述的盐洗液为6M盐酸胍加等体积乙醇组成的混合液，所述的核酸洗脱液为10mMTris-HCL。
7.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述的检测方法还包括富集步骤，富集步骤位于靶标基因定量检测步骤之前。
8.如权利要求7所述的自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述的富集步骤为：(1)在多孔板的反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样进行磁性粒子吸附操作，之后去除液体；(2)将其他反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样定量地移入步骤(1)的反应孔内，进行磁性粒子吸附操作后去除液体；(3)重复步骤(1)-(2)，直至磁性粒子吸附的靶标核酸达到可分析的量为止。
9.如权利要求1所述的自动化微生物分子检测方法在土壤检测、植物检测、食品检测中的应用。
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