CN106084011A - 一种十二肽vpgtpknldspr及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种十二肽VPGTPKNLDSPR及其应用，所述合成多肽的氨基酸序列如下所示：Val‑Pro‑Gly‑Thr‑Pro‑Lys‑Asn‑Leu‑Asp‑Ser‑Pro‑Arg，缩写为VPGTPKNLDSPR，分子量1280.68，纯度96.14%。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。通过体外抗肿瘤活性检测，在100‑500µg/mL梯度范围内，本发明的多肽对乳腺癌细胞MCF‑7和肝癌细胞HepG‑2均呈现出了一定的抑制效果。在500µg/mL时，对MCF‑7和HepG‑2的体外增殖抑制率分别为66.35%和64.09%。本发明提供一种具有体外抗肿瘤活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种合成多肽及其应用。
背景技术
生物活性肽(Bioactivity peptides)又称功能肽(Functional peptides)，顾名思义它是一类具有一定生理活性功能的肽，能抑制肿瘤细胞生长，破坏、杀伤肿瘤细胞或者抗菌、抗病毒、降血压、降血糖等重要作用。由于其分子量小、易于吸收，可以广泛的应用于保健品和药物的开发，因此，生物活性肽已成为蛋白质研究的热点之一。
肿瘤是21世纪的健康杀手，其发病率和死亡率仍在攀升。目前对肿瘤患者的治疗方法主要是化疗和放疗手段，对人体造成极大损害，肿瘤发生恶性转移后无论用何种方式都很难彻底治愈。所以寻找一种能彻底清除癌细胞而不损害到其他细胞的治疗方法成为全球肿瘤医学领域的研究热点。多种生物活性肽陆陆续续被发现具有抗肿瘤活性，这成为抗肿瘤药物研究开发的新方向。日本学者Yamaguchi等曾以酪蛋白和玉米肽共同喂食经7,12-二甲基苯并[a]蒽诱导的患有乳腺肿瘤的大鼠。结果显示玉米肽具有一定的抗乳腺癌作用，且随着玉米肽剂量的增加，其抗肿瘤效果愈明显。杨永芳等研究了紫贻贝酶解多肽的体外抗肿瘤活性，发现该肽具有抗肿瘤活性，可以下调肿瘤细胞中Bc1-2的表达。
本发明提供一种具有体外抗肿瘤活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。
发明内容
本发明选取两种肿瘤细胞MCF-7和HepG-2以及一种正常肝细胞LO2为研究对象，使用MTT法测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外抗肿瘤活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。
本发明合成的多肽缩写为VPGTPKNLDSPR，分子量1280.68，序列为
Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg，其中，
Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；
Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基；
Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Asp表示英文名称为Aspartic，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；
Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；
本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
本发明将终浓度为100-500μg/mL的合成多肽与两种肿瘤细胞MCF-7和HepG-2混匀，孵育48h后，经MTT法检测，对肿瘤细胞抑制率分别达到40.57％-66.35％和31.52％-64.09％。用500μg/mL的合成多肽处理正常肝细胞LO2后抑制率为7.05％,表明对正常肝细胞LO2有较小的杀伤作用,为其在生物医药领域的应用提供参考。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次合成了该肽，并且采用MTT方法检测了合成多肽的体外抗肿瘤活性，所述合成多肽具有一定的肿瘤细胞抑制能力，同时，合成多肽对正常肝细胞有较小的杀伤作用。
附图说明
图1为合成多肽Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg的HPLC图。
图2为合成多肽Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg的ESI-MS图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
多肽固相合成
选用高分子树脂(上海杰肽生物科技有限公司)，按照氨基酸序列Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg的特征，先将Arg的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Arg的氨基和Pro的羧基缩水反应，处理后，再添加Ser，Pro的氨基和Ser的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Val氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱纯化得到最后的产品，纯化过程使用kromasil C18-5(4.6*250mm)色谱柱，流速为1.0mL/min。液相系统使用两个通道，溶剂A:含有0.1％三氟乙酸的水；溶剂B:含有0.1％三氟乙酸的乙腈。梯度洗脱如下：B的初始比例是2％，在0.01min到30min内，B的比例上升到65％，在30min到33min内，B的比例上升为100％，保持100％运行至40min停止，检测波长214nm。收集多肽溶液，液氮速冷，然后冻干。得到纯度95％以上的产品，并经ESI-MS鉴定结构(如图1、2所示)。
合成多肽的体外抑制活性
通过MTT比色法分析各多肽组分对乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG-2和正常肝细胞LO2的生长抑制作用。具体操作步骤如下：
1)取对数生长期的细胞，经0.25％(体积)的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100μL,于37℃恒温CO2培养箱中培养；
2)培养24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的含有不同浓度待测样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养；
3)48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；
4)4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150μL DMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率:
癌细胞生长抑制率(％)＝((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD))/((对照组OD-空白组OD))×100
应用实施例1
肿瘤细胞MCF-7和HepG-2各100μL细胞悬液(5×104个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养。24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的100μg/mL的多肽样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养。48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150μl DMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，100μg/mL的多肽对肿瘤细胞MCF-7和HepG-2的抑制率分别是40.57％和31.52％。
表1对乳腺癌细胞和肝癌细胞的抑制效果(±s，n＝3)(％)
应用实施例2
肿瘤细胞MCF-7和HepG-2各100μL细胞悬液(5×104个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养。24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的200μg/mL的多肽样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养。48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150μl DMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，,200μg/mL的多肽对肿瘤细胞MCF-7和HepG-2的抑制率分别是50.19％和41.27％。
应用实施例3
肿瘤细胞MCF-7和HepG-2各100μL细胞悬液(5×104个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养。24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的300μg/mL的多肽样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养。48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150μl DMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，300μg/mL的多肽对肿瘤细胞MCF-7和HepG-2的抑制率分别是56.28％和52.88％。
应用实施例4
肿瘤细胞MCF-7和HepG-2各100μL细胞悬液(5×104个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养。24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的400μg/mL的多肽样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养。48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鲜基础培养基180μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150μL DMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，400μg/mL的多肽对肿瘤细胞MCF-7和HepG-2的抑制率分别是61.79％和58.6％。
应用实施例5
肿瘤细胞MCF-7和HepG-2及人正常肝细胞LO2各100μL细胞悬液(5×104个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养。24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的500μg/mL的多肽样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养。48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鲜基础培养基180μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150μL DMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由表1可知，500μg/mL的多肽对肿瘤细胞MCF-7和HepG-2及人正常肝细胞LO2的抑制率分别是66.35％、64.09％和7.05％。
Claims (4)
1.一种十二肽，其特征在于氨基酸序列为Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg。
2. 如权利要求1 所述的一种十二肽Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg，其特征在于所述十二肽在浓度为100-500µg/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2的体外增殖抑制率分别为40.57%-66.35%和31.52%-64.09%。
3. 如权利要求1 所述的一种十二肽Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg，其特征在于所述十二肽在浓度为500µg/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2的体外增殖抑制率分别为56.35%和64.09%。
4.如权利要求1 所述的一种十二肽Val-Pro-Gly-Thr-Pro-Lys-Asn-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg，其特征在于所述十二肽在浓度为500µg/mL时，对人正常肝细胞LO2的体外增殖抑制率为7.05%。
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