CN106075580A

CN106075580A - 一种体外构建骺板软骨的方法

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Publication number: CN106075580A
Application number: CN201610403975.8A
Authority: CN
Inventors: 李思远; 曹峻岭; 罗明秀; 陆敏灵; 王加丽; 李锦�; 陈静宏; 付强
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2036-06-08
Also published as: CN106075580B

Abstract

本发明涉及组织工程技术领域，具体而言，涉及一种体外构建骺板软骨的方法，包括：1)、培养人软骨细胞系细胞或人骨髓干细胞至形成细胞单层后，胰酶消化、清洗、重悬得到细胞悬液，计数备用；2)、将预先处理好的骨基质明胶材料切割为小于培养孔直径的圆柱体，并于所述圆柱体上钻出贯穿圆柱两个底面的孔道，灭菌处理；将切割后的骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中；3)、将步骤1)中得到的细胞悬液由孔道植入骨基质明胶材料下方，并使液面浸润骨基质明胶材料，培养得到骺板软骨。该方法建立了C28/I2细胞的培养体系与用其体外构建骺板软骨的方法，解决了种子细胞来源困难的问题；细胞性状稳定，培养成本低。

Description

一种体外构建骺板软骨的方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体而言，涉及一种体外构建骺板软骨的方法。

背景技术

组织工程技术是近些年逐渐用于治疗关节疾病的新策略。其核心在于利用组织工程的方法在体外培养病损部位细胞或组织，通过注射或者手术的方法，将其植入关节内病损部位例如关节软骨缺损处，从而促进病损组织的重构愈合，最终恢复关节功能。而利用组织工程技术体外培养，存在着两大基本前提，即细胞支架和种子细胞。此外，种子细胞与细胞支架之间的整合也是组织工程能否成功的重要因素。

骨基质明胶(Bone Matrix Gelatin，BMG)，是一种利用化学物理方法去除骨内矿物质和细胞后，得到的一种支架材料。BMG是一种类似海绵的多孔隙生物材料，细胞可以在BMG表面和内部种植、迁移、增殖和分化。同时，细胞培养所需要的营养和细胞自身分泌的大分子物质也可以在BMG内部自由穿行。更为重要的是，BMG来源广泛，没有或者只有非常低的抗原性，并且可以在体内被自然吸收，不需要手术取出。以BMG为生物支架，已经在体外成功构建了关节软骨，并将体外构建的组织工程软骨移植到体内，修复了关节软骨的缺损。此外，大量的临床实验证据提示，BMG可以有效的应用于骨缺损的治疗。

在利用组织工程技术修复关节软骨缺损的过程中，种子细胞来源一直是影响组织工程技术的重要因素。目前最为常用的种子细胞为软骨细胞。这些软骨细胞通常来源于人成熟关节软骨，经过一系列酶解后从胞外基质中被释放出来，并经过体外单层培养扩增获得足够的细胞数目。然而，这个过程存在一个显著的问题，即正常成人关节软骨获取非常困难。此外，软骨细胞在体外单层培养扩增过程中会逐渐失去其原来的细胞性状，分化为成纤维细胞，严重影响体外关节软骨构建。

另外一种常用的种子细胞是干细胞，包括成体干细胞和胚胎干细胞。然而，由于伦理学方面的问题以及潜在的肿瘤形成风险，胚胎干细胞作为种子细胞的使用受到了非常大的限制。近些年，成体干细胞在组织工程中的应用日益受到重视。相对于软骨细胞和胚胎干细胞，成体干细胞拥有很多优势：首先，成体干细胞可以从多种组织如骨髓、肌肉、脂肪等组织中分离并提取；其次，成体干细胞可以定向分化为包括关节软骨细胞、成骨细胞在内的多种终末细胞。然而成体干细胞也存在一些缺点，例如目前还缺乏明确的成体干细胞表面标志物，因此分离和提取成体干细胞往往存在不确定性。此外，成体干细胞数目有限，往往需要体外扩增。然而，同关节软骨细胞一样，如何在扩增过程中保证成体干细胞性状的稳定性仍有待解决。更为重要的是，体外诱导分化成体干细胞为软骨细胞及成骨细胞的过程中往往需要加入不同的细胞因子如肿瘤生长因子β，这些生长因子的价格通常非常昂贵，严重制约了成体干细胞大规模应用于临床

此外，目前利用组织工程的方法体外构建的均为关节软骨(articularcartilage)和骨(bone)组织，而体外构建骺板软骨(epiphyseal growth platecartilage)尚未见到报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外构建骺板软骨的方法，所述的方法提供了以人软骨细胞作为种子细胞在体外构建骺板软骨的体系，不仅细胞获取方便，且性状稳定，培养过程中也不需要昂贵的生长因子，大大降低了体外构建骺板软骨的成本。

一种体外构建骺板软骨的方法，包括：

1)、培养人软骨细胞系细胞或人骨髓干细胞至形成细胞单层后，胰酶消化、清洗、重悬得到细胞悬液，计数备用；

2)、将预先处理好的骨基质明胶材料切割为小于培养孔直径的圆柱体，并于所述圆柱体上钻出贯穿圆柱两个底面的孔道，灭菌处理；将切割后的骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中；

3)、将步骤1)中得到的细胞悬液由孔道植入骨基质明胶材料下方，并使液面浸润骨基质明胶材料，培养得到骺板软骨；

其中，步骤1)和步骤2)没有先后顺序。

现有的构建组织工程软骨的技术使用的种子细胞为软骨细胞或者成体干细胞，种植在包括骨基质明胶材料(BMG)的支架材料上，存在种子细胞来源困难、体外扩增培养不易、获得的软骨组织均为关节软骨等缺点。本申请采用软骨细胞系细胞或人骨髓干细胞，种植在BMG下方，克服了种子细胞来源和扩增的问题；

在步骤2)中，所述骨基质明胶材料略小于培育孔即可(圆柱体直径小于培养孔直径0.5～2mm)，以编将圆柱体放进培养孔。将所述骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中时，可选用医用生物胶水固定，骨基质明胶材料的上部于培养孔上部平齐或略低于培养孔上部，悬空固定时，圆柱体下部预留0.1～0.5cm的空间。

同时本领域技术人员了解，若将本申请提供的方法针对不同代培养组织进行相应的条件优化，也可以构建出关节软骨、骺板软骨以及骨组织。

优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，所述人软骨细胞系细胞为C28/I2细胞。

进一步优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤1)中，所述培养人软骨细胞系细胞至形成细胞单层的操作包括：

复苏液氮冷冻的人软骨C28/I2细胞系细胞后以35～45万个细胞的接种量接种于75mL的培养瓶中进行培养，培养条件为：

每个培养瓶加入3.5～4.5mL的含28～32％胎牛血清、90～110U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液，4.5～5.5％CO₂、36～38℃培养；首次换液间隔68～76h，以后每间隔44～52h换液，直至形成细胞单层。

75mL的培养瓶为常规的5cm×5cm×3cm的培养瓶；

形成的细胞单层的汇合度为60～80％。

DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium)。具有F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点，DMEM/F12会促进细胞贴壁和生长，所以细胞会长的快。

为了增强该培养基的缓冲能力，本申请所述的DMEM/F12培养液也可以加入15mMHEPES缓冲液。

优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤1)中，所述胰酶消化、清洗、重悬得到细胞悬液的操作包括：

弃去培养液，每瓶细胞用3～5mL D-Hanks液将细胞洗一次，加入3～5mL0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化酶液，36～38℃消化8～12min；

将5～7瓶培养瓶中的细胞汇集到离心管中，离心弃上清，用8～12mL含13～17％胎牛血清、90～110U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液重悬细胞。

优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤2)中，所述孔道的直径为1.2～1.4mm。

进一步优选的，为了方便操作，所述孔道可位于圆柱体的边缘位置。

进一步优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤3)中，将细胞悬液由孔道植入骨基质明胶材料下方的方法为：

用连有12号针头的注射器通过所述孔道注入细胞悬液。

1.2～1.4mm的开口直接恰好略大于12号针头直径(1.2mm)。经发明人的经验判断，12号针头是比较合适的针头大小，太细的针头注射速度过慢，且冲力不好控制，容易损伤细胞。注射时应缓缓推动注射器。

优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤2)中，所述灭菌处理具体为：

钴-60放射性灭菌。

钴-60，核素符号⁶⁰Co，可制作γ放射源，穿透力强，适合于BMG的灭菌。

优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤3)中，植入细胞悬液之前，还包括：

用无菌琼脂糖凝胶将所述骨基质明胶材料与所述培养孔边缘的缝隙封闭。

封闭所述骨基质明胶材料与所述培养孔边缘的缝隙可防止细胞生长过程中爬出培养孔，只在骨基质明胶材料下方生长。

优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤3)中，植入骨基质明胶材料中的细胞悬液的量为：

细胞悬液液面浸润75～85％的骨基质明胶材料支架。

进一步优选的，如上所述的体外构建骺板软骨的方法，在步骤3)中，每个培养孔中人软骨细胞系细胞或人骨髓干细胞的接种量为10～30万个细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、建立了C28/I2细胞、人骨髓干细胞的培养体系与用其构建软骨组织的方法，解决了种子细胞来源困难的问题。

2)、C28/I2细胞为可稳定传代的细胞系，在培养及扩展过程中可始终保持其原有性状，避免了传统组织培养中采用人成熟关节软骨细胞或成体干细胞容易分化为成纤维细胞的问题。

3)、将C28/I2细胞用于组织工程技术领域，培养及增殖细胞的过程中不需要添加生长因子，大幅度降低了成本，利于该技术的大规模临床应用。

4)、人骨髓干细胞获得较为容易，利用该细胞作为种子细胞构建骺板软骨后，在未来临床使用中不会出现排异性反应这一问题。

5)、提供了一直可行的、利于操作的、技术成熟的体外构建骺板软骨的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例5中甲苯胺蓝染色结果；标尺：50μm；

图2为实施例5中硫酸软骨素免疫组织化学染色结果；标尺：500μm；

图3为实施例5中HE染色图片中；图a：发育不完全的骺板软骨组织；图b：发育完全的骺板软骨组织；标尺：25μm。

具体实施方式

实施例1

一种体外构建骺板软骨的方法，包括：

S11、培养人骨髓干细胞至形成细胞单层后，胰酶消化、清洗、重悬得到细胞悬液，计数备用；

S12、将预先处理好的骨基质明胶材料切割为小于培养孔直径的圆柱体，并于所述圆柱体上钻出贯穿圆柱两个底面的孔道，灭菌处理；将切割后的骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中；

S13、将步骤S11中得到的细胞悬液由孔道植入骨基质明胶材料下方，并使液面浸润骨基质明胶材料，培养得到骺板软骨；

其中，步骤S11和步骤S12没有先后顺序。

实施例2

一种体外构建骺板软骨的方法，包括：

S21、复苏液氮冷冻的人软骨C28/I2细胞系细胞后以35万的接种量接种于75mL的培养瓶中进行培养；培养条件为：每个培养瓶加入3.5mL的含28％胎牛血清、110U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液，4.5％CO₂、38℃培养；首次换液间隔68h，以后每间隔44h换液。

待细胞培养至形成细胞单层后弃去培养液，每瓶细胞用3mL D-Hanks液将细胞洗一次，加入3mL 0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化酶液，36℃消化12min；

将7瓶培养瓶中的细胞汇集到离心管中，离心弃上清，用8mL含13％胎牛血清、110U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液重悬细胞；计数备用；

S22、将预先处理好的骨基质明胶材料切割为小于培养孔直径0.5～2mm的圆柱体，并于所述圆柱体上钻出贯穿圆柱两个底面的孔道，孔道的直径为1.2～1.4mm；钴-60放射性灭菌处理；将切割后的骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中；用无菌琼脂糖凝胶将所述骨基质明胶材料与所述培养孔边缘的缝隙封闭。

S23、将步骤S21中得到的细胞悬液用连有12号针头的注射器由所述孔道植入骨基质明胶材料下方，细胞悬液液面浸润75％的骨基质明胶材料支架，每个培养孔中C28/I2细胞的接种量为10万，常规培养得到骺板软骨。

其中，步骤S21和步骤S22没有先后顺序。

实施例3

一种体外构建骺板软骨的方法，包括：

S31、将预先处理好的骨基质明胶材料切割为略小于培养孔直径的圆柱体，并于所述圆柱体上钻出贯穿圆柱两个底面的孔道，孔道的直径为1.2～1.4mm；钴-60放射性灭菌处理；将切割后的骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中；用无菌琼脂糖凝胶将所述骨基质明胶材料与所述培养孔边缘的缝隙封闭。

S32、复苏液氮冷冻的人软骨C28/I2细胞系细胞后以45万的接种量接种于75mL的培养瓶中进行培养；培养条件为：每个培养瓶加入4.5mL的含32％胎牛血清、90U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液，5.5％CO₂、36℃培养；首次换液间隔76h，以后每间隔52h换液。

待细胞培养至形成细胞单层后弃去培养液，每瓶细胞用5mL D-Hanks液将细胞洗一次，加入5mL 0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化酶液，38℃消化8min；

将5瓶培养瓶中的细胞汇集到离心管中，离心弃上清，用12mL含17％胎牛血清、90U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液重悬细胞；计数备用。

S33、将步骤S32中得到的细胞悬液用连有12号针头的注射器由所述孔道植入骨基质明胶材料下方，细胞悬液液面浸润85％的骨基质明胶材料支架，每个培养孔中C28/I2细胞的接种量为30万，常规培养得到骺板软骨。

实施例4

一种体外构建骺板软骨的方法，包括：

S41、复苏液氮冷冻的人软骨C28/I2细胞系细胞后以40万的接种量接种于75mL的培养瓶中进行培养；培养条件为：每个培养瓶加入4.0mL的含30％胎牛血清、100U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液，5.0％CO₂、37℃培养；首次换液间隔72h，以后每间隔48h换液。

待细胞培养至形成细胞单层后弃去培养液，每瓶细胞用4mL D-Hanks液将细胞洗一次，加入4mL 0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化酶液，37℃消化10min；

将6瓶培养瓶中的细胞汇集到离心管中，离心弃上清，用10mL含15％胎牛血清、100U/mL的青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液重悬细胞；计数备用。

S42、将预先处理好的骨基质明胶材料切割为小于培养孔直径0.5～2mm的圆柱体，并于所述圆柱体上钻出贯穿圆柱两个底面的孔道，孔道的直径为1.2～1.4mm；钴-60放射性灭菌处理；将切割后的骨基质明胶材料悬空固定于所述培养孔当中；用无菌琼脂糖凝胶将所述骨基质明胶材料与所述培养孔边缘的缝隙封闭。

S43、将步骤S41中得到的细胞悬液用连有12号针头的注射器由所述孔道植入骨基质明胶材料下方，细胞悬液液面浸润80％的骨基质明胶材料支架，每个培养孔中C28/I2细胞的接种量为20万，常规培养得到骺板软骨。

实施例5

S51、骨基质明胶(BMG)的制备

本实施例所用的BMG为兔BMG。用削去关节软骨后的骨干部分制备骨基质明胶。相对无菌条件下，剔除附着于骨干骨上的软组织，去除关节软骨和骨髓，并用蒸馏水冲洗后，在磁力搅拌下作如下处理：

1)、室温下，1：1氯仿甲醇作用1h；

2)、三蒸水冲洗；

3)、在4℃下，0.6mol/L HCl作用12h，每6小时换液一次；

4)、三蒸水冲洗；

5)、取出，将骨干骨从中剖开，冲去骨髓，放入1：1氯仿/甲醇12h；

6)、三蒸水冲洗；

7)、在4℃下，0.6mol/L HCl 24h(中间换HCl一次)；

8)、水洗，充分搅拌过夜，使终末PH值达中性；

9)、换入2mol/L的CaCl₂中，4℃下，搅拌2h；

10)、三蒸水冲洗；

11)、取出置于500mL烧杯内，加入0.5mol/L PH为8.0的EDTA，搅拌2h；

12)、三蒸水冲洗；

13)、加入200mL 8mol/L LiCl溶液，4℃下，磁力搅拌2h；

14)、弃去液体，将BMG水洗后。

15)、用剪刀从密质骨和松质骨交界处剪断。

16)、将松质骨剪成直径约3mm的圆形，用蒸馏水冲洗。

17)、放入55℃烘箱，1h后取出，环氧乙烷灭菌后存放于-20℃冰箱备用。

S52、种子细胞培养及体外扩增

常规复苏液氮冷冻的人软骨C28/I2细胞系细胞，以40万细胞/瓶的接种量将关节软骨细胞接种于培养瓶(5cm×5cm×3cm)中，加入4mL含30％胎牛血清和青、链霉素的DMEM/F12，放入含5％CO₂、37℃的CO₂培养箱内培养。3h后逐瓶观察：关节软骨细胞呈圆形，细胞多数已贴壁。培养过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞的生长状况，首次换培养液间隔72h，以后每间隔48h换入新鲜培养液，直至形成细胞单层。培养液弃去，用4mL D-Hanks液将细胞洗一次，加入4mL 0.25％胰酶+0.02％EDTA消化酶液，于37℃消化10min，轻轻摇荡，在倒置显微镜下观察细胞已脱壁，每6瓶倒入一只50mL塑料离心管，用2mL D-Hanks液洗培养瓶一次，也并入塑料离心管内，1500rmp离心10min，弃去上清，用10mL DMEM/F-12+P/S+15％FBS液重悬细胞，用细胞计数板计数。

S53、组织工程培养

根据培养孔直径的大小，用圆锯将BMG材料切割为略小于培养孔直径(小于培养孔直径0.5～2mm)的规整圆柱形，并利用物理方法标记出圆柱上端和下端位置。用手术剪小心的在圆柱边缘修剪出纵贯圆柱上下的凹陷，允许12号针头通过。钴-60放射线灭菌后，在无菌条件下将BMG材料小心置入培养孔当中，用生物胶水将BMG支架与培养孔边缘粘连，使BMG材料悬空于培养孔当中，支架底部与培养孔底部保持一定的距离。随后，用少量无菌琼脂糖凝胶将BMG与培养孔边缘的缝隙封闭。人软骨C28/I2细胞系细胞常规体外扩增、悬浮和清洗后，制成合适浓度的细胞悬液。利用注射器和12号针头，通过预先留出的BMG边缘凹陷处插入培养孔中，小心地将细胞种植于BMG之间的下方，直至培养液液面浸润80％的BMG支架，每个培养孔中植入20万左右个细胞。将培养板置入培养箱，常规培养24天后收获骺板软骨。

当培养3周后，将一部分培养的骺板软骨切片并做甲苯胺蓝染色、硫酸软骨素免疫组织化学染色及HE染色，其结果依次如图1、图2、图3所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，包括：

其中，步骤1)和步骤2)没有先后顺序。

2.如权利要求1所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，所述人软骨细胞系细胞为C28/I2细胞。

3.如权利要求2所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述培养人软骨细胞系细胞至形成细胞单层的操作包括：

4.如权利要求2所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述胰酶消化、清洗、重悬得到细胞悬液的操作包括：

5.如权利要求1所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述孔道的直径为1.2～1.4mm。

6.如权利要求5所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤3)中，将细胞悬液由孔道植入骨基质明胶材料下方的方法为：

用连有12号针头的注射器通过所述孔道注入细胞悬液。

7.如权利要求1所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述灭菌处理具体为：

钴-60放射性灭菌。

8.如权利要求1所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤3)中，植入细胞悬液之前，还包括：

9.如权利要求1所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤3)中，植入骨基质明胶材料中的细胞悬液的量为：

细胞悬液液面浸润75～85％的骨基质明胶材料支架。

10.如权利要求9所述的体外构建骺板软骨的方法，其特征在于，在步骤3)中，每个培养孔中人软骨细胞系细胞或人骨髓干细胞的接种量为10～30万个细胞。