CN106069792A

CN106069792A - 一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法

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Publication number: CN106069792A
Application number: CN201610726014.0A
Authority: CN
Inventors: 陈中坚; 王勇; 魏富刚; 余育启
Original assignee: WENSHAN MIAOXIANG SANQI TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WENSHAN MIAOXIANG SANQI TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2036-08-25
Also published as: CN106069792B

Abstract

本发明公开了一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或花药作为外植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到三七紫色素愈伤组织；所述诱导培养的光照控制为4～8小时光照、4～8小时黑暗，交替进行。其诱导培养的培养基为MS+0.1～2mg/L 2,4‑D+0.1～2mg/L BA+0.002～1mg/L TDZ+30～60g/L蔗糖；或MS+0.1～2mg/L NAA+0.1～2mg/L BA+0.002～1mg/L TDZ+30～60g/L蔗糖。本发明通过对光照时间、培养基、湿度、温度等条件控制，培养出富含紫色素、诱导率高的愈伤组织。本发明通过缩短光照与黑暗的交替时间的方法有效的提高了三七紫色素的含量，并在培养基中加入TDZ及与其他植物激素的搭配，使三七愈伤组织的诱导率明显提高，并有利于紫色素的形成。本发明为大量提取三七愈伤组织中的紫色素奠定了基础。

Description

一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法。

背景技术

三七为五加科人参属植物，有“金不换”、“南国神草”、“参中之王”等美誉，是云南特有的名贵中药材，也是我国中医药中一颗璀璨的明珠。三七紫色素为一种存在于三七植株茎、叶、花及根的细胞液中的化合物，使植株呈现出红、紫红、兰等不同颜色。

三七紫色素的本质为花色苷，花色苷是类黄酮--以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。由于它具有独特的功能性，而被应用于清除体内自由基、增殖叶黄素、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，且对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。

然而，目前并无关于三七紫色素的利用与开发的相关文献及报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过组织培养的方法诱导培养出富含紫色素的三七愈伤组织，为大量提取其中的紫色素奠定了基础。

本发明提供的技术方案：

一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或花药作为外植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到三七紫色素愈伤组织；所述诱导培养的光照控制为4～8小时光照、4～8小时黑暗，交替进行。

优选的，所述诱导培养的光照控制为6小时光照、6小时黑暗，交替进行。

优选的，所述的光照控制的光强度为1500—2000lx。

进一步的，所述诱导培养的培养基为MS+0.1～2mg/L 2,4-D+0.1～2mg/L BA+0.002～1mg/L TDZ+30～60g/L蔗糖(即在每一升的MS培养基中添加0.1～2mg 2,4-D、0.1～2mg BA、0.002～1mg TDZ和30～60g蔗糖)；或MS+0.1～2mg/L NAA+0.1～2mg/LBA+0.002～1mg/LTDZ+30～60g/L蔗糖(即在每一升的MS培养基中添加0.1～2mg NAA、0.1～2mg BA、0.002～1mg TDZ和30～60g蔗糖)。

其中，所述MS为MS培养基，NAA为萘乙酸，2，4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，BA为苄氨基腺嘌呤，TDZ为噻苯隆。

进一步的，所述的诱导培养的环境控制为温度：22℃—25℃；空气相对湿度：50—80％。

进一步的，所述三七茎、叶、花作为外植体的灭菌方法为：选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花为外植体，用清水冲洗5～6次，将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌后用无菌去离子水冲洗6～8次。

进一步的，所述三七茎、叶、花作为外植体的接种方法为：在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm²的块状外植体；在无菌的条件下进行接种，每瓶培养基接种3～5块外植体。

进一步的，所述三七茎、叶、花作为外植体的诱导培养的周期为4～5周。

进一步的，所述三七花药作为外植体的接种方法为：在无菌滤纸上剥取花药；在无菌的条件下进行接种，将花药接种到组培瓶中，每瓶15～20粒；

进一步的，所述三七花药作为外植体的诱导培养的周期为6～7周。

本发明的有益效果：

本发明通过对光照时间、培养基、湿度、温度等条件控制，培养出富含紫色素、诱导率高的愈伤组织。本发明通过缩短光照与黑暗的交替时间的方法有效的提高了三七紫色素的含量，并在培养基中加入TDZ及与其他植物激素的搭配，使三七愈伤组织的诱导率明显提高，并有利于紫色素的形成。

本发明利用组织培养繁殖效率高、生长周期短的优点，建立适合三七紫色素愈伤组织生长的组培条件，从而提供大量的优质的富含紫色素的愈伤组织，为从三七愈伤组织中提取紫色素提供物质基础，有利于自动化、规模化生产,提高生产效率。

具体实施方式

实施例1

一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花作为外植体，用清水冲洗5次，先用70％的酒精灭菌10s，用无菌水冲洗3次后，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗6次，备用。

在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm²的块状外植体；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的外植体接种到培养基上，每瓶培养基接种3～5块外植体。

在MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.002mg/L TDZ+30g/L蔗糖的培养基中进行诱导培养，培养周期为4—5周。

其中，光照控制为4小时光照条件和4小时黑暗条件交替进行，光照强度为1500lx；温度：22℃；空气相对湿度：50％。

实施例2

一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花作为外植体，用清水冲洗6次，先用70％的酒精灭菌10s，用无菌水冲洗3次后，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗8次，备用。

在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm2的块状外植体；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的外植体接种到培养基上，每瓶培养基接种5块外植体。

其中的诱导培养基为MS+2mg/L 2,4-D+2mg/L BA+1mg/L TDZ+60g/L蔗糖。

其中，光照控制为8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行,光照强度为2000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养周期为5周。

实施例3

一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

选取健康的三七的花药作为外植体，将三七花清水冲洗5次，先用70％的酒精灭菌10s，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗6次，备用。

在无菌滤纸上剥取花药；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将花药接种到组培瓶中，每瓶15粒；

在MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L BA+0.002mg/L TDZ+30g/L蔗糖的培养基中进行诱导培养。

其中，光照控制为6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行，光照强度为1600lx；温度：22℃；空气相对湿度：50％，培养周期为6周。

实施例4

一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

选取健康的三七的花药作为外植体，将三七花清水冲洗6次，先用70％的酒精灭菌10s，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗8次，备用。

在无菌滤纸上剥取花药；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将花药接种到组培瓶中，每瓶20粒；

在MS+2mg/L NAA+2mg/L BA+1mg/L TDZ+60g/L蔗糖的培养基中进行诱导培养。

其中，光照控制为5小时光照条件和5小时黑暗条件交替进行，光照强度为1700lx；温度:25℃；空气相对湿度:80％，培养周期为7周。

不同植物激素对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量的影响试验：

选取4组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，分别接种于4组诱导培养基，(1)MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+30g/L蔗糖、(2)MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L BA+30g/L蔗糖、(3)MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖、(4)MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L BA+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖。

在相同的环境下进行培养，其中光照控制为8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行,光照强度为2000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养5周后对其诱导率及紫色素的含量进行测试。

表1，不同植物激素对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量

编号	2,4-D	NAA	BA	TDZ	诱导率	紫色素含量
							1	0.1	0	0.1	0	8％	1％
2	0	0.1	0.1	0	6％	2％
							3	0.1	0	0.1	0.1	48％	18％
4	0	0.1	0.1	0.1	51％	19％

从表1的结果可以看出，TDZ的添加能明显提高三七的诱导愈伤组织的诱导率，有利于愈伤组织的增殖及富含紫色素愈伤组织的诱导，使其紫色素的含量明显提高。

不同光照条件对愈伤组织的诱导率及紫色素含量的影响试验：

选取6组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，接种于相同的诱导培养基MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖中。

对其进行不同的光照处理，分别为(1)4小时光照条件和4小时黑暗条件交替进行,(2)6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行,(3)8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行,(4)12小时光照条件和12小时黑暗条件交替进行,(5)24小时光照条件和24小时黑暗条件交替进行,(6)36小时光照条件和36小时黑暗条件交替进行。

6组的光照强度为2000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养5周后对其诱导率及紫色素的含量进行测试。

表1，不同光照条件对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量

从表2的结果可以看出，使用光照与黑暗交替的光照条件能有效提高三七愈伤组织中紫色素的形成，其中缩短光照与黑暗的交替时间与愈伤组织中紫色素的含量成正比。

不同光照强度对愈伤组织的诱导率及紫色素含量的影响试验：

选取5组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，接种于相同的诱导培养基MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖中，置于温度：25℃；空气相对湿度：80％；6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行的环境中,。

其中，5组的光照强度分别为800lx，1500lx，2000lx，2500lx；培养5周后对其诱导率及紫色素的含量进行测试。

表3，不同光照强度对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量

从表3的结果可以看出，光照强度为1500lx，2000lx的条件下有利于提高三七愈伤组织中紫色素的形成。

Claims

1.一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或花药作为外植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到三七紫色素愈伤组织；所述诱导培养的光照控制为4～8小时光照、4～8小时黑暗，交替进行。

2.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养的光照控制为6小时光照、6小时黑暗，交替进行。

3.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述的光照控制的光强度为1500—2000lx。

4.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养的培养基为MS+0.1～2mg/L 2,4-D+0.1～2mg/L BA+0.002～1mg/L TDZ+30～60g/L蔗糖；或MS+0.1～2mg/L NAA+0.1～2mg/L BA+0.002-1mg/L TDZ+30～60g/L蔗糖。

5.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述的诱导培养的环境控制为温度：22℃—25℃；空气相对湿度：50—80％。

6.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述三七茎、叶、花作为外植体的灭菌方法为：选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花为外植体，用清水冲洗5～6次，将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌后用无菌去离子水冲洗6～8次。

7.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述三七茎、叶、花作为外植体的接种方法为：在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm的块状外植体；在无菌的条件下进行接种，每瓶培养基接种3～5块外植体。

8.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述三七茎、叶、花作为外植体的诱导培养的周期为4～5周。

9.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述三七花药作为外植体的接种方法为：在无菌滤纸上剥取花药；在无菌的条件下进行接种，将花药接种到组培瓶中，每瓶15～20粒。

10.根据权利要求1所述的一种三七紫色素愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述三七花药作为外植体的诱导培养的周期为6～7周。