CN106047741A - 一种利用甲壳素合成pha的菌株和合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用甲壳素合成PHA的菌株，假单胞菌YJY25，保藏号为：CCTCC M 2016075，保藏时间：2016.02.28；合成方法包括利用甲壳素复合酶降解甲壳素形成酶解产物的步骤、以酶解产物作为碳源培养假单胞菌YJY25的步骤和收集假单胞菌YJY25发酵产物获得PHA的步骤；PHA除了作为生物塑料，还可以通过合成水处理制剂用于废水处理。通过低成本的方法得到可降解的生物塑料，解决了目前难降解的塑料对环境造成极大污染和可降解生物塑料造价成本高的现状，并将其利用于废水的脱氮处理工艺，并对甲壳素这一低价、可再生生物资源的合理利用。

Description

一种利用甲壳素合成PHA的菌株和合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及利用复合酶降解甲壳素并以此作为聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）合成菌的碳源发酵合成PHA，涉及微生物发酵技术领域，是对低廉生物资源的二次优化利用。
背景技术
目前，以石油为原料生产的塑料已经广泛应用于各个行业中。然而废弃塑料带来的“白色污染”和垃圾围城现象以及塑料燃烧产生的大气污染、水污染严重地影响了人们的生活环境。随着塑料产量的不断增长和应用领域的日益扩大，塑料废弃物对环境的污染也日趋严重，作为保护环境的重要措施之一，降解塑料的开发成为世界热点问题。而生物可降解塑料作为以石油为原料生产的塑料的替代品受到了广泛的关注。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物在体内积累碳源形成的胞内聚合物。他是许多细菌在生长不平衡条件下合成的碳源储藏性颗粒，它除具有与传统塑料相近的性质，还兼有具有良好的物理特性、生物相容性和生物可降解性，在自然生态环境中可完全降解为水和二氧化碳，环境污染小，被认为是未来替代化工塑料的重要物质，在解决环境污染和能源紧张方面具有很大的潜力。目前，工业生产PHA多以纯菌发酵，包括产碱杆菌、固氮菌、假单胞菌以及重组大肠杆菌等。但纯菌发酵需使用优质底物，以及灭菌等发酵控制工艺造成PHA生产成本昂贵，其市场价格大约为20美元/千克，高于传统塑料的5-10倍，高昂的成本限制了其广泛应用。在微生物发酵合成PHA 的所有发酵条件因素中，碳源是一个重要因素，其成本占到总成本的 28-50％。为此，可以通过使用廉价发酵可大大降低PHA的生产成本。因此利用来源广泛、价格低廉，以其为碳源又可以降低PHA的生产成本，使PHA这种可降解的生物塑料获得更广泛的应用，从而减少白色污染，实现资源的有效再利用是一项迫在眉睫的任务。
甲壳素又名甲壳质、几丁质及壳多糖等，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β-1,4糖苷键连接而成的直链高分子化合物，不仅广泛存在于虾、蟹等甲壳类海洋节肢动物中，而且也大量存在于低等生物菌类、昆虫外壳、藻类细胞中。每年其生物合成量约为100亿吨，产量仅次于纤维素，是地球上第二大再生资源，其中海洋生物的生成量为10亿吨以。工业上用来生产甲壳素的主要原料是水产加工厂废弃的虾蟹壳等。高分子量的甲壳素水溶性差，溶于弱酸性介质，粘度高，不易吸收，很难被生物利用，导致这些可再生资源并没有得到大规模的回收再利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用甲壳素降解后的酶解产物，作为产PHA的假单胞菌YJY25碳源，合成PHA的技术，通过低成本的方法得到可降解的生物塑料，解决了目前难降解的塑料对环境造成极大污染和可降解生物塑料造价成本高的现状，并将其利用于废水的脱氮处理工艺，并对甲壳素这一低价、可再生生物资源的合理利用。
本发明所用到的假单胞菌YJY25（Pseudomonas sp. YJY25）为申请人分离所获，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学,保藏号为：CCTCC NO：M2016075，保藏时间：2016.02.28，能够利用甲壳素酶解后的酶解产物，合成PHA。
利用甲壳素合成PHA的方法，大致包括利用甲壳素复合酶降解甲壳素形成酶解产物的步骤、以酶解产物作为碳源培养假单胞菌YJY25的步骤和收集假单胞菌YJY25发酵产物获得PHA的步骤。
具体的操作步骤为：（1）将甲壳素制备成胶体溶液，并调节pH值为5.0~6.5，加入5~20%的复合酶制剂，于35~60℃摇床进行酶降解，降解时间1~10h，降解产物经絮凝，沉淀，过滤即得酶解产物；（2）将假单胞菌YJY25进行活化，然后接种到以步骤（1）中所得到的酶解产物为碳源的培养基中进行培养；（3）步骤（2）得到的培养物经细胞壁破碎、絮凝、过滤沉淀、洗涤干燥，即可获得PHA。
作为更加优选，所述步骤（2）中，步骤（1）中所得到的酶解产物作为假单胞菌YJY25培养的唯一碳源。
作为优选，所述步骤（2）中，假单胞菌YJY25在以步骤（1）中所得到的酶解产物为碳源的培养基中进行培养的培养条件为：温度25~35℃，pH为7.0~7.5，培养时间为48-60h。
作为优选，假单胞菌YJY25的活化条件为30~35℃，摇床200~250r/min，活化24~48h；活化后菌液以1.~2.0%（v%）的接种量接入含酶解产物的培养中进行培养。
上述得到的PHA除了作为生物塑料，还可以通过合成水处理制剂用于废水处理，尤其是对废水的脱氮处理，尤其是用于处理养殖废水中的脱氮处理。
所述的水处理制剂的组分包括50~100g塑形剂、300~500gPHA粉末、50~100g增效剂。通过在100~150℃条件下造粒形成。
通过实施上述的技术方案，本发明具有如下优点：
1.本发明利用来源广泛、价格低廉、可生物降解的甲壳素作为原料合成可生物降解的优质材料PHA，既降低了生产成本又减少了其他合成原料的二次污染，也是对再生的能源再次利用；
2.本发明生产PHA生产工艺简单，方便可控，且PHA合成产量较高，具有极广工业和开发前景；
3.本发明还提供了PHA除了作为优质材料之外的新功能，用于废水处理，处理效果好，水处理成本低，无副作用，将甲壳素充分利用。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明制备过程，以下通过发明人给出的依本发明技术方案所完成的具体的实施例对本发明作进一步的详细描述，这些仅是本发明较好的实施例，但不限于这些实施例。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
一种利用甲壳素合成PHA的方法，具体操作方法包括：（1）将甲壳素制备成胶体溶液，并调节pH值为6.0，加入5%的复合酶制剂，于60℃摇床进行酶降解，降解时间8h，降解产物经絮凝，沉淀，过滤即得酶解产物；（2）将假单胞菌YJY25在种子培养基中进行活化，活化条件为30℃，摇床200r/min，活化48h；活化后菌液以1.0%（v%）的接种量接入到发酵培养中进行培养，然后接种到以步骤（1）中所得到的酶解产物为唯一碳源的培养基中进行培养，培养条件为温度35℃，pH为7.0，培养时间为48h；（3）步骤（2）得到的培养物（也即发酵产物）经细胞壁破碎、絮凝、过滤沉淀、洗涤干燥，即可获得PHA。
所得到的PHA用于各种塑料制品的原料。
实施例2：
一种利用甲壳素合成PHA的方法，具体操作方法包括：（1）将甲壳素制备成胶体溶液，并调节pH值为5.0，加入15%的复合酶制剂，于50℃摇床进行酶降解，降解时间10h，降解产物经絮凝，沉淀，过滤即得酶解产物；（2）将假单胞菌YJY25在种子培养基中进行活化，活化条件为35℃，摇床250r/min，活化24h；活化后菌液以2.0%（v%）的接种量接入到发酵培养中进行培养，然后接种到以步骤（1）中所得到的酶解产物为唯一碳源的培养基中进行培养，培养条件为温度30℃，pH为7.2，培养时间为50h；（3）步骤（2）得到的培养物经细胞壁破碎、絮凝、过滤沉淀、洗涤干燥，即可获得PHA。
所得到的PHA用于养殖废水的脱氮处理。先制备成水处理制剂，水处理制剂包括80g塑形剂、420gPHA粉末、100g增效剂，各组分混合在150℃条件下造粒形成。
实施例3：
一种利用甲壳素合成PHA的方法，具体操作方法包括：（1）将甲壳素制备成胶体溶液，并调节pH值为6.5，加入20%的复合酶制剂，于35℃摇床进行酶降解，降解时间1h，降解产物经絮凝，沉淀，过滤即得酶解产物；（2）将假单胞菌YJY25在种子培养基中进行活化，活化条件为32℃，摇床230r/min，活化35h；活化后菌液以1.5%（v%）的接种量接入到发酵培养中进行培养，然后接种到以步骤（1）中所得到的酶解产物为唯一碳源的培养基中进行培养，培养条件为温度25℃，pH为7.5，培养时间为60h；（3）步骤（2）得到的培养物经细胞壁破碎、絮凝、过滤沉淀、洗涤干燥，即可获得PHA。
所得到的PHA先制备成水处理制剂，利用水处理制剂可以进行废水处理。水处理制剂包括60g塑形剂、500gPHA粉末、80g增效剂，各组分混合在100℃条件下造粒形成。
实施例4：
一种利用甲壳素合成PHA的方法，具体操作方法包括：（1）将甲壳素制备成胶体溶液，并调节pH值为6.5，加入20%的复合酶制剂，于35℃摇床进行酶降解，降解时间1h，降解产物经絮凝，沉淀，过滤即得酶解产物；（2）将假单胞菌YJY25在种子培养基中进行活化，活化条件为32℃，摇床230r/min，活化35h；活化后菌液以1.5%（v%）的接种量接入到发酵培养中进行培养，然后接种到以步骤（1）中所得到的酶解产物为唯一碳源的培养基中进行培养，培养条件为温度25℃，pH为7.5，培养时间为60h；（3）步骤（2）得到的培养物经细胞壁破碎、絮凝、过滤沉淀、洗涤干燥，即可获得PHA。
所得到的PHA先制备成水处理制剂，利用水处理制剂可以进行废水处理。水处理制剂包括50g塑形剂、300gPHA粉末、50g增效剂，各组分混合在130℃条件下造粒形成。
实施例5：
水处理制剂包括70g塑形剂、430gPHA粉末、100g增效剂，各组分混合在140℃条件下造粒形成。
甲鱼污水以一定的流速从反应器1进水，反应器1为硝化处理池，主要为毛刷挂膜材料，之后水匀速进入反应器2，即加有水处理制剂的处理器，处理水经微型泵再循环至甲鱼污水室，整个载水量为65升，水泵调节为24小时循环一次。反应器1温度为室温，反应器2温度控制为30℃。处理结果如表1：
由表可知：经过5天的处理，系统中氨氮的去除率达90.9%，亚硝酸盐氮的去除率92.6%，总氮的去除率为93.7%。

Claims (9)

1.一种利用甲壳素合成PHA的菌株，名称为：假单胞菌YJY25（Pseudomonas sp.YJY25）；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2016075，保藏日期为：2016年02月28日。
2.一种利用甲壳素合成PHA的方法，其特征在于，包括利用甲壳素复合酶降解甲壳素形成酶解产物的步骤、以酶解产物作为碳源培养假单胞菌YJY25的步骤和收集假单胞菌YJY25发酵产物获得PHA的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体操作方法包括：（1）将甲壳素制备成胶体溶液，并调节pH值为5.0~6.5，加入5~20%的复合酶制剂，于35~60℃摇床进行酶降解，降解时间1~10h，降解产物经絮凝，沉淀，过滤即得酶解产物；（2）将假单胞菌YJY2进行活化，然后接种到以步骤（1）中所得到的酶解产物为碳源的培养基中进行培养；（3）步骤（2）得到的培养物经细胞壁破碎、絮凝、过滤沉淀、洗涤干燥，即可获得PHA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，步骤（1）中所得到的酶解产物作为假单胞菌YJY25培养的唯一碳源。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，假单胞菌YJY25的培养条件为温度25~35℃，pH为7.0~7.5，培养时间为48-60h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，假单胞菌YJY25的活化条件为30~35℃，摇床200~250r/min，活化24~48h；活化后菌液以1.0~2.0%（v%）的接种量接入含酶解产物的培养中进行培养。
7.如权利要求2所述的方法制备得到的PHA的应用，其特征在于，用于废水的脱氮处理。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过合成水处理制剂用于废水的脱氮处理。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水处理制剂的组分包括50~100g塑形剂、300~500gPHA粉末、50~100g增效剂。
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