CN106029895A - 瑞舒伐他汀钙及其中间体的生产方法 - Google Patents

瑞舒伐他汀钙及其中间体的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种能够高效、廉价地生产各自具有高纯度的瑞舒伐他汀钙和用于它的中间体的新方法。本方法在工业规模上高效生产高纯度的瑞舒伐他汀钙和用于它的中间体，而不要求使用任何极低温度反应或任何特殊不对称催化剂。

Description

瑞舒伐他汀钙及其中间体的生产方法
技术领域
本发明涉及瑞舒伐他汀钙及用于它的中间体的生产方法。
背景技术
瑞舒伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的抑制剂，并且可用于例如治疗高胆固醇血症和混合性血脂异常。瑞舒伐他汀是(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸的通用名。在治疗中，瑞舒伐他汀作为其钙盐给药。瑞舒伐他汀钙是CRESTOR(注册商标)的商品名，并作为HMG-CoA还原酶抑制剂销售。瑞舒伐他汀钙具有下面的化学式。
专利文献1公开了瑞舒伐他汀、其钠盐和钙盐以及它们的生产方法。根据专利文献1，瑞舒伐他汀及其盐如下获得：将(3R)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-5-氧代-6-三苯基膦烯己酸甲酯与4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-(N-甲基-N-甲磺酰基氨基)-5-嘧啶甲醛缩合以引入具有一个不对称中心的侧链，然后进行3-羟基的去保护，将5-氧代基团不对称还原，并水解。由于这种方法在不对称还原期间需要极低的温度条件(优选为-85℃～-70℃)，因此它完全不是工业上优选的生产方法。
用于引入具有两个不对称中心的侧链的类似方法也是已知的(专利文献2、3等)。由于这些方法在Wittig反应期间也需要极低的温度条件(例如约-75℃)，因此它们完全不是工业上优选的生产方法。
此外，使用光学活性钛催化剂引入不对称中心的方法也是已知的(专利文献4等)。由于这些方法使用昂贵的光学活性催化剂，并且在不对称还原期间需要极低的温度条件(约-80℃～-50℃)，因此它们完全不是工业上优选的生产方法。
非专利文献1和2描述了一种通过二酮基酯衍生物的还原生产二羟基酯衍生物的方法。然而，非专利文献1和2仅仅具体公开了通过有机合成反应的还原，并且仅仅公开了其中二酮基酯衍生物或二羟基酯衍生物是叔丁酯的化合物。
专利文献5和6描述了一种使用羰基还原酶的生产方法作为匹伐他汀的生产方法。然而，专利文献5和6没有提供涉及瑞舒伐他汀的描述。此外，瑞舒伐他汀具有被磺酰基氨基取代的嘧啶环，而匹伐他汀具有喹啉环，其化学结构具有很大差别。
[文献名单]
[专利文献]
专利文献1：JP-B-2648897
专利文献2：WO 2010/047296
专利文献3：WO 2005/042522
专利文献4：WO 2008/065410
专利文献5：WO 2002/063028
专利文献6；WO 2003/078634
[非专利文献]
非专利文献1：IP.com编号：IPCOM000144026D，2006年12月14日
非专利文献2：IP.com编号：IPCOM000145623D，2007年1月19日
发明概述
本发明待解决的问题
由于瑞舒伐他汀的常规生产方法使用极低温度的反应和昂贵的不对称催化剂，因此需要开发更经济的生产方法。本发明的问题是提供一种能够高效、廉价且以高纯度生产瑞舒伐他汀钙和用于它的中间体的新方法。
解决所述问题的手段
本发明人进行了深入研究以试图解决上面提到的问题，并且发现通过使用下述生产方法和/或中间体，可以在经济的反应条件下高效生产具有高纯度的瑞舒伐他汀钙，这导致本发明的完成。
因此，本发明提供了下述方面。
[1]一种由下式(2)所表示的化合物的生产方法：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，所述方法包括：
(i)还原由下式(1)所表示的化合物的步骤：
其中R如在上述式(2)中对R所定义的，-X1和-X2各自独立地是-OH或＝O，并且-X1和/或-X2是＝O，所述步骤包括将所述化合物与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液进行反应。
[2]上述[1]的生产方法，其中上述酶包含下述(A)、(B)或(C)任一者的多肽：
(A)具有源自于Ogataea minuta var.nonfermentans NBRC1473的羰基还原酶(OCR1)(SEQ ID NO：2)的多肽，
(B)由与SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列构成、并具有将上述式(1)所表示的化合物转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽，
(C)包含在SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列中1个或几个氨基酸被置换、缺失或添加的氨基酸序列、并具有将上述式(1)所表示的化合物转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽。
[3]上述[1]的生产方法，其中编码上述酶的基因是包含下面(D)、(E)或(F)中示出的碱基序列的DNA：
(D)SEQ ID NO：1中示出的碱基序列，
(E)在严紧条件下杂交到由与SEQ ID NO：1中示出的碱基序列互补的序列构成的DNA、并且编码具有作用于上述式(1)所表示的化合物并将其转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列，
(F)具有在SEQ ID NO：1中示出的碱基序列中1个或几个碱基被置换、缺失或添加的碱基序列、并且编码具有作用于上述式(1)所表示的化合物并将其转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列。
[4]上述[1]-[3]任一项的生产方法，其中上述步骤(i)在多元醇存在下进行。
[5]一种由下式(1)所表示的化合物的生产方法：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，-X1和-X2各自独立地是-OH或＝O，并且-X1和/或-X2是＝O，所述方法包括：
(ii)将由下式(3)所表示的化合物：
与由下式(4)所表示的化合物在碱存在下进行缩合的步骤：
其中R1是具有1-8个碳原子的直链或支链烷基。
[6]上述[5]的生产方法，其中包括：
(iia)将下式(3)所表示的化合物：
与下式(4a)所表示的化合物在碱存在下进行缩合的步骤：
其中R2是不同于上述R的具有3-8个碳原子的支链烷基；并且
(iib)将在上述步骤(iia)中获得的下式(5)所表示的化合物：
其中R2如对上述式(4a)中的R2所定义，
与由R-OH所表示的醇进行反应的步骤，其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
[7]上述[5]的生产方法，其包括：
(iia)将下式(3)所表示的化合物：
与下式(4a)所表示的化合物在碱存在下进行缩合的步骤：
其中R2是不同于上述R的具有3-8个碳原子的支链烷基；
(iib)将在上述步骤(iia)中获得的下式(5)所表示的化合物：
其中R2如对上述式(4a)中的R2所定义，
与由R-OH所表示的醇进行反应的步骤，其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基；以及
(ia)将具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液作用于由下式(1a)所表示的化合物，以还原所述化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
从而获得由下式(1b)和/或(1c)所表示的化合物的步骤：
其中R如在上述式(1a)中对R所定义，
其中R如在上述式(1a)中对R所定义。
[8]上述[7]的生产方法，其中上述酶包含下述(A)、(B)或(C)中所示的任一多肽：
(A)具有源自于Ogataea minuta var.nonfermentans NBRC1473的羰基还原酶(OCR1)(SEQ ID NO：2)的多肽，
(B)由与SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列构成、并具有将上述式(1)所表示的化合物转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽，
(C)包含在SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列中1个或几个氨基酸被置换、缺失或添加的氨基酸序列、并具有将上述式(1)所表示的化合物转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽。
[9]上述[7]的生产方法，其中编码上述酶的基因是包含下面(D)、(E)或(F)中示出的碱基序列的DNA：
(D)SEQ ID NO：1中示出的碱基序列，
(E)在严紧条件下杂交到由与SEQ ID NO：1中示出的碱基序列互补的序列构成的DNA、并且编码具有作用于上述式(1)所表示的化合物并将其转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列，
(F)具有在SEQ ID NO：1中示出的碱基序列中1个或几个碱基被置换、缺失或添加的碱基序列、并且编码具有作用于上述式(1)所表示的化合物并将其转变成上述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列。
[10]上述[7]-[9]任一项的生产方法，其中上述步骤(ia)在多元醇存在下进行。
[11]一种由下式(1a)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
[12]一种由下式(1b)或(1c)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
[13]一种由下式所表示的化合物的晶体：
其显示出在2θ＝8.7°、16.3°、19.7°、21.2°、21.3°(±0.2°)处具有特征峰的粉末X-射线衍射图案。
[14]一种由下式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的生产方法：
所述方法包括(iiia)将通过上述[1]的生产方法获得的由上述式(2)所表示的化合物用碱水解，并将其与钙化合物反应的步骤：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
[15]上述[14]的生产方法，其中上述步骤(iiia)中的上述水解在极性溶剂与选自醚溶剂、烃溶剂和卤代溶剂的至少一种溶剂的混合溶剂存在下进行。
[16]上述[14]或[15]的生产方法，其中在步骤(iiia)中与所述钙化合物的反应在pH 5～10下开始。
[17]一种由下式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的生产方法：
所述方法包括步骤(iiib)：用碱水解通过上述[1]的生产方法获得的由上述式(2)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
将其用酸处理，将获得的由下式(8)所表示的化合物与胺化合物反应：
将获得的由下式(9)所表示的化合物与碱进行盐交换，并将其与钙化合物进行反应：
其中R3和R4各自独立地是具有1-8个碳原子的烷基。
[18]一种由下式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的生产方法：
所述方法包括步骤(iiic)：用碱水解通过上述[1]的生产方法获得的由上述式(2)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，在存在或不存在酸催化剂的情况下对其进行分子内脱水缩合，并将获得的由下式(10)所表示的化合物与钙化合物进行反应：
[19]一种(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸正丙胺盐的晶体，其显示出在2θ＝19.8°、22.9°(±0.2°)处具有特征峰的粉末X-射线衍射图案。
[20]一种(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸二甲胺盐的晶体，其显示出在2θ＝6.6°、17.0°(±0.2°)处具有特征峰的粉末X-射线衍射图案。
[21]瑞舒伐他汀钙，其包含不少于1ppm并且不超过1500ppm的由下式(11)所表示的化合物：
[22]一种由下式(2)所表示的化合物的纯化方法：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，所述方法包括将所述化合物溶解在有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂中，并将其以15℃/小时或更低的冷却速率冷却，以沉淀由上述式(2)所表示的化合物的晶体。
[23]一种瑞舒伐他汀钙的生产方法，所述方法包括：
(B)将由下式(12)所表示的化合物：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢，转变成由下式(13)所表示的化合物的步骤：
[24]上述[23]的生产方法，其在上述步骤(B)之前，包括步骤(Aa)：通过将由下式(14)所表示的化合物与由下式(15)所表示的化合物的混合物在碱存在下进行水解：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
其中R如上所定义，
将所述混合物转变成由下式(16)所表示的化合物与由上述式(12)所表示的化合物的混合物：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢。
[25]上述[23]或[24]的生产方法，其在所述上述步骤(B)之后，包含(C)除去由上述式(13)所表示的化合物的步骤。
[26]上述[25]的生产方法，其在上述步骤(C)之后，包含(D)将通过上述步骤(C)获得的化合物与钙化合物进行反应的步骤。
[27]一种包含由下式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙的纯化方法：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢，所述方法包括(B)将由式(12)所表示的化合物转变成由下式(13)所表示的化合物的步骤：
[28]上述[27]的纯化方法，其在上述步骤(B)之前包括(Ab)将包含由上述式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙溶解在溶剂中的步骤。
[29]上述[27]或[28]的纯化方法，其在上述步骤(B)之后，包括(C)除去由上述式(13)所表示的化合物的步骤。
[30]上述[29]的纯化方法，其在上述步骤(C)之后，包括(D)将通过上述步骤(C)获得的化合物与钙化合物进行反应的步骤。
[31]瑞舒伐他汀钙，其包含不少于1ppm并且不超过1000ppm的由下式(13)所表示的化合物：
[本发明的效果]
根据本发明的生产方法，可以在经济的条件下并在工业规模上高效生产具有高纯度的瑞舒伐他汀钙和用于它的中间体，而不使用极低温度的反应或昂贵的不对称催化剂。
附图简述
图1示出了在实施例2中获得的化合物(DOXP((E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二氧代-6-庚酸正丙基酯))的粉末X-射线衍射图案，其中竖直轴显示强度，水平轴显示2θ(°)。
图2示出了在实施例2’中获得的化合物的粉末X-射线衍射图案，其中竖直轴显示强度，水平轴显示2θ(°)。
图3示出了在实施例5中获得的化合物(DOLP((3R),(5S),(6E))-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二羟基-6-庚酸正丙基酯))的粉末X-射线衍射图案，其中竖直轴显示强度，水平轴显示2θ(°)。
图4示出了在实施例11中获得的化合物(DOLP)的粉末X-射线衍射图案，其中竖直轴显示强度，水平轴显示2θ(°)。
图5示出了在实施例7中获得的丙胺盐的粉末X-射线衍射图案，其中竖直轴显示强度，水平轴显示2θ(°)。
图6示出了在实施例9中获得的二甲胺盐的粉末X-射线衍射图案，其中竖直轴显示强度，水平轴显示2θ(°)。
实施方式描述
下面详细解释在本说明书中使用的术语。
在本说明书中，“具有1-8个碳原子的一级烷基”意味着甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基。
在本说明书中，“具有1-4个碳原子的一级烷基”意味着甲基、乙基、正丙基、正丁基。
在本说明书中，“具有3-6个碳原子的二级烷基”意味着异丙基、环丙基、仲丁基、1-甲基丁基、1-甲基庚基、1-乙基丙基、1-乙基丁基。
在本说明书中，“具有3-4个碳原子的二级烷基”意味着异丙基、环丙基、仲丁基。
在本说明书中，“具有1-8个碳原子的直链或支链烷基”意味着甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基、异丙基、环丙基、仲丁基、1-甲基丁基、1-甲基庚基、叔丁基、叔戊基。
在本说明书中，“具有3-8个碳原子的支链烷基”意味着异丙基、环丙基、仲丁基、1-甲基丁基、1-甲基庚基、叔丁基、叔戊基。
在本说明书中，“钙化合物”意味着诸如氯化钙、乙酸钙等的化合物，其可以将羧酸转变成其钙盐。优选地，所述钙化合物是氯化钙。
在本说明书中，“胺化合物”意味着诸如正丙胺、异丙胺、二甲胺等的化合物，其可以将羧酸转变成其胺盐。优选地，所述胺化合物是正丙胺或二甲胺。
本发明的化合物也涵盖所述化合物的盐、酸酐、水合物、溶剂化物等。
在本说明书中，“具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶”，是指具有通过不对称还原将含有羰基的化合物中的羰基转变成光学活性醇的活性的酶。
所述“能够立体选择性还原羰基的活性”是否存在，可以通过用通用测定方法测量通过不对称还原将含有羰基的化合物中的羰基转变成光学活性醇的活性来确定。例如，将测量目标酶与由式(1)所表示的化合物进行反应，直接测量从所述由式(1)所表示的化合物转化的由式(2)所表示的化合物的量，由此可以确认所述酶活性。
在本说明书中，“酶”包括纯化的酶(包括部分纯化的酶)、通过常规固定化技术固定化的酶，例如固定化在载体例如聚丙烯酰胺、卡拉胶等上的酶。
在本说明书中，“能够生产具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶的微生物或细胞”(在后文中有时被称为“本发明的微生物或细胞”)没有具体限制，只要它具有“能够立体选择性还原羰基的活性”即可，并且它可以是固有地具有上述活性的微生物或细胞，或者是通过育种被提供有上述活性的微生物或细胞。作为通过育种提供上述活性的手段，可以采用已知方法例如基因重组处理(转化)、突变处理等。作为转化的方法，可以使用诸如目的基因的引入、有机化合物生物合成途径中的酶基因的增强表达、副产物生物合成途径中的酶基因的降低表达等的方法。
对于所述“微生物或细胞”的种类而言，可以提到的是在下面提到的宿主生物体或宿主细胞中描述的那些。也可以使用处于被冷冻状态的“微生物或细胞”。在本说明书中，“能够生产具有所述活性的酶的微生物或细胞”不限于活的微生物或细胞，而是还包括在生物学上死亡但具有酶活性的微生物或细胞。
本发明中的微生物或细胞可以通过在WO 2003/078634中描述的方法来产生。
在本说明书中，对作为“宿主生物体”的生物体的种类没有特别限制，可以提到的是原核生物例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、棒状杆菌(corynebacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)细菌、芽孢杆菌(Bacillus)细菌、根瘤菌(Rhizobium)细菌、乳杆菌(Lactobacillus)细菌、Succinobacillus细菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)细菌、放线杆菌(Actinobacillus)细菌等，真菌例如酵母、丝状酵母等，真核生物例如植物、动物等。其中，优选的是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、酵母和棒状杆菌，特别优选的是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
在本说明书中，对作为“宿主细胞”的细胞的种类没有特别限制，可以使用动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。
在本说明书中，“表达载体”是通过在上面提到的宿主生物体中引入编码具有所需功能的蛋白质的多核苷酸，用于在所述宿主生物体中复制并表达具有所需功能的蛋白质的遗传因子。其实例包括但不限于质粒、病毒、噬粒、粘粒等。优选的表达载体是质粒。
在本说明书中，“转化体”意味着其中已导入上述表达载体，并且已获得显示出与具有所需功能的蛋白质相关的所需性状的能力的微生物或细胞。
在本说明书中，“微生物或细胞的处理过的产物”意味着通过下述过程获得并含有具有所需功能的蛋白质等的产物：培养微生物或细胞，并且1)用有机溶剂等处理所述微生物或细胞，2)将其冷冻干燥，3)将其固定化在载体等上，4)物理或酶法破坏。
在本说明书中，“通过培养微生物或细胞获得的含有酶的培养液”意味着1)微生物或细胞的培养液，2)通过用有机溶剂等处理微生物或细胞的培养液而获得的培养液，或3)其中微生物或细胞的细胞膜被物理或酶法破坏的培养液。
[本发明的生产方法]
下面详细解释本发明的生产方法。在下文中，w/v意味着重量/体积。
如下所示，本发明的生产方法包括用于将由式(1)所表示的化合物转变成由式(2)所表示的化合物的步骤(i)，以及用于转化由式(2)所表示的化合物或由式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的步骤(iiia)、(iiib)((iiib-1)-(iiib-3))或(iiic)((iiic-1)-(iiic-2))。
其中，R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，优选为具有1-4个碳原子的一级烷基或具有3-4个碳原子的二级烷基。作为R，甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基是优选的。其中，为了高效进行步骤(i)，R更优选为正丙基或异丙基，特别优选为正丙基。
-X1和-X2各自独立地是-OH或＝O，并且-X1和/或-X2是＝O。
R3和R4各自独立地是氢原子或具有1-8个碳原子的烷基，优选为氢原子或具有1-4个碳原子的烷基。
如下所示，作为在步骤(i)中使用的由式(1)所表示的化合物的生产方法，本发明的生产方法包括用于将由式(3)所表示的化合物和由式(4)所表示的化合物转变成由式(1)所表示的化合物的步骤(ii)。
此外，作为步骤(ii)的优选实施方式，包括用于将由式(3)所表示的化合物和由式(4a)所表示的化合物转变成由式(5)所表示的化合物的步骤(iia)，和用于将由式(5)所表示的化合物转变成由式(1)所表示的化合物的步骤(iib)。
此外，作为步骤(i)的另一个实施方式，在本发明的生产方法中还包括用于将由式(1a)所表示的化合物转变成由式(1b)所表示的化合物和/或由式(1c)所表示的化合物的步骤(ia)，和用于将由式(1b)所表示的化合物和/或由式(1c)所表示的化合物转变成由式(2)所表示的化合物的步骤(ib)。
其中R、-X1和-X2如上所定义。
R1是具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，优选为具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，更优选为具有1-4个碳原子的一级烷基或具有3或4个碳原子的二级烷基。作为R1，优选的是甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基。其中，R1更优选为正丙基或异丙基，特别优选为正丙基，因为步骤(i)可以高效地进行。
R2是具有3-8个碳原子的支链烷基，并且不同于上述R。R2优选为异丙基、仲丁基、叔丁基、叔戊基，特别优选为叔丁基。
在下文中，详细解释了本发明的生产方法的每个步骤。
步骤(i)：
在步骤(i)中，通过与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞(本发明的微生物或细胞)、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液(在后文中它们有时被合称为“本发明的酶等”)的反应将由式(1)所表示的化合物还原，以给出由式(2)所表示的化合物。
其中，R、-X1和-X2如上所定义。
作为在步骤(i)中使用的酶，可以使用具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列(在后文中有时被称为“OCR1”)或所述氨基酸序列的同源物的酶。具体来说，可以提到的是含有下列(A)、(B)或(C)的多肽或这些多肽的同源物的酶。
(A)具有JP-B-4270918中所描述的源自于Ogataea minuta var.nonfermentansNBRC1473的羰基还原酶(OCR1)(SEQ ID NO：2)的多肽，
(B)由与SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列构成、并具有将由式(1)所表示的化合物转变成由式(2)所表示的化合物的活性的多肽，
(C)包含在SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列中1个或几个氨基酸被置换、缺失或添加的氨基酸序列、并具有将由式(1)所表示的化合物转变成由式(2)所表示的化合物的活性的多肽。
上述(B)的同源物是与SEQ ID NO：2中示出的全长氨基酸序列具有至少80％、优选地85％或更高、更优选地90％或更高、更优选地95％或更高的同源性的蛋白。
上述(C)的同源物具有在SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列中1个或几个氨基酸被缺失、添加或置换的氨基酸序列，只要能够立体选择性还原羰基的活性不被抑制即可。当在本文中使用时，“1个或几个氨基酸”具体来说是20个或更少、优选地10个或更少、更优选地5个或更少的氨基酸。
编码上述酶的基因是包含下面(D)、(E)或(F)中示出的碱基序列或其同源物的DNA：
(D)SEQ ID NO：1中示出的碱基序列，
(E)在严紧条件下杂交到由与SEQ ID NO：1中示出的碱基序列互补的序列构成的DNA，并且编码具有作用于由式(1)所表示的化合物并将其转变成由式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列，
(F)具有在SEQ ID NO：1中示出的碱基序列中1个或几个碱基被置换、缺失或添加的碱基序列，并且编码具有作用于由式(1)所表示的化合物并将其转变成由式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列。
在这里，上述(E)中的“在严紧条件下杂交的碱基序列”意味着使用DNA作为探针在严紧条件下通过菌落杂交方法、噬斑杂交方法或DNA印迹杂交方法获得的DNA的碱基序列。菌落杂交方法和噬斑杂交方法中的严紧条件的实例包括使用固定化有源自于菌落或噬斑的DNA或所述DNA的片段的滤膜，在0.7mol/L～1.0mol/L氯化钠水溶液存在下在65℃下杂交，并用0.1～2×SSC溶液(1×SSC的组成：150mmol/L氯化钠水溶液，15mmol/L柠檬酸钠水溶液)在65℃下清洗滤膜的条件。
每种杂交可以按照《分子克隆实验指南》第二版(Molecular Cloning:ALaboratory Mannual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989)等中描述的方法来进行。
上述(F)的同源物具有在SEQ ID NO：1中示出的碱基序列中1个或几个碱基被缺失、添加或置换的碱基序列，只要能够立体选择性还原羰基的活性不被抑制即可。当在本文中使用时，“1个或几个碱基”具体来说是60个或更少、优选地30个或更少、更优选地15个或更少的碱基。
在步骤(i)中，由于本发明的酶等在操作性能上优越并且易于添加到反应体系，因此它也可以以冷冻状态使用。当使用冷冻的本发明的酶等时，对其形状没有特别限制，并且例如可以使用棱柱形、圆柱形、块状、球形等。
在步骤(i)中，作为反应底物的由式(1)所表示的化合物通常以0.01％w/v～20％w/v、优选地0.1％w/v～10％w/v的底物浓度使用。反应底物可以在反应开始时立即添加。当底物被酶抑制时，酶也可以连续或间歇地添加以减少其影响或提高得到的产物的积累浓度。
步骤(i)优选地在辅酶NAD(P)+或NAD(P)H存在下进行。在这种情况下，上述辅酶优选地以通常0.001mmol/L～100mmol/L、优选地0.01mmol/L～10mmol/L的浓度添加。
当添加上述辅酶时，在反应体系中将从NAD(P)H产生的NAD(P)+再生成NAD(P)H是优选的，因为可以提高生产效率。再生方法的实例包括：
1)利用本发明中的微生物或细胞本身从NAD(P)+产生NAD(P)H的能力、即NAD(P)+还原能力的方法，
2)包括向反应体系添加下述一者或多者的方法：具有从NAD(P)+产生NAD(P)H的能力的微生物或其处理过的产物，或可用于再生NAD(P)H的酶，例如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等(在后文中被称为“再生酶”)，
3)在生产本发明中的微生物或细胞等时包括在宿主生物体或宿主细胞中同时引入一种或多种上述再生酶基因的方法。
在上述1)的方法中，优选地向反应体系添加葡萄糖、乙醇、2-丙醇或甲酸等。
在上述2)的方法中，可以使用具有生产上述再生酶的能力的微生物，微生物的处理过的产物例如用丙酮处理的或冷冻干燥处理的、物理或酶法破坏的微生物等，作为粗产物或纯化产物获得的酶级分，以及固定化在载体例如聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶等上之后的这些物质等，或者也可以使用可商购的酶。
在这种情况下，所使用的上述再生酶的量，是提供与本发明的具有立体选择性还原羰基的能力的酶的羰基还原活性相比通常为0.01倍至100倍、优选地约0.5倍至20倍的酶活性的量。
当作为上述再生酶的底物的化合物例如当利用葡萄糖脱氢酶时的葡萄糖、当利用甲酸脱氢酶时的甲酸、当利用醇脱氢酶时的乙醇或异丙醇等的添加也是必需的时，其添加量相对于作为反应起始原料的由式(1)所表示的化合物一般为0.1当量-20当量，优选为1当量-10当量。
在上述3)的方法中，可以使用将上述再生酶的DNA与编码步骤(i)中使用的酶的DNA一起并入到染色体中的方法，将两类DNA引入到单个表达载体中并转化宿主生物体或细胞的方法，或将两类DNA引入到分开的表达载体中并转化宿主生物体或细胞的方法。在将两类DNA引入到分开的表达载体中并转化宿主生物体或细胞的方法中，需要考虑到两种表达载体之间的不相容性来选择表达载体。
当多个基因被引入到单一表达载体中时，将涉及表达控制的区域例如启动子和终止子等连接到每个基因，以及作为含有多个顺反子的操纵子例如乳糖操纵子来表达的方法，也是可能的。
步骤(i)在水性介质中或水性介质与有机溶剂的混合物中进行，其含有由式(1)所表示的化合物和上述酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液，以及在需要时各种不同的辅酶(其再生系统，即更优选地所述辅酶可以被再生)。由式(1)所表示的化合物可以通过下文提到的方法来生产。
作为水性介质，可以提到的是水和缓冲液例如磷酸钾缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
作为有机溶剂，可以使用由式(1)所表示的化合物在其中显示出高溶解性的溶剂，例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、正庚烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇等。其中，二甲基亚砜、甲醇、乙醇作为有机溶剂是优选的，因为由式(1)所表示的化合物显示出高溶解性。此外，二甲基亚砜是更加优选的，因为转化率高。
步骤(i)也可以在多元醇例如甘油、乙二醇、丙二醇、赤藓糖醇、肌醇、山梨糖醇、木糖醇等存在下进行。上述多元醇可以是聚合物或衍生物，可以使用其一种，或者也可以使用其两种或更多种的混合物。当步骤(i)在多元醇存在下进行时，转化率倾向于提高。其中，甘油是优选的，因为假定它通过保持酶的构象来维持酶活性，并且易于获得。所使用的甘油的量优选地不少于40g/L，更优选地不少于170g/L，并且优选地不超过600g/L，更优选地不超过400g/L。
下述步骤(ia)和/或步骤(ib)也可以在上述多元醇存在下进行。
步骤(i)通常在4℃～70℃、优选地20℃～60℃的温度下，通常在pH 3～11、优选地pH 4～8下进行。反应时间通常为0.5小时～48小时，优选为0.5小时～24小时。它也可以利用膜反应器等来进行。
在步骤(i)中获得的由式(2)所表示的化合物可以通过如下纯化：通过离心、过滤等分离细胞、多肽等，调整到适合的pH，用有机溶剂例如己烷、乙酸乙酯、甲苯等萃取，并通过柱层析、结晶等进行适合的纯化组合。
当由式(2)所表示的化合物通过结晶进行纯化时，作为可以使用的有机溶剂，可以使用由式(2)所表示的化合物在其中显示出高溶解性的溶剂，例如烃溶剂如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如氯苯、二氯苯等，醚溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(THF)、环戊基甲基醚(CPME)等，醇类溶剂例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等。这些有机溶剂可以单个使用，并且也可以使用这些有机溶剂与水的混合溶剂。
当由式(2)所表示的化合物通过结晶进行纯化时，由上述式(2)所表示的化合物的晶体优选地如下进行沉淀：将由上述式(2)所表示的化合物溶解在有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂中，然后将其以15℃/小时或更低的冷却速率冷却(这个通过冷却进行晶体沉淀的步骤在后文中被称为“冷却步骤”)。
在所述冷却步骤中，冷却开始的温度优选为15℃～60℃，更优选为20℃～55℃。
所述冷却步骤中的冷却速率优选地不超过15℃/小时，更优选地不超过9℃/小时，更优选地不超过6℃/小时，特别优选地不超过5℃/小时。通过这种方式，可以提高获得的由式(2)所表示的化合物的纯度。
在所述冷却步骤中可以改变所述冷却速率。具体来说，在优选地不超过45℃、更优选地不超过40℃的温度范围内缓慢冷却是优选的。具体来说，冷却速率更优选为9℃/小时，更优选地不超过6℃/小时，特别优选地不超过5℃/小时。
在将由上述式(2)所表示的化合物溶解在上述溶剂中之后和上述冷却步骤之前优选包括老化的步骤(在后文中被称为“老化步骤”)。所述老化步骤优选地具有高温下的老化步骤和低温老化步骤，在后者中老化在比高温老化步骤中更低的温度下进行。在所述老化步骤中，对高温老化步骤和低温老化步骤的顺序没有特别限制，并且高温老化步骤优选地在低温老化步骤之后进行。此外，如果需要，低温老化步骤和高温老化步骤可以重复几次。
所述老化步骤中的低温老化步骤是其中在将由上述式(2)所表示的化合物溶解在上述有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂中之后，并且在低于在上述有机溶剂等中的溶解温度并低于下述高温老化步骤的老化温度的温度下进行老化的步骤。
所述低温老化步骤中的老化温度优选地比在上述有机溶剂等中的溶解温度低不少于1℃，更优选地不少于5℃，特别优选地不少于10℃。具体的老化温度优选为0℃～59℃，更优选为5℃～50℃。
在所述低温老化步骤中，可以在中途改变温度。当温度被改变时，例如，老化可以首先在相对高的温度(例如35℃～45℃)下进行5分钟～12小时，随后在相对低的温度(例如30℃～40℃)下进行10分钟～5小时。
所述低温老化步骤优选地进行10分钟～24小时，更优选地20分钟～10小时。
在所述低温老化步骤中，不仅仅只是保持温度，而是在需要时可以搅拌溶液或者可以添加种晶。
所述老化步骤中的高温老化步骤是其中在比上述低温老化步骤的老化温度更高的温度下进行老化的步骤。
所述高温老化步骤中的老化温度优选地比上述低温老化步骤中的老化温度高不少于1℃、更优选地不少于3℃、特别优选地不少于5℃。具体的老化温度优选为20℃～60℃，更优选为25℃～55℃。一般来说，上述冷却步骤从所述高温老化步骤的老化温度(当所述高温老化步骤进行多次时，高温老化步骤的最终温度)开始。在所述高温老化步骤中，温度也可以在中途改变。
所述高温老化步骤优选地进行10分钟～24小时，更优选地20分钟～10小时。
在所述高温老化步骤，不仅仅只是保持温度，而是在需要时可以搅拌所述溶液。
通过形成这种老化步骤，可以获得提高过滤效率和提高目的产物的纯度的效果。
当由式(2)所表示的化合物通过结晶纯化时，优选地在通过将由上述式(2)所表示的化合物溶解在有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂中之后，进行上述老化步骤(上述高温老化步骤和上述低温老化步骤)和上述冷却步骤来进行纯化。
通过用这种方法进行结晶，可以进一步提高获得的晶体的纯度。
步骤(i)也可以在如下所示的步骤(ia)和步骤(ib)的两个步骤中进行。
步骤(ia)：
在步骤(ia)中，通过与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液反应，将由作为其中-X1和-X2是＝O的式(1)的式(1a)所表示的化合物还原，以给出由作为其中-X1是–OH并且-X2是＝O的式(1)的式(1b)所表示的化合物和/或由作为其中-X1是＝O并且-X2是-OH的式(1)的式(1c)所表示的化合物。
由式(1a)所表示的化合物可以通过与步骤(i)中类似的方法来还原。
其中R如上所定义。
在步骤(ia)中获得的由式(1b)和/或(1c)所表示的化合物可以在进行步骤(ib)之前通过例如结晶来纯化。
步骤(ib)：
在步骤(ib)中，通过使用上述具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液，将在步骤(ia)中获得的由式(1b)所表示的化合物和/或由式(1c)所表示的化合物还原，以给出由式(2)所表示的化合物。
由式(1b)所表示的化合物和/或a由式(1c)所表示的化合物可以通过与步骤(i)中类似的方法来还原。
其中R如上所定义。
在步骤(i)或步骤(ia)和(ib)中获得的由式(2)所表示的化合物中，由于其中R是正丙基或异丙基的式(2)的化合物具有高的结晶性，因此它可以以高纯度获得。
其中R是正丙基的式(2)的化合物的晶体具有例如下面示出的粉末X-射线衍射图案(下面示出的粉末X-射线衍射图案在下述实施例5中获得)。
表1
2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度
7.7 16 15.0 12 21.1 100 25.1 5
8.4 65 16.1 26 22.1 8 26.4 6
11.2 8 16.8 36 22.5 13 28.5 8
12.6 32 18.1 7 24.2 6 29.5 6
12.9 9 18.4 11 24.4 9 - -
14.6 11 19.5 35 24.7 10 - -
也就是说，其中R是正丙基的式(2)的化合物的晶体具有在2θ＝8.4°、16.1°、21.1°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案。此外，在2θ＝7.7°、8.4°、16.1°、19.5°、21.1°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案是优选的，在2θ＝7.7°、8.4°、15.0°、16.1°、19.5°、21.1°、22.5°、(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案是更加优选的。此外，在2θ＝16.3°、19.7°、21.3°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案也是优选的，在2θ＝7.9°、16.3°、19.7°、21.3°、22.7°、24.9°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案是更加优选的。
步骤(ii)：
步骤(ii)是用于制备在步骤(i)中使用的由式(1)所表示的化合物的步骤。具体来说，将由式(3)所表示的化合物和由式(4)所表示的化合物在碱存在下进行缩合。
其中，R1、R、-X1和-X2如上所定义。
作为碱，可以使用金属氢化物例如氢化钠、氢化钾、氢化钙等，金属酰胺例如氨基钠等，有机锂例如丁基锂、二异丙基酰胺锂等，Grignard试剂例如叔丁基氯化镁等，烷氧化物例如乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等，具体来说，氢化钠、氨基钠和叔丁醇钠是优选的。所使用的碱的量相对于由式(3)所表示的化合物一般为1当量-6当量，优选为1.5当量-6当量。
所述反应可以使用溶剂来进行。尽管对溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用烃溶剂如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如氯苯、二氯苯等，醚溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(THF)、环戊基甲基醚(CPME)等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等。可以使用其一种，或者也可以使用其两种或更多种的混合物，并且也可以使用极性溶剂与非极性溶剂的混合物。
相对于1g由式(3)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为5mL～100mL，优选为5mL～30mL。
反应温度一般为-10℃～200℃，优选为-5℃～40℃。
反应时间一般为0.1小时～200小时，优选为1小时～24小时。
由式(3)所表示的化合物可以通过例如JP-B-2648897中所描述的方法来生产，并且也可以使用可商购品。
由式(4)所表示的化合物可以按照已知方法例如在SYNTHETIC COMMUNICATIONS,18(7),735-739(1988)中描述的方法和本说明书参考例1中描述的方法来生产，并且也可以使用可商购品。
由式(4)所表示的化合物具有优选地不超过4、更优选地不超过3的pH。由式(4)所表示的化合物的pH是通过将由式(4)所表示的化合物与水以1:1(体积比)混合并测量水性层的pH而获得的值。当所述pH值过高(例如高于4的pH)时，如果需要，可以使用酸例如乙酸、盐酸、硫酸等来降低它。结果，提高了由式(4)所表示的化合物的保存稳定性，并且可以减少反应期间的杂质形成。
当式(4a)中的R1是与式(1)中的R不同的基团时，通过将通过上述缩合获得的化合物与由R-OH表示的醇进行反应，来获得由式(1)所表示的化合物。在这一步骤中，可以使用与下述步骤(iib)中相似的方法。
特别优选地，步骤(ii)包括下列步骤(iia)和(iib)。
步骤(iia)：
在步骤(iia)中，通过将由式(3)所表示的化合物与由作为其中R1是R2的式(4)的式(4a)所表示的化合物在碱存在下进行缩合，来获得由式(5)所表示的化合物。
其中R2如上所定义。
作为碱，可以使用金属氢化物例如氢化钠、氢化钾、氢化钙等，金属酰胺例如氨基钠等，有机锂例如丁基锂、二异丙基酰胺锂等，Grignard试剂例如叔丁基氯化镁等，烷氧化物例如乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等，具体来说，氨基钠、叔丁醇钠和氢化钠是优选的。所使用的碱的量相对于由式(3)所表示的化合物一般为1当量-6当量，优选为1.5当量-6当量。
所述反应可以使用溶剂来进行。尽管对溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用烃溶剂如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如氯苯、二氯苯等，醚溶剂例如叔丁基甲基醚、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等。可以使用其一种，或者也可以使用其两种或更多种的混合物，并且也可以使用极性溶剂与非极性溶剂的混合物。
相对于1g由式(3)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为5mL～100mL，优选为5mL～30mL。
反应温度一般为0℃～200℃，优选为0℃～40℃。
反应时间一般为0.1小时～200小时，优选为1小时～24小时。
由于由式(5)所表示的化合物具有高的结晶性，因此它可以不进行复杂的纯化例如层析等以高纯度获得。
步骤(iib)：
将由式(5)所表示的化合物与由R-OH表示的醇进行反应，以给出由式(1a)所表示的化合物。
在这里，R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，优选为具有1-4个碳原子的一级烷基或具有3-4个碳原子的二级烷基。作为R，甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基是优选的，正丙基或异丙基是更加优选的，正丙基是特别优选的。
相对于1g由式(5)所表示的化合物，所使用的由R-OH所表示的醇的量一般为1mL～100mL，优选为1mL～10mL。
其中R2、R、-X1和-X2如上所定义。
在由式(1)所表示的化合物中，由下式(1a)所表示的化合物是特别优选的。
其中R如上所定义。
所述反应也可以在溶剂中进行。尽管对溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用酯溶剂例如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯等，非极性溶剂如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等，醚溶剂例如叔丁基甲基醚(MTBE)、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等。可以使用其一种，或者也可以使用其两种或更多种的混合物，并且也可以使用极性溶剂与非极性溶剂的混合物。此外，由R-OH所表示的醇本身也可以用作溶剂。
相对于1g由式(5)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为1mL～100mL，优选为1mL～10mL。
反应温度一般为30℃～150℃，优选为40℃～110℃。
反应时间一般为1小时～48小时，优选为2小时～24小时。
在如上所述获得的由式(1)所表示的化合物、特别是由式(1a)所表示的化合物中，其中R是正丙基或异丙基的式(1a)的化合物具有高的结晶性，它可以以高纯度获得。
其中R是正丙基的式(1a)的化合物的晶体优选地具有例如下面示出的粉末X-射线衍射图案(下面示出的粉末X-射线衍射图案在下述实施例2中获得)。
表2
2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度
8.3 32.3 17.4 20.5 23.9 18.7 30.3 4
11.1 21.5 17.7 29.1 24.9 32.5 31.5 11.5
12.1 6.4 18.9 19.2 26.2 9.7 31.8 8.9
13.0 25.3 19.2 9.9 26.6 8.4 33.5 7.7
13.9 23.1 20.6 33.7 27.5 7 37.8 6
15.2 11.7 21.0 100 28.1 7 - -
16.5 41.5 22.0 33.1 28.6 13.5 - -
也就是说，它具有在2θ＝8.3°、16.5°、21.0°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案。此外，在2θ＝8.3°、16.5°、21.0°、22.0°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案是优选的，并且在2θ＝8.3°、13.0°、13.9°、16.5°、17.7°、21.0°、22.0°、24.9°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案是更加优选的。此外，在2θ＝16.7°、17.6°、20.8°、22.1°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案也是优选的。
此外，其中R是正丙基的式(1a)的化合物的晶体还优选地具有下面示出的粉末X-射线衍射图案(下面示出的粉末X-射线衍射图案在下述实施例2’中获得)。
表3
2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度
5.2 6 15.5 5 20.6 17 27.1 5
6.5 6 16.5 30 21.5 63 29.7 6
7.9 7 17.5 8 21.9 10 30.7 5
9.8 15 17.9 5 23.7 19 31.0 5
10.3 100 18.4 46 24.1 5 31.5 5
11.8 57 19.0 19 25.3 10 35.7 8
14.1 35 19.5 21 26.1 12 38.2 5
也就是说，它具有在2θ＝10.3°、11.8°、21.5°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案。此外，在2θ＝10.3°、11.8°、14.1°、18.4°、21.5°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案是优选的，并且在2θ＝10.3°、11.8°、14.1°、16.5°、18.4°、19.0°、19.5°、20.6°、21.5°、23.7°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案是更加优选的。此外，在2θ＝16.7°、19.2°、20.8°、21.3°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案也是优选的。
步骤(iiia)：
在步骤(iiia)中，将由式(2)所表示的化合物用碱水解，与钙化合物反应，并分离获得的产物，由此获得由式(6)示出的瑞舒伐他汀钙。
其中R如上所定义。
在步骤(iiia)中，首先将由式(2)所表示的化合物用碱水解。
作为碱，可以使用氢氧化钠、氢氧化钾等，具体来说，氢氧化钠是优选的。相对于由式(2)所表示的化合物，所使用的碱的量一般为0.9当量-2当量，优选为1当量-1.5当量。
所述反应可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用烃溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等，醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、水等。此外，这些极性溶剂与选自醚溶剂、烃溶剂和卤代溶剂的至少一种的混合溶剂是优选的，并且极性溶剂与醚溶剂的混合溶剂是优选的。使用这种混合溶剂，通过水解获得的得到的产物(例如钠盐)被转移到水性层，并且杂质被转移到有机溶剂层，由此得到的产物和杂质优选地可以被容易地分离开。
当使用极性溶剂与选自醚溶剂、烃溶剂和卤代溶剂的至少一种的混合溶剂作为溶剂时，在上面提到的溶剂中，水或水与其他极性溶剂(例如THF、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜等)的混合溶剂优选地作为极性溶剂。MTBE和CPME优选地作为醚溶剂，环己烷和甲苯优选地作为烃溶剂，并且二氯甲烷优选地作为卤代溶剂。其中，由于溶剂的毒性低，水与MTBE的混合溶剂或水与CPME的混合溶剂被特别优选地使用。
相对于1g由式(2)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为1mL～100mL，优选为2mL～50mL，更优选为5mL～30mL。
反应温度一般为-10℃～50℃，优选为0℃～40℃。
反应时间一般为1小时～48小时，优选为2小时～24小时。
反应期间的pH优选为pH 8或更高，更优选为pH 9或更高。在这一范围内，可以提高反应效率。其上限优选地不超过pH 13。
在由式(2)所表示的化合物水解后，可以将它与下述钙化合物进行反应。在需要时，可以进行清洗、萃取、浓缩、干燥等，并且例如它可以作为钠盐被分离。然后，将通过上述水解获得的得到的产物与钙化合物反应，以给出由式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙。
作为所述钙化合物，可以使用氯化钙、乙酸钙等，并且由于其在水中的高溶解性，乙酸钙是特别优选的。
相对于由式(2)所表示的化合物，所使用的钙化合物的量一般为0.4当量-3当量，优选为0.5当量-2当量，更优选为0.5当量-1.5当量。
在与钙化合物的反应中，尽管对溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用酯溶剂例如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯等，醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、水等。其中，水或水与水之外的极性溶剂的混合溶剂是优选的，并且水是更加优选的。水之外的极性溶剂的实例包括THF、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜等。
相对于1g的由式(2)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为1mL～100mL，优选为2mL～50mL，更优选为5mL～30mL。
反应温度一般为-10℃～50℃，优选为0℃～40℃，更优选为5℃～25℃。
反应时间一般为0.01小时～48小时，优选为0.5小时～24小时。
反应期间的pH一般为pH 5～pH 13，优选为pH 6～pH 12。反应开始时的pH优选为pH 5～pH 10，更优选为pH 6～pH 9。通过调整pH以落于这个范围之内，便于清洗在反应后获得的化合物，并且可以减少获得的化合物中包含的杂质的量。
如果需要，可以对在步骤(iiia)中获得的瑞舒伐他汀钙进行老化、冷却、干燥、粉碎、压碎等。
步骤(iiib)：
在步骤(iiib)中，将由式(2)所表示的化合物用碱水解，用酸处理，将获得的由式(8)所表示的化合物与胺化合物反应，将获得的由式(9)所表示的化合物用碱水解并与钙化合物反应，由此获得由式(6)所示的瑞舒伐他汀钙。
具体来说，将由式(2)所表示的化合物用碱水解，以给出由式(7)所表示的化合物。
其中R如上所定义，并且X是钠或钾等。
作为碱，可以使用氢氧化钠、氢氧化钾等，并且具体来说，氢氧化钠是优选的。相对于由式(2)所表示的化合物，所使用的碱的量一般为0.9当量-2当量，优选为1当量-1.5当量。
作为钙化合物，可以使用氯化钙、乙酸钙等，并且氯化钙是特别优选的。相对于由式(2)所表示的化合物，所使用的钙化合物的量一般为0.4当量-1.5当量，优选为0.5当量-1.2当量。
所述反应可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用酯溶剂例如乙酸乙酯、乙酸甲酯等，非极性溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷等，卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等，醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、水等，并且这些极性溶剂与非极性溶剂的混合物是优选的。相对于1g由式(2)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为1mL～100mL，优选为5mL～30mL。
反应温度一般为-10℃～50℃，优选为0℃～40℃。
反应时间一般为1小时～48小时，优选为2小时～24小时。
然后，将由式(7)所表示的化合物用酸处理，以给出由式(8)所表示的化合物。
其中X如上所定义。
作为酸，可以使用盐酸、硫酸等，并且盐酸是特别优选的。对所使用的酸的量没有特别限制，只要可以进行酸化即可。相对于用于水解的碱，它一般为1当量-3当量，优选为1当量-1.5当量。
反应温度一般为-10℃～50℃，优选为0℃～30℃。
反应时间一般为0.5小时～5小时。
此外，向由式(8)所表示的化合物添加胺化合物，以给出由式(9)所表示的胺盐。具有高结晶性的胺盐可以提高目的产物瑞舒伐他汀钙的纯度。
其中R3和R4如上所定义。
作为胺化合物，可以使用正丙胺、异丙胺、二甲胺等，并且正丙胺和二甲胺是特别优选的。相对于由式(8)所表示的化合物，所使用的胺化合物的量一般为1当量-3当量，优选为1当量-2当量。
所述反应也可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用酯溶剂例如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯等，卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等，醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈等。可以使用其一种，或者可以使用其两种或更多种的混合物，并且也可以使用极性溶剂与非极性溶剂的混合物。
反应温度一般为-10℃～50℃，优选为0℃～30℃。
反应时间为0.5小时～5小时。
具体来说，作为正丙胺盐或二甲胺盐的由式(9)所表示的化合物是优选的，因为它具有高的结晶性并且可以以高纯度获得。
(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸的正丙胺盐具有例如下面示出的X-射线衍射图案(下面示出的粉末X-射线衍射图案在下文描述的实施例7中获得)。
[表4]
2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度
6.0 9 16.8 18 25.3 17 37.6 11
6.4 4 17.8 9 25.6 16 38.9 9
8.1 0 18.5 20 26.8 31 41.0 8
10.0 18 19.1 16 28.1 15 42.0 8
10.8 33 19.8 64 29.1 12 43.7 8
11.8 1 20.9 48 30.3 19 45.7 9
12.8 8 21.6 15 32.6 8 46.8 9
13.7 12 22.9 100 34.2 11 48.6 5
15.3 39 23.8 9 35.4 12 51.2 4
16.3 15 24.4 11 36.5 7 52.7 5
也就是说，它具有在2θ＝19.8°、22.9°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案。此外，在2θ＝10.8°、15.3°、19.8°、20.9°、22.9°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案是优选的，并且在2θ＝10.0°、10.8°、15.3°、16.8°、18.5°、19.8°、20.9°、22.9°、26.8°、30.3°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案是更加优选的。此外，它可以具有在2θ＝26.8°、29.1°、30.3°、38.9°、45.7°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案，并且进一步任选地具有在2θ＝19.8°、22.9°、26.8°、29.1°、30.3°、34.2°、36.5°、38.9°、45.7°、46.8°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案。
此外，(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸的二甲胺盐具有例如下面示出的粉末X-射线衍射图案(下面示出的粉末X-射线衍射图案在下文描述的实施例9中获得)。
[表5]
2θ 相对强度 2θ 相对强度
6.6 100 18.9 34
10.1 60 19.4 28
10.4 18 19.6 24
11.8 12 20.5 36
12.9 14 21.2 24
13.5 62 22.4 18
17.0 74 24.0 22
17.9 16 27.7 12
18.3 46 28.8 12
也就是说，它具有在2θ＝6.6°、17.0°(±0.2°)处显示出特征峰的粉末X-射线衍射图案。此外，在2θ＝6.6°、10.1°、13.5°、17.0°、18.3°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案是优选的。具体来说，在2θ＝6.6°、10.1°、13.5°、17.0°、18.3°、18.9°、19.4°、19.6°、20.5°、21.2°(±0.2°)处显示出峰的粉末X-射线衍射图案是更加优选的。
然后，将由式(9)所表示的胺盐与碱进行盐交换，以给出由式(7)所表示的化合物。
其中R3、R4和X如上所定义。
作为碱，可以使用氢氧化钠、氢氧化钾等，并且氢氧化钠是特别优选的。相对于由式(9)所表示的化合物，所使用的碱的量一般为1当量-3当量，优选为1当量-2当量。
所述反应可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、水等。可以使用其一种，或者可以使用其两种或更多种的混合物，并且也可以使用极性溶剂与非极性溶剂的混合物。
反应温度一般为-10℃～50℃，优选为0℃～30℃。
反应时间一般为0.5小时～10小时。
此外，将由式(7)所表示的化合物与钙化合物反应，以给出由式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙。
其中X如上所定义。
作为钙化合物，可以使用氯化钙、乙酸钙等，并且氯化钙是特别优选的。相对于由式(7)所表示的化合物，所使用的钙化合物的量一般为0.5当量-3当量，优选为0.6当量-2.8当量。
所述反应可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、水等。可以使用其一种，或者也可以使用其两种或更多种的混合物，并且也可以使用极性溶剂与非极性溶剂的混合物。
反应温度一般为0℃～200℃，优选为20℃～110℃。
反应时间一般为0.01小时～200小时，优选为0.5小时～24小时。
步骤(iiic)：
在步骤(iiic)中，将由式(2)所表示的化合物用碱水解，以给出由式(7)所表示的化合物，将所述由式(7)所表示的化合物在存在或不存在酸催化剂的情况下进行分子内脱水缩合，并将获得的由式(10)所表示的化合物与钙化合物反应，以给出由式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙。
其中R和X如上所定义。
可以将与步骤(iiib)中类似的方法用于其中将由式(2)所表示的化合物用碱水解以给出由式(7)所表示的化合物的步骤。
在所述将由式(7)所表示的化合物在存在或不存在酸催化剂的情况下进行分子内脱水缩合以给出由式(10)所表示的化合物的步骤中，可以使用对甲苯磺酸、对甲苯磺酸吡啶鎓、硫酸、盐酸等作为酸催化剂，并且盐酸和对甲苯磺酸是特别优选的。相对于由式(7)所表示的化合物，所使用的酸催化剂的量一般为0.001当量-0.5当量，优选为0.01当量-0.1当量。
上述分子内脱水缩合可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但可以使用酯溶剂例如乙酸乙酯、乙酸甲酯等，非极性溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等，醚溶剂例如MTBE、THF等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等，并且极性溶剂与非极性溶剂的混合物是优选的。相对于1g由式(7)所表示的化合物，所使用的溶剂的量一般为1mL～100mL，优选为5mL～50mL。
反应温度一般为0℃～200℃，优选为20℃～110℃。
反应时间一般为1小时～72小时，优选为1小时～24小时。
可以将与步骤(iiib)中类似的方法用于其中将由式(10)所表示的化合物与钙化合物反应以给出由式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的步骤。
如果需要，本发明的瑞舒伐他汀钙的生产方法优选地还包括下列步骤(B)。在步骤(B)中，
(B)将由下式(12)所表示的化合物：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢，转变成由下式(13)所表示的化合物：
具体来说，步骤(B)可以高效地除去由上述式(12)所表示的杂质，并且可以进一步提高瑞舒伐他汀钙的纯度。当进行上述步骤(iiia)时，包括步骤(B)是特别优选的。
在下述式(16)和上述式(12)中，M优选为碱金属元素。在这里，所述碱金属元素优选为锂、钠或钾，特别优选为钠。
本发明的生产方法优选地靶向在晚些时候标明的由式(16)所表示的化合物，其在通过HPLC(高效液相色谱)(检测波长：UV 245nm)测量时，含有不低于0.01面积％、更优选地不低于0.05面积％的由上述式(12)所表示的化合物。尽管对上限没有特别限制，只要可以获得本发明的效果即可，但它一般不超过99面积％、优选地不超过50面积％、更优选地不超过25面积％、特别优选地不超过5面积％、最优选地不超过1面积％。在本发明的特别优选的实施方式中，在晚些时候标明的由式(16)所表示的化合物含有不低于0.01面积％并且不超过5面积％的由上述式(12)所表示的化合物。
在上述步骤(B)之前，本发明的生产方法优选地包括(Aa)通过在碱存在下水解，将由下式(14)所表示的化合物与由下式(15)所表示的化合物的混合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
其中R如上所定义，
转变成由下式(16)所表示的化合物和由上述式(12)所表示的化合物的混合物的步骤：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢。
在上述式(14)和(15)中，R优选为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、仲丁基、正丁基，更优选为甲基、乙基、异丙基、正丙基，特别优选为乙基、异丙基、正丙基。
此外，在上述步骤(B)之后优选地包括(C)除去由上述式(13)所表示的化合物的步骤。
此外，在上述步骤(C)之后优选地包括(D)将在上述步骤(C)中获得的化合物与钙化合物进行反应的步骤。
本发明的生产方法的步骤(Aa)和(B)-(D)，将在下文中对每个步骤进行解释。
步骤(Aa)：
在步骤(Aa)中，通过在碱存在下进行水解，将由上述式(14)所表示的化合物与由上述式(15)所表示的化合物的混合物转变成由上述式(16)所表示的化合物与由上述式(12)所表示的化合物的混合物。在这种情况下，由上述式(14)所表示的化合物被转变成由上述式(12)所表示的化合物，并且由上述式(15)所表示的化合物被转变成由上述式(16)所表示的化合物。
步骤(Aa)的详细情况在上述步骤(iiia)的解释中描述。
步骤(B)：
在步骤(B)中，由上述式(12)所表示的化合物被转变成由上述式(13)所表示的化合物。
对反应条件等没有特别限制，只要由上述式(12)所表示的化合物可以被转变成由上述式(13)所表示的化合物即可。步骤(B)中的反应条件的优选实例在下文中描述。
步骤(B)优选地在溶剂存在下进行。在这里，溶剂的实例包括醚类(甲基叔丁基醚、THF、环戊基甲基醚等)、乙酸酯类(例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯等)、酰胺类(例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等)、烃类(例如甲苯、环己烷等)、醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇等)、水等。其中，甲基叔丁基醚、THF、乙酸乙酯、甲苯和水是优选的。
反应温度一般不低于30℃，优选地不低于40℃，并且一般不超过130℃，优选地不超过100℃。为了高效地进行所述反应，如有需要优选地进行加热。在本发明的特别优选的实施方式中，步骤(B)在不低于30℃并且不超过130℃的条件下进行。
尽管对步骤(B)的pH条件没有特别限制，但为了加速反应，酸性条件或碱性条件是优选的。
当使用酸性条件时，所述步骤优选地在不低于pH 0且不高于pH 3下进行。可以在这里使用的酸的实例包括盐酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等，并且盐酸或硫酸是优选的。
当使用碱性条件时，所述步骤优选地在不低于pH 10且不高于pH14下进行。可以在这里使用的碱的实例包括碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾等)、氢氧化钙、碳酸钙、三乙胺、二异丙基乙基胺等。其中，氢氧化钠和氢氧化钾是优选的。
尽管反应时间随着其他条件而变，但它一般不少于1小时，优选地不少于2小时，并且一般不超过48小时，优选地不超过24小时。
为了缩短上述反应时间，如果需要，优选地在步骤(B)中搅动所述反应溶液。
在这一步骤中，通常，由上述式(16)所表示的化合物不被特别转化。
步骤(C)：
在步骤(C)中，从步骤(B)中获得的混合物中除去由上述式(13)所表示的化合物。当在本文中使用时，除去不必定意味着完全除去，只需要除去其大部分以便可以提高获得的化合物的纯度即可。当在这一步骤中除去由上述式(13)所表示的化合物时，由上述式(16)所表示的化合物剩余。
对用于这一步骤的手段和反应条件没有特别限制，只要可以除去由上述式(13)所表示的化合物即可。步骤(C)的优选实例在下文中描述。
在步骤(C)中，优选地通过在碱性条件下用有机溶剂萃取来除去由上述式(13)所表示的化合物。
可以在这里使用的有机溶剂的实例包括醚类(例如甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚(CPME)等)，酯类例如乙酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等，甲苯，酮类例如甲乙酮等。其中，甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、甲乙酮和乙酸乙酯是优选的。
在碱性条件下优选地意味着不低于pH 8且不高于pH 14，更优选地不低于pH 10且不高于pH 14。
可以在这里使用的碱的实例包括碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾等)、氢氧化钙、碳酸钙、三乙胺、二异丙基乙基胺等。其中，氢氧化钠和氢氧化钾是优选的。
步骤(D)：
在步骤(D)中，将在上述步骤(C)中获得的化合物、即由上述式(16)所表示的化合物与钙化合物反应。
对反应条件等没有特别限制，只要可以通过将在上述步骤(C)中获得的化合物与钙化合物进行反应而获得钙盐即可。步骤(D)中的反应条件等的优选实例在下文中描述。
作为钙化合物，可以使用氯化钙、乙酸钙等，并且氯化钙是特别优选的。相对于在上述步骤(C)中获得的化合物，所使用的钙化合物的量一般为0.5当量-3当量，优选为0.6当量-2.8当量。
所述反应可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、水等，以及极性溶剂与非极性溶剂(例如甲苯、环己烷、均三甲苯等)的混合物，是优选的。
反应温度一般为0℃～200℃，优选为20℃～110℃。
反应时间一般为0.01小时～200小时，优选为0.5小时～24小时。
[本发明的纯化方法]
在本发明的瑞舒伐他汀钙的纯化方法中，可以纯化含有由上述式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙。可以对通过上述本发明的生产方法生产的瑞舒伐他汀钙或通过其他生产方法生产的瑞舒伐他汀钙执行本发明的纯化方法。
在这里，瑞舒伐他汀钙优选地靶向当通过HPLC(高效液相色谱)(检测波长：UV245nm)测量时含有不少于0.01面积％、更优选地不少于0.05面积％的由上述式(12)所表示的化合物的化合物。尽管对所述上限没有特别限制，只要可以获得本发明的效果即可，但它一般不超过99面积％，优选地不超过50面积％，更优选地不超过25面积％，特别优选地不超过5面积％，最优选地不超过1面积％。在本发明的特别优选的实施方式中，瑞舒伐他汀钙含有不少于0.01面积％且不超过5面积％的由上述式(12)所表示的化合物。
本发明的纯化方法的特征在于包含(B)将由上述式(12)所表示的化合物转变成由上述式(13)所表示的化合物的步骤。
在上述步骤(B)之前，优选地包括(Ab)将包含由上述式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙溶解在溶剂中的步骤。
此外，在上述步骤(B)之后，优选地包括(C)除去由上述式(13)所表示的化合物的步骤。
此外，在上述步骤(C)之后，优选地包括(D)将通过上述步骤(C)获得的化合物与钙化合物进行反应的步骤。
本发明的纯化方法的步骤(Ab)和(B)-(D)的每个步骤，在下文中进行解释。
步骤(Ab)：
步骤(Ab)是将包含由上述式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙溶解在溶剂中的步骤。作为所述溶剂，可以提到的是醚类(例如甲基叔丁基醚、THF、环戊基甲基醚(CPME)等)，酯类例如乙酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等，甲苯，酮类例如甲乙酮等，水等。其中，醚类(例如甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚(CPME)等)，酯类例如乙酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等，甲苯，酮类例如甲乙酮等以及水，是优选的。
在步骤(Ab)中，通常将瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)转变成由下式(17)所表示的化合物：
((3R,5S,6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-羟基-庚-6-烯酸)
在这一步骤中，通常由上述式(12)所表示的化合物不被特别转化。
步骤(B)：
在步骤(B)中，将由上述式(12)所表示的化合物转变成由上述式(13)所表示的化合物。
在步骤(B)中，通常根据用于上述反应的酸和碱的种类，将由上述式(17)所表示的化合物转变成由上述式(16)所表示的化合物。
对反应条件等没有特别限制，只要可以将由上述式(12)所表示的化合物转变成由上述式(13)所表示的化合物即可。步骤(B)中的反应条件的优选实例在下文中描述。
步骤(B)优选地在溶剂存在下进行。作为溶剂，可以提到的是醚类(例如甲基叔丁基醚、THF、环戊基甲基醚等)，乙酸酯类(例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯等)，酰胺类(例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等)，烃类(例如甲苯、环己烷等)，醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇等)，水等。其中，甲基叔丁基醚、THF、乙酸乙酯、甲苯和水是优选的。
反应温度一般不低于50℃，优选地不低于60℃，并且一般不超过120℃，优选地不超过110℃。为了高效地进行反应，如果需要，优选地进行加热。在本发明的特别优选的实施方式中，步骤(B)在不低于60℃且不超过100℃的条件下进行。
尽管对步骤(B)的pH条件没有特别限制，但为了加速所述反应，酸性条件或碱性条件是优选的。
当使用酸性条件时，所述步骤优选地在不低于pH 0且不高于pH 3下进行。可以在这里使用的酸的实例包括盐酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等，并且盐酸或硫酸是优选的。
当使用碱性条件时，所述步骤优选地在不低于pH 10且不高于pH14下进行。可以在这里使用的碱的实例包括碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾等)、氢氧化钙、碳酸钙、三乙胺、二异丙基乙基胺等。其中，氢氧化钠和氢氧化钾是优选的。
尽管反应时间随着其他条件而变，但它一般不少于1小时，优选地不少于2小时，并且一般不超过72小时，优选地不超过48小时。
为了缩短上述反应时间，如果需要，优选地在步骤(B)中搅动所述反应溶液。
步骤(C)：
在步骤(C)中，从步骤(B)中获得的混合物(当存在步骤(Ab)时为溶液)中除去由上述式(3)所表示的化合物。当在本文中使用时，除去不必定意味着完全除去，只需要除去其大部分以便可以提高获得的化合物的纯度即可。当在这一步骤中除去由上述式(13)所表示的化合物时，由上述式(16)所表示的化合物剩余。
对用于这一步骤的手段和反应条件没有特别限制，只要可以除去由上述式(13)所表示的化合物即可。步骤(C)的优选实例在下文中描述。
在步骤(C)中，优选地通过在碱性条件下用有机溶剂萃取来除去由上述式(13)所表示的化合物。
可以在这里使用的有机溶剂的实例包括醚类(例如甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚(CPME)等)，酯类(例如乙酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等)，酮类(例如甲苯、甲乙酮等)等。其中，上述醚类和酯类是优选地。其中，甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、甲乙酮和乙酸乙酯是优选的。
在碱性条件下优选地意味着不低于pH 8且不高于pH 14，更优选地不低于pH 10且不高于pH 14。
可以在这里使用的碱的实例包括碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾等)、氢氧化钙、碳酸钙、三乙胺、二异丙基乙基胺等。其中，氢氧化钠和氢氧化钾是优选的。
步骤(D)：
在步骤(D)中，将在上述步骤(C)中获得的化合物、即由上述式(16)所表示的化合物与钙化合物反应。
在步骤(D)中，将由上述式(16)所表示的化合物转变成其钙盐，即瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)。
对反应条件等没有特别限制，只要可以通过将在上述步骤(C)中获得的化合物与钙化合物进行反应而获得钙盐即可。步骤(D)中的反应条件等的优选实例在下文中描述。
作为钙化合物，可以使用氯化钙、乙酸钙等，并且氯化钙是特别优选的。相对于在上述步骤(C)中获得的化合物，所使用的钙化合物的量一般为0.5当量-3当量，优选为0.6当量-2.8当量。
所述反应可以在溶剂中进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要反应可以进行即可，但醚溶剂例如MTBE、THF、CPME等，极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、水等，以及极性溶剂与非极性溶剂(例如甲苯、环己烷、均三甲苯等)的混合物，是优选的。
反应温度一般为0℃～200℃，优选为20℃～110℃。
反应时间一般为0.01小时～200小时，优选为0.5小时～24小时。
[本发明的瑞舒伐他汀钙]
通过本发明的生产方法获得的瑞舒伐他汀钙是高纯的，并且由下式(11)所表示的化合物：
即5-[反式-(3S,5R)-二羟基己烯-1-基]-4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶的含量，优选地不超过1500ppm，更优选地不超过1000ppm，更优选地不超过100ppm，特别优选地不超过50ppm，并且优选地不低于1ppm。这种瑞舒伐他汀钙可以被稳定地保存。
本发明的瑞舒伐他汀钙包含的由上述式(13)所表示的化合物优选地不超过1000ppm，更优选地不超过500ppm，更优选地不超过100ppm。由上述式(13)所表示的化合物的含量优选地不低于1ppm。
含有不低于1ppm且不超过1000ppm的由上述式(13)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙，可以被稳定地保存。
在本发明中，粉末X-射线衍射谱可以通过已知方法来测量。例如，将样品装填在玻璃样品板上，将从在45kV和40mA下运行的陶瓷X-射线管Cu发射的波长为1.5406埃的X-射线辐照在所述样品上并测量。由于取决于测量装置和样品，粉末X-射线衍射谱的2θ值在±0.2°误差范围内变化，因此本发明中的2θ值不应被解释为绝对值。
[实施例]
在下文中，通过参考实施例对本发明进行更详细描述，所述实施例不应被解释为限制性的。
实施例中的定量分析包括在下述条件下使用HPLC(高效液相色谱)的测量。
<DHAB的化学纯度>
柱：资生堂制造，Capcell Pack C18MG(4.6mm×75mm，3μm)
流动相：A：0.1mol/L乙酸铵，0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐；B：10％流动相A，90％甲醇
梯度程序(B的浓度)：40％(0分钟)→100％(12分钟)→100％(14分钟)
流速：1mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 254nm
<DOXP的化学纯度>
柱：Capcell Pak C18MG(4.6mm×75mm，3μm)，由资生堂制造
流动相：A：水/乙酸/乙酸铵＝1000/100/7.7(mL/mL/g)；B：THF
梯度程序(B的浓度)：38％(0分钟)→38％(17分钟)→80％(27分钟)
流速：1mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 254nm
<DOXE的化学纯度>
柱：Capcell Pak C18MG(4.6mm×75mm，3μm)，由资生堂制造
流动相：A：水/乙酸/乙酸铵＝1000/100/7.7(mL/mL/g)；B：THF
梯度程序(B的浓度)：41％(0分钟)→41％(17分钟)→90％(27分钟)
流速：1mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 254nm
<DOLP的化学纯度>
柱：Capcell Pak C18MGIII-H(2.0mm×100mm，3μm)，由资生堂制造
流动相：A：0.1M乙酸铵/乙醇＝3/2(mL/mL)；B：0.1M乙酸铵/乙醇＝1/4(mL/mL)
梯度程序(B的浓度):0％(0分钟)→0％(10分钟)→100％(25分钟)→100％(30分钟)
流速：0.3mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 245nm
在实施例4和5中，将下述条件用于测量。
柱：Cadenza CD-C18(4.6mm×150mm，3μm)，由Imtakt Inc.制造
流动相：A：0.1％甲酸水溶液；B：乙醇
梯度程序(B的浓度)：40％(0分钟)→60％(20分钟)→80％(25分钟)
流速：0.8mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 245nm
<RSV-Ca的化学纯度>
柱：Cadenza CD-C18(4.6mm×250mm，3μm)，由Imtakt Inc.制造
流动相：A：0.1％甲酸水溶液；B：含有0.1％甲酸的甲醇
梯度程序(B的浓度)：60％(0分钟)→75％(12分钟)→100％(20分钟)
流速：0.8mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 245nm
<RSV-Ca的光学纯度>
柱：Chiralpak IB(4.6mm×250mm,3μm)，由大赛璐公司制造
流动相：三氟乙酸/己烷/乙醇＝0.1/90/10(mL/mL/mL)
流速：1mL/分钟；柱温：25℃
检测波长：UV 245nm
<RSV-Ca中的DOLH的分析>
柱：Cadenza CD-C18(4.6mm×250mm，3μm)，由Imtakt Inc.制造
流动相：A：0.1％甲酸水溶液；B：含有0.1％甲酸的甲醇
梯度程序(B的浓度)：60％(0分钟)→75％(12分钟)→100％(20分钟)
流速：0.8mL/分钟；柱温：40℃
检测器：MS(极性：正离子模式：SIM；裂解电压：200；无水气体流速：5L/分钟；喷雾器：40psi；无水气体温度：250℃；汽化器温度：150℃)
<DOXP和DOLP的粉末X-射线衍射谱>
DOXP和DOLP的粉末X-射线衍射谱(实施例2、2’、5和11)使用X-射线衍射装置XRD-6000(由株式会社岛津制造)来测量。将从陶瓷X-射线管Cu发射的波长为1.5406埃的X-射线辐照在样品上。将平行设定的X-射线源通过自动发散狭缝，并通过高速半导体检测器测量反射的X-射线。将高速半导体检测器附连到所述仪器。测量条件如下。
单色器：使用
管电压：40.0Kv
管电流：40.0mA
发散：1.00deg
散射：1.00deg
接收：0.15mm
模式：连续扫描
驱动轴：2θ/θ
数据范围：5–40deg
步级：0.02deg
扫描速度：3.5000deg/分钟(运行时间：10分钟)
旋转速度：60rpm
<丙胺盐的粉末X-射线衍射谱>
丙胺盐(实施例7)的粉末X-射线衍射谱在与<DOXP和DOLP的粉末X-射线衍射谱>中相同的条件下测量，区别在于使用X-射线衍射装置X’Pert-PRO MPD(由思百吉株式会社制造)，并将测量条件设定如下。
单色器：使用
管电压：45.0Kv
管电流：40.0mA
发散：自动
辐照宽度：10.00mm
样品宽度：10.00mm
模式：连续扫描
驱动轴：2θ/θ,
数据范围：5–40deg
步级：0.017deg
扫描步骤时间[s]：10.9834
执行时间：10分钟40sec
<二甲胺盐的粉末X-射线衍射谱>
二甲胺盐(实施例9)的粉末X-射线衍射谱在与上述<DOXP和DOLP的粉末X-射线衍射谱>中相同的条件下测量，区别在于使用X-射线衍射装置RAD-RB(由株式会社理学制造)，并将测量条件设定如下。
单色器：使用
管电压：40.0Kv
管电流：100mA
发散狭缝：1.00deg
散射狭缝：1.00deg
接收狭缝：0.15mm
模式：连续扫描
驱动轴：2θ/θ
数据范围：2–40deg
步级：0.02deg
扫描速度：2deg/分钟(执行时间：19分钟)
参考例1
(DHAB(3,5-二氧代己酸叔丁酯)的合成)
[步骤1]
在氮气气氛下，将Meldrum’s酸(MA)(900.1g，6.24mol)和氯苯(4532.1g)装入10L烧瓶中，并在搅拌开始后，将内部温度调整到20℃。在25分钟内向所述混合物逐滴加入三乙胺(631.9g，6.24mol)。在搅拌30分钟后，在2小时内向所述混合物逐滴加入双烯酮(DK)(557.8g，6.86mol)。在22℃的内部温度下搅拌1.5小时后，在1小时20分钟内向反应混合物逐滴加入35％盐酸(651.4g)和水(1799.9g)的混合物。分离有机层并用水洗涤。将获得的有机层在无水SK1B(H型离子交换树脂，由三菱化学社制造)上干燥。
在干燥后，将所述有机层过滤并用于下一步骤中。
[步骤2]
在氮气气氛下，将在前一步骤中获得的有机层装入10L烧瓶中，并添加叔丁醇(555.4g，7.48mol)。将所述混合物加热至内部温度为60℃。在搅拌7小时后，将反应混合物冷却至室温。向反应混合物添加7％碳酸氢钠水溶液(1325.8g)，并将反应混合物过滤。然后，分离有机层并用水洗涤。将有机层浓缩，直至在60℃下没有有机溶剂被蒸馏出来。
将残留物通过薄膜蒸馏装置进行纯化(压力：50Pa～80Pa，热传递介质温度：110℃)。获得的3,5-二氧代-己酸叔丁酯(DHAB)为893g(得率69％)，通过HPLC测定的纯度为92.1面积％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3，互变异构体混合物)δ1.43-1.49(9H,m),2.07(2.5H,s),2.25(0.5H,s),3.24(1.7H,s),3.46(0.3H,s),3.73(0.3H,s),5.61(0.7H,s)
参考例2
(DHAE(3,5-二氧代己酸乙酯)的合成方法)
[步骤1]
在氮气气氛下，将Meldrum’s酸(MA)(100.2g，0.69mol)和氯苯(554g)装入2L烧瓶中，并在搅拌开始后将内部温度调整到20℃。在17分钟内向所述混合物逐滴加入三乙胺(70.3g，0.69mol)。在搅拌1小时后，在1小时20分钟内向所述混合物逐滴加入双烯酮(64.6g，0.76mol)。在25℃的内部温度下搅拌5.5小时后，在30分钟内向反应混合物逐滴加入预先制备的35％盐酸(72.3g)和水(277.5g)的混合溶液。分离有机层并用水洗涤。将获得的有机层在无水SK1B(H型离子交换树脂，由三菱化学社制造)上干燥。
在干燥后，将所述有机层过滤并用于下一步骤中。
[步骤2]
在氮气气氛下，将在前一步骤中获得的有机层装入2L烧瓶中，并添加乙醇(38.5g，0.83mol)。将所述混合物加热至内部温度为60℃。在搅拌9小时后，将所述反应混合物冷却至室温。向反应混合物添加7％碳酸氢钠水溶液(87.2g)，并将反应混合物过滤。分离有机层，并将所述有机层用水洗涤。将有机层浓缩，直至在60℃下没有有机溶剂被蒸馏出来。
将残留物通过单个蒸馏装置纯化(压力：50Pa～80Pa，热传递介质温度：110℃)。获得的3,5-二氧代-己酸乙酯(DHAE)为83.5g(得率：70％)，通过HPLC测定的纯度为97.9面积％。
实施例1
(DOXP((E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二氧代-6-庚酸正丙酯)的生产)
在氮气气氛下，将氢化钠(5.50g)(纯度62.1％，142mmol)和四氢呋喃(50mL)装入烧瓶中，并将混合物冷却至0℃～5℃。在1小时内向所述混合物逐滴添加在参考例1中获得的DHAB(68.3mmol)在四氢呋喃(50mL)中的溶液。在滴加完成后，将混合物在0℃～5℃搅拌1小时。(反应混合物A)
在氮气气氛下，将4-(4-氟苯基)-5-甲酰基-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶(ALD(可商购的产品))(10.0g，28.5mmol)和甲基叔丁基醚(100mL)装入烧瓶，并冷却至0℃～5℃。随后，在相同温度下逐滴加入反应混合物A。在所述滴加完成后，在2小时内将内部温度加热至20℃，并且将混合物在20℃搅拌4小时。作为通过HPLC进行分析的结果，向DOXB((E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二氧代-6-庚酸叔丁酯)的转化率为97.0％。随后，将内部温度冷却至10℃，并且逐滴加入水(100mL)。在滴加后，将混合物升温至室温，并通过分配来分离水性层。然后，将有机层依次用2％氢氧化钠水溶液(50.0g)(NaOH 1.0g，水49.0g)、10％柠檬酸水溶液(50.0g)(柠檬酸5.0g，水45.0g)、2％NaCl水溶液(60.0g)(NaCl 2.0g，水58.0g)洗涤。将获得的有机层通过HPLC进行定量分析，发现从ALD的得率为87.0％。
将获得的有机层在35℃的外部温度下在减压下浓缩。向获得的残留物添加正丙醇，并将所述混合物在40℃的外部温度下在减压下浓缩。在浓缩后，向残留物再次添加正丙醇，并将所述混合物在40℃的外部温度下在减压下浓缩。
随后，向获得的残留物添加正丙醇以将液体体积调整到50mL，并将混合物加热至100℃的内部温度。7.5小时后，通过HPLC进行的分析揭示出向DOXP的转化率为99.0％。随后，将混合物冷却，在内部温度为60℃时开始在减压下浓缩，并将混合物浓缩至溶液体积达到30mL。当将内部温度调整到45℃时，添加DOXP的晶种，并将混合物逐渐冷却至0℃～5℃。在冷却后，通过固液分离来回收晶体。通过HPLC检测的获得的晶体的纯度为95.5面积％。
将获得的晶体和甲醇(31mL)装入100mL可分离烧瓶中，并将混合物加热至溶剂的回流温度以给出均匀的溶液。在确认晶体完全溶解后，将内部温度降低到45℃。在45℃的内部温度下添加DOXP的晶种，并在2小时内将混合物冷却至0℃。在冷却后，通过固液分离回收晶体。将获得的湿晶体在减压下干燥。通过HPLC检测的获得的DOXP的纯度为97.4面积％，回收量为9.59g(得率为64.7％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ0.92-0.96(3H,t,J＝7.5Hz),1.29(3H,s),1.31(3H,s),1.64-1.70(2H,q,J＝7.0Hz),3.36-3.42(2H,m),3.52(3H,s),3.59(3H,s),4.09-4.12(2H,t,J＝6.5Hz),5.53(1H,s),5.79-5.83(1H,d,J＝15.9Hz),7.10-7.15(2H,m),7.61-7.68(3H,m)
(DOXP的晶种的生产)
在氮气气氛下，将氢化钠(52.5g)(纯度为65％，1.42mol)和四氢呋喃(0.5L)装入反应器中，并将混合物冷却到0℃～5℃的内部温度。在分开的反应釜内，在氮气气氛下，制备以与参考例1中相同的方式合成的DHAB(137.0kg，0.683mol)与四氢呋喃(0.5L)的溶液。在1小时内向氢化钠在四氢呋喃中的溶液逐滴添加DHAB在四氢呋喃中的溶液，并将混合物在0℃～5℃搅拌1小时。(反应混合物B)
在氮气气氛下，将4-(4-氟苯基)-5-甲酰基-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶(ALD)(100g，0.281mol)和四氢呋喃(1L)装入反应器中，并将混合物冷却到0℃～5℃。随后，逐滴加入反应混合物B并在同时将内部温度控制到0℃～5℃。在滴加完成后，将混合物在相同温度下搅拌5小时。作为通过HPLC进行的分析的结果，从ALD的转化率为99.2％。
在反应完成后，加入甲基叔丁基醚(1L)，逐滴加入水(1L)并在同时将内部温度控制到0℃～5℃。在滴加完成后，通过分配来分离水性层。然后，将有机层依次用2％NaCl水溶液(500g)(NaCl 10g，水490g)、10％柠檬酸水溶液(1000g)(柠檬酸100g，水900g)和水(500g)洗涤。将获得的有机层通过HPLC进行定量分析，DOXB以83.2％的得率从ALD获得。
将获得的有机层在35℃的外部温度下在减压下浓缩至总量为500g。向获得的残留物添加异丙醇(200mL)，并将所述混合物在40℃的外部温度下在减压下浓缩至总量为500g。将这一操作重复三次。
随后，在1小时内将内部温度冷却到0～5℃，并通过固液分离来回收晶体。将获得的晶体在减压下干燥以给出DOXB。通过HPLC检测的获得的DOXB的纯度为98.7面积％，并且回收率为98.7g(得率65％)。
向通过上述方法获得的DOXB(1g)添加正丙醇(10mL)，并将混合物加热到98℃的内部温度。在10小时后，通过HPLC分析混合物，并发现向DOXP的转化率为99.5％。
将反应混合物浓缩，并将获得的残留物通过快速柱层析进行纯化(洗脱液：庚烷/乙酸乙酯＝94/6至50/50(体积比)，线性梯度)，回收含有大量目标产物的级分，并在50℃的外部温度下浓缩。将获得的残留物在减压下干燥，由此将DOXP结晶。通过HPLC检测的获得的DOXP的纯度为97.2面积％，并且回收量为1.01g(得率为103％)。
实施例2
(DOXP的生产)
在氮气气氛下，将氢化钠(8.28kg)(纯度为61.9％，214mol)和四氢呋喃(75L)装入反应器中，并将混合物冷却到0℃～5℃的内部温度。在分开的反应器中，在氮气气氛下，制备以与参考例1中相同的方式合成的DHAB(20.5kg，103mol)和四氢呋喃(75L)的溶液。在5小时内，向氢化钠在四氢呋喃中的溶液逐滴加入DHAB在四氢呋喃中的溶液，并将混合物在0℃～5℃下搅拌1小时。(反应混合物C)
在氮气气氛下，将4-(4-氟苯基)-5-甲酰基-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶(ALD)(14.9kg，42.4mol)和甲基叔丁基醚(150L)装入反应器中，并将混合物冷却到0℃～5℃。随后，逐滴加入反应混合物C，并在同时将内部温度控制在0℃～5℃。在滴加完成后，在2小时内将内部温度升温至20℃～25℃，并将混合物在20℃～25℃搅拌2小时。作为通过HPLC进行的分析的结果，从ALD的转化率为99.3％。
在反应完成后，将内部温度冷却到20℃或更低温度，逐滴加入水(150L)并同时维持在20℃或更低温度。在滴加后，通过分配来分离水性层。然后将有机层依次用2％氢氧化钠水溶液(75.0kg)(NaOH 1.5kg，水73.5kg)、10％柠檬酸水溶液(75.0kg)(柠檬酸7.5kg，水67.5kg)、2％NaCl水溶液(75.0kg)(NaCl 1.5kg，水73.5kg)洗涤。将获得的有机层通过HPLC进行定量分析，并且DOXB以82.8％的得率从ALD获得。
将获得的有机层在35℃的外部温度下，在减压下浓缩至总量为30L。向获得的残留物添加正丙醇(75L)，并将混合物在40℃的外部温度下，在减压下浓缩到总量为30L。
随后，向获得的残留物添加正丙醇(38L)，并将内部温度升高到97℃。在反应8小时后，通过HPLC分析所述混合物，发现向DOXP的转化率为99.3％。
将混合物在60℃的内部温度下在减压下浓缩，并将溶液体积浓缩至45L。随后，将混合物冷却到45℃的内部温度，并在相同温度下添加DOXP的晶种。在4小时内将混合物冷却到0℃～5℃，并通过固液分离来回收晶体。通过HPLC检测的获得的晶体的纯度为98.1面积％。
将获得的晶体和甲醇(50L)装入120L反应容器中，将混合物加热以给出均匀的溶液。在确认晶体完全溶解后，将内部温度调整到45℃并加入DOXP的晶种。在4小时内将混合物冷却到0℃～5℃，并通过固液分离回收晶体。将获得的晶体在减压下干燥以给出DOXP。通过HPLC检测的获得的DOXP的纯度为99.0面积％，并且回收量为14.0kg(得率为63.4％)。
获得的DOXP晶体的粉末X-射线衍射谱示出在图1中。
实施例2’
(DOXP的生产)
在氮气气氛下，在反应器中，将氢化钠(17.1kg)(纯度为60％，427mol)溶解在四氢呋喃(THF)(150L)中，并将混合物冷却到0℃～5℃的内部温度(溶液D)。
在分开的反应器中，在氮气气氛下，加入甲基叔丁基醚(150L)来溶解以与参考例1中相同的方式合成的DHAB(41kg，204mol)。在将内部温度控制在10℃或更低温度的同时，将获得的溶液逐滴添加到溶液D(氢化钠在THF中的溶液)(溶液E)。
在分开的反应器中，将4-(4-氟苯基)-5-甲酰基-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶(ALD)(30kg，85.3mol)溶解在THF(300L)中。将所述溶液逐滴添加到溶液E，同时将内部温度控制到0℃～5℃。在滴加完成后，将混合物升温到20℃～25℃的内部温度，并在相同温度下搅拌7小时。作为通过HPLC进行分析的结果，ALD的剩余量为0.7％。
随后，逐滴加入水(300L)。在分配后，将获得的有机层洗涤三次。作为溶剂，依次使用2％盐水、10％柠檬酸水溶液和2％盐水。将洗涤过的有机层在45℃左右的外部温度下，在减压下浓缩。向获得的残留物添加正丙醇，并将所述混合物在45℃左右的外部温度下，在减压下再次浓缩。
向得到的残留物添加正丙醇，将混合物升温直至正丙醇回流，并在这种状态下维持10小时。通过HPLC分析获得的溶液，发现DOXB的剩余量为1.6％。
将获得的溶液在60℃～70℃的外部温度下，在减压下浓缩。随后，将混合物冷却到42℃～45℃的内部温度，并在相同温度下添加DOXP的晶种。在4小时内将混合物冷却到-5℃～0℃，并通过固液分离回收湿晶体。
将获得的湿晶体和正丙醇(60kg)装入反应器，升高混合物的温度，并将混合物在回流下加热1小时。随后，将内部温度调整到42℃～45℃并加入DOXP的晶种。随后，在4小时内将混合物冷却到-5℃～0℃，并通过固液分离回收湿晶体。将获得的湿晶体在减压下干燥以给出作为晶体的DOXP。通过HPLC检测的获得的DOXP晶体的纯度为99.0面积％，并且回收量为23.2kg(得率为52％)。
获得的DOXP晶体的粉末X-射线衍射谱示出在图2中。
实施例3
(使用氨基钠通过缩合生产DOXP)
在氮气气氛下，将氨基钠(5.5g，142mmol)和四氢呋喃(THF)(50mL)装入250mL可分离烧瓶中。在冷却到2℃的内部温度后，逐滴加入以与参考例1中相同的方式合成的DHAB(14.8g)在THF(50mL)中的溶液，同时将温度控制在2℃～5℃之间。在滴加完成后，将混合物在3℃的内部温度下搅拌1小时。向该混合物加入ALD(10g，28.5mmol)在MTBE(100mL)中的溶液，同时将温度控制到0℃～1℃。在滴加完成后，将混合物在0℃的内部温度下搅拌3小时，将温度升高到10℃并将混合物继续搅拌3.5小时。随后，向反应混合物添加水(100g)。在分配后，将获得的有机层依次用2wt％氢氧化钠水溶液(50g)、10wt％柠檬酸水溶液(50g)和2wt％氢氧化钠水溶液(50g)洗涤。通过HPLC定量分析获得的有机层，并且DOXB以70％的得率从ALD获得。
随后，将有机层在40℃的外部温度下，在减压下浓缩，向残留物添加正丙醇(50mL)，并将混合物在40℃的外部温度下，在减压下再次浓缩。添加正丙醇以使获得的残留物的体积为40mL，并将内部温度升高到97℃。将混合物在相同温度下反应5小时，将反应混合物冷却到45℃，并加入DOXP的晶种。将反应混合物冷却到0℃，并通过过滤收集获得的晶体。向回收的晶体添加甲醇(30mL)，通过将内部温度升高到52℃来溶解混合物。将溶液冷却到40℃并添加DOXP的晶种。将溶液冷却到0℃并通过过滤收集获得的晶体。将所述晶体在40℃下在减压下干燥。获得的晶体的重量为7.7g，并且通过HPLC定量分析，从ALD的得率为54％，纯度为97.8面积％。
实施例1’
(DOXE((E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二氧代-6-庚酸乙酯)的合成)
[步骤1]
在氮气气氛下，将60％氢化钠(1.2g，29.9mmol)装入200mL三颈烧瓶中，并加入无水正戊烷(10mL)。在搅拌5分钟后，将混合物静置并取出上清液。随后，加入THF(50mL)，并将混合物冷却到-10℃的内部温度。逐滴加入在参考例2中合成的DHAE(4.9g，28.5mmol)在THF(10mL)中的溶液，并在同时将内部温度维持在-10℃左右。在-10℃左右搅拌50分钟后，将混合物冷却到-30℃的内部温度。随后，逐滴加入1.3mol/L正丁基锂在THF(40.6mL，56.9mmol)中的溶液，同时将内部温度维持在-27℃至-25℃之间。在滴加完成后，将混合物在-15℃的内部温度下搅拌40分钟。将混合物冷却到-30℃的内部温度，并逐滴加入ALD(5g，14.2mmol)在THF(90mL)中的溶液。将反应混合物升温到0℃的内部温度并搅拌2小时。随后，在0℃左右的内部温度下逐滴加入乙酸(6.8mL)，并加入甲苯(50mL)和水(40mL)。在分配后，将获得的有机层用水(25mL)、然后用25wt％氢氧化钠水溶液(25mL)洗涤。随后，在减压下蒸发有机溶剂，以给出HDOXE(7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-7-羟基-3,5-二氧代-6-庚酸乙酯)的粗产物(9.2g)。
[步骤2]
在氮气气氛下，将在前一步骤中获得的HDOXE粗产物(3.7g)(净含量等同于2.9g，5.67mmol)、对甲苯磺酸(PTSA)(0.11g，0.57mmol)和甲苯(60mL)装入100mL三颈烧瓶中。随后，将内部温度升高到110℃，并将混合物回流4小时。随后，将反应混合物冷却到25℃，并向混合物加入饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)。在分配后，将获得的有机层在硫酸钠上干燥。将干燥的有机层过滤并蒸发掉溶剂。将获得的残留物通过硅胶柱层析进行纯化(洗脱液：己烷/乙酸乙酯＝100/0～90/10)。将主要级分浓缩，以给出作为油状物的目标DOXE(0.92g，32％，纯度为89面积％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,互变异构体混合物)δ1.22-1.31(9H,m),3.25-3.41(3H,m),3.52(3H,s),3.59(3H,s),4.18-4.23(2H,q,J＝4.5Hz),5.30(0.7H,s),5.52(1.3H,s),5.79-5.83(1H,d,J＝10.1Hz),7.11-7.16(2H,m),7.60-7.69(3H,m)
参考例3
(细胞的制备)
[共表达羰基还原酶(后文中的OCR1)和葡萄糖-1-脱氢酶(后文中的GDH)的重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH的制备例]
(1)基因的克隆
在源自于编码Ogataea minuta variant nonfermentans(Ogataea minutavar.nonfermentans)NBRC(以前的IFO)1473的基因序列(ocr1)的OCR1(JP-B-4270918，SEQID NO：2)的基础上，设计并合成用于扩增全长ocr1基因的引物ocr1_F(SEQ ID NO：3)和ocr1_R(SEQ ID NO：4)。然后，按照常规方法，使用Ogataea-Minuta variantnonfermentans(Ogataea minuta var.nonfermentans)的染色体DNA作为模板进行PCR，以给出约0.8kbp的DNA片段。
然后，在编码GDH(SEQ ID NO：6)的基因序列(在后文中称为gdh(SEQ ID NO：5))的基础上，设计并合成用于扩增全长gdh基因的引物gdh_F1(SEQ ID NO：7)和gdh_R1(SEQ IDNO：8)，所述GDH是由源自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因(GeneBank登记号AL009126.3)编码的葡萄糖-1-脱氢酶，其中作为第96位氨基酸残基的谷氨酸被丙氨酸置换。然后，按照常规方法进行PCR，以给出约0.8kbp的DNA片段。
(2)表达质粒的制备
将在上述(1)中获得的ocr1的DNA片段用限制性酶EcoRI和HindIII消化，并使用Ligation-Convenienc试剂盒(由Nippon Gene Co.,Ltd.制造)引入到JP-A-2005-34025中描述的并用MunI和HindIII消化的质粒pKV32中trc启动子的下游中，以给出pKV32OCR1。
然后，将在上述(1)中获得的gdh的DNA片段用限制性酶EcoRI和XbaI消化，并使用Ligation-Convenienc试剂盒(由Nippon Gene Co.,Ltd.制造)引入到用MunI和XbaI消化的质粒pKV32中trc启动子的下游中，以给出pKV32GDH。
使用pKV32GDH作为模板和添加有限制性酶位点HindIII的引物gdh_F2(SEQ IDNO：9)和gdh_R2(SEQ ID NO：10)，进行PCR，将获得的片段用限制性酶HindIII消化并插入到预先用限制性酶HindIII消化的质粒pKV32OCR1的下游中，以给出pKV32OCR1-GDH。在获得的质粒中gdh基因的方向通过PCR来确认。
(3)表达菌株的制备
使用在上述(2)中获得的质粒pKV32OCR1-GDH，按照常规方法转化大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109(由宝生物工程株式会社制造)，以给出重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH。
实施例4
(DOLP((3R),(5S),(6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二羟基-6-庚酸正丙基酯)的生产)
将离子交换水(385.9mL)、葡萄糖(19.5g，108.2mmol)、NADP+(由东方酵母工业株式会社制造)(75mg，0.1mmol)、磷酸氢二钾(0.5g，2.9mmol)和磷酸二氢钾(3.8g，27.9mmol)装入1L发酵罐(由Able Co.,Ltd.制造，型号BMJ-01)中并在其中溶解。向其加入通过参考例3的方法制备的重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH的冷冻细胞(55.6g)和全部量的通过将DOXP(7.0g，13.5mmol)溶解在二甲基亚砜(DMSO)(86.3g，1111.4mmol)中制备的底物溶液，并将混合物在50℃的内部温度下搅拌3小时。在反应期间，逐滴加入25wt％氢氧化钠水溶液以维持pH 6.5。将获得的反应混合物以10,000rpm离心10分钟，给出由细胞和反应得到的产物构成的沉淀物。将所述沉淀物悬浮在5wt％硫酸钠水溶液中，并用乙酸乙酯萃取。将使用乙酸乙酯的萃取重复三次，将得到的萃取液混合，并通过HPLC分析混合的萃取液。作为结果，DOLP的产量为6.05g(得率为85.8％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ0.95(3H,t,J＝7.6Hz),1.26(6H,d,J＝7.2Hz),1.44-1.70(4H,m),2.48(2H,d,J＝6.8Hz),3.36(1H,m),3.52(3H,s),3.57(3H,s),3.62(1H,s),3.76(1H,s),4.09(2H,t,J＝6.8Hz),4.21(1H,m),4.46(1H,m),5.45(1H,dd,J＝5.6Hz,16.0Hz),6.64(1H,d,J＝16.0Hz),7.09(2H,m),7.64(2H,m)
实施例4-1-4-4
(DOLP的生产)
DOLP在与实施例4中相同的条件下生产，区别在于装入离子交换水、甘油、葡萄糖(48.3g，268.1mmol)、NADP+(由东方酵母工业株式会社制造)(138mg,0.18mmol)、磷酸氢二钾(8.29g，47.6mmol)和磷酸二氢钾(3.97g，29.2mmol)以获得在表6中描述的甘油浓度，所使用的重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH的冷冻细胞的量被设定到50.60g，底物溶液为通过将DOXP(14.4g，27.7mmol)溶解在二甲基亚砜(DMSO)(124.20g，1589.7mmol)中制备的溶液，反应时间被设定到5小时，并在反应期间维持pH 6。向DOLP的转化率示出在表6中。显然，通过在甘油存在下进行反应提高了转化率。DOLP的产生通过HPLC的保留时间来确认。
[表6]
甘油浓度(g/L) 转化率(％)
实施例4-1 255 95.78
实施例4-2 170 94.22
实施例4-3 85 92.54
实施例4-4 0 90.25
实施例5
(DOLP的生产)
将离子交换水(1929.6mL)、葡萄糖(97.7g，542.2mmol)、NADP+(由东方酵母工业株式会社制造)(374mg，0.49mmol)、磷酸氢二钾(2.6g，14.9mmol)和磷酸二氢钾(19.1g，140.3mmol)装入5L发酵罐(型号BMS，由Able Co.,Ltd.制造)中并在其中溶解。向其加入通过参考例3的方法制备的重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH的冷冻细胞(278g)和全部量的通过将DOXP(35g，67.4mmol)溶解在DMSO(434.1g，5556.1mmol)中制备的底物溶液，并将混合物在50℃的内部温度下搅拌3小时。在反应期间，逐滴加入25wt％氢氧化钠水溶液以维持pH 6.5。将获得的反应混合物以10,000rpm离心10分钟，给出由细胞和反应得到的产物构成的沉淀物。将所述沉淀物悬浮在5wt％硫酸钠水溶液中，并用乙酸乙酯萃取。将使用乙酸乙酯的萃取重复三次，将得到的萃取液混合，并通过HPLC分析混合的萃取液。作为结果，DOLP的产量为29.5g(得率为83.7％)。
(DOLP分离)
将生物还原的DOLP反应混合物的乙酸乙酯萃取液(含有24.1g DOLP)在40℃的外部温度下在减压下浓缩。在浓缩后加入甲醇，并将混合物再次在40℃的外部温度下在减压下浓缩，给出DOLP的甲醇溶液(72.4g)(DOLP 24.1g，甲醇48.3g)。向该溶液添加水(36.2g)和甲醇(18.6g)，以给出相对于DOLP含有5体积比的70％甲醇水溶液。将该溶液加热到50℃～60℃以给出均匀溶液，并在48℃的内部温度下添加DOLP的晶种。在2小时内将所述混合物冷却到40℃的内部温度，并在所述温度下搅拌30分钟。随后，在2小时内将混合物冷却到3℃的内部温度，搅拌30分钟，并通过固液分离来回收晶体。获得的湿晶体的重量为35.4g。将湿晶体在40℃下在减压下干燥，以给出干燥形式的DOLP。采取干燥形式的DOLP的回收量为22.1g，纯度为97.3面积％。
将DOLP(40.7g)(HPLC纯度为98.9面积％)和甲苯(204mL)装入烧瓶中，并将混合物加热到65℃的内部温度，以给出均匀溶液。在确认DOLP完全溶解后，将混合物冷却到45℃的内部温度。在45℃的内部温度下添加DOLP的晶种，并将混合物搅拌1小时。在搅拌完成后，将内部温度调整到50℃，并将混合物搅拌1小时。在搅拌完成后，将混合物以10℃/hr的冷却速率冷却到0℃～5℃，并在所述温度下搅拌1小时。在搅拌完成后，通过固液分离回收晶体。将得到的湿晶体在减压下干燥，以给出纯化的DOLP。通过HPLC检测的得到的纯化DOLP的纯度为99.4面积％，回收量为38.1g，回收率为93.6％。
得到的纯化DOXP晶体的粉末X-射线衍射谱示出在图3中。
(DOLP的晶种的生产)
将按照实施例4中描述的方法生产的含有0.7g DOLP的乙酸乙酯溶液在减压下浓缩。将得到的残留物通过快速柱层析进行纯化(洗脱液：乙酸乙酯/庚烷＝10/90至80/20(体积比)，线性梯度)。回收含有大量目标产物的级分，并在减压下浓缩。作为结果，DOLP被结晶。得到的晶体的纯度为98.7面积％，回收量为0.4g。
实施例5-1
在氮气气氛下装入按照实施例5中描述的方法生产的DOLP(66.2g)(HPLC纯度为98.1面积％)和甲苯(400g)，并将混合物加热直至DOLP溶解。在确认DOLP完全溶解后，将混合物冷却到29℃～31℃，在相同温度下加入DOLP的晶种(晶种按照实施例5中描述的方法来生产)，并将混合物搅拌10分钟。随后，将混合物加热到50～52℃并搅拌1.5小时。在5小时内将获得的悬液冷却到1℃左右，并通过固液分离回收晶体。将得到的湿晶体在减压下干燥。
纯化的DOLP的回收量为64.7g。纯化的DOLP的HPLC纯度为99.0面积％，比装料时的纯度提高了0.9面积％。
实施例5-2
在氮气气氛下装入按照实施例5中描述的方法生产的DOLP(65.3g)(HPLC纯度为97.9面积％)和甲苯(395g)，并将混合物加热直至DOLP溶解。在确认DOLP完全溶解后，将混合物冷却到34℃～36℃，在相同温度下加入DOLP的晶种(晶种按照实施例5中描述的方法来生产)，并将混合物搅拌30分钟。随后，将混合物加热到50～52℃并搅拌1.5小时。在11小时内将获得的悬液冷却到1℃左右，并通过固液分离回收晶体。将得到的湿晶体在减压下干燥。
纯化的DOLP的回收量为63.1g。纯化的DOLP的HPLC纯度为99.3面积％，比装料时的纯度提高了1.4面积％。
实施例5-3
在氮气气氛下装入按照实施例5中描述的方法生产的DOLP(48.7g)(HPLC纯度为96.9面积％)和甲苯(210g)，并将混合物加热直至DOLP溶解。在确认DOLP完全溶解后，将混合物冷却到38℃～41℃，在相同温度下加入DOLP的晶种(晶种按照实施例5中描述的方法来生产)，并将混合物搅拌1小时。随后，将混合物冷却到33℃～35℃并搅拌1小时。将混合物进一步加热到50～53℃并搅拌10分钟。在14.5小时内将获得的悬液冷却到3℃左右，并通过固液分离回收晶体。将得到的湿晶体在减压下干燥。
纯化的DOLP的回收量为46.2g。纯化的DOLP的HPLC纯度为99.5面积％，比装料时的纯度提高了2.6面积％。
[表7]
实施例6
(RSV-Ca的生产)
在氮气气氛下，将DOLP(36g，68.8mmol)和乙醇(666g)装入烧瓶并在其中溶解。随后添加水(766.8g)。在7分钟内，在23℃的内部温度下向所述混合物逐滴加入2mol/L氢氧化钠水溶液(38.5mL，77.0mmol)。在搅拌2小时后，将反应混合物浓缩并蒸发掉乙醇。向获得的溶液添加乙酸乙酯(144g)。在搅拌20分钟后，将所述混合物分配。将这一操作重复两次。通过在减压下浓缩，蒸发掉在得到的水性层中包含的乙酸乙酯。加入2mol/L氢氧化钠水溶液以将得到的溶液调整到pH 12左右，将混合物冷却到9℃的内部温度。随后，在24分钟内逐滴加入0.17mol/L氯化钙水溶液(451g)。在相同温度下搅拌2小时后，通过过滤收集沉淀的晶体。将回收的晶体在40℃下在减压下干燥。得到的晶体(28.5g，83％)含有3.4％的水分。作为HPLC分析的结果，得到的瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)晶体的化学纯度为99.7面积％，并且光学纯度为100％e.e.。
1H-NMR(400MHz,DMSO)δ1.12(3H,d,J＝8.4Hz),1.23(1H,m),1.45(1H,m),1.93(1H,m),2.07(1H,m),3.37-3.30(4H,m),3.42(3H,s),3.70(1H,br s),4.13(1H,br s),4.99(1H,br s),5.45(1H,dd,J＝5.2Hz,16.0Hz),5.75(1H,br s),6.43(1H,d,J＝16.0Hz),7.20(2H,m),7.63(2H,m)
实施例7
(正丙胺盐的生产)
将DOLP(1g，1.91mmol，纯度：99.1面积％)、叔丁基甲基醚(4.41g)和水(10.0g)装入试管中。在室温下向混合物逐滴加入2mol/L氢氧化钠水溶液(1.17g，2.13mmol)。在搅拌4小时后，将混合物静置以允许分配操作。向得到的有机层添加1mol/L盐酸(2.5g)，以酸化所述反应系统。向所述混合物添加乙酸乙酯(9.0g)以允许分配操作。将得到的有机层用2wt％氢氧化钠水溶液(10g)洗涤两次。在减压下蒸发掉一部分有机溶剂，并将液体体积调整到总体积为10mL。
向上述溶液逐滴加入正丙胺(136mg，2.3mmol)在乙酸乙酯中的溶液(5mL)。向得到的混合溶液添加正丙胺盐的晶种，并将混合物冷却到5℃的内部温度，并通过过滤收集正丙胺盐的沉淀的晶体。将得到的晶体在40℃的外部温度下在真空中干燥。作为HPLC分析的结果，得到的正丙胺盐的重量为0.90g，纯度为99.9面积％。
得到的正丙胺盐晶体的粉末X-射线衍射谱示出在图5中。
(正丙胺盐的晶种的生产)
在氮气气氛下，将DOLE((3R),(5S),(6E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-3,5-二羟基-6-庚酸乙酯)(100mg，0.002mmol)、乙醇(2.07g)和水(2g)装入试管中。在室温下搅拌后，加入2mol/L氢氧化钠水溶液(0.16mL)。在室温下搅拌2小时后，在减压下蒸发掉乙醇。将回收的水性层用乙酸乙酯萃取两次，再次添加乙酸乙酯，并用1mol/L盐酸将所述混合物调整到pH 5。通过分配操作除去水性层，并蒸发掉溶剂。向得到的残留物添加乙腈(1mL)，逐滴加入10wt％正丙胺水溶液(139mg)。将所述混合物在5℃的外部温度下静置两夜，通过过滤收集沉淀的晶体并在减压下干燥，以给出正丙胺盐(0.04g)。
实施例8
(RSV-Ca的生产)
向正丙胺盐(800mg，1.48mmol，HPLC纯度：99.9面积％)添加水(6mL)和2mol/L氢氧化钠水溶液(0.81mL，1.63mmol)。在搅拌1小时后，向所述反应混合物逐滴加入氯化钙(239mg)在水(2mL)中的溶液。在滴加后，将内部温度冷却到5℃，并通过过滤收集沉淀的晶体。将得到的晶体在40℃的外部温度下在真空中干燥。作为HPLC分析的结果，得到的RSV-Ca晶体的重量为0.69g，纯度为99.9面积％。
实施例9
(二甲胺盐的生产)
在氮气气氛下，将DOLE(100mg，0.002mmol)、乙醇(2.07g)和水(2g)装入试管中。将混合物在室温下搅拌，并加入2mol/L氢氧化钠水溶液(0.16mL)。在搅拌2小时后，在减压下蒸发掉乙醇。将回收的水性层用乙酸乙酯萃取两次，再次添加乙酸乙酯，并且用1mol/L盐酸将混合物调整到pH 5。通过分配操作除去水性层，并蒸发掉溶剂。向得到的残留物添加乙腈(1mL)，并逐滴加入10wt％二甲胺水溶液(212mg)。通过过滤收集沉淀的晶体并在减压下干燥，以给出二甲胺盐(0.03g)。
得到的二甲胺盐的晶体的粉末X-射线衍射谱示出在图6中。
实施例10
(RSV-Ca的生产)
将DOLE(净含量0.5g，0.98mmol，纯度92.8面积％)、乙醇(9.24g)和水(10g)装入试管中。在25℃下向其添加1mol/L氢氧化钠水溶液(1.1mL，1.1mmol)。在搅拌3小时后，在40℃下将反应混合物在减压下浓缩。随后，加入水(10g)和乙酸乙酯(2.28g)以允许进行分配。将这个操作重复两次。向得到的水性层添加乙酸乙酯(10g)和1mol/L盐酸(1L)。在分配后，向得到的水性层添加乙酸乙酯，并将混合物再次分配。将得到的有机层浓缩，并添加甲苯(17.2g)。在40℃的外部温度下在减压下浓缩甲苯(8.6g)，并将浓缩的产物加热到110℃的内部温度。将该温度维持6小时，并将混合物冷却到5℃的内部温度。通过过滤收集沉淀的晶体，以给出内酯形式(0.35g)。作为HPLC分析的结果，得到的内酯形式的纯度为96.4面积％。
将得到的内酯形式(0.2g)、乙醇(9.3g)和水(10.6g)装入试管，并添加1mol/L氢氧化钠水溶液(0.3g)。在反应完成后，在40℃的外部温度下将反应混合物在减压下浓缩。向得到的溶液添加乙酸乙酯(2.3g)以允许进行分配。将这个操作重复两次。在40℃的外部温度下将得到的水性层在减压下浓缩。向回收的溶液添加水(1g)，并添加0.17mol/L氯化钙水溶液(3.2g)。将反应混合物在10℃的内部温度下搅拌，并通过过滤收集沉淀的晶体。将得到的晶体在40℃的外部温度下，在减压下干燥。作为HPLC分析的结果，RSV-Ca晶体的重量为0.8g，并且纯度为98.2面积％。
实施例11
(DOLP的生产)
将离子交换水(200L)、葡萄糖水(110.94kg)、磷酸氢二钾(2.13kg)和磷酸二氢钾(4.25kg)装入1m3反应罐中并在其中溶解。然后在其中装入重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH的冷冻细胞(52.7kg)和溶解在离子交换水(3L)中的NADP+(0.144kg)，以给出悬液。向其添加在实施例2中获得的DOXP(10.0kg，19.2mol)在DMSO(96.0kg)中的溶液，并将混合物在45℃～52℃的内部温度下搅拌6小时。在反应期间，逐滴加入1N氢氧化钠水溶液以维持pH 6.0。在反应完成后，使用98wt％硫酸将混合物调整到pH 5.0，并将混合物在65℃的内部温度下搅拌1小时。搅拌后DOLP的HPLC纯度为92.60面积％。
将所述反应混合物离心，获得由细胞和反应得到的产物构成的沉淀物。将得到的沉淀物悬浮在20％甲醇水溶液(502L)中并离心。
(DOLP的萃取)
将通过上述方法获得的沉淀物悬浮在5wt％硫酸钠水溶液(105.3kg)中，并用乙酸乙酯萃取三次。将得到的萃取液混合并在减压下浓缩。将得到的浓缩物用4wt％硫酸钠水溶液(104kg)洗涤，将得到的有机层过滤，并在减压下再次浓缩。得到的DOLP的乙酸乙酯溶液为132.8kg，并且DOLP含量为7.0kg(回收率70.0％，HPLC纯度为94.13面积％)。
(DOLP的结晶)
将通过上述方法获得的DOLP的乙酸乙酯溶液(含有6.7kg DOLP)在减压下浓缩。向得到的残留物添加1-丙醇(51.5kg)，并将混合物在减压下再次浓缩。在浓缩后加入水(25.6kg)，并将温度冷却到10℃。加入DOLP的晶种以允许晶体的沉淀，并加入水(12.8kg)。通过固液分离回收沉淀的晶体。得到的DOLP的纯度为98.80面积％。不需干燥进行下一次结晶。
在氮气气氛下，向DOLP的湿晶体添加甲苯(48.1kg)。将混合物加热到45℃，并通过分配除去水性层。在分配后，将混合物在减压下浓缩。将温度调整到40℃，加入DOLP的晶种，并将DOLP沉淀。在冷却到0℃后，通过固液分离回收晶体。将所述晶体用预先冷却到5℃的甲苯(2.4kg)洗涤。得到的DOLP的纯度为98.87面积％，并且不需干燥进行下一次结晶。
在氮气气氛下，向DOLP的湿晶体添加甲苯(31.7kg)。将混合物加热到62℃以溶解DOLP。将所述溶液冷却到40℃，加入DOLP的晶种(5.2g)以允许结晶。随后加入甲苯(9kg)。在冷却到0℃后，通过固液分离回收晶体。将所述晶体用预先冷却到5℃的甲苯(2.2kg)洗涤。得到的DOLP的纯度为99.58面积％，并且不需干燥进行下一次结晶。
将上述方法重复两次，并将得到的晶体在减压下干燥并回收。在干燥后DOLP的重量为3.41kg(总回收得率为48％)，纯度为99.86面积％。得到的晶体的粉末X-射线衍射的结果示出在图4和表8中。
[表8]
2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度 2θ 相对强度
7.7 13 16.1 23 22.5 13 27.8 5
8.4 57 16.9 33 23.6 5 28.6 10
11.2 8 18.0 8 24.2 5 29.6 6
12.7 28 18.4 12 24.5 10 30.4 5
12.9 10 19.5 33 24.7 14 - -
14.7 10 21.1 100 25.1 7 - -
15.0 12 22.2 12 26.5 6 - -
实施例12
在氮气气氛下，将在实施例11中获得的DOLP(2.99kg，5.71mol)和甲基叔丁基醚(11.1kg)装入反应容器中，并加入脱盐水(29.0kg)。在10分钟内，在25～28℃的内部温度下向得到的悬液逐滴加入2mol/L氢氧化钠水溶液(3.47kg，6.42mol)。在搅拌3.5小时后，将混合物分配并向得到的水性层添加甲基叔丁基醚(11.1kg)。将得到的溶液搅拌30分钟，分离有机层并再次除去，将水性层在减压下浓缩至液体量为24L。将得到的溶液调整到25～28℃的内部温度，并在1小时内逐滴加入10％氯化钙水溶液(6.92kg，6.22mmol)。将得到的悬液在25～28℃的内部温度下搅拌1小时，冷却到0～5℃，在相同温度下老化140分钟，并通过过滤收集沉淀的晶体。将回收的晶体在40℃下在减压下干燥。
得到的晶体(2.14kg，得率为75％)含有2.9％水分。作为HPLC分析的结果，得到的瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)晶体的化学纯度为99.93面积％，光学纯度为100％e.e.。所述晶体含有20ppm由下式(11)所表示的化合物：
实施例13
(RSV-Ca的生产)
在氮气气氛下，将按照实施例11中描述的方法生产的DOLP(10g，19.1mmol)、甲基叔丁基醚(50mL)和水(100g)混合。向得到的混合物逐滴加入2mol/L氢氧化钠水溶液，以将混合物调整到pH 12–13。在搅拌后，将混合物分配。向得到的水性层添加甲基叔丁基醚。在搅拌后，将混合物分配，并通过在减压下浓缩蒸发掉得到的水性层中包含的甲基叔丁基醚。向得到的溶液添加0.2N乙酸水溶液，以将混合物调整到pH 6～7。随后，逐滴加入1mol/L乙酸钙溶液，并将混合物冷却。通过过滤收集沉淀的晶体，并将其干燥。
得到的晶体(8.85g，92％)含有1.9％的水分。作为HPLC分析的结果，得到的瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)晶体的化学纯度为99.92面积％。
本发明的生产方法和纯化方法的实例在下文中示出。
对于实施例中的定量分析来说，使用HPLC(高效液相色谱)，并且测量在下述条件下进行。
<MoSi和DiSi的化学纯度>
柱：HP-5(0.32mm×30m，薄膜厚度0.25μm)，由Agilent Technologies制造
温度：45℃(0分钟)→(20℃/分钟)→240℃(5分钟)
入口温度：250℃
检测器温度：250℃
柱流速：1.5mL/分钟；(氦气)分流比：20:1
检测器：FID
<DOXP的化学纯度>
测量在与上述相同的条件下进行。
<5-MOLP和DOLP的化学纯度>
柱：Capcell Pak C18MGIII-H(2.0mm×100mm，3μm)，由资生堂制造
流动相：A：0.1M乙酸铵/乙醇＝3/2(mL/mL)；B：0.1M乙酸铵/乙醇＝1/4(mL/mL)
梯度程序(B的浓度)：0％(0分钟)→0％(10分钟)→100％(25分钟)→100％(30分钟)
流速：0.3mL/分钟；柱温：40℃
检测波长：UV 245nm
<RSV-Ca中DENK的分析>
柱：Cadenza CD-C18(4.6mm×250mm，3μm)，由Imtakt Inc.制造
流动相：A：0.1％甲酸水溶液；B：含有0.1％甲酸的甲醇
梯度程序(B的浓度)：60％(0分钟)→75％(12分钟)→100％(20分钟)
流速：0.8mL/分钟；柱温：40℃
检测器：MS(极性：正离子模式：SIM；裂解电压：200；无水气体流速：5L/分钟；喷雾器：40psi；无水气体温度：250℃；汽化器温度：150℃)
[参考例4]
在氮气气氛下，将乙酰乙酸丙酯(EAA)(75.4g，523mmol)和正庚烷(518.1g)装入1L烧瓶中。将内部温度调整到20℃并加入三乙胺(58.2g，575mmol)。随后，将内部温度冷却到10℃，并在40分钟内逐滴加入三甲基甲硅烷基氯(61.4g，564mmol)。随后，将内部温度调整到20℃并将混合物搅拌1.5小时。通过过滤收集得到的晶体，并用257g正庚烷洗涤。将得到的母液在40℃的外部温度下在减压下浓缩。得到的MoSi的重量为110.5g，通过GC测定的纯度为99.1面积％，含有2.8％正庚烷。
[参考例5]
在氮气气氛下，将二异丙胺(52.9g，522mmol)和THF(244g)装入2L烧瓶中。将内部温度冷却到-25℃，在30分钟内逐滴加入2.5M正丁基锂在正己烷中的溶液(200ml)。在滴加完成后，将内部温度冷却到-73℃。随后，在1小时内逐滴加入在参考例4中获得的MoSi(106.4g)在THF(104g)中的溶液。在滴加完成后，在40分钟内逐滴加入三甲基甲硅烷基氯(61.9g，570mmol)在THF(69.8g)中的溶液。将反应混合物升温至室温，并在20℃的外部温度下在减压下浓缩。通过过滤收集得到的晶体，并将晶体用正庚烷(132g)洗涤，再次在20℃的外部温度下在减压下浓缩。得到的DiSi的重量为144.1g，并且通过GC检测的纯度为78.3面积％，含有2％正己烷、0.1％THF、0.16％正庚烷。
[参考例6]
在氮气气氛下，将二氯甲烷(45ml)和分子筛4A(1g)和(S)-1,1’-联-2-萘酚((S)-BINOL)(1g)装入100mL烧瓶中。在环境温度下逐滴加入四异丙氧基钛(1g)。将混合物搅拌2.5小时，过滤并在环境温度下在减压下浓缩。得到的残留物的重量为1.59g，其不需纯化直接用于下一反应中。
[参考例7]
在氮气气氛下，将ENAL(5g，13.25mmol)、在参考例6中制备的催化剂(0.21g)、氯化锂(0.2g，4.7mmol)和THF(75ml)装入300mL烧瓶中。在27℃的内部温度下加入四甲基乙二胺(1.46g，12.6mmol)。在相同温度下搅拌1.5小时后，在30分钟内逐滴加入在参考例5中制备的DiSi(10.3g)在THF(5ml)中的溶液。在相同温度下搅拌17小时后，将内部温度冷却到12℃，并加入98％硫酸(2.65g)和水(22.1g)的混合溶液。在搅拌10分钟后，将混合物静置以允许分配。将得到的有机层用5％碳酸氢钠水溶液(9.3g)洗涤，然后用饱和盐水(10.4g)洗涤，并在硫酸镁(4.3g)上干燥。在过滤后，将得到的母液在43℃的外部温度下在减压下浓缩。将残留物通过硅胶柱层析进行纯化(洗脱液：正庚烷和乙酸乙酯)。将含有目标产物的级分浓缩，以给出5-MOLP(5.8g)。通过HPLC检测的得到的5-MOLP的纯度为86.8面积％。
[参考例8]
在氮气气氛下，装入通过参考例7的方法合成的5-MOLP(0.1g)、甲基叔丁基醚(1mL)和水(1mL)。在环境温度下加入2N氢氧化钠水溶液(0.11g)。在环境温度下搅拌过夜后，将混合物静置并分离水性层和有机层。将得到的水性层加热到80℃的外部温度并搅拌13小时。在反应完成后，将混合物冷却到室温，加入甲基叔丁基醚(2ml)以允许分配。将得到的有机层在环境温度下在减压下浓缩。对残留物进行分析，发现包含的DENK的纯度通过HPLC分析为93.5面积％。
得到的DENK的1H-NMR如下所示。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ1.30(6H,d,J＝6.4Hz),1.80(1H,m),2.30(3H,s),3.52(3H,s),3.59(3H,s),6.08(1H,d,J＝16.4Hz),6.22(1H,m),7.15(4H,m),7.65(2H,m)
[实施例14]
(DOXP的生产)
使用通过与上述参考例1中相同的方法和通过与上述实施例2中相同的方法生产的DHAB，生产DOXP。
(细胞的制备)
细胞通过与上述参考例3中相同的方法来制备，以给出重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH。
(DOLP的合成)
(1)生物反应
将离子交换水(900mL)、葡萄糖水(212.5g)、磷酸氢二钾(18.5g)、磷酸二氢钾(31.0g)和甘油(480.0g)装入5L反应罐中并在其中溶解。然后，在其中装入上面获得的重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109/pKV32OCR1-GDH的冷冻细胞((202.4g)和NADP+(552mg)并悬浮。将上面获得的DOXP(57.6g，110.81mmol)溶解在DMSO(496.8g)中，并将所述溶液添加到上述细胞的悬液。在45℃～52℃的内部温度下将混合物搅拌6小时，同时通过滴加24％氢氧化钠水溶液维持pH 6.0。在反应完成后，用98％硫酸将混合物调整到pH 5.0，并将混合物在65℃的内部温度下搅拌1小时。得到的DOLP的HPLC纯度为92.0面积％，含有5.1面积％的5-MOLP。
将得到的反应混合物离心，获得由细胞和得到的反应产物构成的沉淀物。将得到的沉淀物进一步悬浮在20％甲醇水溶液(11.5kg)中并离心。
(2)DOLP萃取
将上面获得的沉淀物和氯化钠(230g)悬浮在丙酮(1.72kg)中，并进行固液分离。
(3)DOLP结晶
将得到的DOLP在丙酮中的溶液在减压下浓缩。向得到的残留物添加1-丙醇(973g)并将混合物在减压下浓缩。加入水(192g)，并将温度冷却到5℃以允许晶体沉淀。随后，加入水(96.9g)并进行固液分离。将得到的晶体在减压下干燥。在干燥后晶体的重量为45.9g(得率为80％)，纯度为98.80面积％，含有1.5面积％的5-MOLP。
在氮气气氛下向通过上述方法获得的晶体(DOLP)(35.0g)加入甲苯(242.2g)。随后，通过加热到62℃将混合物溶解，将温度调整到42℃左右，并加入DOLP的晶种。在搅拌3.5小时后，加入甲苯(60.5g)。将温度冷却到0℃并通过固液分离回收晶体。将得到的晶体在减压下干燥。干燥后DOLP的量为32.5g(回收得率93％)，纯度为99.3面积％，含有0.4面积％的5-MOLP。
在氮气气氛下向得到的晶体(DOLP)(30g)加入甲苯(207.6g)，并将混合物加热到61℃以溶解晶体。将得到的溶液冷却到40℃以允许结晶。在老化1小时后，加入甲苯(51.7g)，将混合物冷却到0℃，并通过固液分离来回收晶体。将得到的晶体在减压下干燥。干燥后DOLP的量为28.3g(回收得率94％)，纯度为99.6面积％，含有0.16面积％的5-MOLP。
(RSV-Ca的合成)
在氮气气氛下，将通过上述方法获得的DOLP(10g，19.1mmol)和甲基叔丁基醚(44.0g)装入反应容器中，加入脱盐水(100g)。在25℃左右的内部温度下，在5分钟内向其逐滴加入2mol/L氢氧化钠水溶液(10.4g，19.3mmol)。在搅拌6小时后，将混合物分配，并将得到的水性层在80℃的外部温度下加热。在加热8小时后，向溶液加入甲基叔丁基醚(22.0g)。将得到的溶液搅拌10分钟，分离并除去有机层，并将水性层在减压下浓缩到液体量为80ml。将得到的溶液调整到25℃左右的内部温度，在25分钟内逐滴加入预先混合的单水乙酸钙(3.5g)和脱盐水(20g)的溶液。将得到的悬液在25℃左右的内部温度下搅拌1小时，冷却到0～5℃，并通过过滤收集沉淀的晶体。将回收的晶体在40℃下在减压下干燥。
得到的晶体为8.8g(得率为91％)并含有0.9％水分。作为HPLC分析的结果，得到的瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)晶体的化学纯度为99.95面积％，并含有0.02面积％的由上述式(12)所表示的化合物7-(4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-(甲磺酰基甲基氨基)嘧啶-5-基)-5-羟基-3-氧代-6-庚酸正丙酯(在后文中称为“5-MOLA”)和91ppm的DENK。从与干燥后DOLP的分析结果的比较明显看出，5-MOLA含量降低到1/20。
[实施例15]
(RSV-Ca的纯化)
在氮气气氛下，将含有5-MOLA(0.09面积％)的瑞舒伐他汀钙(7.5g)、甲基叔丁基醚(32.6g)和水(22.2g)装入500ml烧瓶上，加入1N盐酸(15.8g)并在其中溶解。将得到的溶液搅拌2.5小时并静置，以允许分配。向得到的有机层添加水(29.4g)和2N氢氧化钠水溶液(8.4g)。在搅拌10分钟后，将混合物静置以允许分配。在80℃的外部温度下加热的同时，将得到的水性层搅拌34小时。随后，将混合物冷却到室温，并用甲基叔丁基醚(38ml)萃取两次。将得到的水性层在50℃的外部温度下在减压下浓缩。随后，向浓缩的溶液加入乙酸，以将系统中的pH调整到7.5。将外部温度设定到20℃，并在30分钟内逐滴加入单水乙酸钙(2.7g)和水(14.8g)的混合溶液。随后，将外部温度冷却到0℃，并通过过滤收集沉淀的晶体。将回收的晶体在40℃的外部温度下，在减压下干燥。
得到的晶体为6.7g(得率为89％)并含有0.3％水分。作为HPLC分析的结果，得到的瑞舒伐他汀钙(RSV-Ca)晶体的化学纯度为99.94面积％，并含有0.02面积％的5-MOLA。从与瑞舒伐他汀钙在装料时的分析结果的比较清楚看到，5-MOLA含量降低至1/5。
[工业实用性]
本发明可以提供一种在经济的条件下和工业规模上高效生产具有高纯度的瑞舒伐他汀钙和用于它的中间体，而不使用极低温度的反应或昂贵的不对称催化剂的方法。
本申请是基于在日本提交的专利申请Nos.2014-21769、2014-209142和2014-209480，所述申请的内容整体并入本文。

Claims (31)

1.一种由下式(2)所表示的化合物的生产方法：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，所述方法包括：
(i)还原由下式(1)所表示的化合物的步骤：
其中R如对所述式(2)中的R所定义，-X1和-X2各自独立地是-OH或＝O，并且-X1和/或-X2是＝O，所述步骤包括将所述化合物与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液进行反应。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其中所述酶包含下述(A)、(B)或(C)任一者的多肽：
(A)具有源自于Ogataea minuta var.nonfermentans NBRC1473的羰基还原酶(OCR1)(SEQ ID NO：2)的多肽，
(B)由与SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列构成、并具有将所述式(1)所表示的化合物转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽，
(C)包含在SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列中1个或几个氨基酸被置换、缺失或添加的氨基酸序列、并具有将所述式(1)所表示的化合物转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其中编码所述酶的基因是包含下面(D)、(E)或(F)中示出的碱基序列的DNA：
(D)SEQ ID NO：1中示出的碱基序列，
(E)在严紧条件下杂交到由与SEQ ID NO：1中示出的碱基序列互补的序列构成的DNA、并且编码具有作用于所述式(1)所表示的化合物并将其转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列，
(F)具有在SEQ ID NO：1中示出的碱基序列中1个或几个碱基被置换、缺失或添加的碱基序列、并且编码具有作用于所述式(1)所表示的化合物并将其转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列。
4.根据权利要求1至3任一项所述的生产方法，其中所述步骤(i)在多元醇存在下进行。
5.一种由下式(1)所表示的化合物的生产方法：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，-X1和-X2各自独立地是-OH或＝O，并且-X1和/或-X2是＝O，所述方法包括：
(ii)将由下式(3)所表示的化合物：
与由下式(4)所表示的化合物在碱存在下进行缩合的步骤：
其中R1是具有1-8个碳原子的直链或支链烷基。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其中包括：
(iia)将下式(3)所表示的化合物：
与下式(4a)所表示的化合物在碱存在下进行缩合的步骤：
其中R2是不同于所述R的具有3-8个碳原子的支链烷基；以及
(iib)将在所述步骤(iia)中获得的下式(5)所表示的化合物：
其中R2如对所述式(4a)中的R2所定义，
与由R-OH所表示的醇进行反应的步骤，其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
7.根据权利要求5所述的生产方法，其包括：
(iia)将下式(3)所表示的化合物：
与下式(4a)所表示的化合物在碱存在下进行缩合的步骤：
其中R2是不同于所述R的具有3-8个碳原子的支链烷基；
(iib)将在所述步骤(iia)中获得的下式(5)所表示的化合物：
其中R2如对所述式(4a)中的R2所定义，
与由R-OH所表示的醇进行反应的步骤，其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基；以及
(ia)将具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理过的产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液作用于由下式(1a)所表示的化合物，以还原所述化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
从而获得由下式(1b)和/或(1c)所表示的化合物的步骤：
其中R如在所述式(1a)中对R所定义，
其中R如在所述式(1a)中对R所定义。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其中所述酶包含下述(A)、(B)或(C)中所示的任一多肽：
(A)具有源自于Ogataea minuta var.nonfermentans NBRC1473的羰基还原酶(OCR1)(SEQ ID NO：2)的多肽，
(B)由与SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列构成、并具有将所述式(1)所表示的化合物转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽，
(C)包含在SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列中1个或几个氨基酸被置换、缺失或添加的氨基酸序列、并具有将所述式(1)所表示的化合物转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽。
9.根据权利要求7所述的生产方法，其中编码所述酶的基因是包含下面(D)、(E)或(F)中示出的碱基序列的DNA：
(D)SEQ ID NO：1中示出的碱基序列，
(E)在严紧条件下杂交到由与SEQ ID NO：1中示出的碱基序列互补的序列构成的DNA、并且编码具有作用于所述式(1)所表示的化合物并将其转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列，
(F)具有在SEQ ID NO：1中示出的碱基序列中1个或几个碱基被置换、缺失或添加的碱基序列、并且编码具有作用于所述式(1)所表示的化合物并将其转变成所述式(2)所表示的化合物的活性的多肽的碱基序列。
10.根据权利要求7至9任一项所述的生产方法，其中所述步骤(ia)在多元醇存在下进行。
11.一种由下式(1a)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
12.一种由下式(1b)或(1c)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
13.一种由下式所表示的化合物的晶体：
其显示出在2θ＝8.7°、16.3°、19.7°、21.2°、21.3°(±0.2°)处具有特征峰的粉末X-射线衍射图案。
14.一种由下式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的生产方法：
所述方法包括(iiia)将通过根据权利要求1所述的生产方法获得的由所述式(2)所表示的化合物用碱水解，并将其与钙化合物反应的步骤：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基。
15.根据权利要求14所述的生产方法，其中所述步骤(iiia)中的所述水解在极性溶剂与选自醚溶剂、烃溶剂和卤代溶剂的至少一种溶剂的混合溶剂存在下进行。
16.根据权利要求14或15所述的生产方法，其中在步骤(iiia)中与所述钙化合物的反应在pH 5～10下开始。
17.一种由下式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的生产方法：
所述方法包括步骤(iiib)：用碱水解通过根据权利要求1所述的生产方法获得的由所述式(2)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
将其用酸处理，将获得的由下式(8)所表示的化合物与胺化合物反应：
将获得的由下式(9)所表示的化合物与碱进行盐交换，并将其与钙化合物进行反应：
其中R3和R4各自独立地是具有1-8个碳原子的烷基。
18.一种由下式(6)所表示的瑞舒伐他汀钙的生产方法：
所述方法包括步骤(iiic)：用碱水解通过根据权利要求1所述的生产方法获得的由所述式(2)所表示的化合物：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
在存在或不存在酸催化剂的情况下对其进行分子内脱水缩合，并将获得的由下式(10)所表示的化合物与钙化合物进行反应：
19.一种(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸正丙胺盐的晶体，其显示出在2θ＝19.8°、22.9°(±0.2°)处具有特征峰的粉末X-射线衍射图案。
20.一种(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲磺酰基)氨基]嘧啶-5-基]-(3R,5S)-3,5-羟基-6-庚烯酸二甲胺盐的晶体，其显示出在2θ＝6.6°、17.0°(±0.2°)处具有特征峰的粉末X-射线衍射图案。
21.瑞舒伐他汀钙，其包含不少于1ppm并且不超过1500ppm的由下式(11)所表示的化合物：
22.一种由下式(2)所表示的化合物的纯化方法：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，所述方法包括将所述化合物溶解在有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂中，并将其以15℃/小时或更低的冷却速率冷却，以沉淀由所述式(2)所表示的化合物的晶体。
23.一种瑞舒伐他汀钙的生产方法，所述方法包括：
(B)将由下式(12)所表示的化合物：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢，转变成由下式(13)所表示的化合物的步骤：
24.根据权利要求23所述的生产方法，其在所述步骤(B)之前，包括步骤(Aa)：通过将由下式(14)所表示的化合物与由下式(15)所表示的化合物的混合物在碱存在下进行水解：
其中R是具有1-8个碳原子的一级烷基或具有3-6个碳原子的二级烷基，
其中R如上所定义，
将所述混合物转变成由下式(16)所表示的化合物与由所述式(12)所表示的化合物的混合物：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢。
25.根据权利要求23或24所述的生产方法，其在所述步骤(B)之后，包含(C)除去由所述式(13)所表示的化合物的步骤。
26.根据权利要求25所述的生产方法，其在所述步骤(C)之后，包含(D)将通过所述步骤(C)获得的化合物与钙化合物进行反应的步骤。
27.一种包含由下式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙的纯化方法：
其中M是碱金属元素、碱土金属元素或氢，所述方法包括(B)将由式(12)所表示的化合物转变成由下式(13)所表示的化合物的步骤：
28.根据权利要求27所述的纯化方法，其在所述步骤(B)之前包括(Ab)将包含由所述式(12)所表示的化合物的瑞舒伐他汀钙溶解在溶剂中的步骤。
29.根据权利要求27或28所述的纯化方法，其在所述步骤(B)之后，包括(C)除去由所述式(13)所表示的化合物的步骤。
30.根据权利要求29所述的纯化方法，其在所述步骤(C)之后，包括(D)将通过所述步骤(C)获得的化合物与钙化合物进行反应的步骤。
31.一种瑞舒伐他汀钙，其包含不少于1ppm并且不超过1000ppm的由下式(13)所表示的化合物：
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