CN106011037A

CN106011037A - 一种嗜酸乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106011037A
Application number: CN201610634249.7A
Authority: CN
Inventors: 倪莉; 饶甜甜; 刘志彬; 张雯
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Xiamen Longli Industry And Trading Co ltd
Priority date: 2016-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-08-05
Also published as: CN106011037B

Abstract

本发明是关于一种嗜酸乳杆菌及其应用。所述的嗜酸乳杆菌是一种嗜酸乳杆菌FZU‑LA1301X，保藏号为：CGMCC No. 12453，保藏日期为2016年5月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。嗜酸乳杆菌FZU‑LA1301X可以在断奶仔猪体内定植，对胃酸、胆盐和肠液有较强的耐受性；在改进的发酵培养基中有较好的活菌数，喷雾干燥后有较高的存活率，可用于动物饲料添加剂。

Description

一种嗜酸乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嗜酸乳杆菌及其应用。

技术背景

目前普遍采用在饲料中添加抗生素药物的办法来预防动物腹泻，但抗生素会破坏消化道微生态平衡，还会导致免疫机能下降，并且容易在畜产品中残留，对人类健康构成极大威胁。因此，无残留、无毒副作用、无耐药性的抗生素替代品—微生态制剂应运而生。微生物饲料添加剂具有维护动物肠道健康、缓解不良应激、调节机体代谢和改善畜产品品质的功能。在饲料工业中人们将微生态制剂作为抗生素最有效的替代产品之一，寄希望于通过微生态制剂生产安全的畜产品，同时强化对环境的保护。

1989年，美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料监察协会（AAFCO）公布了可用于饲喂的微生物；2008年，我国农业部1126号公告中规定了16种饲料微生物添加剂。主要有乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属和酵母菌属等。其中乳酸菌制剂作为饲料添加剂应用较多的有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌，制成乳酸菌发酵饲料、乳酸菌粉和乳酸菌提取物。

在16种饲料级微生物添加剂中，嗜酸乳杆菌具有调节肠道菌群平衡、增强动物免疫力、提高生产性能等诸多功能,并且由于乳酸菌的产酸功能,还可以替代饲料中的酸化剂,因此被认为是一种理想的微生态制剂。但嗜酸乳杆菌耐温性不佳，活性下降快，产品中活菌数很难达到规定的最小活菌限量10⁶cfu/g。因而选育耐高温菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合紫外诱变和高温驯化后得到的嗜酸乳杆菌，使得该嗜酸乳杆菌具有良好的耐温性和耐消化能力。

本发明提供的菌株是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)FZU-LA1301X，保藏号为：CGMCC No. 12453，保藏日期为2016年5月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

1、通过紫外诱变筛选得到具有较强耐消化能力的嗜酸乳杆菌；

2、对耐消化菌株通过高温驯化得到耐温性良好的嗜酸乳杆菌；

（1）人工胃液的配制

用1mol/L的HCl将MRS液体培养基的pH值调至3.0—5.0，121℃灭菌20min，无菌添加胃蛋白酶3-10 mg/mL，NaCl 0.3%—0.9%，配制模拟胃液。置于合适的温度中培养，通过平板计数法计算活菌数。

（2）不同胆盐浓度的配制

在MRS液体培养基中加入猪胆盐，使其浓度分别为0%—0.6%。将活化后的乳酸菌菌株按1%—5%的接种量接种于上述不同浓度的液体培养基中，再置于合适的温度中培养，通过平板计数法计算活菌数。

（3）人工肠液的配制

用1mol/L的NaOH将MRS液体培养基pH值调至6.0—8.0，121℃灭菌20min，无菌添加胰酶3—10mg/mL，猪胆盐0.03%—0.3%，NaCl 0.3%—0.9%，配制模拟肠液。置于合适的温度中培养，通过平板计数法计算活菌数。

3、本发明所述的在MRS液体培养基的基础上添加蔗糖、乳糖和麦芽糖作为碳源；不同浓度的蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白胨为氮源；3%～5%浓度的黄瓜汁、西红柿汁和胡萝卜汁为增殖因子；分别调节接种量至1%～5%、初始pH值5.8～6.2和取样时间，嗜酸乳杆菌在优化后的培养基中有较高的活菌量，达5.0×10⁸ cfu/mL～5.0×10⁹ cfu/mL。

4、采用喷雾干燥技术制备乳酸菌制剂，以阿拉伯胶、麦芽糊精、可溶性淀粉为喷雾干燥的壁材，分别在10-30%的浓度下进行喷雾干燥，测定菌粉中的活菌数。嗜酸乳杆菌在喷雾干燥后有较高的活菌数5.0×10⁸ cfu/g～5.0×10⁹ cfu/g，可用于动物的饲料添加剂。

5、前述的嗜酸乳杆菌的应用，其中所述的嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X用于动物的饲料添加剂进行断奶仔猪的饲喂，结果是能有效的促进断奶仔猪的生长，明显提高仔猪的生长性能，且将降低腹泻率和死亡率降至5%之内。菌剂在仔猪饲料中的添加量为50-300g/t。

借由上述的技术方案，本发明通过紫外诱变和高温驯化得到一株耐消化能力和耐温性良好的嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X，该菌株在发酵培养基中有较高的活菌数，喷雾干燥后有较高的活菌数，且乳酸菌制剂具有促进仔猪生长和降低腹泻率、死亡率的能力。

附图说明

图1本发明嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X的光学显微镜图。

图2为驯化前后菌株的生长曲线图。

图3为微胶囊贮藏稳定性图。

具体实施方式

实施例1：

嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X的诱变驯化

将MRS发酵液于4000r/m离心15min，重悬于生理盐水中，调整菌体浓度为10⁸cfu/mL，制成细胞悬浮液。将菌悬液在最佳的诱变时间（致死率在70%-80%）照射后，稀释适合的倍数后涂布于MRS固体培养基中，置于37℃中培养24h，以耐消化能力为筛选指标，选取最佳的突变菌株嗜酸乳杆菌FZU-LA1301Y。

将紫外诱变得到的突变株接种于MRS液体培养基中37℃培养至对数生长期，转移至42℃环境中继续培养24h，再转接至MRS液体培养基，同时平板计数其存活率。在42℃中反复传代5代，使其连续2-3代的存活率达90%以上，再将培养温度提高至45℃，筛选连续2-3代的存活率达90%以上的菌株，再继续提高驯化温度。最终得到能耐46℃的嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X。

获得的嗜酸乳杆菌保藏号为：CGMCC No. 12453，保藏日期为2016年5月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

如附图1所示，嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X菌落形态呈白色、圆形，边缘完整，表面光滑。在光学显微镜下细胞形状为杆状，革兰氏染色呈阳性。

实施例2：

嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X耐消化能力实验

1、相关配方

（4）人工胃液的配制

用1mol/L的HCl将MRS液体培养基的pH值调至3.0、3.5、4.0、4.5，121℃灭菌20min，无菌添加胃蛋白酶5mg/mL，NaCl 0.5%，配制模拟胃液。置于合适的温度中培养，通过平板计数法计算活菌数。

（5）不同胆盐浓度的配制

在MRS液体培养基中加入猪胆盐，使其浓度分别为0%(对照)、0.15%、0.3%。将活化后的乳酸菌菌株按1%的接种量接种于上述不同浓度的液体培养基中，再置于合适的温度中培养，通过平板计数法计算活菌数。

（6）人工肠液的配制

用1mol/L的NaOH将MRS液体培养基pH值调至6.0、7.0、8.0，121℃灭菌20min，无菌添加胰酶5mg/mL，猪胆盐0.3%，NaCl 0.5%，配制模拟肠液。置于合适的温度中培养，通过平板计数法计算活菌数。

2、实验结果

表 1 FZU-LA1301X在模拟胃液下的菌数Log(CFU/mL)

表2 FZU-LA1301X不同胆盐浓度下菌数Log(CFU/mL)

表 3 FZU-LA1301X在模拟胃液下的菌数Log(CFU/mL)

在1%的接种量下，嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X对胃酸、胆盐和肠液都有很好的耐受性，在胃酸环境中3h后，活菌数活菌数是上升的，说明该菌株能顺利通过胃环境且保持一定的活菌数到达肠道；0%—0.3%的胆盐浓度对嗜酸乳杆菌无抑制作用，相较于0h，24h时的活菌数在增加；同样，肠液环境对活菌数影响不大，说明该菌株能耐受肠液环境且在肠道中存活。

实施例3：乳酸菌制剂的制备

1、采用喷雾干燥技术制备乳酸菌制剂，以阿拉伯胶为喷雾干燥的壁材，设置进口温度160℃、壁材浓度20%，进料速率400mL/h和壁材比例1:9，喷雾后活菌数为8.70 log CFU/g。

2、测定乳酸菌制剂的包埋率和稳定性

微胶囊的包埋率是评价微胶囊质量的重要指标之一，是指微胶囊中的活菌数与产品中的活菌数的比值。乳酸菌制剂包埋率为72.18%。

稳定性是含活菌制剂微胶囊质量评价中的重要指标，为评价微胶囊的货架稳定性，将喷雾后的微胶囊分别置于常温（约25℃）和4℃条件下贮藏，并定期测定其活菌数，结果如图3所示。无论是在4℃还是常温保存，嗜酸乳杆菌的活菌数都呈下降趋势，但在4℃贮藏时下降比较缓慢，第3天到第45天，活菌数从7.89 log CFU/g下降至7.0 log CFU/g，第90天时活菌数为6.23 log CFU/g；而常温贮藏下降一个数量级大约10-15天，第30天时活菌数为6.08 log CFU/g。

实施例4：乳酸菌菌剂的应用

1、实验方法

1.1 断奶仔猪生长性能测定

实验共分4组，每组3个重复，每个重复50头断奶仔猪。其中，以不添加任何添加剂为对照组，以喷雾干燥后的乳酸菌菌粉为实验组，试验期30天。饲喂方法见表4。

表4 饲喂试验分组

断奶仔猪生长性能测定主要包括以下指标：平均日增重、平均日采食量、料重比、腹泻率和死亡率。

平均日增重测定：每天对断奶仔猪进行空腹称重，并记录当天每头仔猪的初重和末重，计算平均日增重。

平均日采食量测定：记录各组每天饲料实际消耗量，计算平均日采食量。

料重比(即饲料转化率)计算：平均日采食量／平均日增重。

腹泻率：每天观察断奶仔猪的腹泻情况，及时记录腹泻个体，并按腹泻率(％)=实验期内某组腹泻总次数／(实验期内某组猪总头数×饲养天数)方法来计算腹泻率。

死亡率：记录类似于腹泻率，按死亡率(％)=实验期内某组死亡头数／实验期内某组猪总头数计算死亡率。

1.2 断奶仔猪粪便样品微生物

试验结束时，各组随机采集新鲜粪便样品，用选择性培养基测定其中的乳酸菌及大肠杆菌的活菌数变化情况，并记录。

2、实验结果

各实验组对断奶仔猪生产性能和腹泻的防治效果的影响见表5。实验前仔猪的初始重无显著差异，符合实验要求；在均日增重方面，乳酸菌组较于对照组，有显著性差异（P<0.05）；腹泻率方面，与对照组相比，乳酸菌组腹泻率下降了57.55%；死亡率方面，与对照组相比，乳酸菌组死亡率下降了40.03%，可见在饲料中添加乳酸菌能防治仔猪腹泻，降低断奶仔猪的死亡率。

表5 乳酸菌制剂对断奶仔猪生长性能的影响

注：同行肩标小写字母或无字母表示差异不显著（P>0.05），小写字母不同表示差异显著（P<0.05）

乳酸菌、地衣芽孢杆菌和酵母对断奶仔猪粪便微生物菌群的影响如表6所示。与对照组相比，实验组的仔猪粪便中乳酸菌数量显著高于对照组，而大肠杆菌数量明显低于对照组。

表6 乳酸菌制剂对断奶仔猪粪便微生物菌群的影响

综上所述，本发明中经过紫外诱变和高温驯化得到的嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X具有良好的耐温性和耐消化能力，在改进后的培养基中培养后有较高的活菌数，并且，相应的乳酸菌制剂可以显著提高断奶仔猪的生长性能，有效地降低腹泻率和死亡率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)FZU-LA1301X，保藏号为：CGMCC No. 12453，保藏日期为2016年5月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌，其特征在于：嗜酸乳杆菌FZU-LA1301X经过高温驯化，能在45℃环境中生长，具有一定的耐消化能力。

3.如权利要求1所述嗜酸乳杆菌制备获得的菌剂。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中嗜酸乳杆菌的活菌数5.0×10⁸cfu/g～5.0×10⁹ cfu/g。

5.如权利要求3所述嗜酸乳杆菌菌剂在断奶仔猪饲料添加剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：菌剂在仔猪饲料中的添加量为50-300g/t。