CN105980558B - 样品制备方法和设备 - Google Patents
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Abstract
一种具有靶标富集的制备核酸样品的方法,采用反应容器(11),其中向样品加入螯合剂并加热至约99℃以提供粗裂解物。提供PNA探针,浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。PNA探针可附着珠(26),珠(26)初始包埋于蜡主体(17)并在加热期间释放,从而其自由移动并接触PNA探针和靶DNA。结合发生后,所述珠沿着蜡(17)磁性吸引回口袋(16)中,蜡(17)能在移出反应容器前凝固。
Description
引言
本发明涉及制备用于分析的样品,如组织或血液样品,或有核酸(NA)(如DNA或RNA)的任何其它样品。
从样品分离和纯化感兴趣NA是在法医学、食品安全、医学等领域的分子生物应用中的关键步骤。样品裂解和全核酸提取技术通常是复杂的、耗时、需要技术人员或机器人、需要昂贵的消耗品和增加交叉污染的风险。复杂性对人工和自动系统等构成问题,相似地,越简单系统越稳健。当提取自较大量样品时,盐的共沉淀(其可抑制下游化学反应)和玻璃微纤滤器的NA过载是常见问题。过量DNA能抑制PCR,因为隔绝了扩增所需要的Mg2+。这限制可用的总NA提取的量,当提取物中的靶DNA相对稀少时这比较麻烦。总NA提取对于大部分基因检测而言不必要。纯化感兴趣序列会在许多情况下优选。另外,许多技术效果好(PCR)或甚至需要更短的NA模板(如下一代测序)。
多个液体处理步骤能导致不同DNA或RNA损失或提取效率不均匀。μRNA由于表达变化而在早期疾病鉴定中变得更重要,然而μRNA特异性试剂盒昂贵,且因为尺寸小(18-24bp),μRNA可能在许多提取技术中丧失。Poly(T)探针有时用于从总RNA提取中选择性捕获信使RNA(mRNA)。然后,富集的mRNA部分可进行测序以分析不同基因的相对表达(外显子组分析)。此表达概况包含有价值的信息以用于农业和医疗诊断,或组织培养物对新药物疗法的反应。然而,mRNA仅为1-5%的总RNA(~80%是核糖体RNA),且现有提取方法易导致稀有材料损失或改变不同序列的相对频率。另外,RNA特别容易受破坏,通常通过普遍存在的环境RNase。简单快速提取感兴趣的靶NA(尤其是稀有或脆弱种类如mRNA)会提高下游分析的质量。最后,现有靶向mRNA的试剂盒一般昂贵(每样品大于€25)。鉴于遗传分析技术的发展,这类样品制备成本是使这些技术可用于工业和医疗部门用户的一大障碍。
US2003/0059789(Efimov等)描述寡核苷酸类似物、合成方法和使用方法。其在靶标富集中使用PNA。
US2004/0161788(Chen等)描述有3个区段的样品处理管。其看来描述复杂的多试剂步骤、多室和多阀门系统。提及螯合剂,即EDTA。这显然作为一些示例中的抗凝剂,而另一些示例中于靶标富集期间在DNA提取后使用。
Michele K.Nishiguchi等:“DNA分离程序(DNA Isolation Procedures)”2002年1月1日,Birkhauser Basel,Basel ISBN 978-3-03-488125-8第249-287页描述多种DNA分离程序。这教授数种DNA分离方法,包括向样品加入含ChelexTM和EDTA即2种螯合剂的缓冲液并在100C加热12分钟(265-266页:“方案4”)。
需要有改善的方法和设备用于简单快速的NA提取,这尽可能减少加工和取样期间NA交叉污染和损失的风险。另一目的是破坏敏感NA(特别是RNA)的步骤更少且时间更少。另一目的是其应仅靶向大样品或序列混合物中的感兴趣序列,或总RNA的mRNA部分。另一目的是使方法和设备简单、可重复及可再生,并能直接从大的介观流控(mesofluidic)样品有效进行序列特异性靶核酸提取和纯化,而用户输入最少。
本发明涉及实现一些或所有上述目的。
发明内容
根据本发明,提供具有靶标富集的制备用于分析的核酸样品以的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在反应容器中,向样品加入螯合剂直至细胞裂解以提供粗裂解物,和
(b)提供PNA探针,浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。
根据本发明另一方面,提供制备核酸样品以用靶标富集分析的设备,所述设备包括反应容器,用于向容器中的样品加入螯合剂直至细胞裂解的装置以提供粗裂解物,和提供PNA探针的装置,探针浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。所述设备还可进行任何如下所定义步骤的特征。
在一个实施方式中,所述样品与螯合剂一起加热。
在一个实施方式中,所述方法包括提供附着PNA探针的珠。优选地,所述珠在细胞裂解后提供且PNA探针有结合靶核酸的时间。在一个实施方式中,所述珠是顺磁性的或有磁性的。在一个实施方式中,所述珠的尺寸范围是50nm-5μm。
在一个实施方式中,所述PNA探针附着反应容器内部或在容器内的溶液中。在一个实施方式中,在粗裂解物冷却到低于裂解物退火温度(如63℃)后,使PNA探针和粗裂解物相互接触。
在一个实施方式中,执行步骤(a),从而靶核酸剪切成片段。在一个实施方式中,所述样品通过磁吸引来部分或完全形成流动。
在一个实施方式中,所述螯合剂浓度范围是相对于样品lw/v-20%w/v。
在一个实施方式中,所述螯合剂是含亚氨基二乙酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,如ChelexTM 100树脂(BioRad)。
在一个实施方式中,所述加热温度是70℃-99.5℃,优选范围98℃-99.5℃,持续至少5分钟以提供10-11范围的样品pH。
在一个实施方式中,所述珠在靶核酸附着PNA探针后磁性移除。在一个实施方式中,所述珠在磁体磁场中的表面上移除。在一个实施方式中,所述珠在磁体磁场中的主体(body)凹处或口袋中移除。在一个实施方式中,所述口袋包括油或蜡的载体。在一个实施方式中,所述油或蜡在反应期间处于液体形式而不施加磁场,并在施加磁场且所述珠被吸引到袋中后引起固化。在一个实施方式中,由于用热裂解,所述油或蜡熔化。在一个实施方式中,定位所述油或蜡,从而使其温度未达到裂解温度,而是更低的温度,其引起油或蜡熔化以释放珠。
优选地,所述油或蜡位于样品表面,在容器下端加热,其中油或蜡在熔化时由于漂浮而保持在表面顶部。
在一个实施方式中,所述容器细长且垂直的,在其下端加热容器,油或蜡主体被支撑在容器中的样品表面处或附近。
在一个实施方式中,所述油或蜡主体被支撑在容器内插入物下端的口袋中,且插入物还包括磁性装置以施加和撤回磁场。
在一个实施方式中,所述插入物有内部管道,在所述内部管道内,磁体可从分隔位置移动到足够靠近口袋的位置从而其向油或蜡主体施加磁场。在一个实施方式中,所述油或蜡包含油或蜡的双相和温控的主体以及包括离子液体的水,所述离子液体与水的可混和性根据物理参数如温度或pH而改变。
在一个实施方式中,所述螯合剂是离子液体的阴离子或阳离子所具有的官能团,其中当离子液体是水溶性时,该官能团从水性溶液中捕获靶阳离子,且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性,且其中离子液体、官能团和任何所捕获的靶分析物在相间移动,用于移出。
在一个实施方式中,离子液体的阴离子或阳离子具有PNA官能团,其中当离子液体是水溶性时,该官能团从水性溶液中捕获靶核酸,且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性,其中离子液体、官能团和任何所捕获的靶分析物以此方式在相间移动,用于提取和纯化靶分析物。
另一方面,本发明提供微生物写样品制备设备,包括:
反应容器,
加热器,用于在所述容器下端加热所述容器到足以裂解容器中样品的水平,所述样品带有分析物,
探针,
支撑物,保持带有包埋的顺磁性的或有磁性的珠的固态油或蜡主体,所述珠具有吸引探针的涂层,
其中所述探针固定化于支撑物和/或油或蜡主体的表面和/或容器内表面,
磁性装置,用于施加磁场,当蜡或油主体熔化时,在孵育后将珠吸引到支撑物。
在一个实施方式中,所述设备配置成用于从容器移出支撑物以移出珠,因为在所述主体重凝固后所述珠包埋于蜡或油主体和/或因为通过磁场将所述珠吸引到支撑物。
在一个实施方式中,所述磁性装置包括支撑物内的管道,在所述管道内,磁体可在支撑物下端附近位置与分隔位置之间移动。在一个实施方式中,所述支撑物具有带面向下的开面的口袋,其中啮合油或蜡主体。在一个实施方式中,所述装置包含用于分析所述分析物而不移出所述分析物的装置。
优选地,所述支撑物在上端包括所述分析装置。在一个实施方式中,所述分析装置包括环介导扩增装置。在一个实施方式中,所述分析装置包括电容传感器。在一个实施方式中,所述分析装置包括光学传感器。
在一个实施方式中,所述支撑物是主干,配置有头部以从材料移出样品。
在一个实施方式中,所述主干包括有凹处的尖端,在凹处侧壁中的至少一个接受器,以及凹处中的导引物,用于随着尖端被压入材料而径向挤压材料进入接受器。在一个实施方式中,所述导引物是指向远端的尖锥(spike)且接受器是凹处壁中的开口。在一个实施方式中,所述头部可从通过联锁连接的主干分离,这需要联锁固体部分与固体蜡中间体的摩擦配合,但蜡熔化导致分离,从而头部下降到容器底部。
另一方面,本发明提供制备微生物样品的方法,所述方法包括步骤:
将样品沉积到反应容器中,
在容器下端加热所述容器到足以裂解样品的水平,
提供探针,
在样品表面保持带有包埋的顺磁性的或有磁性的珠的固态油或蜡的主体,所述珠具有吸引探针的涂层,
加热蜡或油主体,从而油或蜡熔化且珠自由混合于样品,
施加磁场,当蜡或油主体熔化时,在孵育后将珠吸引到支撑物。
在一个实施方式中,所述方法包括从容器移出支撑物以移出珠的步骤,因为在所述主体重凝固后所述珠包埋于蜡或油主体和/或因为通过磁场将所述珠吸引到支撑物。
在一个实施方式中,所述用于裂解样品的加热在容器中低于蜡或油塞的位置进行,且所述加热足以在较低容器水平裂解细胞,并在较高容器水平熔化蜡或油。在一个实施方式中,所述方法包括分析所述分析物而不将其移出支撑物容器。
附图说明
通过以下关于其一些实施方式的描述可更清楚理解本发明,仅以举例方式给出附图,其中:
图1是本发明样品制备设备的透视图;
图2是图解的剖视图,显示内部组件;
图3是放大的横断面图,显示有包埋的珠的蜡塞的具体细节;
图4显示用于移出珠的设备;和
图5(a)-5(f)是系列图,显示另一实施方式的采样设备。
发明详述
在一些实施方式中,本发明使用肽核酸(PNA)作为探针。PNA是合成聚合物,具有由肽键连接的N-(2-氨乙基)-甘氨酸骨架以及通过亚甲桥(-CH2-)和羰基(-(C=0)-)结合的嘌呤和嘧啶碱基,允许其参与和其它PNA及NA的沃森-克里克结合。PNA最初开发作为靶向信使RNA并影响基因表达的药物类型,但后来显示出在NA杂交过程中的价值。PNA耐受极端pH和核酸酶降解。PNA探针结合的特异性使得更短的探针也能采用,特别用于结合μRΝΑ。由于其没有电荷,故不需要阳离子筛选的益处以允许其参与沃森-克里克结合PNA或NA。
ChelexTM提取导致低离子含量。离子浓度较低时,2条互补核酸链结合困难,因为其都带负电并在没有阳离子屏蔽此电荷的情况下往往相互排斥。这产生单链DNA,并防止使用DNA或RNA探针以从ChelexTM提取进行靶标富集。此低离子溶液、高pH和ChelexTM提取中的剪切被广泛视作此类提取的严重劣势。然而,通过使用PNA探针克服所述问题,这些劣势而转化为优势。PNA探针以高特异性结合互补DNA和RNA序列,即使是在低离子/高pH溶液中。所述独特但有利的ChelexTM提取与PNA探针组合可提供迅速、序列特异性核酸提取过程。
优选步骤的时间安排为:
(a)最初提供PNA探针,随后
(b)裂解细胞,从而ChelexTM和低离子溶液确保NA是单链并可用于结合PNA探针,和
(c)最后,提供珠以结合PNA探针。
参考图1-3,阐明样品制备设备1。设备1包括有热交换外壳4的基底2,所述外壳具有嵌入式座位3用于一个或多个独立样品制备装置10。各装置10包括管状外壳11,其顶口由帽12封闭,帽12具有带覆盖O环密封条14的肩状物的主体13。帽主体13的下部以向下延伸到管状外壳11的插入物15的形式作为帽主体13的延续。在其下端,插入物15形成面向下的凹处16,罩住蜡塞17。主体13也具有向下延伸通过其的盲孔18,在距凹处16约0.5mm终止。
装置10还包括棒19,其配置成垂直移动通过孔18,在其下端携带磁体20。这允许磁体20接近蜡塞17,但由孔18与凹处16之间的短固体塑料缺口分开。
如下详述,蜡塞17由蜡25形成,其内部是均匀分布的磁珠26,具有涂层(如链霉亲和素)以结合选定用于吸引管状外壳11中塞17下所形成体积内靶NA的探针。该体积包含裂解物且蜡塞17在凹处16内摩擦配合。塞子17是蜡25的圆盘形主体(如分子级石蜡),其内部是包埋的顺磁性珠26,这是聚苯乙烯和铁氧体纳米粒子的已知复合材料。
样品制备方法主要步骤
以下描述用设备1进行的本发明样品制备方法。各步的一般时间以括号给出。应理解所述方法可另外用不同设备进行,可能没有一些设备1的优势,如样品制备中的密闭环境。
向含ChelexTM 100(5-20%w/v)和水(如去离子水)的容器11加入感兴趣样品。所述容器随后加帽12。例如,样品可具有带分析物的载体液体且液面达到塞子17底部。(1分钟)。
如上所示,链霉亲和素包被的顺磁性珠26保持于口袋16中的蜡塞17内。帽12和塞子17的表面由于目前低于液面,在与感兴趣序列互补的冻干的、生物素化的PNA探针中包被。PNA探针随后进入溶液,因为其从表面游离。密封容器11下端由基底2加热到99℃,产生粗裂解物。对流热使蜡25熔化(如高于60℃),但珠26由磁体20保持在原位。(5分钟)。
基底处的温度下降到PNA探针和感兴趣NA的退火温度,允许结合。此温度是63℃。(3分钟)。移出磁体20,更高密度和亲水珠26掉出蜡塞17并进入裂解物,在该处其散布(circulate)并结合生物素化PNA探针和任何所捕获的靶NA。(5分钟)。磁体20通过孔18再插入,在体积顶部,一般在凹处16内再捕获散布的珠26(1分钟)。靶NA现在由珠安全转运(因此是“T珠”)并在蜡塞17内浓缩。帽12和蜡/珠一起从容器11中移出。PNA探针/靶NA混合物以磁力保持在凹处16内。其转运到分析站。有利地,由于包埋于蜡,污染的可能性很小。在分析站中,分离由PNA-NA沃森-克里克结合、生物素-链霉亲和素结合和顺磁性珠提供(1分钟)。
从上可理解完整样品制备过程在约15分钟内完成,从引入样品开始没有打开容器11。同样,加热提供在容器下部于约70℃-99.5℃低温裂解的效果,优选约97℃-约99.5℃。然而,在更接近塞子17的更高液面,温度更低,约55-65℃。这足以熔化蜡以释放珠26,但蜡保持于顶部,因为其比下面的液体轻并因而漂浮。温差还通过对流提供容器11内的混合。此对流足以充分混合组分以尽量增加靶NA与探针以及探针与珠26的接触。然而,此循环不足以均衡温度。这是因为容器11具有高纵横比。
更详细地,顺磁性珠(“T珠”)26直径为~2.8μm,链霉亲和素包被。一般,优选珠尺寸范围为100nm-5μm。
珠26良好分散于蜡25。帽在无菌包中。一包帽也可采用无菌包(如X96)。
序列特异性PNA探针在凹处16和容器11的表面上冻干提供。
此实施方式中,基底2包括Peltier装置用于加热和冷却。
容器11为聚丙烯SBS,带2D条形码,容量1.4ml。该管高度为40mm,内径为8.5mm且壁厚为1mm,因此适合对流加热。管11预填充有1ml(液柱高29.5mm,上面有10.5mm空气,范围为100-1300μ1)裂解缓冲液,所述缓冲液含有10%w/v(范围5-20%)ChelexTM 100树脂(Biorad)。ChelexTM是含亚氨基二乙酸基团的苯乙烯-二乙烯苯共聚物。其有助于通过离子交换纯化其它化合物并能结合过渡金属离子。ChelexTM溶液是碱性(pH 8.4-10),这与加热(如99℃)共同提供有效的样品裂解。然而,降解NA的核酸酶也在细胞裂解中释放。另外,ChelexTM树脂清除核酸酶作用所需的金属离子(辅因子),保护NA免于降解。用户移出铝箔封口并加入样品(如用unicore取自牛尸体的组织的窄的1μl塞)。
单块、注塑、无菌的聚丙烯帽12适合管11。帽12有螺丝头和橡胶O环14(直径都为8.5mm)以牢固密封进管11。拧入管11的帽12部分高度为11.5mm且外径为7.0mm。因此,凹处16会浸入裂解溶液。插入物15是直径3mm的圆柱体并延伸10.5mm,底部因而隔绝于裂解缓冲液。棒19手动插入孔18并固定有小的钕磁铁20(如Apex Magnets 12.0mm X 3.0mm磁体)。凹处16具有7.0mm外径、6.5mm内径和1mm深度。凹处或口袋填充有塞子17,塞子17具有会在中高温(例如>45℃)熔化的合适蜡(如分子级石蜡)。T珠26保持在原位并通过分散于固体蜡25而在储存期间防止聚集。这去除了使用前阻断和洗珠的需求,其在许多采用珠的现有系统中可能是个问题。PNA探针可在塞子17和帽12的表面上冻干。
帽12啮合管11,在裂解步骤中密封管。帽12的底端浸入裂解物。这引起冻干的PNA探针进入溶液。将加帽的管11/12置于99℃的加热板2。出现管底部与顶部之间的有利热差。基底处99℃区中的组织被裂解。所述体积顶部达到约72℃温度,这易熔化蜡塞17但不损坏链霉亲和素。珠26由磁体20原位保持,免受裂解物中的高pH影响。5分钟裂解步骤和NA释放后,管基底处的温度下降到PNA和感兴趣NA的退火问题(如63℃)。瑞利-贝纳尔对流以及游离溶液中存在PNA和感兴趣NA可在3分钟孵育步骤期间提供良好反应动力学和PNA-NA结合。
蜡25在此温度仍熔化。移出棒19和磁体20。T珠26的更高密度和亲水性质导致其掉入裂解物。T珠、PNA探针和靶NA的对流可在3分钟孵育步骤中提供良好反应动力学。生物素化探针和所结合的靶NA在链霉亲和素包被的T珠上捕获。再次使用(re-engage)棒19和磁体20。因为在裂解物环流,T珠26通过外磁场拉入熔化的蜡25。1分钟后,管11可从基板2中移出。蜡25与T珠26、PNA探针和靶NA一起凝固,所述T珠26、PNA探针和靶NA与裂解物分开并在蜡内安全密封。此富集的靶NA能安全保存,使其用于生物库(bio-banking)。
若需要,帽12现在能从管11中移出并置于另一容器。蜡包封有助于防止转移中的环境污染。将帽12置于0.5ml 2D条形码洗脱管,所述管填充有>80℃的去离子水。蜡25会在此温度熔化。棒19和磁体20脱离。珠26掉入第二管,其中PNA/NA的沃森-克里克结合会解开(melt)并洗脱NA。珠重新回到接受器,在该处其再次于蜡中捕获。
上述试验和条形码管设备特别适合机器人自动化操作,用于单次良好设计和标准SBS足迹96孔模式。一阵列的帽12能拧入多个架子的管11,其各自含有样品。类似地,96个棒19和磁体20的阵列能用温控基板根据试验需要自动参与或脱开。
我们的发明在装置中迅速提取和浓缩靶NA,这允许重复性和便于保存及转移至其它容器。加入样品后,用户友好型装置在完成过程剩余的数个步骤中完全密封,降低误差和交叉污染风险。所有试剂整合入装置。
在另一实施方式中,所述洗脱容器由啮合凹处16的分析容器取代。在此实施方式中,所述蜡熔化(>45℃)以产生液-液界面,通过其完整的T珠-PNA-NA复合体被引入分析容器。所捕获DNA的单链性质意味着下游反应如环介导等温扩增(LAMP)不需要初始变性步骤。如果分析容器整合入帽12,基板2能控制60℃的等温LAMP。
在另一实施方式中,额外组的珠(R珠)可纳入蜡塞,所述组有共价结合的用于附近(~100-5000bp)第二基因座的探针,其由T珠上的探针靶定。这使得第二珠连到T珠。此排列产生额外特异性并允许单倍型推断。第二珠过小以至于无法克服界面张力且不吸入蜡塞,除非连到T珠。可移出采样装置中蜡塞(1106)内捕获的R珠数为下游测定提供信息。
在另一实施方式中,R珠结合装置内置的多重传感器硅芯片上的不同、互补PNA探针。所述芯片能用去离子水冲洗而不影响PNA结合,因为PNA-DNA或PNA-PNA结合不需要阳离子屏蔽效应。分离的珠复合体能原位保存用于生物库。可稍后读取芯片的各传感器上捕获的珠数量,其传达关于样品中存在的各靶NA数目和彼此相对浓度的信息。芯片具有足够的敏感性以检测捕获珠(和因而的捕获NA),而不需任何NA扩增。这去除酶步骤(如PCR),显著简化此样品制备发明中的化学过程。
参考图4,提供设备50以从容器中的液体聚集珠52。其具有带内孔的主干54,其中磁体53移动以在珠52聚集于凹头51时与其啮合和脱开。凹形有利,因为其允许大量珠以紧密和紧凑构型撤出。
参考图5,设备100具有带有蜡主体102的主干101,所述蜡主体具有珠109。有单独的头部105和2个窗口108,头部105带有齿106、头部105内的尖锥107。
头部105通过联锁115连接主干101(图5(b)最佳说明),以主干101上的外环脊116和头部105上的内环117连接。这些制造成在蜡102存在下(固体时)用摩擦配合联锁。如此互联时,其形成统一设备以从材料如尸体采样。
头部105被压入材料并扭动,从而尖锥107的锥形面将组织挤出进入窗口108,当装置移出时其夹紧组织。
将装置100置于接受器120中,如图5(c)-5(f)所示,接受器120具有易碎膜122下方的裂解缓冲液123。加热接受器120,蜡102熔化,导致头部105与主干101分开。随着其落下,其带走不需要的基体材料,留下所需DNA附着珠109并在磁体150影响下向上移动。将主干置于含裂解缓冲液123的管120时,窗口108提供样品裂解期间样品与裂解缓冲液123之间的更好接触。所述机制类似如上就设备1所述的那些。
所述设备100、120具有如下优势:初始用作采样装置以取出小材料样品并随后用作测试装置。这使得采样工艺更简单、迅速和安全,因为采样不需金属手术刀和钳子。这还使取出的组织量标准化,也有助于使裂解物中用于下游分析的DNA和RNA浓度标准化。有利地,装置100、120的所有组分于密封后在一起。
在各种实施方式中,螯合剂(如亚氨基二乙酸)是离子液体的官能团(cf PierreBonhote,*,Ana-Paula Dias,Nicholas Papageorgiou,Kuppuswamy Kalyanasundaram,和Michael Gratze(1996)Inorganic Chemistry 35(5),1168-1178),其比水重并在室温形成双相系统,但在更高温度可混合。所螯合的阳离子(如Ca2+和Mg2+)保持在重于水性裂解物的层中。
在一个实施方式中,PNA探针是离子液体的官能团(cf Bonhote 1996),其具有不同于水的密度并在室温形成双相系统,但在更高温度可混合。
应理解本发明提供简单且交叉污染风险低的方法和设备。其仅需要低容量,有简单、迅速和独立的裂解。
使用螯合剂和PNA探针具有意外的优势。许多技术用Chelex提取时并不令人满意,例如限制性片段长度多态性。已知Chelex提取在PCR中发挥作用,因为其能采用单链和有点剪切的DNA作为模板。加入的小量(1:20)大部分时间不影响PCR化学。
我们实施方式的简单性,包括步骤最少和防止靶标损失的单管提取,迅速以及在更高密度材料如树脂上使用螯合剂(意味着核酸酶辅因子和螯合剂保留在容器中)是所有明显优势。低离子溶液和高pH防止NA结合NA,包括发夹和环,并确保任何靶NA可用于探针。低离子溶液和高pH通常被认为是ChelexTM提取的劣势且限制其在该领域的普及性。然而,在我们的发明中,此环境确保仅具有中性骨架和高pH抗性的PNA探针能结合靶标。标准DNA、RNA(或RNA衍生物)探针在这些条件下不结合靶标,即我们的试验高度特异。通过顺磁性珠选择性转运和保存靶NA不太可行,除非极不寻常地使用PNA探针与ChelexTM,采用的特征通常视作ChelexTM的独特劣势。
本发明的优选实施方式包括在引入链霉亲和素包被珠之前引入PNA探针。此PNA游离以在裂解物中循环并结合任何靶NA。这改善过程的动力学和速度。此设备允许维持珠与裂解物和生物素化靶标分离,直至合适时间过去。这随后通过移出磁场来完成,将珠释放到裂解物内。这允许控制过程的动力学而不需打开管。
本发明不限于所述实施方式。例如,使用螯合剂与PNA探针的机制可用于更多手动方式,而不需特定设备如设备1。同样,珠不必须包埋于蜡。其可另外以冻干形式或在胶塞中提供。同样,珠不必须从容器中移出用于分析。此情况下,分析原位发生。例如,分析方式可在帽内。此情况下,磁性机制可排列成运输珠到上室用于分析,可能通过支持物中的环形通道。这些实施方式具有使一切自始至终保持在同一密闭环境内的益处。
同样,任何实施方式的设备可与具有NA以外分析物的样品一起使用,如蛋白、细菌或其它微生物实体。
Claims (16)
1.一种具有靶富集的制备用于分析的核酸样品的方法,所述方法包括步骤:
在反应容器(11)中用施加的热量用螯合剂裂解样品以提供具有剪切成片段的靶核酸的粗裂解物,其中所述样品与所述螯合剂一起在70℃-99.5℃范围内的温度加热,并且所述螯合剂浓度范围是相对于样品l%w/v-20%w/v,和
提供PNA探针,浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸,
提供顺磁性的或有磁性的珠(26),所述PNA探针附着于所述珠(26),
其中所述珠分散于凹处或口袋中的固体油或蜡塞中,所述油或蜡位于样品表面,施加热以释放所述珠,从而所述蜡在融化时由于漂浮而保持在所述表面顶部,并且在靶核酸附着PNA探针后磁性移出所述珠,并且
其中:
所述油或蜡(25)在不施加磁场结合和捕获反应期间处于液体形式,并在施加磁场且所述珠被吸引到所述油或蜡中后通过冷却引起固化,或
熔化的油或蜡提供液-液界面,完整的珠-PNA探针-靶核酸复合体通过所述界面被引入分析容器。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述珠的尺寸范围是50nm-5μm。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中在所述粗裂解物冷却到低于裂解物退火温度后,使所述PNA探针和所述粗裂解物接触。
4.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所述螯合剂是含亚氨基二乙酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述螯合剂是ChelexTM 100树脂。
6.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所述加热的温度范围是98℃-99.5℃,持续至少5分钟以提供10-11范围内的样品pH。
7.如权利要求1所述的方法,其中定位所述油或蜡,从而其温度未达到裂解温度,而是更低的温度,其引起油或蜡熔化以释放珠。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述油或蜡位于样品表面,并且在容器下端(2)加热,其中油或蜡在融化时由于漂浮而保持在表面顶部。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述容器(11)是细长并垂直的,在其下端加热容器,且油或蜡主体(17)被支撑在容器中的样品表面处或其附近。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述油或蜡主体(17)被支撑在容器内插入物下端的口袋中,且插入物还包含磁性装置以施加和撤回磁场。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述插入物有内部管道(18),在所述内部管道内,磁体可从分隔位置移动到足够靠近口袋的位置从而其向油或蜡主体施加磁场。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述油或蜡包含油或蜡的双相和温控的主体以及包括离子液体的水,所述离子液体与水的可混和性根据物理参数而改变。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述物理参数是温度或pH。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述螯合剂是离子液体的阴离子或阳离子具有的官能团,其中当离子液体是水溶性时,该官能团从水性溶液捕获靶阳离子,且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性,且其中离子液体、官能团和任何所捕获的靶分析物在相间移动,用于移出。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述离子液体的阴离子或阳离子具有PNA官能团,其中当离子液体是水溶性时,该官能团从水性溶液捕获靶核酸,且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性,且其中离子液体、官能团和任何所捕获的靶分析物以此方式在相间移动,用于提取和纯化靶分析物。
16.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所述珠在细胞裂解后提供且PNA探针有结合靶核酸的时间;所述珠是链霉亲和素包被的且所述探针是生物素化的,并且所述探针和结合的靶核酸在所述珠上捕获。
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