CN105969909A - 一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的rapd标记及应用 - Google Patents

一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的rapd标记及应用 Download PDF

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陈美元
廖剑华
郭仲杰
李洪荣
蔡志欣
卢政辉
王泽生
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明提供了一个用于鉴定双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及其应用，双孢蘑菇菌株根据农艺性状不同可分为G型、H型、HG型等不同类型，利用RAPD分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增，仅G型菌株能扩增出2500bp特异片段。本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇G型菌株,而不用经过出菇试验。该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定亲本菌株的特性，极大地提高了双孢蘑菇杂交育种的效率。

Description

一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用。
背景技术
我国是世界上最大的双孢蘑菇科研、生产、加工与出口的国家，2015年全国产双孢蘑菇鲜品达230多万吨，占世界年产量的一半以上，产值100多亿元人民币，因此双孢蘑菇生产具有显著的经济效益、社会效益和生态效益。
福建省农业科学院食用菌研究所（本发明人单位）30年来收集世界各地的双孢蘑菇种质资源达450多株，保藏量占世界第三位，仅次于美国和法国。根据菌株的栽培农艺特性，结合酯酶同工酶表型分析，可把这些菌株区分为G型、H型、HG型等不同类型，其详细的农艺特征见下表。在杂交育种中需要选择不同类型的亲本，传统的筛选手段盲目性强，需要进行出菇来筛选，工作量巨大。
RAPD (随机扩增的多态性DNA)技术在生物学许多研究领域已得到广泛的应用，它克服了同工酶和RFLP等技术的一些缺点，快速、简便、灵敏度高、需样量少。本发明人通过大量的引物筛选和验证，找到了一个适用于双孢蘑菇菌株类型预测的、操作快速简便的分子标记。利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定用作亲本的G型菌株，不用出菇试验，省时省力，这对杂交育种中缩短育种周期、提高育种效率有着重要的意义。
发明内容
本发明基于分子标记技术，建立一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用。
本发明为一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用，是利用RAPD分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增。
利用RAPD引物对双孢蘑菇菌株基因组DNA进行RAPD-PCR，能特异性地扩增出2500bp的产物，所述RAPD引物的核苷酸序列为：5’-ACAACGCCTC-3’。
所述的RAPD-PCR方法按照本发明人文献 [陈美元,廖剑华,李洪荣,郭仲杰,卢政辉,蔡丹凤,王泽生. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报,2009,(04):149-156.]，具体条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，扩增42个循环；72℃延伸5min, 4℃保存。反应体系为：30 ng模板DNA，30 ng引物，0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液，用ddH2O将总体积补至20µL。
所述引物与标记条带在鉴别双孢蘑菇G型菌株上的应用。
本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇G型菌株，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物2500bp条带的有无来鉴定菌株类型，具有该条带的菌株为G型菌株，没有该条带的菌株为非G型菌株。
附图说明
图1 双孢蘑菇24个G型菌株的RAPD图谱，M: LambdaDNA/EcoRI+HindIII Markers；1-24：沪8213，8211，闽1号，As376，As1671，As1789，As321，As555，T-8205，A，D，沪101，21，22，175，751，福罐3，福罐10，厦前751，仙游841，沪102-1，黄岩62，浣沙176-4，Ag10。右边箭头指示特异条带位置，显示24个G型菌株均扩增出2500bp特异条带。
图2 双孢蘑菇24个非G型菌株的RAPD图谱，M: LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarkers；25-48：102-2，苏锡一号，T-03，111-455，111，浣沙176，浣沙176-3，245-6，F4，F20，Ag6，8132D，02，7001，7601，701，Ag18，台-1，0072，S46，50-1，125，浣沙176-2，日本118。右边箭头指示特异条带位置，显示24个非G型菌株均未扩增出2500bp特异条带。
具体实施方式
实施例1
1.Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2 、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，RAPD引物购自上海生工生物科技有限公司。所述RAPD引物的核苷酸序列为：5’-ACAACGCCTC-3’。
2.双孢蘑菇DNA提取与电泳
双孢蘑菇DNA提取与DNA电泳按照文献[陈美元,廖剑华,王泽生. 双孢蘑菇三种类型菌株的RAPD扩增研究. 食用菌学报,1998,5(4):6-10.]。
3.RAPD-PCR反应体系与条件
RAPD-PCR反应体系与条件按照文献 [陈美元,廖剑华,李洪荣,郭仲杰,卢政辉,蔡丹凤,王泽生. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报,2009,(04):149-156.]，反应体系为：30 ng模板DNA，30 ng引物，0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/LMgCl2，1 U Taq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液，用ddH2O将总体积补至20µL。扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，扩增42个循环；72℃延伸5min, 4℃保存。扩增产物20 µL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，GeneFinder荧光染料染色并拍照。
4.结果分析
RAPD-PCR检测结果如图1、图2，1-24号为双孢蘑菇G型菌株，扩增出约2500bp特异性DNA条带，检出阳性率为100%。25-48号为双孢蘑菇非G型菌株，均未扩增出2500bp特异性条带，检出阳性率为0%。因此，该标记与双孢蘑菇G型菌株性状紧密连锁。该标记与方法可以非常方便地对双孢蘑菇G型或非G型菌株进行区分和鉴定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院食用菌研究所
<120> 一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaacgcctc 10

Claims (3)

1.一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记引物，其特征在于：所述RAPD标记引物的核苷酸序列为：5’-ACAACGCCTC-3’。
2.利用权利要求1所述的引物区分双孢蘑菇菌株类型的方法，其特征在于：利用RAPD标记引物对双孢蘑菇菌株的基因组DNA进行PCR扩增，G型菌株扩增出2500bp的特异性条带，而非G型菌株不会扩增出该特异条带。
3.如权利要求1所述引物在鉴定双孢蘑菇G型菌株上的应用。
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CN105112547A (zh) * 2015-09-24 2015-12-02 福建省农业科学院食用菌研究所 用于鉴定双孢蘑菇非杂交菌株特性的rapd引物与方法

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张静: "双孢蘑菇品种间DNA分子标记遗传多样性与亲缘关系的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库，农业科技辑，D048-50》 *
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陈美元等: "双孢蘑菇丛生变异的RAPD 分析及差异片段的克隆", 《厦门大学学报》 *
陈美元等: "双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析", 《中国农学通报》 *

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