CN105969885A

CN105969885A - 一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒

Info

Publication number: CN105969885A
Application number: CN201610473965.1A
Authority: CN
Inventors: 陈实; 黎寒
Original assignee: JIANGSU XIONGMING MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU XIONGMING MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2016-09-28

Abstract

本发明公开了一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒。该试剂盒可以检测研究报道与阿尔兹海默症相关的10个致病基因，包括APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK3β、DYRK1A、Tomm40、CLU、PICALM、TAU。检测方法是：设计和合成各基因特异性引物，通过采集待测个体的标本，运用RT‑PCR技术，将各基因得到特异性DNA产物进行测序分析，然后将样本序列与正常基因序列进行比对，分析是否有致病突变，以评估个体患病风险。本发明之阿尔兹海默症基因诊断试剂盒能一次性检测出致病基因蛋白编码区（CDS）不同的致病突变位点，具有简便快速，准备可靠，特异性好，灵敏度高等优点。

Description

一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒

技术领域

发明涉及一种遗传性疾病的基因诊断试剂盒，更具体的说是一种阿尔茨海默症（又称为老年痴呆症）的基因诊断试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease， AD)，又称为老年痴呆症，是一种多发于老年人群的神经退行性疾病。该病由德国医生Alois Alzheimer于1906年首先记录和描述，表现为（1）其特征性病理改变为β-淀粉样蛋白沉积和Tau蛋白过度磷酸化形成神经细胞内神经原纤维缠结，神经元丢失伴胶质细胞增生，为神经退行性病变。该病早期表现为轻微记忆障碍，随着病情的发展，患者的认知能力（如记忆力、计算力、思维判断力等）逐渐衰退、智力减退、出现情感以及语言障碍，最终神经系统功能遭到严重破坏，导致死亡；（2）在美国AD及其相关疾病成为国家公共健康问题，其患病率在65岁及以上为3～11% ，年龄超过85岁为25%～ 47%。数据统计，目前我国65周岁以上人口约为1.3亿，占总人口的10.1%，患病多发生于65岁以上老人，约占4%-5%，且随着年龄增长，患病率增加，阿尔茨海默症后期生活不能自理，已严重影响到老年人的身心健康和生活质量，给患者.家庭和社会带来了沉重的经济负担。

阿尔兹海默症起病隐匿，进展缓慢。在早期阶段，AD很难鉴定是由于正常老化认知功能障碍还是轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment），后者往往预示着AD的可能。其认知功能障碍是全面的，大致分为早、中、晚期，其中早期主要表现为记忆力减退，尤其以近记忆力障碍为主，在这期间患者能够自理日常生活，故多被忽视。随着病情的发展，症状往往表现为语言障碍更持久，人格方面出现兴趣和始动性丧失，情绪迟钝或难以控制，逻辑思维，运动协调能力，记忆功能逐级到全部丧失，因吞咽困难而不主动进食，终年卧床，最后因身体瘦弱，多继发感染肺炎，压疮和心肾功能衰竭而死亡。

AD的诊断是根据美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所-阿尔兹海默及相关疾病学会（National Institute of Neurological Communicative Disorders andStroke-Alzheimer Disease and Related Disorders Association， NINCDS-ADRDA）的标准。根据这一标准分类“确诊”（临床诊断与病理确认）、“很可能”（典型的临床综合症而无组织学证实）或“可能”（非典型临床特点，没有可选择的诊断，没有病理证实）。根据NINCDS-ADRDA的诊断标准，一个确诊的AD是有经过临床诊断并有病例证实。临床诊断“很可能”的病例86%～90%得到尸检的支持。随着对疾病过程的认识增长，AD的临床表型不再是有排他性条款。对其确诊还必须结合磁共振成像的广泛颞叶内侧脑部结构影像学改变，正电子发射体层扫描（positron emission tomography， PET）的分子影像学异常和脑脊液（cerebrospinal fluid， CSF）分析、β-淀粉样蛋白的生物标记物等。

在全面性AD出现之前的早期阶段进行诊断是临床的一个挑战，目前主要采用详细的认知和功能评估方法进行筛选。美国精神病学协会的精神疾病诊断与统计手册公布的阿尔兹海默病的诊断标准包括记忆、语言、感知能力等8个认知领域，被广泛用于简易精神状态检查与评估。但由于阿尔兹海默病症状具有隐匿性和可逆性，使得早期识别该综合症成为困难。

根据上述心理测试的全面评估和正式诊断并结合相关影像学变化等，典型的AD并不难判断，然而用于临床上却过于严格。有些疾病（如抑郁症、甲状腺功能减退）和阿尔兹海默症临床表现很相似）。诊断AD还必须考虑和鉴别与记忆障碍及相关症状有关的内科.神经科或精神科疾病，如血管性痴呆、进行性核上性麻痹、脑淀粉样血管病等，以防止误诊。此外，由于主治医生的延误和患者不认识AD的早期症象，存在一定程度的漏诊。早期诊断AD患者会让他们家人朋友制定和参与照顾计划，以便更好地应对未来出现的神经退化过程。现有的药物在改善疾病病情发展方面有可能给患者提供有益的帮助。研究证据也表明，早期治疗会给患者和照料者以及整个社会节约经济效益。鉴于及时和准确诊断AD的挑战和效益，目前急需有助于阿尔兹海默症早期诊断工具的出现。

阿尔兹海默症的病因复杂，涉及遗传环境等多种因素相互协同作用。随着分子生物学的飞速发展，遗传因素越来越得到关注。越来越多与阿尔兹海默症相关的致病基因被发现，包括APP、PSEN1、PSEN2、GSK3β等。特别是APP基因和位于1号、14号上的PSEN1和PSEN2基因，在离体和在体实验中证明了基因突变与发病密切相关。目前发现的致病基因的致病突变也有多种，如PSEN1已报道100多个突变位点，基因APP致病突变多达60多个。这些突变包括碱基置换、缺失、移码、插入突变等，分布在各外显子上。

针对阿尔兹海默症早期隐匿性强，临床症状不明显，由于基因突变是阿尔兹海默症发病关键因素之一，利用基因诊断将是早期诊断的有效手段。在该技术帮助下，医生能够在病人未发病之前就能筛查出高危人群。它直接检测被检者某一特定基因的结构或者功能是否异常，相对于常规诊断，更注重个体基因状态，不仅可以对患者所患疾病做出判断，也可以对表型正常但携带某种特定疾病基因或者特定疾病的易感性做出判断。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)是体外扩增特异DNA片段的技术，具有快速，灵敏和特异性强等特点。

传统的等位基因特异性PCR结果直观可靠，但是一次只能鉴别一个突变位点。由于阿尔兹海默症致病基因多，各基因内又可表现为不同的突变位点，且多发生在蛋白编码区，应用RT-PCR技术结合现在快速发展的基因测序技术，将引物设计在蛋白编码区（CDS）两侧附近，可一次性检测出AD一个致病基因内所有外显子的不同位点突变，具有更强的适用性。目前尚未见到这一技术对AD疾病分子诊断的专利和报道，本专利方法的建立为AD的快速诊断和早期筛查提供技术支撑。

参考文献：

(1)Berchtold NC，Cotman CW. Evolution in the conceptualization of dementiaand Alzheimer’s disease: Greco-Roman period to the 1960s. Neurobiol Aging,1998, 19(3): 173-89

(2) Selkoe DJ. Alzheimer’s disease: genes，proteins，and therapy. PhysiolRev, 2001, 81(2): 741-66

发明内容

鉴于阿尔兹海默症致病基因多，且各致病基因可表现为不同的突变位点，多数都分布在蛋白编码区，应用RT-PCR技术结合现在快速发展的基因测序技术，可方便检测出阿尔兹海默症一个致病基因内所有外显子的多个突变。综合试剂盒所列所有致病基因的突变情况，可以获得测试样本与阿尔兹海默症相关致病基因的全面信息。本专利方法的建立为阿尔兹海默症的快速诊断和早期筛查提供技术支撑。

本发明的目的是提供一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒及检测方法，该试剂盒操作简便快速、准确可靠、特异性好，可应用于患者、表型正常的携带者及产前基因诊断，从而为临床诊断和早期的预防治疗提供参考。

本发明依据国内外对阿尔兹海默症（AD）的分子遗传学研究的成果，针对多个与AD相关的致病基因，包括APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK3β、DYRK1A、Tomm40、CLU、PICALM、TAU，阿尔兹海默发病与上述基因的蛋白编码区（CDS）基因突变密切相关。利用RT-PCR方法结合基因测序技术，达到全面检测该疾病患病风险的目的。

具体的技术方案是：

根据发明的一个方面，一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒，包括有用于扩增如下基因的引物组：APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK3β、DYRK1A、Tomm40、CLU、PICALM、TAU。

所述的引物组是由如下的引物对所组成，每个引物对中分别是由一条正向引物和一条反向引物所组成，其引物序列如下所示：

用于扩增APP基因的引物对：SEQ ID NO.1～2；

用于扩增APOE基因的引物对：SEQ ID NO.3～4；

用于扩增PSEN1基因的引物对：SEQ ID NO.5～6；

用于扩增PSEN2基因的引物对：SEQ ID NO.7～8；

用于扩增GSK3β基因的引物对：SEQ ID NO.9～10；

用于扩增DYRK1A基因的引物对：SEQ ID NO.11～12；

用于扩增Tomm40基因的引物对：SEQ ID NO.13～14；

用于扩增CLU基因的引物对：SEQ ID NO.15～16；

用于扩增PICALM基因的引物对：SEQ ID NO.17～18；

用于扩增TAU基因的引物对：SEQ ID NO.19～20。

根据本发明的另一个方面，包括有上述引物组的阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒。

所述的基因诊断试剂盒，每个引物对所在的扩增体系的组成是：cDNA模板2.0 μl、反应混合物25.0 μl、正向引物2.0 μl、反向引物2.0 μl、dd H₂O补足至50 μl。

所述的基因诊断试剂盒，还包括有RNA提取试剂和反转录试剂。

试剂盒的使用方法，包括如下步骤：（1）样品组织RNA的提取；（2）将所得RNA反转录成cDNA；（3）通过所述的引物组对cDNA样本进行PCR反应；（4）将所得扩增DNA片段测序；（5）测序结果与各基因的CDS区域碱基进行比对，判断有无突变。

有益效果

本发明的阿尔兹海默症基因诊断试剂盒及检测方法，是根据国内外对阿尔兹海默症的分子生物学和遗传学研究的结果，检测与阿尔兹海默症相关的一系列致病基因，包括APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK3β、DYRK1A、Tomm40、CLU、PICALM、TAU，根据各基因保守区设计引物，利用引物特异性扩增各基因的全部CDS区，所建立优化的RT-PCR反应体系结合测序技术保证了检测结果的快速性、准确性和灵敏性。使用本发明的基因诊断试剂盒，可以单管一次性PCR同时检测到一个基因的CDS区内全部的致病突变位点，能够覆盖大多数患者和携带者的诊断，具有简便、高效、准确等优点。该方法可运用于患者、携带者及产前诊断，可为临床疾病诊断提供重要的参考依据，也有利于对该疾病的早期预防治疗，具有巨大的普及和推广应用价值。

附图说明

以下图是根据本发明提供的试剂盒进行RT-RCR检测正常细胞株ND29194致病突变位点电泳结果。

图1是CLU基因扩增产物电泳图，泳道1是Marker，泳道2是CLU；

图2是APP 基因扩增产物电泳图，泳道1是Marker，泳道2是APP；

图3是APOE基因扩增产物电泳图，泳道1是APOE，泳道2是Marker；

图4是PSEN1基因扩增产物电泳图，泳道1是PSEN1，泳道2是Marker；

图5是PSEN2基因扩增产物电泳图，泳道1是PSEN2，泳道2是Marker；

图6是GSK3β基因扩增产物电泳图，泳道1是GSK3β，泳道2是Marker；

图7是DYRK1A基因扩增产物电泳图，泳道1是Marker，泳道2是DYRK1A；

图8是Tomm40基因扩增产物电泳图，泳道1是Marker，泳道2是Tomm40；

图9是PICALM基因扩增产物电泳图，泳道1是PICALM,泳道2是Marker;

图10是TAU基因扩增产物电泳图，泳道1是Marker，泳道2是TAU；

图11是Marker各条带大小分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件( 例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社) 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 基因的确定、引物设计以及试剂盒组成及扩增程序

本发明涉及的10个基因与AD疾病相关，已有文献报道了其相关性。10个基因的序列可以通过如下途径获得。

在网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 根据如下基因ID可检索到基因序列。

表1 基因ID

引物设计过程上，主要是根据各基因保守区进行设计，利用引物特异性扩增各基因的全部CDS区。正向和反向引物分别设计在5'-UTR和3'-UTR区，确保扩增产物能够覆盖全部的CDS区，能够使该试剂盒检测各致病基因全部CDS区上的突变位点。

以CLU基因为例，其mRNA序列如下所示，其中下划为设计引物所对应的结合区，用括号[]括起的部分为CDS区。设计引物的扩增产物可以包含全部的CDS区长度。

GCTTTCCGCGGCATTCTTTGGGCGTGAGTCATGCAGGTTTGCAGCCAGCCCCAAAGGGGGTGTGTGCGCGAGCAGAGCGCTATAAATACGGCGCCTCCCAGTGCCCACAACGCGGCGTCGCCAGGAGGAGCGCGCGGGCACAGGGTGCCGCTGACCGAGGCGTGCAAAGACTCCAGAATTGGAGGC[ATGATGAAGACTCTGCTGCTGTTTGTGGGGCTGCTGCTGACCTGGGAGAGTGGGCAGGTCCTGGGGGACCAGACGGTCTCAGACAATGAGCTCCAGGAAATGTCCAATCAGGGAAGTAAGTACGTCAATAAGGAAATTCAAAATGCTGTCAACGGGGTGAAACAGATAAAGACTCTCATAGAAAAAACAAACGAAGAGCGCAAGACACTGCTCAGCAACCTAGAAGAAGCCAAGAAGAAGAAAGAGGATGCCCTAAATGAGACCAGGGAATCAGAGACAAAGCTGAAGGAGCTCCCAGGAGTGTGCAATGAGACCATGATGGCCCTCTGGGAAGAGTGTAAGCCCTGCCTGAAACAGACCTGCATGAAGTTCTACGCACGCGTCTGCAGAAGTGGCTCAGGCCTGGTTGGCCGCCAGCTTGAGGAGTTCCTGAACCAGAGCTCGCCCTTCTACTTCTGGATGAATGGTGACCGCATCGACTCCCTGCTGGAGAACGACCGGCAGCAGACGCACATGCTGGATGTCATGCAGGACCACTTCAGCCGCGCGTCCAGCATCATAGACGAGCTCTTCCAGGACAGGTTCTTCACCCGGGAGCCCCAGGATACCTACCACTACCTGCCCTTCAGCCTGCCCCACCGGAGGCCTCACTTCTTCTTTCCCAAGTCCCGCATCGTCCGCAGCTTGATGCCCTTCTCTCCGTACGAGCCCCTGAACTTCCACGCCATGTTCCAGCCCTTCCTTGAGATGATACACGAGGCTCAGCAGGCCATGGACATCCACTTCCATAGCCCGGCCTTCCAGCACCCGCCAACAGAATTCATACGAGAAGGCGACGATGACCGGACTGTGTGCCGGGAGATCCGCCACAACTCCACGGGCTGCCTGCGGATGAAGGACCAGTGTGACAAGTGCCGGGAGATCTTGTCTGTGGACTGTTCCACCAACAACCCCTCCCAGGCTAAGCTGCGGCGGGAGCTCGACGAATCCCTCCAGGTCGCTGAGAGGTTGACCAGGAAATACAACGAGCTGCTAAAGTCCTACCAGTGGAAGATGCTCAACACCTCCTCCTTGCTGGAGCAGCTGAACGAGCAGTTTAACTGGGTGTCCCGGCTGGCAAACCTCACGCAAGGCGAAGACCAGTACTATCTGCGGGTCACCACGGTGGCTTCCCACACTTCTGACTCGGACGTTCCTTCCGGTGTCACTGAGGTGGTCGTGAAGCTCTTTGACTCTGATCCCATCACTGTGACGGTCCCTGTAGAAGTCTCCAGGAAGAACCCTAAATTTATGGAGACCGTGGCGGAGAAAGCGCTGCAGGAATACCGCAAAAAGCACCGGGAGGAGTGA]GATGTGGATGTTGCTTTTGCACCTACGGGGGCATCTGAGTCCAGCTCCCCCCAAGATGAGCTGCAGCCCCCCAGAGAGAGCTCTGCACGTCACCAAGTAACCAGGCCCCAGCCTCCAGGCCCCCAACTCCGCCCAGCCTCTCCCCGCTCTGGATCCTGCACTCTAACACTCGACTCTGCTGCTCATGGGAAGAACAGAATTGCTCCTGCATGCAACTAATTCAATAAAACTGTCTTGTGAGCTGATCGCTTGGAGGGTCCTCTTTTTATGTTGAGTTGCTGCTTCCCGGCATGCCTTCATTTTGCTATGGGGGGCAGGCAGGGGGGATGGAAAATAAGTAGAAACAAAAAAGCAGTGGCTAAGATGGTATAGGGACTGTCATACCAGTGAAGAATAAAAGGGTGAAGAATAAAAGGGATATGATGACAAGGTTGATCCACTTCAAGAATTGCTTGCTTTCAGGAAGAGAGATGTGTTTCAACAAGCCAACTAAAATATATTGCTGCAAATGGAAGCTTTTCTGTTCTATTATAAAACTGTCGATGTATTCTGACCAAGGTGCGACAATCTCCTAAAGGAATACACTGAAAGTTAAGGAGAAGAATCAGTAAGTGTAAGGTGTACTTGGTATTATAATGCATAATTGATGTTTTCGTTATGAAAACATTTGGTGCCCAGAAGTCCAAATTATCAGTTTTATTTGTAAGAGCTATTGCTTTTGCAGCGGTTTTATTTGTAAAAGCTGTTGATTTCGAGTTGTAAGAGCTCAGCATCCCAGGGGCATCTTCTTGACTGTGGCATTTCCTGTCCACCGCCGGTTTATATGATCTTCATACCTTTCCCTGGACCACAGGCGTTTCTCGGCTTTTAGTCTGAACCATAGCTGGGCTGCAGTACCCTACGCTGCCAGCAGGTGGCCATGACTACCCGTGGTACCAATCTCAGTCTTAAAGCTCAGGCTTTTCGTTCATTAACATTCTCTGATAGAATTCTGGTCATCAGATGTACTGCAATGGAACAAAACTCATCTGGCTGCATCCCAGGTGTGTAGCAAAGTCCACATGTAAATTTATAGCTTAGAATATTCTTAAGTCACTGTCCCTTGTCTCTCTTTGAAGTTATAAACAACAAACTTAAAGCTTAGCTTATGTCCAAGGTAAGTATTTTAGCATGGCTGTCAAGGAAATTCAGAGTAAAGTCAGTGTGATTCACTTAATGATATACATTAATTAGAATTATGGGGTCAGAGGTATTTGCTTAAGTGATCATAATTGTAAAGTATATGTCACATTGTCACATTAATGTCACACTGTTTCAAAAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.21)

采用的标准样品是从Coriell Institute for Medical Research 购买的人皮肤成纤维细胞，其详细信息如下，下述的信息经过Coriell Institute for Medical Research的确认鉴定。

表2 细胞样本信息

该试剂盒在使用中，首先提取样本的RNA，再将RNA逆转录为cDNA，接着通过PCR对cDNA进行扩增，将扩增产物进行测序，获知突变情况。每个基因都分别在单独的扩增体系中采用相应的引物进行PCR扩增。对引物设计以及扩增程序的循环往复的大量试验调整，并结合对模版量、引物的Tm值的相应的优化后，较优的引物及具体信息如下表3所示：

表3 引物序列

在进行基因扩增时，各个基因所对应的引物分别在一个单独扩增体系中进行扩增，较优地，经过大量试验摸索得到的PCR扩增程序是：

表4 扩增程序

实施例2 阿尔兹海默症的基因检测

根据实施例1的试剂盒，进行实施例2的应用，具体分别按以下步骤进行：

本发明提供的阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒，其检测的样品可以是待测个体的血液、体液、毛发、骨骼、细胞或组织标本等。本实施例中，采用同实施例1的标准细胞株。

一、待测个体人成纤维皮肤细胞RNA的提取：

1. 取待测样品加入1 ml Trizol液在冰上混匀，捣碎匀浆；冰上静置10 min；

2. 在匀浆液中加入200 μl氯仿，用力振摇15s，室温孵育10 min

3. 4℃，12000 g/min,l离心15 min

4. 取水相（上层），加入500 μl异丙醇，轻轻晃动，室温孵育10~15 min

5. 4℃，12000 g/min,l离心10 min

6. 弃上清，用1 ml 75%乙醇（v/v）洗涤一次，4℃，7500~10000g/min，离心5 min

7. 空气干燥超净工作台处晾干，用20～30 μl DEPC水溶解（若不能完全溶解可于55~60℃孵育5~10 min），得到RNA提取液。

二、样品RNA反转录为cDNA

取2 μl RNA提取液95℃预热5～10 min，加入含RT反应液的反应管，在PCR仪或者恒温水浴锅中按以下程序进行扩增反应：25℃，5 min，42℃孵育60 min，最后70℃，15 min使反转录酶灭活。最终得到RT-PCR反应模板。

RT反应液的组成是：

表5 RT反应液组成（20 μl反应体系）

三、对cDNA进行PCR扩增

取2 μl RT-PCR反应模板加入到48 μl 扩增体系中，每管中加入用于扩增一个基因的引物对，10个基因分别在10个管中进行反应，引物如表3所示，混匀后在PCR仪中按照表5中的程序进行反应。

PCR扩增中的扩增体系如表6所示。

表6 PCR扩增体系组成（50μl反应体系）

本发明中所述的反应混合物是指PCR反应过程中，所需要的DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺等必需组合的混合物。

四、电泳，PCR产物判断及测序

反应结束后，对产物进行电泳分离，对目的产物进行切胶后做T-A克隆，直接进行测序，委托南京金斯瑞生物科技公司。图1所示的是CLU基因的扩增产物的电泳结果，从图中可以看出，扩增产物呈清晰、单一的条带，可见其扩增效率高，无特异性产物出现，公开序列经过扩增后其产物大小预计在1571 bp，其实际大小为1571 bp，其大小与预期相符。经过测序，该细胞株样本的测序结果与其已知序列一致，证明了该引物组的可靠性。

其它基因的扩增结果如图2～10所示，从图中可以看出，对于其它基因的扩增产物大小也与预期的大小一致，且呈现单一、清晰的条带；将各个扩增产物切胶后进行测序，测序结果与该样本的已知序列一致，同样证实了该试剂盒能够对上述的其它基因进行可靠地扩增。

结果：

应用DNAMAN 软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，确定是否存在致病突变位点。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏雄鸣医药科技有限公司

<120> 一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒

<130> 无

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgcccg gtttgg 16

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctagttctgc atctgctc 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccttgagtcc tactcagccc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgatgcgtg aaacttggtg a 21

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggcgggga agcgta 16

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtccagccgg gaatcttgac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgtccggga ttcagacctc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccaaagagct ggttctgcct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgaaaagcc aagaggacga 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctttccaaac gtgaccagtg t 21

<210> 11

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<212> DNA

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<400> 11

gctggactct tccctccctt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agctttgccc tcttgtagcg 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctctgacct ctcccctagc ag 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaagcgccat tcagttccag a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaggcgtgca aagactccag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttcccatgag cagcagagtc 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggtggaggag ctgcagaga 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtcccaattt ccttcatggg c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atggctgagc cccgccagga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agccaaagcc gagtgacaaa 20

Claims

1.一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下基因的引物组：APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK3β、DYRK1A、Tomm40、CLU、PICALM、TAU。

2.根据权利要求1所述的阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒，其特征在于：所述的引物组是由如下的引物对所组成，每个引物对中分别是由一条正向引物和一条反向引物所组成，其引物序列如下所示：用于扩增APP基因的引物对：SEQ ID NO.1～2；用于扩增APOE基因的引物对：SEQ ID NO.3～4；用于扩增PSEN1基因的引物对：SEQ ID NO.5～6；用于扩增PSEN2基因的引物对：SEQ ID NO.7～8；用于扩增GSK3β基因的引物对：SEQ ID NO.9～10；用于扩增DYRK1A基因的引物对：SEQ ID NO.11～12；用于扩增Tomm40基因的引物对：SEQ ID NO.13～14；用于扩增CLU基因的引物对：SEQ ID NO.15~16；用于扩增PICALM基因的引物对：SEQID NO.17～18；用于扩增TAU基因的引物对：SEQ ID NO.19～20。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的基因诊断试剂盒，每个引物对所在的扩增体系的组成是：cDNA模板2.0 μl、反应混合物25.0 μl、正向引物2.0 μl、反向引物2.0 μl、dd H₂O补足至50 μl。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括有RNA提取试剂和反转录试剂。

5.权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）样品组织RNA的提取；（2）将所得RNA反转录成cDNA；(3)通过所述的引物组对cDNA样本进行PCR反应；（4）将所得扩增DNA片段测序；（5）测序结果与各基因的CDS区域碱基进行比对，判断有无突变。