CN105968143B - 一种具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物及其制备方法和应用，属于有机光电材料技术领域。该配合物包括C^N配体、金属中心和含有烷基链的辅助配体，结构式如下式所示。本发明的磷光铱配合物能够被可见光激发，产生在近红外区域的发射光，从而减弱激发光源对生物样品的损伤并具有较深的组织穿透深度。此外，该配合物有着良好的抗光漂白性能，在成像上可以实现对细胞组织较长时间有效的观测。本发明的磷光铱配合物可应用于溶酶体标记以及生物成像领域，其具有简单的化学结构以及良好的生物相容性，是很好的溶酶体靶向磷光探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物及其制备方法和应用，属于有机光电材料技术领域。
背景技术
目前研究较多的电致磷光材料主要包括铱、钌、铂、锇等有机金属配合物，其中磷光环金属铱配合物有着优异的磷光特性，例如高的量子产率，大的Stokes位移，长的磷光寿命，发光颜色的易调节性以及好的抗光漂白性，是目前研究得最多的一种磷光材料。并且磷光过渡金属配合物的发射寿命(几百纳秒到几十微秒)比荧光(几纳秒)长得多，这个特性不仅赋予其对氧气敏感的特性，还使其能够在时间分辨成像技术中发挥其特长，有效滤除背景荧光的干扰，目前，它们已广泛应用于生物成像和传感探针等领域中。申请公开号为CN104402936A的专利申请中记载了一种铱配合物的制备方法，但是其制备而成的铱配合物中配体结构只有一种，无法通过配体结构的调整而调节发光波长从而使电致发光器件的颜色覆盖整个可见光区。
溶酶体内部含有多种水解酶，这些酶能够降解几乎所有种类的生物分子，因此溶酶体是细胞内的消化器官。细胞自溶、防御以及对某些物质的利用均与溶酶体的消化作用有关，因此对活细胞中溶酶体进行生物成像具有重要意义。但是由于细胞一般没有明确有效的靶点，能够实现特定细胞靶向作用的化学小分子很少。目前为止，以特定细胞器为靶点，如溶酶体，能够在活体细胞中作用于这些靶点的，应用比较成熟的有染料和抗体两类。一般染料都会有光漂白性和光致毒性，在紫外可见光的照射下短时间内即失去荧光活性，或者产生单线态氧等极易对活细胞发生毒害作用的物质，不利于活体细胞的无损伤成像。抗体虽然低毒，但是价格昂贵、易失活的特性限制了其应用。申请公开号为CN101962536A的专利申请中记载了一种溶酶体靶向的荧光物质，但是其化学结构较复杂，生物相容性不是很好。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提出了一种具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物及其制备方法和应用，以实现对溶酶体的靶向功能，利于细胞的无损伤成像。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物，包括C^N配体、金属中心以及含有烷基链的辅助配体，该铱配合物具有如下结构式：
其中，C^N配体为下列中的任意一个：
为了解决上述另一技术问题，本发明提出的技术方案是：一种制备具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物的制备方法，该方法的合成路线如下：
具体步骤：室温下将化合物1与甲醇钠溶液搅拌反应22小时，然后向反应液中加入氯化铵反应6小时，反应结束后过滤掉未反应的氯化铵，将滤液旋干去除甲醇溶剂，得到浅黄色粉末，之后用乙醚洗涤三次，除去未反应的化合物1，再用乙醇-乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体化合物2；再将化合物2与乙酰乙酸乙酯在乙醇钠催化条件下加热回流24小时，旋干除掉溶剂后将固体溶于适量去离子水中，调节pH值至4-5，水中会有大量白色固体析出，过滤得该白色固体，并用水和乙醚洗涤三次，得到白色固体化合物3；将化合物3、溴己烷与K2CO3溶于丙酮后在氮气氛围中60℃回流搅拌过夜，再将反应液用水和二氯甲烷萃取三次除去残留的的K2CO3，收集有机相，用无水Na2SO4干燥后旋蒸除去有机溶剂，将得到的油状混合物用层析柱提纯，得到黄色油状液体化合物4；最后将化合物4和铱二氯桥在二氯甲烷与甲醇的混合溶剂中，在氮气氛围下55℃回流搅拌过夜，反应完成后待反应溶液温度降至室温，再向其中加入KPF6继续搅拌2小时，之后旋蒸除掉有机溶剂，并将得到的固体用层析柱提纯，得到红色粉末状固体Ir-alkyl(1-7)。
为了解决上述另一技术问题，本发明提出的技术方案是：具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物的应用，该磷光铱配合物应用于活细胞溶酶体的标记。
进一步的，该磷光铱配合物应用于细胞成像领域。
进一步的，该磷光铱配合物应用于生物标记领域。
进一步的，该磷光铱配合物应用于乏氧检测领域。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的磷光铱配合物能够被可见光激发，产生在近红外区域的发射光，从而减弱激发光源对生物样品的损伤并具有较深的组织穿透深度。另外，其具有长寿命的磷光发射能够在生物成像方面利用时间门有效地消除背景荧光以达到提高图像信噪比的目的，并且该配合物有着优秀的抗光漂白性能，在成像上可以实现对细胞组织较长时间有效的观测。本发明的磷光铱配合物可应用于溶酶体标记，生物成像，具有简单的化学结构以及良好的生物相容性，是很好的溶酶体靶向磷光探针。
附图说明
下面结合附图对本发明的作进一步说明。
图1.实施例3中铱配合物Ir-alkyl(7)的甲苯溶液(10-5M)的紫外-可见吸收光谱；
图2.实施例3中铱配合物Ir-alkyl(7)的甲苯溶液(10-5M)的发射光谱；
图3.实施例4中铱配合物Ir-alkyl(7)在Hela细胞中的MTT细胞毒性实验；
图4.实施例5中铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料的在A549细胞中的共染成像；
图5.实施例5中铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料的在Hela细胞中的共染成像；
图6.实施例5中铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料的在HepG2细胞中的共染成像；
图7.实施例6中铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料的在Hela细胞中的抗光漂白性实验；
图8.实施例7中铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料的在Hela细胞中的PLIM(a)和时间门成像(b～f)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实例。
实施例1：含烷基链的辅助配体的制备
化合物2的制备：取20ml甲醇加入50ml单口瓶中，加入50mg金属Na，室温下搅拌直至Na完全反应溶解，室温下将化合物1(24mmol)与甲醇钠溶液搅拌反应22小时，然后向反应液中加入氯化铵(26mmol)反应6小时，反应结束后过滤掉未反应的氯化铵，将滤液旋干去除甲醇溶剂，得到浅黄色粉末，之后用乙醚洗涤三次，除去未反应的化合物1，再用乙醇-乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体化合物2产率：83％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝9.69(s,4H),8.85–8.73(m,1H),8.45(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(td,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.85–7.71(m,1H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ＝162.67,150.33,144.37,138.76,129.01,124.00。
表1.合成化合物2的反应原料用量与产物的产量和产率
| 序号 | 化合物1 | 氯化铵 | 化合物2 | 产率 |
| 1 | 2.50g | 1.40g | 3.10g | 82％ |
| 2 | 2.50g | 1.40g | 3.17g | 84％ |
| 3 | 2.50g | 1.40g | 3.13g | 83％ |
化合物3的制备：将化合物2(6mmol)与乙酰乙酸乙酯(6mmol)在乙醇钠催化条件下加热回流24小时，旋干除掉溶剂后将固体溶于适量去离子水中，调节pH值至4-5，水中会有大量白色固体析出，过滤得该白色固体，并用水和乙醚洗涤三次，得到白色固体化合物3。产率：55％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝11.89(s,1H),8.69(d,J＝4.4Hz,1H),8.25(d,J＝7.9Hz,1H),8.00(td,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.60(dd,J＝6.9,5.1Hz,1H),6.25(s,1H),2.26(s,3H)。
表2.合成化合物3的原料用量与产物的产量和产率
化合物4的制备：将化合物3(1.5mmol)、溴己烷(6.0mmol)与K2CO3(5.25mmol)溶于丙酮(6ml)后在氮气氛围中60℃回流搅拌过夜，再将反应液用水和二氯甲烷萃取三次除去残留的的K2CO3，收集有机相，用无水Na2SO4干燥后旋蒸除去有机溶剂，将得到的油状混合物用层析柱提纯，得到黄色油状液体化合物4。产率25％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.72(ddd,J＝1.2,2.0,4.8Hz,1H),8.33(dt,J＝0.8,8.0Hz,1H),7.95(td,J＝1.6,7.6Hz,1H),7.51(ddd,J＝1.2,4.8,7.6Hz,1H),6.81(s,1H),4.42(t,J＝6.4Hz,2H),2.46(s,3H),1.78-1.71(m,2H),1.45-1.37(m,2H),1.33-1,29(m,4H),0.86(t,J＝7.2Hz,3H)。
表3.合成化合物4的反应原料用量与产物的产量和产率
实施例2：含烷基链铱配合物Ir-alkyl(7)的制备
化合物Ir-alkyl(7)的制备：将化合物4(0.22mmol)和铱二氯桥(0.1mmol)在二氯甲烷(3mL)与甲醇(1mL)的混合溶剂中，在氮气氛围下55℃回流搅拌过夜，反应完成后待反应溶液温度降至室温，再向其中加入KPF6(2.2mmol)继续搅拌2小时，之后旋蒸除掉有机溶剂，并将得到的固体用层析柱提纯，得到红色粉末状固体Ir-alkyl(7)。产率23％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.45(d,J＝7.6Hz,1H),8.12-8.08(m,3H),8.01-7.68(m,9H),7.36-7.31(m,2H),7.15-7.14(m,1H),7.08-6.98(m,10H),6.94-6.85(m,4H),6.82-6.79(m,4H),6.76-6.70(m,5H),6.50(ddd,J＝2.0,4.0,8.4Hz,2H),5.84(d,J＝2.0Hz,1H),5.53(d,J＝2.4Hz,1H),4.46-4.34(m,2H),1.97(s,3H),1.65-1.58(m,2H),1.22-1.21(m,6H),0.83(t,J＝7.2Hz,3H)。
表4.合成Ir-alkyl(7)的反应原料用量与产物的产量和产率
| 序号 | 化合物4 | 铱二氯桥 | KPF6 | Ir-alkyl(7) | 产率 |
| 1 | 60mg | 194mg | 405mg | 30mg | 24％ |
| 2 | 60mg | 194mg | 405mg | 25mg | 21％ |
| 3 | 60mg | 194mg | 405mg | 28mg | 23％ |
其他六种不同主配体的铱的配合物[Ir-alkyl(1-6)]的合成方法与实例一致，得到不同的铱的配合物只需在合成配合物的那个反应中用不同主配体的铱二氯桥替换即可。
实施例3：铱配合物Ir-alkyl(7)的吸收和发射光谱测试
本发明采用的光谱测试浓度为10μM，测试溶剂为甲苯溶液，测发射光谱时，激发波长为405nm。
Ir-alkyl(7)的吸收与发射光谱如图1和图2所示。分析图1和图2可以得出，配合物在紫外区250-380nm以及可见蓝光区400-500nm均表现出了较强的吸收，特别是该配合物能够被可见光激发，因此在做细胞成像实验时能够大大减少激发光源对细胞的损伤。测量其发射光谱时，先用氧气与氮气体积比不同的气流往溶液中鼓气10分钟然后进行测试。由结果可知其发射较宽，发射峰位于600nm，长波长的发射光使得在生物组织中的较大的穿透深度，使之更适用于生物成像，并且随着溶液中氧含量的减少，发射光的强度逐渐增强，证明该配合物能够应用于乏氧检测的领域。
实施例4：铱配合物Ir-alkyl(7)的MTT细胞毒性实验
将消化后的细胞接种在96孔板中，每孔的接种密度为104个/孔，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时。之后吸除不新鲜的培养液，再用不同浓度Ir-alkyl(7)(1、5、10、25、50μM)的细胞培养液继续培养细胞24小时。然后再在每孔加入10μL MTT(5mg/mL)继续培养4小时。最后吸除培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，摇床震荡10分钟后使用酶标仪测试OD570。
MTT细胞毒性实验结果如图3所示，在配合物的浓度增至50μM时，培养24小时后，细胞存活率依然大于80％，证明该配合物具有较低的细胞毒性，可用于细胞成像。
实施例5：铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料LysoGreen对活细胞溶酶体的共染实验
本测试采用的细胞分别为A549细胞、HepG2细胞和Hela细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后用Ir-alkyl(7)(5μM)的细胞培养液孵育细胞12小时。之后用含有LysoGreen(200nM)的细胞培养液继续培养10分钟后进行成像测试。
配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料LysoGreen的在A549细胞、HepG2细胞和Hela细胞中共染成像图如图4、图5和图6所示。LysoGreen由488nm蓝光激发，收集500-540nm绿光发射，Ir-alkyl(7)由488nm蓝紫光激发，收集580-640nm红光发射。将溶酶体染料的发射区域与配合物Ir-alkyl(7)的发射区域向叠加，发现二者重合度高。由计算可得，在三种细胞中的共染系数分别为0.93、0.82和0.91，证明本发明的配合物Ir-alkyl(7)能够靶向活细胞溶酶体，可用于活细胞溶酶体标记。
实施例6：铱配合物Ir-alkyl(7)与商业溶酶体染料LysoGreen在Hela细胞中的抗光漂白性试验；
本测试采用的细胞Hela细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后分成两组，一组细胞用含有Ir-alkyl(7)(5μM)的细胞培养液孵育细胞12小时，另一组细胞用含有LysoGreen(200nM)的细胞培养液培养10分钟，然后进行抗光漂白测试。
LysoGreen由488nm蓝光激发，收集500-540nm绿光发射，Ir-alkyl(7)由488nm蓝紫光激发，收集580-640nm红光发射。先收集光漂白前的共聚焦图像，再在两组细胞中分别选定特定区域用强激光照射一秒钟进行光漂白，之后收集共聚焦图像。对比两者光漂白前后的图像可知，点1位置在光漂白前后的发光强度变化远小于点2位置的发光强度变化，由此可证明Ir-alkyl(7)的抗光漂白性优于商业溶酶体染料LysoGreen的性能。
实施例7：铱配合物Ir-alkyl(7)在Hela细胞中的PLIM和时间门成像。
本测试采用的细胞为Hela细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后用Ir-alkyl(7)(5μM)的细胞培养液孵育细胞12小时。然后用PBS溶液清洗三次后进行成像测试。
Ir-alkyl(7)由405nm蓝紫光激发。由生成的PLIM图像(图8(a))图可知，在细胞内配合物靶向的溶酶体区域发光寿命体现了磷光发射长寿命特点。在时间门成像实验中，分别收集了延迟0ns、20ns、50ns、100ns和200ns的信号，可以看到在扣除了背景荧光干扰之后，细胞成像保持着良好的信噪比和分辨率(图8(b～f))。证明Ir-alkyl(7)在生物成像方面有很好的适用性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由本发明权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物，包括C^N配体、金属中心以及含有烷基链的辅助配体，其特征在于：该铱配合物具有如下结构式：
2.一种如权利要求1所述的具有溶酶体靶向功能的磷光铱配合物的制备方法，其特征在于：该方法的合成路线如下：
具体步骤：室温下将化合物1与甲醇钠溶液搅拌反应22小时，然后向反应液中加入氯化铵反应6小时，反应结束后过滤掉未反应的氯化铵，将滤液旋干去除甲醇溶剂，得到浅黄色粉末，之后用乙醚洗涤三次，除去未反应的化合物1，再用乙醇-乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体化合物2；再将化合物2与乙酰乙酸乙酯在乙醇钠催化条件下加热回流24小时，旋干除掉溶剂后将固体溶于适量去离子水中，调节pH值至4-5，水中会有大量白色固体析出，过滤得该白色固体，并用水和乙醚洗涤三次，得到白色固体化合物3；将化合物3、溴己烷与K2CO3溶于丙酮后在氮气氛围中60℃回流搅拌过夜，再将反应液用水和二氯甲烷萃取三次除去残留的的K2CO3，收集有机相，用无水Na2SO4干燥后旋蒸除去有机溶剂，将得到的油状混合物用层析柱提纯，得到黄色油状液体化合物4；最后将化合物4和铱二氯桥在二氯甲烷与甲醇的混合溶剂中，在氮气氛围下55℃回流搅拌过夜，反应完成后待反应溶液温度降至室温，再向其中加入KPF6继续搅拌2小时，之后旋蒸除掉有机溶剂，并将得到的固体用层析柱提纯，得到红色粉末状固体Ir-alkyl(7)。
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