CN105903034A - 一种香菇多糖修饰的碳纳米管及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香菇多糖修饰的碳纳米管，它是以共价键修饰的方法将香菇多糖接枝在碳纳米管上制备得到的。本发明还公开了该香菇多糖修饰的碳纳米管的制备方法和在制备免疫增强药物中的应用。与现有技术相比，本发明解决了香菇多糖成分易氧化、不易制剂等问题，而且便于药物的吸收，可以使药物缓慢地的释放，有效地延长药效，能显著提高动物免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。同时，本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。

Description

一种香菇多糖修饰的碳纳米管及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及一种香菇多糖修饰的碳纳米管及其制备方法与应用。

背景技术

香菇多糖的免疫调节活性是其生物活性的重要基础。香菇多糖是典型的T细胞激活剂，体内外均能促进细胞毒T淋巴细胞(CTL)的产生，提高CTL的杀伤活力，增强正常或免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反应(DTH)，提高抗体依赖性细胞毒细胞(ADDC)活性。体内给药还能诱生r-干扰素(IFN)。香菇多糖还能促进T细胞产生巨噬细胞活化因子，在体内可使腹腔巨噬细胞扩增、活化，并可诱导杀伤性巨噬细胞和抗体依存性巨噬细胞的细胞毒活性，还受靶细胞的敏感性影响。香菇多糖还可使由巨噬细胞诱导的各种类型的生物活性因子，如IL-1、IL-3、IL-6、和CSF(集落刺激因子)水平提高，从而导致免疫活性因子进一步分泌和免疫活性细胞的成熟、分化和增殖，参与机体的应答和免疫调节。Oka等通过体外香菇多糖与宿主细胞共培养，流式细胞仪免疫荧光检测，研究香菇多糖免疫调节活性的触发机制，结果发现多数香菇多糖能结合到人单核细胞上，认为香菇多糖结合到人单核细胞上可能是影响免疫系统的首要因素。

碳纳米管为晶形碳同素异形体，由六边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆管，层与层之间保持固定距离(约0.34nm)。多壁碳纳米管直径一般为2～20nm。因其独特结构，碳纳米管在电子、能源、分子传感器及生物载体领域都有潜在的应用价值。碳纳米管为纳米材料，其空腔管体还可容纳生物特异性分子及药物，因此可载送生物活性分子及药物进入细胞或组织。生物大分子(蛋白、核酸等)的细胞穿透性较差，可将其吸附或偶联到可穿透细胞的载体上，载送它们进入细胞。新型碳纳米管材料具备了优良的细胞穿透性能，从而在载体领域倍受关注.碳纳米管不溶于有机溶剂和水，从而限制了它在药物载体领域的应用。而功能化修饰碳纳米管则可改善其溶解性，并可提高其生物相容性，使碳纳米管在药物载体领域得以应用。从载送药物、疫苗等生物活性分子乃至基因进入细胞，碳纳米管在载体领域中的应用与研究日益深入。

本发明首次利用用共价键修饰的方法将香菇多糖枝接在碳纳米管上，并对其制备工艺进行优化比较，并将其和模式抗原OVA一起应用免疫，建立了香菇多糖碳纳米管的制备方法，优化了制备条件，发现香菇多糖碳纳米管能显著提高香菇多糖的免疫增强作用，提高其生物利用度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种香菇多糖修饰的碳纳米管，以解决现有技术存在的香菇多糖不稳定、体内代谢快、生物利用度低和用药量大等问题。

本发明还要解决的技术问题是提供上述香菇多糖修饰的碳纳米管的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述香菇多糖修饰的碳纳米管的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种香菇多糖修饰的碳纳米管的制备方法，它包括如下步骤：

(1)将氯化亚砜和羧基化碳纳米管混合后进行超声，加入DMF作为催化剂后继续超声，超声结束后，经回流、减压蒸馏和干燥，得到乙酰化碳纳米管；

(2)将乙酰化碳纳米管溶于DMF后，加入预处理过的香菇多糖进行超声，加入吡啶作为催化剂继续超声，超声结束后进行反应，产物经离心、洗涤和冷冻干燥后，得到香菇多糖修饰的碳纳米管粉末。

步骤(1)中，羧基碳纳米管和氯化亚砜的固液比为1g：43～50mL，二甲基甲酰胺体积为氯化亚砜体积的4～6％。

步骤(1)中，加入二甲基甲酰胺前，超声功率为400～600W，超声时间为10～15min；加入二甲基甲酰胺后，超声功率为400～600W，超声时间为3～5min。

步骤(1)中，

回流方法为在70～72℃下回流10～12h，回流时每2h超声10min，超声功率为400～600W；

减压蒸馏方法为75～77℃下回流1～2h；

干燥方法为50～55℃下真空干燥。

步骤(2)中，所述的预处理过的香菇多糖是指将香菇多糖在110～120℃下加热2～3h。

步骤(2)中步骤(2)中，乙酰化碳纳米管和二甲基甲酰胺的固液比为1g：43～50mL，乙酰化碳纳米管和香菇多糖的质量比为3～4：1，吡啶体积为二甲基甲酰胺体积的4～6％。。

步骤(2)中，加入吡啶前，超声功率为400～600W，超声时间为10～15min；加入吡啶后，超声功率为400～600W，超声时间为3～5min。

步骤(2)中，反应温度为110～115℃，反应时间为20～24h；反应时，每3h超声10min，超声功率为400～600W。

步骤(2)中，离心方法为以8000rpm的转速离心20min，离心结束后弃去液体部分。

步骤(2)中，洗涤的方法为用DMAC/LICL(体积比95/5)溶液超声离心(8000rpm，15min)洗涤5次后，再用PBS洗涤2次，温水(20～30℃)洗涤5次。

上述制备方法中任意一项制备得到的香菇多糖修饰的碳纳米管也在本发明的保护范围之内。

上述香菇多糖修饰的碳纳米管在制备免疫增强药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

按此方法制备的香菇多糖碳纳米管，平均接枝率为9.1±1.1％。得到香菇多糖碳纳米管后，利用紫外光谱扫描仪对香菇多糖碳纳米管表面进行了分析，并通过高分辨投射电镜、红外光谱扫描仪、热重分析仪对香菇多糖碳纳米管的结构进行研究。

将香菇多糖碳纳米管和OVA一起应用免疫小鼠，能显著提高小鼠血清OVA特异性IgG抗体效价、不同亚型抗体水平和细胞因子含量，同时发现香菇多糖碳纳米管能够促进抗原转运到附近淋巴结，同时提高淋巴结中成熟树突状细胞的比例，表明了其具有较好的免疫增强功能，对提高动物机体的免疫功能，防治疾病具有重要应用价值。

有益效果

动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成为热点。

香菇多糖是灵芝中所含的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗过敏、抗肿瘤和增强免疫功能等广泛的生物学功能和药理学作用。然而，香菇多糖作为一种免疫增强剂直接用于兽医临床，存在着高用药量、体内代谢较快、作用时间较短、成分复杂，质量控制有一定困难等不足之处，免疫增强作用相对较弱，从而限制了临床应用。利用碳纳米管搭载香菇多糖，不仅可以防止香菇多糖被氧化不稳定，解决用药量大等问题，而且可以有效维持香菇多糖在机体内的有效浓度，提高其生物利用度。

本发明采用共价键修饰的方法将香菇多糖接枝在碳纳米管上，香菇多糖碳纳米管接枝率高，不仅可以解决香菇多糖成分易氧化、不易制剂等问题，而且便于药物的吸收，可以使药物缓慢地的释放，有效地延长药效，能显著提高动物免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.香菇多糖碳纳米管的制备国内外未见报道，本发明提供了一种香菇多糖碳纳米管的制备方法，填补了国内外研究的空白。

2.香菇多糖碳纳米管的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明香菇多糖通过制备成香菇多糖碳纳米管后能够显著提高其免疫增强活性，表现为提高小鼠血清OVA特异性IgG抗体效价、不同亚型抗体水平和细胞因子含量，同时发现香菇多糖碳纳米管能够促进抗原转运到附近淋巴结，同时提高淋巴结中成熟树突状细胞的比例，与香菇多糖相比，能够诱导机体记忆细胞的分化，从而长时间增强动物免疫功能。因此，香菇多糖碳纳米管可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。

附图说明

图1为原始碳纳米管和香菇多糖碳纳米管的透射电镜图；其中，a为原始碳纳米管，b为香菇多糖碳纳米管；

图2为原始碳纳米管和香菇多糖碳纳米管的紫外光谱图；

图3为原始碳纳米管和香菇多糖碳纳米管的红外光谱图；

图4为原始碳纳米管和香菇多糖碳纳米管的热失重曲线图；

图5为实施例2中各组的抗体水平、抗体亚型及细胞因子的变化示意图；其中，a为总体免疫球蛋白，b为IgG1和IgG2a，c为IFN-γ和TNF-α，d为IL-4和IL-6；

图6为实施例2中淋巴结中树突状细胞的变化示意图；其中a为首免24h后数据，b为首免48h后数据。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1香菇多糖碳纳米管的制备

在蒸馏烧瓶内加入30ml氯化亚砜，0.7g羧基化碳纳米管后超声10min，加入1mlDMF超声3min，70℃回流10h(每2h超声10min)，73℃减压蒸馏1-2h，50℃真空干燥(每隔3h换气)至完全干燥，得到乙酰化碳纳米管，用30mlDMF溶解乙酰化碳纳米管，将0.2g经过120℃2h预处理过的香菇多糖加入DMF，超声处理30min，加入1ml吡啶超声3min，控温110℃反应24h(每3h超声10min)，冷却至室温，离心倾倒，用DMAC/LICL(95/5)溶液超声离心洗涤反复5次，PBS洗涤2次，温水洗涤5次，冷冻干燥，低温干燥处保存。

由图1的透射电镜图片(a：原始碳纳米管(C-MWCNTs)，b：香菇多糖碳纳米管(L-MWCNTs))可知，香菇多糖(lentinan)确实附着在碳纳米管表面；从紫外光谱图(图2)和红外光谱图(图3)分析可知，香菇多糖在枝接过程中发生一定程度的分解,但仍可在香菇多糖碳纳米管上找到香菇多糖的特征峰，同时推测出香菇多糖是以酯键连接在碳纳米管上。同时碳纳米管，香菇多糖和香菇多糖碳纳米管的热失重曲线(图4)显示香菇多糖的接种率为9.1％。电镜及红外、紫外光谱及热重分析数据表明香菇多糖以共价键的方式枝接在了碳纳米管上。

实施例2香菇多糖碳纳米管免疫增强活性比较

以实施例1中制备的香菇多糖碳纳米管(L-MWCNTs)为研究对象，以香菇多糖(lentinan)和羧基碳纳米管(C-MWCNTs)作为对照，测定了它们对模式抗原(OVA)免疫后机体IgG抗体水平、抗体亚型、淋巴结树突状细胞的活化、淋巴结中OVA抗原及细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12p70、IL-4和IL-17含量的影响。

(1)动物分组及处理

60只6-8周龄的Blab/c小鼠随机均分为5组，分别为香菇多糖碳纳米管组(L-MWCNTs)、香菇多糖组(lentinan)、羧基碳纳米管组(C-MWCNTs)、阳性对照组(FCA)和PBS对照组(PBS)。皮下免疫小鼠3次，每次免疫间隔1周。分别于首免后7、14、21和28天检测机体IgG抗体水平、抗体亚型、淋巴结树突状细胞的活化、淋巴结中OVA抗原及血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6含量变化。

(2)香菇多糖碳纳米管对抗体水平以及对血清中细胞因子的影响

就总体免疫球蛋白而言，首免后第7天，L-MWCNTs组就与FCA组显著高于其他组，并且在14天时高于阳性对照组，并且直到21天仍与阳性对照组效果相同，在28天时低于FCA组但显著高于其他各组(图5a)。对于IgG1和IgG2a，香L-MWCNTs组IgG1在初期与C-MWCNTs持平，低于阳性对照组但显著高于其他组，在28天时则与FCA效果相同。L-MWCNTs组IgG2a在初期低于FCA，但在28天时显著高于包括FCA在的其他组(图5b)。

首免后的第7天L-MWCNTs组TNF-α就表现出显著高于其他对照组，并且IFN-γ仅低于FCV组，在28天，L-MWCNTs组IFN-γ显著高于FCA组，但L-MWCNTs组TNF-α与其他组无显著性差异(图5c)。L-MWCNTs组IL-4的分泌在整个过程都低于FCA组但显著高于其他组，IL-6则在第7天与FCA相同显著高于其他组，但在28天时高于所有组(图5d)。

注：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001相比于对照组，图6同。

(3)香菇多糖碳纳米管对小鼠淋巴结中成熟树突状细胞比例的影响

作为最主要初级免疫反应场所的淋巴结在疫苗免疫过程中发挥着及其重要的作用。抗原在注射进动物机体后，其迁移至淋巴结的效率与诱导机体产生有效的免疫反应息息相关。有效的疫苗递载系统类佐剂能够明显的提高抗原递呈细胞摄取抗原、运载抗原至淋巴结及递呈抗原到T淋巴细胞。首免后的24h、48h，L-MWCNTs组显著地促进了小鼠淋巴结中成熟树突状细胞的比例，淋巴结中成熟树突状细胞的比例显著高于C-MWCNTs组和lentinan组(图6)，表明了L-MWCNTs组能有有效的促进成熟树突状细胞的归巢从而更加有效的将抗原递呈给淋巴细胞，进一步引起强烈的免疫反应。

根据上述动物试验结果可以得出香菇多糖碳纳米管可以提高小鼠机体IgG抗体水平、不同亚型抗体含量、淋巴结树突状细胞的活化、淋巴结中OVA抗原及细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6含量，从而提高机体免疫功能，说明本发明涉及的香菇多糖碳纳米管可用于提高动物机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。

Claims (10)

1.一种香菇多糖修饰的碳纳米管的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)将氯化亚砜和羧基化碳纳米管混合后进行超声，加入二甲基甲酰胺后继续超声，超声结束后，经回流、减压蒸馏和干燥，得到乙酰化碳纳米管；

(2)将乙酰化碳纳米管溶于二甲基甲酰胺后，加入预处理过的香菇多糖进行超声，加入吡啶继续超声，超声结束后进行反应，产物经离心、洗涤和冷冻干燥后，得到香菇多糖修饰的碳纳米管。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，羧基碳纳米管和氯化亚砜的固液比为1g：43～50mL，二甲基甲酰胺体积为氯化亚砜体积的4～6％。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入二甲基甲酰胺前，超声功率为400～600W，超声时间为10～15min；加入二甲基甲酰胺后，超声功率为400～600W，超声时间为3～5min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，回流方法为在70～72℃下回流10～12h，减压蒸馏方法为75～77℃下回流1～2h，干燥方法为50～55℃下真空干燥。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的预处理过的香菇多糖是指将香菇多糖在110～120℃下加热2～3h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，乙酰化碳纳米管和二甲基甲酰胺的固液比为1g：43～50mL，乙酰化碳纳米管和香菇多糖的质量比为3～4：1，吡啶体积为二甲基甲酰胺体积的4～6％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入吡啶前，超声功率为400～600W，超声时间为10～15min；加入吡啶后，超声功率为400～600W，超声时间为3～5min。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应温度为110～115℃，反应时间为20～24h。

9.权利要求1～8中任意一项制备得到的香菇多糖修饰的碳纳米管。

10.权利要求9所述的香菇多糖修饰的碳纳米管在制备免疫增强药物中的应用。