CN108524550A - Seb类毒素疫苗气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SEB类毒素疫苗气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制备方法。本发明所提供的制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的方法，包括如下步骤：(1)通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B疫苗递送至动物的肺部；(2)再通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(1)处理过的所述动物的肺部；(3)再对步骤(2)处理过的所述动物进行脂多糖致敏，得到动物模型。本发明成功制备了葡萄球菌肠毒素B类毒素疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型。证实，SEB类毒素疫苗经肺递送吸入感染免疫后具有较好的免疫效果，能保护10倍LD50剂量SEB的感染。本发明对于筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种SEB类毒素疫苗气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制备方法。
背景技术
生物威胁及其防御是目前世界各国最重要的国家安全关切问题之一，也是军事医学研究的重要领域之一。生物威胁主要包括生物战争和生物恐怖活动，是指利用生物剂(包括战剂)故意对特定目标人群以及与人类生产生活密切相关的其他生物体(如动物、植物)和设施等发动袭击的行为。因此，生物威胁不仅可以大量杀伤人、畜，而且造成的民众心理恐慌、社会混乱以及经济损失等都是十分巨大的。构成生物威胁的主要元素是生物剂，而生物剂中最主要的是烈性病原体及其毒性产物(毒素)。
金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)是金黄色葡萄球菌产生的一种外毒素，是重要的细菌超抗原，能在很低浓度条件下激活大量T细胞，并刺激释放细胞因子，能引起人和动物呕吐、腹泻、腹痛等中毒症状，甚至造成机体不可逆的病变导致死亡。1.7μg的SEB就可杀死一个成年人，是被列入联合国《禁止生物武器公约》核查清单的11种生物毒素之一。
SEB感染一个重要的临床症状是毒性休克综合征(TSS)，这与SEB的超抗原特性有关，是SEB刺激免疫细胞分泌过量的细胞因子的结果。目前对SEB中毒的治疗仅限于支持疗法，尚缺乏更有效的手段。而SEB疫苗的思路是对SEB蛋白进行基因突变或修饰，使之失去或降低超抗原的毒性作用，但能刺激机体产生具有保护作用的特异抗体，用于防治SEB的毒性效应。SEB疫苗常规接种途径为皮下注射，目前无其他接种途径的研究报道。
目前，针对液体气溶胶或干粉气溶胶等的研究多采用口鼻暴露和全身暴露，这两种方法虽然对实验动物无创伤，但是无法精确定量给药剂量，样品在暴露塔中损耗较大且容易发生沉降。而且相关的仪器设备体积大、价格不菲。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的方法。
本发明所提供的制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的方法，具体可包括如下步骤：(1)通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B疫苗递送至动物的肺部；(2)再通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(1)处理过的所述动物的肺部；(3)再对步骤(2)处理过的所述动物进行脂多糖(LPS)致敏，得到动物模型。
进一步地，所述动物可为小鼠，如BALB/c小鼠，具体如BALB/c雌性小鼠。
进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗中的活性成分为葡萄球菌肠毒素B类毒素。
其中，所述葡萄球菌肠毒素B类毒素为经甲醛灭活的葡萄球菌肠毒素B。具体的，所述葡萄球菌肠毒素B类毒素是将甲醛和葡萄球菌肠毒素B按照4300:1～21500:1(如4300:1)的摩尔比于37℃反应30天后制得的。
更进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和CpG佐剂按照质量比1:1混合而成。
进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的递送次数为3次，每2周递送一次，每次的递送量为以所述葡萄球菌肠毒素B类毒素的量计10μg/体重为0.02kg。如每只小鼠10μg(小鼠体重0.02kg)。
进一步地，自末次递送所述葡萄球菌肠毒素B疫苗之日起，第13天递送所述葡萄球菌肠毒素B。
在本发明的一个实施例中，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的3次递送分别是第1天，第14天，第28天。然后，在第40天递送所述葡萄球菌肠毒素B。
进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B的递送量为所述葡萄球菌肠毒素B对所述动物的半数致死剂量(LD50)的10倍。在本发明的小鼠实验中，所述葡萄球菌肠毒素B的递送量为4.0μg/体重为0.02kg。如每只小鼠4.0μg(小鼠体重0.02kg)。
进一步地，步骤(1)中，所述通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B疫苗递送至动物的肺部为将所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的溶液通过液体气溶胶肺递送装置递送至所述动物的肺部。
在本发明的一个实施例中，具体为将所述动物完全麻醉后，在喉镜辅助下，用肺递送装置Penn-Century高压喷雾器将所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的溶液递送至所述动物的肺部。
进一步地，步骤(2)中，所述通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(1)处理过的所述动物的肺部为将葡萄球菌肠毒素B的溶液通过液体气溶胶肺递送装置递送至所述动物的肺部。
在本发明的一个实施例中，具体为将所述动物完全麻醉后，在喉镜辅助下，用肺递送装置Penn-Century高压喷雾器将所述葡萄球菌肠毒素B的溶液递送至所述动物的肺部。
进一步地，步骤(3)中，对步骤(2)处理过的所述动物进行脂多糖致敏为向所述动物腹腔注射脂多糖。
在本发明的一个实施例中，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的溶液具体为由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素、CpG佐剂和含有0.05-0.2％(如0.05％，％表示体积百分含量)泊洛沙姆的生理盐水组成；其中，所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和所述CpG佐剂的质量比为1:1。
在本发明的一个实施例中，所述葡萄球菌肠毒素B的溶液具体为将葡萄球菌肠毒素B溶于含有0.05-0.2％(如0.05％，％表示体积百分含量)泊洛沙姆的生理盐水中后得到的溶液。
其中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。具体为泊洛沙姆188(P5556-100ML，Sigma)。
在本发明的小鼠实验中，向所述动物腹腔注射脂多糖的剂量为75μg/体重为0.02kg。如每只小鼠75μg(每只小鼠体重0.02kg)。
在所述方法中，步骤(3)是在步骤(2)完成后4小时进行的。
本发明要求保护一种葡萄球菌肠毒素B疫苗。
本发明所要求保护的葡萄球菌肠毒素B疫苗中的活性成分为葡萄球菌肠毒素B类毒素。进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗中的活性成分为葡萄球菌肠毒素B类毒素。具体的，所述葡萄球菌肠毒素B类毒素是将甲醛和葡萄球菌肠毒素B按照4300:1～21500:1(如4300:1)的摩尔比于37℃反应30天后制得的。
更进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和CpG佐剂按照质量比1:1混合而成。
其中，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗可以液体气溶胶形式存在。
本发明要求保护如下任一应用：
(A1)前文所述方法在筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物中的应用；
(A2)前文所述方法制备得到的动物模型在研究葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的作用机制中的应用。
其中，所述葡萄球菌肠毒素B所致疾病可为毒性休克综合征(TSS)、葡萄球菌肠毒素B吸入性肺炎等。
本发明要求保护一种用于制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的试剂盒。
本发明所提供的用于制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的试剂盒，可含有葡萄球菌肠毒素B疫苗、葡萄球菌肠毒素B、脂多糖(LPS)和液体气溶胶肺递送装置。
其中，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗中的活性成分为葡萄球菌肠毒素B类毒素。所述葡萄球菌肠毒素B类毒素可为经甲醛灭活的葡萄球菌肠毒素B。具体的，所述葡萄球菌肠毒素B类毒素是将甲醛和葡萄球菌肠毒素B按照4300:1～21500:1(如4300:1)的摩尔比于37℃反应30天后制得的。更进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和CpG佐剂按照质量比1:1混合而成。
所述葡萄球菌肠毒素B可以溶液形式存在。所述溶液具体可为将葡萄球菌肠毒素B溶于含有0.05-0.2％(如0.05％，％表示体积百分含量)泊洛沙姆(如泊洛沙姆188)的生理盐水中后得到的溶液。
所述液体气溶胶肺递送装置可为肺递送装置Penn-Century高压喷雾器。
第四方面，本发明要求保护所述试剂盒在如下任一中的应用：
(B1)制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型；
(B2)筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物；
(B3)研究葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的作用机制。
其中，所述动物可为小鼠，如BALB/c小鼠，具体如BALB/c雌性小鼠。
所述葡萄球菌肠毒素B疫苗可为前文所述的葡萄球菌肠毒素B疫苗。
所述葡萄球菌肠毒素B所致疾病可为毒性休克综合征(TSS)、葡萄球菌肠毒素B吸入性肺炎等。
最后，本发明还要求保护一种筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的方法。
本发明所提供的筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的方法，具体可包括如下步骤：(a1)通过液体气溶胶的方式将候选的葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物递送至动物的肺部；(a2)再通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(a1)处理过的所述动物的肺部；(a3)再对步骤(a2)处理过的所述动物进行脂多糖致敏；(a4)观察免疫效果，根据免疫效果筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物。
其中，步骤(a4)中，可通过比较对照组(不免疫候选疫苗或药物)和实验组动物的生存曲线来确定免疫效果。
本发明成功制备了葡萄球菌肠毒素B类毒素疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型。证实，SEB类毒素疫苗经肺递送吸入感染免疫后具有较好的免疫效果，能保护10倍LD50剂量SEB的感染。另外，本发明还有如下优点：(1)相比重组减毒突变体疫苗，SEB类毒素疫苗的脱毒效果更好，抗原表位更丰富，能诱发较强的抗SEB保护性抗体。(2)肺递送吸入免疫是一种新兴的接种途径，可以同时诱导全身免疫与局部粘膜免疫，具备更好的免疫效果，经气管进行肺递送可以将样品直接到达肺部靶器官，作用直接，节约样品。本发明对于筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗具有重要意义。
附图说明
图1为SEB类毒素电泳图。fSEB表示经甲醛灭活的SEB(即SEB类毒素)；nSEB为未经灭活的SEB。
图2为SEB肺递送吸入感染小鼠致死剂量曲线。
图3为SEB类毒素肺递送吸入免疫后，野生型SEB攻毒后小鼠生存曲线。其中，ctrl表示PBS阴性对照组；CpG表示为CpG佐剂对照组，CpG+SEB表示CpG和SEB类毒素联合免疫组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中实验动物采用BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，SPF级，体重20g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
下述实施例中采用的葡萄球菌肠毒素B(SEB)为军事科学院军事医学研究院产品。
下述实施例中采用的脂多糖(LPS)为sigma公司产品，货号为L2880。
下述实施例中采用的CpG佐剂为InvivoGen公司产品，货号为tlrl-2006。
下述实施例中采用的泊洛沙姆188为sigma公司产品，货号为P5556-100ML。
实施例1、葡萄球菌肠毒素B类毒素疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制备及鉴定
一、SEB类毒素疫苗的制备
1mL浓度为2mg/ml的SEB溶液中加入9μL甲醛溶液，使得甲醛与SEB的摩尔比为4300:1，37℃反应30天后，冻干备用。
甲醛灭活后，SDS-PAGE电泳显示SEB类毒素分子量增大，推测可能是因醛化而聚合(图1)。将SEB类毒素经肺递送以10×LD50剂量吸入感染BALB/c小鼠，然后用75μg的LPS致敏，观察15天小鼠无死亡情况，提示SEB类毒素制备成功。
二、确定SEB肺递送吸入感染小鼠的半数致死剂量
1、液体气溶胶SEB母液的制备
将SEB冻干粉溶于含有0.05％泊洛沙姆188的生理盐水中，终浓度1mg/mL。
2、液体气溶胶肺递送SEB感染(LPS致敏)小鼠
先腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后行肺递送吸入感染实验，肺递送吸入感染方法如下：待小鼠完全麻醉后，在喉镜辅助下，用肺递送装置Penn-Century高压喷雾器将SEB液体(含0.05％泊洛沙姆188)递送至小鼠肺部；肺递送液体量为每只小鼠50μL。将小鼠放回鼠笼，注意保暖，小鼠一般在麻醉3小时左右苏醒。感染4h后，腹腔注射小鼠LPS进行致敏，75μg/只，100μL。
设定6个剂量组，SEB感染剂量分别为0mg/kg(5只小鼠)，0.0005mg/kg(5只小鼠)，0.0025mg/kg(6只小鼠)，0.0125mg/kg(10只小鼠)，0.05mg/kg(8只小鼠)，0.25mg/kg(5只小鼠)，观察记录肺递送吸入感染5天内小鼠存活情况，计算每组的死亡率，绘制SEB肺递送吸入感染的致死剂量曲线。结果如图2所示，根据该曲线计算出SEB肺递送吸入感染的半数致死剂量为LD50＝0.02mg/kg。
三、SEB类毒素疫苗肺递送免疫方案
设PBS阴性对照组、CpG佐剂对照组，CpG和SEB类毒素联合免疫组，每组10只小鼠。小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，在喉镜辅助下，用Penn-Century高压喷雾器给药50μL。将小鼠放回鼠笼，注意保暖，小鼠一般在麻醉3小时左右苏醒。每两周免疫一次，共免疫3次，分别是第1天，第14天，第28天。在第40天，以10倍的LD50(即4μg/只小鼠)经肺递送吸入SEB感染攻毒，并在感染4h后用75μg的LPS致敏，然后观察15天内动物存活情况。
其中，CpG和SEB类毒素联合免疫组：免疫物为SEB类毒素疫苗。所述SEB类毒素疫苗为由SEB类毒素、CpG佐剂和含有0.05％泊洛沙姆188的生理盐水组成；其中，SEB类毒素和CpG佐剂的质量比为1:1。每次每只小鼠的免疫剂量为“CpG 10μg，SEB类毒素10μg”。PBS阴性对照组的免疫物为等体积的PBS，CpG佐剂对照组的免疫物与CpG和SEB类毒素联合免疫组相比差别仅在于缺少SEB类毒素。
结果如图3所示：SEB类毒素疫苗经肺递送吸入感染免疫后具有较好的免疫效果，能保护10倍LD50剂量SEB的感染。
上述研究实验结果说明SEB类毒素疫苗是安全的，且在经肺递送吸入感染免疫后能诱发有效的免疫保护效果。
以上对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不局限于上述实施例。对于本领域技术人员而言，在不违背发明创造精神的前提下可以对本发明进行等同修改和替代，这些等同的修改和替代均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的方法，包括如下步骤：(1)通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B疫苗递送至动物的肺部；(2)再通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(1)处理过的所述动物的肺部；(3)再对步骤(2)处理过的所述动物进行脂多糖致敏，得到动物模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物为小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述葡萄球菌肠毒素B疫苗中的活性成分为葡萄球菌肠毒素B类毒素；
进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和CpG佐剂按照质量比1:1混合而成。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的递送次数为3次，每2周递送一次，每次的递送量为以所述葡萄球菌肠毒素B类毒素的量计10μg/体重为0.02kg；
和/或
自末次递送所述葡萄球菌肠毒素B疫苗之日起，第13天递送所述葡萄球菌肠毒素B；
和/或
所述葡萄球菌肠毒素B的递送量为所述葡萄球菌肠毒素B对所述动物的半数致死剂量的10倍
和/或
步骤(1)中，所述通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B疫苗递送至动物的肺部为将所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的溶液通过液体气溶胶肺递送装置递送至所述动物的肺部；
和/或
步骤(2)中，所述通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(1)处理过的所述动物的肺部为将葡萄球菌肠毒素B的溶液通过液体气溶胶肺递送装置递送至所述动物的肺部；
和/或
步骤(3)中，对步骤(2)处理过的所述动物进行脂多糖致敏为向所述动物腹腔注射脂多糖；
和/或
步骤(3)是在步骤(2)完成后4小时进行的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄球菌肠毒素B疫苗的溶液为由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素、CpG佐剂和含有体积百分含量为0.05-0.2％的泊洛沙姆的生理盐水组成；其中，所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和所述CpG佐剂的质量比为1:1；
和/或
所述葡萄球菌肠毒素B的溶液为将葡萄球菌肠毒素B溶于含有体积百分含量为0.05-0.2％的泊洛沙姆的生理盐水中后得到的溶液；
和/或
向所述动物腹腔注射脂多糖的剂量为75μg/体重为0.02kg。
6.葡萄球菌肠毒素B疫苗，其特征在于：所述葡萄球菌肠毒素B疫苗中的活性成分为葡萄球菌肠毒素B类毒素；
进一步地，所述葡萄球菌肠毒素B疫苗由所述葡萄球菌肠毒素B类毒素和CpG佐剂按照质量比1:1混合而成。
7.根据权利要求6所述的葡萄球菌肠毒素B疫苗，其特征在于：所述葡萄球菌肠毒素B疫苗以液体气溶胶形式存在。
8.一种用于制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型的试剂盒，含有葡萄球菌肠毒素B疫苗、葡萄球菌肠毒素B、脂多糖(LPS)和液体气溶胶肺递送装置。
9.如下任一应用：
(A1)权利要求1-7中任一所述方法在筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物中的应用；
(A2)权利要求1-7中任一所述方法制备得到的动物模型在研究葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的作用机制中的应用；
(A3)权利要求8所述的试剂盒在制备葡萄球菌肠毒素B疫苗液体气溶胶肺递送免疫动物模型中的应用；
(A4)权利要求8所述的试剂盒在筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物中的应用；
(A5)权利要求8所述的试剂盒在研究葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的作用机制中的应用。
10.一种筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物的方法，包括如下步骤：(a1)通过液体气溶胶的方式将候选的葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物递送至动物的肺部；(a2)再通过液体气溶胶的方式将葡萄球菌肠毒素B递送至步骤(a1)处理过的所述动物的肺部；(a3)再对步骤(a2)处理过的所述动物进行脂多糖致敏；(a4)观察免疫效果，根据免疫效果筛选葡萄球菌肠毒素B疫苗或葡萄球菌肠毒素B所致疾病的治疗药物。
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| CN103781487A (zh) * | 2011-04-20 | 2014-05-07 | 米科生物公司 | 用于增强免疫应答的组合物和方法 |
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