CN105884935A - 一种肝素钠的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肝素钠的提纯方法,该制备方法包括酶解、过滤、酶解蛋白、去除蛋白、沉淀脱水、干燥,获得肝素钠精品,本方法具有周期较短、生产成本较低、收率较高、毒害物质产生较少。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素及其衍生物的提纯方法,特别地涉及一种肝素钠的提纯方法。
背景技术
肝素钠是粘多糖硫酸脂类抗凝血药、栓塞性疾病的首用药物,能够防治深层静脉血栓形成。随着研究不断深入,人们发现肝素钠不仅有抗凝、抗血栓形成、调整血脂的作用,还有抗炎、抗过敏、抗病毒等多种生物学功能。
肝素是由糠醛酸和氨基葡萄糖以1-4糖苷键连起来的重复二糖单元组成的线性粘多糖,其广泛分布于哺乳动物的组织中,由结缔组织性肥大细胞表达产生。肝素在动物体内大部分以肝素钠-蛋白复合物的形式存在。由于肝素钠解离不完全,肝素提取方法会残留以共价键结合的蛋白质和以静电结合的带正电蛋白质。
目前,肝素钠的提纯方法一般是,对动物小肠刮取,得到粘液;酶解该粘液,过滤,用树脂吸附,洗脱,用乙醇沉淀,脱水,烘干,得到肝素钠产品。上述现有工艺具有收率低、损失大、污染严重等缺陷。
发明内容
针对上述现有工艺的缺陷,本发明提供了一种肝素钠的提纯方法,其具备工艺简单、收率较高、废液排放量较低、适于工业化生产等特点。
为了达到上述优点,本发明具体采用了如下技术方案。
一种肝素钠的提纯方法,其步骤包括:
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.0~10.0,加入3%~5%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至56~60℃,恒温下搅拌1~3小时,升温至70~80℃,保温20~25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.5~7.4,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌4~7小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的85%~90%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10~12小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
本发明具备如下优点:
1)取消树脂吸附步骤,降低了操作的难度,简化了工艺;
2)加入用微孔滤膜过滤,能降低肝素钠中杂质,提高产品收率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.0,加入3%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至56℃,恒温下搅拌1小时,升温至70℃,保温20分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.5,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌4小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的85%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例2
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至10.0,加入5%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至60℃,恒温下搅拌3小时,升温至80℃,保温25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至7.4,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌7小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的90%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀12小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例3
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.2,加入3.5%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至57℃,恒温下搅拌1.5小时,升温至75℃,保温20分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.7,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌4.2小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的87%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10.5小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例4
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.8,加入4%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至58℃,恒温下搅拌2.5小时,升温至75℃,保温23分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.9,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌5小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的88%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀12小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例5
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.9,加入4.5%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至57℃,恒温下搅拌2.6小时,升温至79℃,保温24分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.6,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌5小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的90%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10~12小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例6
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.6,加入4.9%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至57℃,恒温下搅拌2.7小时,升温至73℃,保温25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至7.2,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌6.7小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的88%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀11.5小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例7
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.1,加入4.4%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至59℃,恒温下搅拌1~3小时,升温至79℃,保温23分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.7,升温至61℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌4~7小时,升温至97℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的88%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10.8小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例8
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.9,加入4.8%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至57℃,恒温下搅拌1.5小时,升温至77℃,保温25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至7.1,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌5.2小时,升温至96℃,保温17分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的90%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10.8小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
实施例9
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.8,加入3.7%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至57℃,恒温下搅拌3小时,升温至74℃,保温20~25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至7.3,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌6.5小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的89%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀11.9小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明实施方式的限定。对于所述领域的技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (3)
1.一种肝素钠的提纯方法,其特征在于,其步骤包括:
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.0~10.0,加入3%~5%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至56~60℃,恒温下搅拌1~3小时,升温至70~80℃,保温20~25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.5~7.4,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌4~7小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的85%~90%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10~12小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
2.如权利要求1所述肝素钠的提纯方法,其特征在于,其步骤包括:
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.0,加入3%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至56℃,恒温下搅拌1小时,升温至70℃,保温20分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至6.5,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌4小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的85%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀10小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
3.如权利要求1所述肝素钠的提纯方法,其特征在于,其步骤包括:
1)将固液比约为2∶9的猪的小肠粘膜液抽入反应罐,用工业碱调pH至9.0~10.0,加入5%(重量比)的氯化钠,加入重量相当于0.5%原料重量的活性酶,混匀,升温至60℃,恒温下搅拌3小时,升温至80℃,保温25分钟,冷却,得到冷却液;
2)将上述步骤1的冷却液用抽滤机过滤2次,用2μm微孔滤膜过滤,取滤液,用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液,除去杂质,取滤液;
3)调节滤液的pH至7.4,升温至60℃,加入相当于0.5%原料重量的活性酶,60℃下搅拌7小时,升温至96℃,保温16分钟,冷却,得到冷却液;
4)将上述步骤3的冷却液用微滤膜过滤,浓缩,得到浓缩液;
5)加入与上述浓缩液相同体积的90%乙醇到上述浓缩液中,搅拌,沉淀12小时,除去上清液,收集沉淀,加入与上述浓缩液相同体积的无水乙醇,干燥,得到肝素钠产品。
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