CN105878047A - 一种包裹细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒的制备及应用 - Google Patents
一种包裹细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒的制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种脂质体磷酸钙纳米粒(Lipide calcium phosphate nanoparticles LCP NP)，具体是以脂质体包裹的磷酸钙纳米粒为载体及传递介质，在其中包裹细胞生长因子(FGF)制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂或膏霜剂。所述组合物具有滋润、保湿、修复、抗衰的作用，脂质体磷酸钙纳米粒还能使携带的活性成分深入深层皮肤，活化深层皮肤细胞，起到重建皮肤屏障，修复敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。
Description
技术领域
本发明提供一种以脂质磷酸钙核心的组合物，具体是以脂质体磷酸钙纳米粒为主要材质，其可单独使用，和/或作为载体及传递介质，包裹细胞重组人成纤维细胞生长因子(FGF)生物活性蛋白制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。属于美容护肤品的技术领域。
技术背景
生物护肤品的主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，而成纤维细胞生长因子(FGF)无疑是当中的佼佼者。它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。但是皮肤致密的屏障功能使大分子FGF的经皮吸收率低，无法发挥其优良的生物活性。提高FGF体外皮肤给药的生物利用度一直是生物美容领域亟待解决的一个关键问题。
现代制剂技术水平的提高，微囊包裹技术在医药行业的广泛运用，然而因其在外用皮肤给药方面的显著优势也使其近年来在化妆品行业崭露头角。脂质磷酸钙(LCP)纳米粒是一种新型的基因转染非病毒载体，已经不仅成功用于体外将核酸递送入细胞内并表达，且有报道用于负载吉西他滨和Trp2多肽等抗肿瘤成分能显著地增强其抑制肿瘤细胞增殖的作用[Zhang Y，Kim WY，Huang L.Systemic delivery of gemcitabine triphosphate via LCP nanoparticles for NSCLC andpancreatic cancer therapy[J].Biomaterials，2013，34(13)：3447～3458；Xu Z，Ramishetti S，Tseng YC，.Multifunctional nanoparticles co-delivering trp2peptideand CPG adjuvant induce potent cytotoxic t-lymphocyte response against melanomaand its lung metastasis[J].J Control Release，2013，172(1)：259～265]。该纳米粒不但具备了脂质体和磷酸钙良好的生物粘附性和生物相容性，生物利用度及安全性高等特点，而且改变了单纯磷酸钙纳米粒容易聚合的特点，大大提高了大分子活性成分的包封率和稳定性，从而提高内含活性成分的疗效。
本发明公开了一种以脂质磷酸钙纳米粒为核心的组合物，具体是以脂质磷酸钙纳米粒作为载体及传递介质，包裹细胞生长因子(FGF)生物活性蛋白制备而成的化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。具有滋润、保湿、祛角质、抗衰、抗氧化的作用。与市场上现有的产品比较，本发明的脂质磷酸钙纳米粒还能使携带的活性成分深入深层皮肤，清除皮肤内部自由基，活化深层皮肤细胞，特别适用于敏感肌肤，起到重建表皮，修复敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。
发明内容
本发明公开了一种以脂质磷酸钙纳米粒的组合物，具体是以脂质磷酸钙纳米粒作为载体及传递介质，包裹细胞生长因子(FGF)生物活性蛋白制备而成的化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。所述组合物具有滋润、保湿、修复的作用，脂质体磷酸钙纳米粒还能使携带的活性成分深入深层皮肤，活化深层皮肤细胞，起到重建皮肤屏障，修复受损及敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。
在本发明的第一个方面，提供了一种以脂质磷酸钙为核心的组合物，其包含1～50重量％的脂质体，1～50重量％磷酸钙，0.0001～1重量％的细胞生长因子FGF。
其中所述脂质磷酸钙是以纳米粒的形态存在，其粒径为50nm～200nm。
其中所述的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)，和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。所述重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)的氨基酸序列(GenBank NO：AAB29057.2)。所述的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的氨基酸序列为(GenBank NO：AAB21432.2)。
在本发明的第二个方面，提供了一种脂质磷酸钙纳米粒为载体的包裹FGF的活性半成品及其制备方法。
其中所述包裹FGF脂质磷酸钙纳米粒的制备方法为：
(1)将表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂A按照混合，构成油相三元体系。将氯化钙水溶液(10～250mM)、磷酸盐水溶液(10～250mM)以及FGF水溶液(0.1～0.5mg/mL)混合，制成水相，将水相缓慢加入油相充分搅拌，制成油包水的微乳，室温静置5～15min产生磷酸钙沉淀，将柠檬酸钠溶液(5～50mM)逐滴加入微乳中，搅拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过1g 60～200目的硅胶填充的硅胶柱，用体积比1～5∶1的乙醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干乙醇后即得磷酸钙纳米粒水溶液。
(2)取磷脂和胆固醇按1～10∶1混合，溶于有机溶剂B中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0.5～3h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。
(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照0.1～10∶1混合即得。
步骤(1)中所述的有机表面活性剂为泊洛沙姆、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或聚山梨醇中的一种或几种；
所述的助表面活性剂为正己醇、丙二醇、丙三醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种；
所述的有机溶剂A为环己烷、正己烷、正辛烷中的一种；
所述的表面活性剂：助表面活性剂：有机溶剂A＝1～5∶1～5∶1～5。
所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。
所述的rhFGF为重组人成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。
所述的氯化钙水溶液∶磷酸盐水溶液∶FGF水溶液＝10～200∶10～200∶10～50。
步骤(2)中所述的有机溶剂B为氯仿、二氯甲烷、乙醇中的一种或几种混合；
所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)；
所述的包裹FGF脂质磷酸钙纳米粒亦可通过以下制备方法获得：
(1)将氯化钙水溶液(10～500mM)、FGF水溶液(0.1～5mg/mL)以及油相混合，作为混合液A。将磷酸溶液(10～50mM，pH＝9.0)，油相以及磷脂混合，作为混合液B。将A、B混合20min，加入10～50mL乙醇，12000g离心5～30min，乙醇洗2-3遍后挥干乙醇，加1～10mL去离子水制成包含FGF的磷酸钙纳米粒混悬液。
(2)取磷脂和胆固醇按1～10∶1混合，溶于有机溶剂B中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0.5～3h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。
(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照0.1～10∶1混合即得。
步骤(1)中所述的油相为环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(50-80％∶50-20％)。氯化钙水溶液：FGF水溶液∶油相＝0.05～1∶0.05～1∶10～30。
所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。
所述的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。
步骤(1)中所述的磷脂为1，2-油酰磷脂酸(DOPA)，1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种，优选1，2-油酰磷脂酸(DOPA)。
所述的磷酸盐水溶液∶油相∶磷脂＝0.05～1∶10～30∶0.05～1。
步骤(2)中所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙醚中的一种或几种混合；
所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)；
本发明所述包裹细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂或膏霜剂。
因此，本发明提供下述：
1.一种以脂质磷酸钙纳米粒为核心的组合物，其包含1～50重量％的脂质体，1～50重量％磷酸钙，0.0001～1重量％的细胞生长因子FGF。
2.根据第1项所述的组合物，其中所述脂质磷酸钙纳米粒的粒径为100nm～500nm。
3.根据第1项所述的组合物，其中FGF为通过基因工程技术获得的重组人FGF(rhaFGF和rhbFGF)。
4.根据第1项所述的组合物，其中所述脂质体磷酸钙以纳米粒形式存在，所述纳米粒负载有FGF，形成包裹有FGF的脂质体磷酸钙米粒，其制备方法为：(1)将表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂A按照混合，构成油相三元体系。将氯化钙水溶液(10～250mM)、磷酸盐水溶液(10～250mM)以及FGF水溶液(0.1～0.5mg/mL)混合，制成水相，将水相缓慢加入油相充分搅拌，制成油包水的微乳，室温静置5～15min产生磷酸钙沉淀，将柠檬酸钠溶液(5～50mM)逐滴加入微乳中，搅拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过1g 60～200目的硅胶填充的硅胶柱，用体积比1～5∶1的乙醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干乙醇后即得磷酸钙纳米粒水溶液。(2)取磷脂和胆固醇按1～10∶1混合，溶于有机溶剂B中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0.5～3h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照0.1～10∶1混合即得。
5.根据第4项步骤(1)中所述的有机表面活性剂为泊洛沙姆、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或聚山梨醇中的一种或几种；所述的助表面活性剂为正己醇、丙二醇、丙三醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种；所述的有机溶剂A为环己烷、正己烷、正辛烷中的一种；所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。所述的rhFGF为重组人成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。步骤(2)中所述的有机溶剂B为氯仿、二氯甲烷、乙醇中的一种或几种混合；所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)；
6.根据第1项所述的组合物，其还可以通过下述制备所得：(1)将氯化钙水溶液(10～500mM)、FGF水溶液(0.1～5mg/mL)以及油相混合，作为混合液A。氯化钙水溶液∶FGF水溶液∶油相＝0.05～1∶0.05～1∶10～30。将磷酸溶液(10～50mM，pH＝9.0)，油相以及磷脂混合，作为混合液B。磷酸盐水溶液∶油相∶磷脂＝0.05～1∶10～30∶0.05～1。将A、B混合20min，加入10～50mL乙醇，12000g离心5～30min，乙醇洗2-3遍后挥干乙醇，加1～10mL去离子水制成包含FGF的磷酸钙纳米粒混悬液。(2)取磷脂和胆固醇按1～10∶1混合，溶于有机溶剂B中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0.5～3h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照0.1～10∶1混合即得。
7.根据第6项步骤(1)中所述的油相为环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(50-80％∶50-20％)。氯化钙水溶液∶FGF水溶液∶油相＝0.05～1∶0.05～1∶10～30。所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。所述的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。步骤(1)中所述的磷脂为1，2-油酰磷脂酸(DOPA)，1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种，优选1，2-油酰磷脂酸(DOPA)。步骤(2)中所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙醚中的一种或几种混合；所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)；
8.第1-7项中任一项所述的脂质磷酸钙组合物可作为化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。
9.根据第8项所述的脂质磷酸钙纳米粒在其它制剂中的添加量为1～5重量％。
10.一种皮肤修护系列化妆品，其包含有效量的1-9项中任一项的包裹细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒组合物。
与现有技术相比，本发明所述的一种包裹FGF的脂质磷酸钙纳米粒具有下述优点：
1、细胞生长因子常温稳定性差，易降解，易失活；生物利用率低、半衰期短、代谢迅速等特点，在常规剂型应用中存在诸如稳定性差，给药方式单一、用药损伤大、生物利用度低等众多特点。由于稳定性的限制，市售的FGF主要有冻干制剂和液体制剂，其他剂型较为少见。磷酸钙以其良好的稳定性目前已被广泛应用于口腔正畸护理、骨替代物、药物递送材料及血管支架中，而脂质体近年来也同样被广泛利用于多肽和蛋白的载体。以脂质包裹磷酸钙纳米粒为载体极大程度地提高FGF的稳定性。
2、脂质体与磷酸钙均为缓释制剂载体，使内含物缓慢释放，延长内含物作用时间，在细胞内外持久的发挥作用。减少使用量，提高使用安全性。
3、极高的组织相容性，脂质磷酸钙纳米粒增加皮肤对FGF的吸收，外层脂质的生物膜类似结构与皮肤角质层磷脂结构相互作用，改变角质层对药物的屏障作用，通过吸附、融合等方式将药物释放到皮肤细胞间隙。
附图说明
附图1FGF脂质磷酸钙纳米粒制备流程图。
附图2FGF脂质磷酸钙纳米粒制备流程图。
附图3Bal b/c 3T3细胞增殖实验倒置显微镜下(40×)细胞状态图对比。(1)为aFGF脂质磷酸钙纳米粒组；(2)为空白对照组。(1)组比(2)组细胞显著增加。表明aFGF在制备成脂质磷酸钙纳米粒后仍然保持极高的增值活性。
附图4Bal b/c 3T3细胞增殖实验细胞增殖情况对比图。
附图5aFGF脂质磷酸钙纳米粒与aFGF原液稳定性比较。(1)为4℃条件下存放时两种样品的活性变化；(2)为25℃条件下存放时两种样品的活性变化；(3)为40℃条件下存放时两种样品的活性变化。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
本领域技术人员应该理解，如无特别说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。
实施例1FGF脂质磷酸钙纳米粒的制备(方法一)
(1)将聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-1)2.52mL、正己醇1.68mL、环己烷2.8mL混合，构成油相三元体系7mL。将250mM氯化钙水溶液100μL，250mM磷酸氢二钠100μL以及25μL0.1mg/mL的aFGF或bFGF混合，制成水相，将水相缓慢加入油相充分搅拌，制成油包水的微乳，室温静置15min产生磷酸钙沉淀，将125μL 15mM的柠檬酸钠溶液逐滴加入微乳中，搅拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过1g 60～200目的硅胶填充的硅胶柱，用体积比3∶1的乙醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干乙醇后溶于5mL的蒸馏水中。
(2)取DOTAP(购自西安瑞禧生物科技有限公司)与胆固醇按质量比4∶1的比例混合，溶于无水乙醇5mL中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的5mL蒸馏水水合2h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。
(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照1∶1的体积混合即得aFGF或bFGF脂质磷酸钙纳米粒。
实施例2FGF脂质磷酸钙纳米粒的制备(方法二)
(1)取300μL 500mM的氯化钙水溶液，100μL 2mg/mL aFGF或bFGF溶液，15mL环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(71∶29)混合作为溶液A。将300μL 25mM磷酸氢二钠溶液(pH＝9.0)，15mL环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(71∶29)混合后加入200μL，20mg/mL DOPA(购自西安瑞禧生物科技有限公司)搅拌均匀作为溶液B。将溶液A和溶液B混合20min，加入30mL乙醇，12000g离心15min，乙醇洗2～3遍后挥干乙醇，用1mL去离子水溶解。即得包含FGF的磷酸钙纳米粒混悬液。
(2)取DOTAP与胆固醇(均购自西安瑞禧生物科技有限公司)按质量比4∶1的比例混合，溶于无水乙醇5mL中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的5mL蒸馏水水合2h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。
(3)将500μL磷酸钙纳米粒(CaP)加入50μL脂质体溶液，混合均匀即得。
实施例3aFGF脂质磷酸钙纳米粒凝胶剂的制备
按照实施例1制备包含aFGF的脂质磷酸钙纳米粒冻干粉备用，并按照下述方法制备凝胶剂：
各组分的质量百分比如下(质量％)：
| aFGF的脂质磷酸钙纳米粒 | 1％ |
| 卡波姆 | 0.5％ |
| 甘油 | 8％ |
| 山梨酸钾 | 0.1％ |
| 三乙醇胺 | 2％ |
| 去离子水 | 余量 |
将aFGF脂质磷酸钙纳米粒冻干粉10g用蒸馏水溶解备用，加入卡波姆1g、甘油8g、山梨酸钾0.11g，搅拌溶解，加入三乙醇胺2g调节pH值到6-7，加入蒸馏水至全量，搅拌均匀，制成凝胶100g，即得到包含aFGF的脂质磷酸钙纳米粒凝胶剂。
该凝胶剂同样具有良好的创面修复作用，由于凝胶的胶黏特性，作用时间更持久，保湿效果更好，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，避免伤口的感染发炎，并降低过敏的发生率。使用方便，清洗简单。
实施例4皮肤修复乳液
组成乳液的产品的组分及百分数含量为：
制备方法：
(1)将A组加热到80℃后搅拌5min溶解均匀，静置冷却至40℃。
(2)按照实施例1所述方法制备aFGF脂质磷酸钙纳米粒。将事先混合溶解的B组分加入上述A组分的混合溶液搅拌均匀。
(3)将C组分的加入上述两组分的混合溶液，搅拌均匀即得。
实施例5皮肤修复霜
组成霜的产品的组分及百分数含量为：
制备方法：
(1)将A组加热到80℃后搅拌5min溶解均匀，静置冷却至40℃。
(2)将C组分用适量去离子水溶解备用，将C组分加入A组分中，搅拌3min使其均匀。
(3)按照实施例1所述方法制备aFGF脂质磷酸钙纳米粒。将事先混合溶解的B组分加入上述两组分的混合溶液搅拌均匀即得。
实施例6aFGF脂质磷酸钙纳米粒促进3T3细胞增殖作用
将处于对数生长期的3T3细胞(3T3细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)用含10％FBS(FBS购自杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM培养基(DMEM培养基购自美国Gibco公司)常规培养至80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化，以0.5×105个/ml的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换无血清DMEM培养基培养，24h后将培养基吸出后分别加入浓度为50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL的实施例1制备的包裹aFGF脂质磷酸钙纳米粒、aFGF原液以及空白的脂质磷酸钙纳米粒(不含aFGF)，每个浓度设3个复孔，空白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养24h，加入10μl噻唑蓝(MTT)(0.5mg/ml)，培养箱中孵育4h后，吸出孔中溶液并加入150μl DMSO，振荡后于570nm波长下检测吸光度OD值。结果见图3和图4。
图3结果显示与空白脂质磷酸钙纳米粒对照组比较，aFGF脂质磷酸钙纳米粒具有显著的促细胞增殖作用。图4结果显示aFGF脂质磷酸钙纳米粒与aFGF细胞原液同样具有显著的细胞增殖效果，且具有良好的浓度依赖性，表明以脂质磷酸钙纳米粒为载体包裹的FGF仍然保持着良好的细胞增殖活性。
实施例7包裹重组人细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒稳定性考察
分别将上述3批aFGF脂质磷酸钙纳米粒(LCP-aFGF)和aFGF水溶液于温度4℃、25℃和40℃的条件下密闭放置。于放置后0、1、3、5、10、30、60、90天分别检测两者活性。结果见图5。
图5中(1)为4℃条件下存放时两种样品的活性变化；(2)为25℃条件下存放时两种样品的活性变化；(3)为40℃条件下存放时两种样品的活性变化。实验结果显示4℃、25℃和40℃的条件下的aFGF脂质磷酸钙纳米粒组比aFGF原液组降解速度显著降低。表明脂质磷酸钙纳米粒作为载体具有显著提高内含物细胞生长因子的稳定性，使活性成分在常温使用条件下仍能保持较高活性，便于长期储存，延长产品有效期。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (10)
1.一种以脂质磷酸钙纳米粒为核心的组合物，其包含1～50重量％的脂质体，1～50重量％磷酸钙，0.0001～1重量％的细胞生长因子FGF。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质磷酸钙纳米粒的粒径为50nm～200nm。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中FGF为通过基因工程技术获得的重组人FGF，主要为重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和重组人碱性细胞生长因子(rhbFGF)。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体磷酸钙以纳米粒形式存在，所述纳米粒负载有FGF，形成包裹有FGF的脂质体磷酸钙米粒，其制备方法为：(1)将表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂A按照混合，构成油相三元体系。表面活性剂∶助表面活性剂∶有机溶剂A＝1～5∶1～5∶1～5。将氯化钙水溶液(10～250mM)、磷酸盐水溶液(10～250mM)以及FGF水溶液(0.1～0.5mg/mL)混合，制成水相，氯化钙水溶液∶磷酸盐水溶液∶FGF水溶液＝10～200∶10～200∶10～50。将水相缓慢加入油相充分搅拌，制成油包水的微乳，室温静置5～15min产生磷酸钙沉淀，将柠檬酸钠溶液(5～50mM)逐滴加入微乳中，搅拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过1g 60～200目的硅胶填充的硅胶柱，用体积比1～5∶1的乙醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干乙醇后即得磷酸钙纳米粒水溶液。(2)取磷脂和胆固醇按1～10∶1混合，溶于有机溶剂B中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0.5～3h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照0.1～10∶1混合即得。
5.根据权利要求4，步骤(1)中所述的有机表面活性剂为泊洛沙姆、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或聚山梨醇中的一种或几种；所述的助表面活性剂为正己醇、丙二醇、丙三醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种；所述的有机溶剂A为环己烷、正己烷、正辛烷中的一种；所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。所述的rhFGF为重组人成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。步骤(2)中所述的有机溶剂B为氯仿、二氯甲烷、乙醇中的一种或几种混合；所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、聚乙二醇2000-二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)。
6.根据权利要求1所述的组合物，其还可以通过下述制备所得：(1)将氯化钙水溶液(10～500mM)、FGF水溶液(0.1～5mg/mL)以及油相混合，作为混合液A。氯化钙水溶液∶FGF水溶液∶油相＝0.05～1∶0.05～1∶10～30。将磷酸溶液(10～50mM，pH＝9.0)，油相以及磷脂混合，作为混合液B。磷酸盐水溶液∶油相∶磷脂＝0.05～1∶10～30∶0.05～1。将A、B混合20min，加入10～50mL乙醇，12000g离心5～30min，乙醇洗2-3遍后挥干乙醇，加1～10mL去离子水制成包含FGF的磷酸钙纳米粒混悬液。(2)取磷脂和胆固醇按1～10∶1混合，溶于有机溶剂B中，于50℃旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0.5～3h，过0.22μm微孔滤膜，得到脂质体溶液。(3)将(1)、(2)制备所得的溶液按照0.1～10∶1混合即得。
7.根据权利要求6，步骤(1)中所述的油相为环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(50-80％∶50-20％)。氯化钙水溶液∶FGF水溶液∶油相＝0.05～1∶0.05～1∶10～30。所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。所述的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)中的一种。步骤(1)中所述的磷脂为1，2-油酰磷脂酸(DOPA)，1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种，优选1，2-油酰磷脂酸(DOPA)。步骤(2)中所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙醚中的一种或几种混合；所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷(DOTAP)。
8.权利要求1-7中任一项所述的脂质磷酸钙组合物可作为化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。
9.根据权利要求8，所述的FGF脂质磷酸钙纳米粒在其它制剂中的添加量为1～5重量％。
10.一种皮肤修护系列化妆品，其包含有效量的权利要求1-9中任一项的包裹细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒组合物。
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