CN105873605A - 氟化钙组合物 - Google Patents

氟化钙组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN105873605A
CN105873605A CN201480070872.3A CN201480070872A CN105873605A CN 105873605 A CN105873605 A CN 105873605A CN 201480070872 A CN201480070872 A CN 201480070872A CN 105873605 A CN105873605 A CN 105873605A
Authority
CN
China
Prior art keywords
calcium fluoride
composite
compositions
solution
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480070872.3A
Other languages
English (en)
Inventor
V.范德维尔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Publication of CN105873605A publication Critical patent/CN105873605A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/099—Bordetella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

提供了包含氟化钙复合材料的组合物，所述氟化钙复合材料包含Ca、F和有机分子，还提供了使用它们的方法。

Description

氟化钙组合物
技术领域
本公开内容涉及用于稳定化疫苗抗原和用于增强免疫应答的复合材料，所述免疫应答针对与所述复合材料一起使用的抗原。
背景技术
亚单位疫苗（例如重组蛋白/多肽抗原）仅仅是弱免疫原性的，且因而需要安全且有效的佐剂。各种佐剂是已知的，包括包含金属盐（诸如明矾、磷酸铝和磷酸钙）的那些。参见，例如，Lindblad (2004) Vaccine 22:3658-3668; Jiang等人(2004) Vaccine 23:693-698。
由于实用和后勤原因，疫苗的热稳定性是期望的，这是因为疫苗的热稳定性减小或避免在全世界分销过程中对低温运输系统(cold-chain)的需要。经常应用冷冻干燥技术来稳定抗原。但是，冷冻干燥不总是可能或有效。此外，绕过昂贵的且耗时的冷冻干燥生产步骤可以增加疫苗向世界上更大数目的人的可达性。
发明概述
在一个方面，本公开内容提供了包含Ca、F和Z的氟化钙复合材料，其中Z是有机分子。提供了它们的生产方法。还提供了使用它们作为佐剂的方法，也提供了使用它们稳定抗原免于温度效应的方法。这样的方法包括使用一些没有经过冷冻干燥的复合材料。
在另一个方面，提供了包含氟化钙复合材料的氟化钙组合物，所述复合材料包含Ca、F和Z，其中Z是有机分子。
在另一个方面，提供了通过溶胶凝胶沉淀制备氟化钙复合材料的方法，所述方法包括下述步骤：在沉淀条件下组合CaCl2、NaF和NaZ，和收集不溶于水的氟化钙复合材料。在另一个方面，提供了通过所述方法制备的产品。
在另一个方面，提供了佐剂组合物，其包含在上述方面中公开的氟化钙组合物。
在另一个方面，提供了制备在上述方面中公开的佐剂组合物的方法。
在另一个方面，提供了免疫原性组合物，其包含抗原和如在上述方面中公开的佐剂组合物。
在另一个方面，提供了制备在上述方面中公开的免疫原性组合物的方法。
附图简述
图1：用HepB得到的动物结果：抗体测量(抗-HBs 14pII)。当将抗原吸附在本文描述的CaF2家族的不同载体上时，维持抗原的应答。
图2：批次8833107相比于8833111的红外光谱图。红外分析显示球霰石（Vaterite）型CaCO3的存在。
图3：Ca/F/OH复合材料的水可溶性，揭示所述复合材料的可溶性比在手册中报道的CaF2的可溶性更高。
图4：在t=0通过SDS-PAGE分析来分析的F4T制剂。泳道：1，分子量标准品；2，样品缓冲液；3，CaF2/CO3 + 脂质体；4，F4T + CaF2；5，F4T + CaF2 + 脂质体；6，F4T + CaF2/半胱氨酸；7，F4T + CaF2/半胱氨酸+ 脂质体；8，F4T + CaF2/CO3；9，F4T + CaF2/CO3 + 脂质体；10，F4T。参见实施例3B。
图5：在4℃1个月以后通过SDS-PAGE分析的F4T制剂。泳道：1，分子量标准品；2，F4T主体(bulk)：在-80℃储存1个月并恰好在储存之前融化的主体；3，在4℃储存1个月的F4T主体；4，在没有无机物存在下配制并在4℃储存1个月的F4T；5，F4T + CaF2；6，F4T + CaF2 +脂质体；7，F4T + CaF2/半胱氨酸；8，F4T + CaF2/半胱氨酸+ 脂质体；9，F4T + CaF2/CO3；10，F4T + CaF2/CO3 + 脂质体。参见实施例3B。
图6：在30℃1个月以后通过SDS-PAGE分析的F4T制剂。泳道：1，分子量标准品；2，F4T主体：在-80℃储存1个月并恰好在储存前融化的主体；3，在30℃储存1个月的F4T主体；4，在没有无机物存在下配制并在30℃储存1个月的F4T；5，F4T + CaF2；6，F4T + CaF2 + 脂质体；7，F4T + CaF2/半胱氨酸；8，F4T + CaF2/半胱氨酸+ 脂质体；9，F4T + CaF2/CO3；10，F4T + CaF2/CO3 + 脂质体。注意到泳道3和4 (不含复合材料的F4T)的显著降解。参见实施例3B。
图7：复合材料+ ClfAN123免疫原性(抗体)。当将抗原吸附到不同的载体上时，维持抗原的免疫原性。用稳定化的ClfAN123复合材料(吸附在无机载体上)免疫小鼠。通过ELISA-ClfAN123复合材料进行这些吸附的复合材料在乳剂制剂中的免疫原性(在Post III上的浓度(µg/mL))。从左至右，未处理，吸附在CaF2/CaCO3上，吸附在CaF2/N-乙酰半胱氨酸上，吸附在CaF2上，和吸附在CaF2/半胱氨酸上。参见实施例4。
图8：批次8833152-7的红外光谱图。
图9：HepB吸附的抗原的免疫应答。参见实施例5。
图10：本文公开的氟化钙复合材料的电子显微镜照片。拍摄在批号10616125中公开的氟化钙复合材料的照片(参见表1和标题为“Ca/F/N-乙酰半胱氨酸批号10616125。”的实施例)。
图11：用吸附在不同复合材料上的两种不同剂量的rF抗原的第二次免疫接种14天以后血清中的RSV中和滴度。参见实施例6。
图12：用吸附在不同复合材料上的两种不同剂量的rF抗原的第二次免疫接种14天以后血清中的抗-rF IgG浓度。参见实施例6。
图13：根据由2µg rF和佐剂组成的各种方式，RSV攻击4天以后肺中的RSV滴度。参见实施例7。
图14：复合材料-19F-DT制剂在Balb/c小鼠免疫原性模型中的评价。参见实施例8。
图15：复合材料-19F-DT制剂在Balb/c小鼠免疫原性模型中的评价(续)。参见实施例8。
图16：复合材料-19F-DT制剂在Balb/c小鼠免疫原性模型中的评价(续)。参见实施例8。
图17：复合材料-19F-DT制剂在Balb/c小鼠免疫原性模型中的评价(续)。参见实施例8。
图18：各种复合材料-PRN的动物结果。参见实施例9。
详细描述
本文中公开了抗原对不溶于水的氟化钙复合材料的吸附稳定抗原免于温度依赖性的降解。此外，公开了氟化钙复合材料通过增加针对吸附在其上面的抗原的免疫应答而作为佐剂起作用。
组合物
在一些方面，提供了包含氟化钙复合材料的氟化钙组合物，所述复合材料包含Ca、F和Z。“Z”是指有机(含碳的)分子。“复合材料”是指当干燥时作为固体存在且不溶于或难溶于纯水的材料。
在一些方面，所述复合材料包含相等百分比(w/w)的Ca和F。在一些方面，所述复合材料包含比F百分比(w/w)更大的Ca百分比(w/w)。“X百分比(w/w)”(其中X是在组合物中发现的分子或元素)是指可归因于X的组合物的总重量的百分比。因而，在本发明的上下文中，w/w是指干重。对于其中已知相对比率的组合物，可以在数学上确定百分比(w/w)。例如，CaF2的组合物包含大致51%Ca和大致49%F (w.w)：%w/w Ca = [(40g/mol Ca * 100)]/[40g/mol Ca + (2 * 19g/mol F)] = 51；%w/w F = [(2 * 19g/mol F) * 100]/[40g/molCa + (2 * 19g/mol F)] = 49。尽管如此，也可以通过经验方法确定%w/w。例如，在目标分子是酸或碱的情况下，通过滴定可以确定该分子的百分比(w/w)(在Z是碳酸盐的情况下，通过用HCl滴定可以确定百分比(w/w)/碳酸盐)。可替换地，在分子含有部分重量百分比的氮的情况下，通过元素分析方法可以确定该分子的百分比(w/w)，在所述元素分析方法中，确定氮的量，然后使用含氮分子的分子量计算可归因于含氮分子的总重量。用于该方法的仪器可商业得到，例如得自AntekTM, 300 Bammel Westfield Road, Houston, Texas 77090。可替换地，通过氧化-还原滴定方法，可以确定可氧化的有机分子的百分比（w/w），例如在高锰酸钾存在下在硫酸存在下。
在一些方面，本文公开的氟化钙复合材料可以如下表示：
CaF(2-x)Z(x)/Z(y) 式I
其中x是0-2（包括端点）的非负数字，且y是非负数字。在一些方面，y是0-2（包括端点）的非负数字。在一些方面，x和y一起的总和是等于或小于2的非负数字。在一些方面，x和y不都为0。但是，如在已知它们的组成时将会理解的，如本文中所述的氟化钙复合材料可以不是均匀的，而是可能包含其中Z与剩余组分主要通过离子或共价相互作用而相互作用的区域和其中Z与剩余组分通过弱力而相互作用的区域(由“/Z”表示)。在该背景下，Z(x)代表Z的离子化形式，且Z(y)代表Z的未离子化形式，诸如HZ或AZ或其混合物，其中A是抗衡离子。这样的不均匀的复合材料可以如下表示：
CaF(2-x)Z(x)/HZ(y) 式II
或者
CaF(2-x)Z(x)/AZ(y) 式III
其中x和y都不为0。
如本文公开的氟化钙复合材料将具有在干燥时形成固体的特征，将不溶于或难溶于纯水，且表现出在5.0-11.0（包括端点）范围内的E.C.P.。
在一些方面，Z包含当离子化时形成阴离子的官能团。这样的官能团包括但不限于一个或多个选自以下的官能团：羟基、羟基化物、配位羟离子(hydroxo)、氧代、N-羟基化物、氧肟酸盐(hydroaxamate)、N-氧化物、碳酸氢盐、碳酸盐、羧酸盐、脂肪酸、硫醇盐、有机磷酸盐、磷酸二氢盐(dihydrogenophosphate)、磷酸氢盐(monohydrogenophosphate)、磷酸的单酯、磷酸的二酯、磷脂的酯、硫代磷酸酯、硫酸盐、硫酸氢盐、烯醇化物、抗坏血酸盐、含磷抗坏血酸盐(phosphoascorbate)、酚盐和亚胺-醇盐（imine-olates）。在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是对钙具有亲合力且与钙和氟化物形成不溶于水的复合材料的阴离子有机分子。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z可以归类为包含选自以下的化学种类的成员：羟基、羟基化物、配位羟离子、氧代、N-羟基化物、氧肟酸盐、N-氧化物、碳酸氢盐、碳酸盐、羧酸盐和二羧酸盐、羧酸的盐、QS21的盐、皂皮树(Quillaja saponaria)树皮的提取物、免疫活性皂苷的提取物、饱和或不饱和脂肪酸的盐、油酸的盐、氨基酸的盐、硫醇盐、硫羟乳酸盐、硫醇-化合物的盐、半胱氨酸的盐、N-乙酰半胱氨酸的盐、L-2-氧代-4-噻唑烷羧酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢盐、磷酸的盐、磷酸的单酯和它们的盐、磷酸的二酯和它们的盐、3-O-脱酰基-4’-单磷酰基脂质A的酯、3D-MLA的酯、MPL、磷脂的酯、DOPC、二油酰基磷脂衍生物、来自CPG基序的磷酸盐、来自CpG家族的硫代磷酸酯、硫酸盐、硫酸氢盐、硫酸的盐、烯醇化物、抗坏血酸盐、含磷抗坏血酸盐、酚盐、α-生育酚、亚胺-醇盐、胞嘧啶、甲基-胞嘧啶、尿嘧啶(uracyl)、胸腺嘧啶、巴比妥酸、次黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤、鸟苷、8-氧代-腺嘌呤、黄嘌呤、尿酸、蝶酸、蝶酰谷氨酸、叶酸、核黄素和光黄素。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z选自：N-乙酰半胱氨酸；硫羟乳酸盐；己二酸盐；碳酸盐；叶酸；谷胱甘肽；和尿酸。在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z选自：N-乙酰半胱氨酸；己二酸盐；碳酸盐；和叶酸。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是N-乙酰半胱氨酸，且所述复合材料包含51%Ca、48%F、不超过1%N-乙酰半胱氨酸(w/w)至37%Ca、26%F和37%N-乙酰半胱氨酸(w/w)。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是硫羟乳酸盐，且所述复合材料包含51%Ca、48%F、不超过1%硫羟乳酸盐(w/w)至42%Ca、30%F、28%硫羟乳酸盐(w/w)。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是己二酸盐，且所述复合材料包含51%Ca、48%F、不超过1%己二酸盐(w/w)至38%Ca、27%F、35%己二酸盐(w/w)。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是Z是碳酸盐，且所述复合材料包含51%Ca、48%F、不超过1%碳酸盐(w/w)至48%Ca、34%F、18%碳酸盐(w/w)。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是叶酸，且所述复合材料包含51%Ca、48%F、不超过1%叶酸(w/w)至22%Ca、16%F、62%叶酸(w/w)。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是谷胱甘肽，且所述复合材料包含51%Ca、48%F、不超过1%谷胱甘肽(w/w)至28%Ca、20%F、52%谷胱甘肽(w/w)。
在一些方面，本文中的氟化钙复合材料包含Z，其中Z是尿酸，且所述复合材料包含51%Ca、48%F和不超过1%尿酸(w/w)至36%Ca、26%F和38%尿酸(w/w)。
在一些方面，包含Ca、F和Z的氟化钙复合材料具有以下组成(图表1)：
。
在一些方面，本文公开的氟化钙组合物是药物上可接受的。
在一些方面，本文公开的氟化钙复合材料呈颗粒形式。在一些方面，所述复合材料颗粒是在纳米颗粒(nanoparticle)或微米颗粒(microparticle)尺寸范围内。
“纳米颗粒”是指在1 nm - 999 nm（包括端点）的范围内的颗粒。在该定义内包括在以下范围内的颗粒：(A) 50nm至100nm（包括端点）；45nm至110nm（包括端点）；40nm至120nm（包括端点）；35nm至130nm（包括端点）；30nm至140nm（包括端点）；25nm至150nm（包括端点）；20nm至160nm（包括端点）；15nm至170nm（包括端点）；10nm至180nm（包括端点）；(B)不小于10nm、不小于15nm、不小于20nm、不小于25nm；(C)不超过150nm、不超过200nm、不超过250nm、不超过300nm、不超过350nm、不超过400nm、不超过450nm、不超过500nm、不超过550nm、不超过600nm、不超过650nm、不超过700nm、不超过750nm、不超过800nm、不超过850nm；或(D)大致约25 nm。
“微米颗粒”是指在1µm - 999µm（包括端点）的范围内的颗粒。在该定义内包括在不超过50µm、不超过100µm、不超过150µm、不超过200µm、不超过250µm、不超过300µm、不超过350µm、不超过400µm、不超过450µm、不超过500µm、不超过550µm、不超过600µm、不超过650µm、不超过700µm、不超过750µm、不超过800µm、不超过850µm、不超过900µm、不超过950µm的范围内的颗粒。
在一些方面，本文公开的氟化钙组合物包含超过一种复合材料，其中每种复合材料包含如在上述段落中公开的Ca、F和Z，且其中每种复合材料彼此的差别在于Ca、F或Z的百分比（w/w）或在于Z的化学结构。
在一些方面，本文公开的氟化钙组合物包含抗原，其中所述抗原吸附至氟化钙复合材料。
“抗原”是指能够在人或动物中引起免疫应答的蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖缀合物、分子或半抗原。抗原可以是衍生的、同源的或合成的以模仿来自病毒、细菌、寄生物、原生动物或真菌的分子。在本发明的一个替代实施方案中，抗原是衍生的、同源的或合成的以模仿来自肿瘤细胞或瘤形成的分子。在本发明的另一个实施方案中，抗原是衍生的、同源的或合成的以模仿来自在变态反应、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、肥胖和烟碱依赖中涉及的物质的分子。
Lindemann (1985) Scandinavian Journal of Dental Research, 93:381-83描述了清蛋白、硫酸软骨素和糖蛋白在氟化钙(Ca F2)上的吸附。Cheung等人(2007) Journalof applied Microbiology 102:701-710)报道了微生物在CaF2上的吸附。最近，Zhang等人(2010) Chem. Eur. J. 16:5672-5680描述了布洛芬在单分散CaF2中空纳米球(nano-sphere)上的吸附。通过在适当的缓冲液中将抗原混合至纳米或微米颗粒形式的无机材料的水悬浮液中，进行抗原在无机材料上的吸附。根据关于所述抗原已知的或确定的条件，选择时间、温度、pH、盐和赋形剂的存在的最优化。取决于抗原的性质和化学组成，可能发生下述相互作用吸附模式中的至少一种：通过配体交换、通过静电力或通过疏水力实现的吸附。基于个例来最优化抗原/无机物比率。通过使用较小尺寸的颗粒，可以增加可利用的无机物表面。
在一些方面，在温和搅拌下在室温历时2小时吸附抗原。在一些方面，制备氟化钙组合物的方法包括在形成氟化钙复合材料的过程中将一种或多种抗原吸附至所述氟化钙复合材料的步骤。在一些方面，制备氟化钙组合物的方法包括在形成氟化钙复合材料以后将一种或多种抗原吸附至所述氟化钙复合材料的步骤。
对于各种有机化合物(Z)，在颗粒的表面处测量的电荷会变化(参见表2A)。该颗粒性质可以用于最优化通过相互作用的静电模式实现的抗原吸附。
在一些方面，本文公开的氟化钙组合物用于稳定化抗原。在该应用的一些方面，将抗原热稳定化。在该应用的一些方面，将抗原吸附至所述氟化钙复合材料。
在一些方面，本文公开的氟化钙组合物用于医学。在一些方面，本文公开的氟化钙组合物用于在哺乳动物中引起免疫应答。在一些方面，本文公开的氟化钙组合物用于在人中引起免疫应答。在一些方面，本文公开的氟化钙组合物用于预防和/或治疗哺乳动物免于由病毒、细菌或寄生物造成的疾病。在一些方面，本文公开的氟化钙组合物用于预防和/或治疗人免于由病毒、细菌或寄生物造成的疾病。对于这样的应用，通过施用给有此需要的受试者，可以递送本文公开的组合物。施用可以是通过许多途径，包括肌内地、皮下地、皮内地、舌下地、向扁桃体或鼻内地递送。
从固体颗粒制备组合物的方法
CaF2可商业得到(Riedel de Haën™)。用在本文公开的组合物中的纯CaF2可以通过下述方案从固体CaF2制备。
方案1：
1. 将CaF2固体颗粒放在容器中。
2. 加入水。
3. 混合CaF2 + 水。
4. 将混合物静置。
5. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
6. 重复步骤3 - 5。
7. 浓缩CaF2固体(通过，例如，离心)。
用在本文公开的组合物中的复合材料可以通过下述方案制备。起始组分可商业得到。
方案2：
1. 制备包含选择的化合物Z的溶液。
2. 加入CaF2固体颗粒。
3. 混合CaF2固体颗粒+包含Z的溶液。
4. 将混合物静置。
5. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
8. 重复步骤3 - 5。
6. 浓缩得到的固体(通过，例如，离心)。
从水溶液制备组合物的方法
已知在溶液中从起始组分合成CaF2的方法。例如，Sun等人(2008) Dental materials24:111-116报道了通过喷雾干燥下述制备纳米尺寸氟化钙，但是该方法具有使用氢氧化钙溶液的缺点，所述氢氧化钙溶液容易从空气吸附CO2，从而产生不希望的碳酸钙污染。参见Kalinkin (2005) Inorganic Materials 41:1073-1079。根据Feldmann等人(2006) Small2:1248-1250，也可以制备纳米级氟化钙，但是该方法具有使用硝酸盐的缺点，所述硝酸盐即使在痕量水平浓度对于人注射用制剂也是有问题的。通过溶胶凝胶沉淀方法，可以合成CaF2。
在Nandiyanto等人(2011)“Liquid-phase Synthesis of CaF2 Particles andTheir Low Refractive Index Characterization”KONA Powder and Particle Journal29:141-155中，描述了溶胶凝胶沉淀方法。Nandiyanto显示，某些参数影响在溶胶凝胶方法下的颗粒形成。例如，为了影响颗粒生长步骤，可以调节计时和温度。申请人通过包括如在下述步骤中一般地描述的和在实施例中详细地描述的洗涤步骤而修改了所述溶胶凝胶方法。在一些方面，洗涤步骤的包括是减小颗粒生长步骤的另一种途径。观察到，在通过稀释进行洗涤的过程中，原材料的浓度下降。还预见到，在洗涤过程中，将发生新形成的颗粒的稀释。根据如方案3所修改的反应I，通过溶胶凝胶沉淀可以制备用在本文公开的组合物中的CaF2。
CaCl2 + NaF→CaF(2) + NaCl 反应I。
方案3：
1. 制备包含NaF的溶液(并通过过滤灭菌)。(NaF可商业得到.)
2. 制备包含CaCl2的溶液(并通过过滤灭菌)。(CaCl2可商业得到.)
3. 混合步骤1和2的溶液。
4. 将混合物静置。
5. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
6. 将保留的液体混合，并将混合物静置。
7. 重复步骤5 - 6。
8. 浓缩得到的固体(通过，例如，离心)。
通过在反应中包括Z，进一步修改用在本公开内容中的溶胶凝胶方法。在一些方面，提供了通过溶胶凝胶沉淀制备氟化钙复合材料的方法，所述方法包括下述步骤：在沉淀条件下组合CaCl2、NaF和NaZ，和收集不溶于水的氟化钙复合材料。在一些方面，所述方法包括洗涤所述氟化钙复合材料的步骤。在一些方面，提供了通过溶胶凝胶沉淀制备氟化钙复合材料的方法，所述方法包括下述步骤：在沉淀条件下组合CaCl2、NaF和NaZ，和收集不溶于水的氟化钙复合材料。
通过遵循方案4，根据反应II可以制备用在本文公开的组合物中的氟化钙复合材料。
CaCl2 + NaF + AZ→CaF(2-x)Zx/Zy + NaCl 反应II
其中A是金属，且x和y如在式I中所述。在一些方面，A是Ca或Na。
方案4：
1. 制备包含选择的NaZ的溶液(并通过过滤灭菌)。
2. 制备包含NaF的溶液(并通过过滤灭菌)。
3. 制备包含CaCl2的溶液(并通过过滤灭菌)。
4. 将步骤1和2的溶液组合，然后与步骤3的溶液组合，然后混合。
5. 将混合物静置。
6. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
7. 将保留的液体混合，并将混合物静置。
8. 重复步骤6 - 7。
9. 浓缩得到的固体(通过，例如，离心)。
可替换地，通过遵循方案5，根据反应II可以制备用在本文公开的组合物中的氟化钙复合材料。
方案5：
1. 制备包含NaF的溶液(并通过过滤灭菌)。
2. 制备包含CaCl2和选择的有机Z的溶液(并通过过滤灭菌)。
3. 混合步骤1和2的溶液。
4. 将混合物静置。
5. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
6. 将保留的液体混合，并将混合物静置。
7. 重复步骤5 - 6。
8. 浓缩得到的固体(通过，例如，离心)。
可替换地，通过遵循方案6，根据反应II可以制备用在本文公开的组合物中的氟化钙复合材料。
方案6：
1. 制备包含NaF和选择的有机Z的溶液(并通过过滤灭菌)。
2. 制备包含CaCl2的溶液(并通过过滤灭菌)。
3. 混合步骤1和2的溶液。
4. 将混合物静置。
5. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
6. 将保留的液体混合，并将混合物静置。
7. 重复步骤5 - 6。
8. 浓缩得到的固体(通过，例如，离心)。
可替换地，根据方案7，使用抗坏血酸钙可以制备用在本文公开的组合物中的氟化钙复合材料。
方案7：
1. 制备包含CaC12H14O12的溶液(并通过过滤灭菌)。
2. 制备包含NaF的溶液(并通过过滤灭菌)。
3. 混合步骤1和2的溶液。
4. 将混合物静置。
5. 将直到或超过½的上清液除去并用水替换。
6. 将保留的液体混合，并将混合物静置。
7. 重复步骤5 - 6。
8. 浓缩得到的固体(通过，例如，离心)。
在一些方面，制备氟化钙组合物的方法包括在沉淀条件下将一种或多种抗原与CaCl2、NaF和NaZ组合。在一些方面，制备氟化钙组合物的方法包括洗涤所述氟化钙复合材料的步骤，其中所述洗涤步骤还包括将一种或多种抗原与所述氟化钙复合材料组合。在一些方面，制备氟化钙组合物的方法包括将所述氟化钙复合材料与一种或多种抗原混合的步骤。
在一些方面，公开了通过本文所述的方法制备的产品。
佐剂组合物
在一些方面，提供了一种佐剂组合物，其包含本文公开的氟化钙组合物。“佐剂组合物”是指，与单独抗原的施用相比，能够增加对所述抗原的免疫应答的本文公开的氟化钙组合物。在一些方面，本文公开的佐剂组合物还包含免疫刺激剂。
在一个方面，该免疫刺激剂可以是皂苷。用在本发明中的一种特别合适的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美洲树皂皮树（Quillaja Saponaria Molina）分离出的皂苷制剂，且由Dalsgaard等人在1974年(“Saponin adjuvants”, Archiv. fur diegesamte Virusforschung, 第44卷, Springer Verlag, Berlin, 第243-254页)首次描述为具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留佐剂活性，没有与Quil A有关的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21 (也被称作QA7和QA21)。QS-21是从皂皮树的树皮衍生出的天然皂苷，其诱导CD8+ 细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和优势的IgG2a抗体应答。在本发明的上下文中，QS21是一种优选的皂苷。
在本发明的合适形式中，在所述佐剂组合物内的皂苷佐剂是皂皮树(saponariamolina) quil A的衍生物，优选地是Quil A的免疫活性级分，诸如QS-17或QS-21, 适当地是QS-21。
在一个具体的方面，将QS21提供在它的低反应原性组合物中，其中将它用外源固醇（诸如胆固醇）猝灭。存在低反应原性组合物的几种特定形式，其中将QS21用外源胆固醇猝灭。在一个具体的方面，所述皂苷/固醇是呈脂质体结构的形式(WO 96/33739)。在该方面，所述脂质体适当地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其适当地在室温是非结晶的，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂基磷脂酰胆碱。所述脂质体还可以含有带电荷的脂质，对于由饱和脂质组成的脂质体而言，所述带电荷的脂质增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况中，带电荷的脂质的量适当地是1-20%w/w，优选地是5-10%。固醇与磷脂的比率是1-50%(mol/mol)，适当地是20-25%。
合适的固醇包括β-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个特定方面，所述佐剂组合物包含胆固醇作为固醇。这些固醇是本领域众所周知的，例如胆固醇作为在动物脂肪中发现的天然存在的固醇公开在Merck Index, 第11版, 第341页。
在活性皂苷级分是QS21的情况下，QS21: 固醇的比率将通常是在1:100至1:1 (w/w)的量级，适当地在1:10至1:1 (w/w)之间，且优选地在1:5至1:1 (w/w)之间。适当地存在过量的固醇，QS21:固醇的比率是至少1:2 (w/w)。在一个方面，QS21:固醇的比率是1:5 (w/w)。所述固醇适当地是胆固醇。
在另一个方面，所述佐剂组合物包含免疫刺激剂，其为Toll-样受体4 (TLR4)激动剂。“TLR激动剂”是指这样的组分：其能够作为直接配体或通过内源性或外源性配体的产生而间接地造成经由TLR信号传导途径的信号传导应答(Sabroe等人, Jl 2003 p1630-5)。TLR4激动剂能够造成经由TLR-4信号传导途径的信号应答。TLR4激动剂的一个合适的例子是脂多糖，适当地是脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3-脱酰的单磷酰脂质A (3D - MPL)。
3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.在名称MPL下销售，并且在本文件中自始至终称作MPL或3D-MPL。参见，例如，美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-g (Th1)表型的CD4+ T细胞应答。根据在GB 2 220211 A中公开的方法，可以生产3D-MPL。在化学上，它是具有3、4、5或6个酰化链的3-脱酰的单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL来制备佐剂组合物。小颗粒3D-MPL具有使它可以通过0.22 μm过滤器无菌过滤的颗粒尺寸。这样的制剂描述在WO 94/21292中。优选地，使用粉状3D-MPL来制备本发明的佐剂组合物。
可以使用的其它TLR4激动剂是氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，诸如在WO98/50399或美国专利号6,303,347 (也公开了制备AGP的方法)中公开的那些，适当地是如在美国专利号6,764,840中公开的RC527或RC529或AGP的药物上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，且一些是TLR4拮抗剂。认为二者都可用作免疫刺激剂。
其它合适的TLR-4激动剂如在WO2003/011223中和在WO 2003/099195中所述，诸如在WO2003/011223的第4-5页上或在WO2003/099195的第3-4页上公开的化合物I、化合物Il和化合物III，且特别是在WO2003/011223中作为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764公开的那些化合物。例如，一种合适的TLR-4激动剂是ER804057。
在一个特定方面，所述佐剂组合物包含皂苷和TLR4激动剂两者。在一个具体实例中，所述佐剂组合物包含QS21和3D-MPL。
TLR-4激动剂（诸如脂多糖，诸如3D-MPL）可以以1-100 μg/人剂量的佐剂组合物之间的量使用。3D-MPL可以以约50 μg的水平使用，例如40-60 μg之间，适当地45-55 μg之间，或49-51 μg之间或50 μg。在另一个方面，所述佐剂组合物的人剂量包含约25 μg水平的3D-MPL，例如20-30 μg之间，合适的21-29 μg之间或22-28 μg之间或28-27 μg之间或24-26 μg之间，或25 μg。
皂苷（诸如QS21）可以以1-100 μg/人剂量的佐剂组合物之间的量使用。QS21可以以约50 μg的水平使用，例如40 - 60 μg之间，适当地45-55 μg之间或49-51 μg之间或50 μg。在另一个方面，所述佐剂组合物的人剂量包含约25 μg水平的QS21，例如20-30 μg之间，适当地21-29 μg之间或22-28 μg之间或28-27 μg之间或24-26 μg之间，或25 μg。
在TLR4激动剂和皂苷都存在于佐剂组合物中的情况下，那么TLR4激动剂与皂苷的重量比适当地是在1:5至5:1之间，适当地是1:1。例如，在3D-MPL以50 μg或25 μg的量存在的情况下，那么适当地QS21也可以分别以50 μg或25 μg/人剂量的佐剂组合物的量存在。
在一个方面，所述免疫刺激剂是TLR9激动剂，例如如在WO 2008/142133中所述。在一个具体实例中，所述TLR9激动剂是免疫刺激性的寡核苷酸，尤其是含有未甲基化的CpG基序的寡核苷酸。这样的寡核苷酸是众所周知的，并且描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488和US 5,865,462中。用在本文描述的佐剂组合物中的合适TLR9激动剂是含有CpG的寡核苷酸，其任选地含有被至少三个（合适地，至少六个或更多个）核苷酸隔开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和随后的鸟嘌呤核苷酸。
在一个方面，所述寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或可能是硫代磷酸酯键，尽管也可以使用磷酸二酯和其它核苷酸间键，包括具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中。预见到包含不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。可以使用使寡核苷酸稳定的其它核苷酸间键。
适合于包含在本文描述的佐剂组合物中的CpG寡核苷酸的例子具有以下序列。在一个方面，这些序列含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。
替代性的CpG寡核苷酸可以包含上面的序列，它们在其中具有对所述序列的不连续缺失或添加。
在一个方面，所述免疫刺激剂是母育酚。母育酚是本领域众所周知的，且描述在EP0382271中。在一个特定方面，所述母育酚是α-生育酚或其衍生物诸如α-生育酚琥珀酸酯(也被称作维生素E琥珀酸酯)。
在一个方面，本文公开的佐剂组合物包含吸附至氟化钙复合材料的免疫刺激剂。在一个方面，佐剂组合物包含吸附至氟化钙复合材料的免疫刺激剂，其中所述吸附至氟化钙复合材料的免疫刺激剂是MPL。
在一个方面，公开了本文公开的佐剂组合物，与当将抗原与氟化钙组合物一起或单独地施用时针对所述抗原产生的免疫相比，所述佐剂组合物用于增加对所述抗原的免疫应答。在一个方面，公开了本文公开的佐剂组合物，与当将抗原与磷酸钙一起施用时针对所述抗原产生的免疫相比，所述佐剂组合物用于增加对所述抗原的免疫应答。通过施用给有此需要的受试者，可以递送本文公开的组合物。施用可以是通过许多途径，包括肌内地、皮下地、皮内地、舌下地、向扁桃体或鼻内地递送。
制备佐剂组合物的方法
在一些方面，公开了制备如在本文公开的佐剂组合物的方法，所述方法包括将免疫刺激剂与本文描述的氟化钙复合材料组合的步骤。在一些方面，公开了制备如在本文公开的佐剂组合物的方法，所述方法包括将抗原吸附至如本文中所述的氟化钙复合材料的步骤。
免疫原性组合物
在一些方面，提供了包含抗原和如本文中所述的佐剂组合物的免疫原性组合物。在一些方面，提供了要肌内地、皮下地、皮内地、舌下地、向扁桃体或鼻内地递送的如本文公开的免疫原性组合物。
在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中所述组合物的pH是在约pH5至pH9之间。在一些方面，提供了适合于人施用的如本文公开的免疫原性组合物。在一些方面，提供了如本文公开的免疫原性组合物，其包含一种或多种药物上可接受的赋形剂，尤其是缓冲剂、Tris缓冲剂；或组氨酸缓冲剂。在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中所述组合物在无菌条件下制备。在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中所述组合物是无致热原的。在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中所述组合物是等渗的。在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中所述组合物包含糖或多元醇。
在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中至少一种抗原和至少一种免疫刺激剂吸附至如百分比(w/w) Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的单一类型的复合材料。在一些方面，提供了如在本文公开的免疫原性组合物，其中超过一种抗原和超过一种免疫刺激剂吸附至如百分比(w/w) Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的单一类型的复合材料。在一些方面，提供了如本文公开的免疫原性组合物，其至少包含如百分比(w/w) Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的第一类和第二类复合材料，其中至少一种抗原、至少一种免疫刺激剂或二者吸附至所述第一类复合材料，且其中至少一种抗原、至少一种免疫刺激剂或二者吸附至所述第二类复合材料。在一些方面，提供了如本文公开的免疫原性组合物，其包含至少一种如百分比(w/w) Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的复合材料，其中至少一种抗原、至少一种免疫刺激剂或二者吸附至所述至少一种复合材料，且其中至少一种抗原、至少一种免疫刺激剂或二者吸附至不同的金属盐佐剂。在一些方面，所述第二种金属盐佐剂是磷酸钙。
在一些方面，提供了本文公开的免疫原性组合物，与当将抗原与氟化钙组合物一起或单独地施用时针对所述抗原产生的免疫相比，所述免疫原性组合物用于增加对所述抗原的免疫应答。在一个方面提供了本文公开的免疫原性组合物，与当将抗原与磷酸钙一起施用时针对所述抗原产生的免疫相比，所述免疫原性组合物用于增加对所述抗原的免疫应答。通过施用给有此需要的受试者，可以递送本文公开的组合物。施用可以是通过许多途径，包括肌内地、皮下地、皮内地、舌下地、向扁桃体或鼻内地递送。
制备免疫原性组合物的方法
在一些方面，提供了制备如在本文公开的免疫原性组合物的方法，所述方法包括将本文描述的氟化钙组合物与本文公开的佐剂组合物组合的步骤。
使用组合物的方法
提供了用于治疗或预防哺乳动物中由病毒、细菌或寄生物造成的感染或疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文描述的氟化钙组合物、佐剂组合物或免疫原性组合物给药至所述哺乳动物。提供了用于治疗或预防人中由病毒、细菌或寄生物造成的感染或疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文描述的氟化钙组合物、佐剂组合物或免疫原性组合物给药至所述人。
提供了在有此需要的哺乳动物中诱导免疫原性应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的本文描述的氟化钙组合物、佐剂组合物或免疫原性组合物。提供了在有此需要的人中诱导免疫原性应答的方法，所述方法包括给所述人施用有效量的本文描述的氟化钙组合物、佐剂组合物或免疫原性组合物。
除非另外解释，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。单数术语“一个”(a)、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另外清楚地指出。术语“多个”表示两个或更多个。另外，关于物质的浓度或水平（诸如溶液组分浓度或其比率）和反应条件（诸如温度、压力和周期时间）给出的数字限制意图是近似值。本文中使用的术语“约”意图指所述量±10%。
将参考以下非限制性的附图和实施例进一步描述本发明。
实施例
分析方法：
相等补偿点
相等补偿点(Equal Compensation Point)测量：通过电位滴定(J.R.Feldkamp等人,Journal of Pharmaceutical Sciences, 1981, 第70卷, 第6期第638-640页)，进行相等补偿点(E.C.P.)的测量。结果呈现在总图中，所述总图通过4条不同滴定曲线的并置而得到：其中的两条在水中测量，且另外两条在有各种KCl (或KNO3)浓度存在下测量。例如，在批次Ca/F/CO3 # 8833172A中，得到两个相等补偿点(E.C.P.)：在H2O/KCl系统中的6.4和8.7。在该情况下，在pH 6.4以下，颗粒表面带负电荷；在pH 6.4和pH 8.7之间，颗粒表面带正电荷；且在pH 8.7以上，表面颗粒带负电荷(方案8)。关于得到的E.C.P. H2O/KNO3值之间的对比，参见表2A (下文)。
干重
将悬浮液匀浆以后，将等分试样(10 ml)在80℃在5天中蒸发至干燥。样品的重量(按mg计)代表在10 ml悬浮液中存在的干燥材料量。该重量除以10，代表干燥材料量/ml悬浮液。
红外光谱图
将所述干燥材料(如本文中所述得到)用手研磨，并原样用于红外分析。将几mg样品放在Perkin Elmer FT-Infra Red仪器的多反射支架上。从4000cm-1至600cm-1，以透射比%模式扫描光谱。有趣的是，注意到，吸附在无机材料上的有机材料总是在红外光谱学中产生非常宽的信号(相比于产生非常尖锐的信号的纯有机材料)。
关于吸附在CaF2中空球上的布洛芬(C.Zhang等人, 2010, Chem. Eur. J. 第16卷第5672-5680页)或油酸盐(oleatate)吸附的萤石(CaF2) (Handbook of InfraredSpectroscopy of Ultrathin Films. V.T. Tolstoy, I.V. Chernyshova和V.A.Skryshevsky. 2003 John Wiley & Sons, Inc.(第552页)，描述了这方面的例子。
通过Antek测定氮含量
将悬浮液在没有任何其它处理下注射进Antex仪器中。因此，以µgN/ml为单位表示N浓度，且代表关于上清液溶液和吸附的材料两者发现的总N含量。还对最后一次洗涤上清液(W-10)进行分析。
Ca和F元素分析
将含有500mg干燥材料的悬浮液过滤以取出固体部分，将其煅烧。矿化以后，将一部分用于Ca%测定(+/-0.5%)，且将另一部分用于F%测定(+/-1%)。
抗氧化能力
在有硫酸溶液存在下，高锰酸钾(KMnO4)是最强的氧化剂之一。紫色高锰酸根阴离子被还原成氧化锰（manganate oxide）(MnO2棕色)。这可以根据中色(incolor) Mn++阳离子进一步还原，从而产生5个电子交换。在这样的条件下，大多数有机材料都被完全氧化，而无机物质（诸如CaF2），是不敏感的。
MnO4- (紫色) + 4H+ + 3e- →MnO2 + 2H2O
MnO2 + 4H+ + 2e- →Mn++ (中色) + 2H2O。
通常，将5个样品(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml悬浮液)放在透明的高分子容器(当将氟化物衍生物放在酸性介质中时，避免玻璃容器)中。向它们中的每一个中，加入1ml 5M的H2SO4 (将酸加入水中，且决不得将水加入酸中)。通过逐滴加入1.0mM的KMnO4 (紫色)直到变色在3分钟中持续，进行滴定。因而，得到以µl 1.0mM的KMnO4/ml悬浮液表示的抗氧化能力。可以以µl 1.0mM的KMnO4/mg干燥材料转化那些值。用已知量的半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸溶液(1.0 mM)进行类似的滴定。因而，可以确立KMnO4的消耗量和半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸含量之间的关联。此外，考虑到在悬浮液中存在的干燥材料的重量，可以计算按干燥材料计的有机材料(半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸)的量，并以%w/w可氧化的有机材料/干重表示。
商购可得的化学药品
已经使用下述市售产品：
● CaCO3固体: OMYA™产品OMYAPURE 35；
● CaCO3固体颗粒:Sigma-Aldrich产品12010；
● 氟化钠: Merck™产品1064490250；
● 氯化钙: Merck™产品n°1023780500；
● 半胱氨酸: Aldrich™产品168149；半胱氨酸: Merck产品1028380100；
● N-乙酰半胱氨酸: Sigma™产品A5099；
● 硫甘油: Sigma™产品88640；
● 磷酸乙醇胺: Sigma™产品P0503-100；
● 氟化钙: Riedel de Haën™产品01123；
● 碳酸氢钠:Merck™产品1063295000；
● 碳酸钠: Merck™产品1063981000；
● 二水合氯化钙(CaCl2.2H2O): Merck™产品2382；
● 二水合氯化钙(CaCl.2.2H2O): Sigma Aldrich™产品12022；
● 二水合磷酸氢二钠: Merck™产品1065805000；
● 柠檬酸三钠: Merck™产品1110371000；
● 氢氧化钠: Merck™产品1064981000；
● 抗坏血酸钙: Fluka™产品11138；
● 谷胱甘肽: Merck™产品104090.0050；
● 谷胱甘肽氧化物: Sigma™产品G46265G；
● 硫羟乳酸:Sigma Aldrich™产品T3,100-3；
● 己二酸: Carlo ERBA™产品401785；
● 尿酸: Fluka™产品51449；
● 六水合氯化钙: Merck™产品102072.1000；
● 叶酸: Fluka™产品01769；
● 次黄嘌呤: Fluka产品56700
● 黄嘌呤: Sigma™产品X7375-256
● 鸟嘌呤: Aldrich™产品G11950-100G
● 胞嘧啶: Fluka™产品30430
● 胸腺嘧啶: Sigma™产品T0376-5G。
实施例1. 氟化钙的溶胶-凝胶形成的特征
形成了氟化钙复合材料，并通过各种方法进行了表征。该表征的结果总结在该实施例中。在实施例1中提及的每个批次的形成的细节可以参见实施例2。
溶胶-凝胶形成允许人们影响颗粒尺寸，例如，通过改变在Nandiyanto中公开的起始溶液的浓度。各种选择的有机化合物在溶液中的应用允许人们得到具有不同表面电荷(通过它们的E.C.P. 值测量，表2A)的复合材料颗粒。
当在CaF2沉淀过程中同时使用碳酸盐时，得到Ca/F/CO3复合材料颗粒。通过改变碳酸氢盐或碳酸盐的相对量，得到表现出不同表面性质的复合材料(表2B)。
对于低碳酸盐摩尔比，形成的复合材料表现出球霰石型的碳酸盐。这是令人惊讶的，这是因为其他人描述的球霰石形成显示，需要高浓度(1M的CaCl2 + 1M的K2CO3)才能得到球霰石型的碳酸盐。Mori等人(2009) Materials Science and Engineering 29:1409-1414和Parkin等人(2009) Optics Express 17:21944-21955。通过本文公开的方法得到的球霰石型的碳酸盐对于具有免疫学性质的有机材料的吸附而言是重要的(参见实验部分:MPL的吸附)。
当在沉淀过程中使用半胱氨酸时，得到Ca/F/半胱氨酸复合材料颗粒。通过改变加入的次序，得到表现出不同表面性质的复合材料(表3)。
在本文中得到的纳米颗粒表现出比手册标准值(其通常与单晶有关)更高的可溶性。例如，图3呈现了Ca/F/OH纳米颗粒批次11000123的水溶性。该复合材料的可溶性比在手册中报道的CaF2的可溶性(0.14mM)更高。因而，这些类型的纳米复合材料颗粒在使用肌内（IM）施用模式的疫苗领域中具有巨大利益。
如在分析方法中所述，通过Antek分析了氮含量。从那些结果认为，大部分的氮（源自在制备过程中使用的选择的起始有机材料）位于不溶性颗粒上(参见表4A)。
如在分析方法中所述，使用抗氧化能力来确定%（w/w）可氧化的有机材料/干重。结果显示在表4B中。
实施例2. 复合材料的形成
根据在详细描述中提供的一般方案，形成了各种复合材料。除非相反说明，否则商业得到本文中使用的原材料。
1°商业固体颗粒的处理
{CaCO3}固体水洗涤: 批号8833111
如所述的(方案1)，用250ml水处理264.8mg碳酸钙（来自查询: OMYA®）。给出了上清液pH (参见表5)。
终体积为30ml，并在该悬浮液上测量E.C.P.。将10 ml该悬浮液在80℃蒸发至干燥并称重。以相对于起始粉末的重量的百分比，表达得率。对干燥材料的样品进行红外分析，其显示了CaCO3的方解石类型。
{CaCO3}固体水洗涤: 批号8833167
如同批号8833111 (表5)那样处理247.9mg合成的碳酸钙（其通过用CO2在Ca(OH)2溶液中作泡状通过来沉淀，得自Mineral Technology®(Multiplex MM批次U203)）。
{CaCO3}固体水洗涤: 批号11000077
如同批号8833111 (表5)那样处理0.828g得自NanoMaterials Technology®的HighGravity Controlled Precipitation NPCC111（合成的碳酸钙）。
用NaF溶液处理的{CaCO3}固体: 批号8833107
将氟化钠(710.7mg)溶解在水中并将pH调至pH 7.43，从而形成168 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入265.1mg CaCO3固体颗粒(OMYA®)。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表5)，终体积为30ml。将10 ml该悬浮液在80℃蒸发至干燥并称重。以相对于起始粉末的重量的百分比，表达得率。对干燥材料的样品进行红外分析，其显示了球霰石型的CaCO3的存在(图2)。
用NaF溶液处理的{CaCO3}固体：批号9923127
用7.0843g溶解在1升水中的NaF处理2.6612g CaCO3(OMYA®)，从而产生9.52的起始pH，并像关于批号8833107那样处理(表5)。得率为74.8%。给出了元素Ca和F分析(表5)。CaCO3的理论元素组成是Ca：40%和CO3:60%；而CaF2给出Ca：51.28%和F：48.72%。实验数据给出Ca：48%和F：41.9%，从而显示氟化物%因为过低而不是纯的CaF2，且Ca%因为过低而不是纯的CaCO3。对干燥材料的样品进行红外分析，显示与在图2中呈现的样品编号8833107之一类似的球霰石型碳酸盐的存在。HCl滴定显示，该粉末仅是2.6%碳酸盐。因而，得到了Ca/F/CO3的复合材料，其中CaCO3部分属于球霰石型，且因而不同于起始CaCO3材料。
用CaCl2溶液处理的{CaCO3}固体: 批号8833164
将氯化钙(2.0223 g)溶解在水中并将pH调至pH 7.48，从而形成180 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入276.8mg CaCO3固体颗粒(OMYA®)。像关于批号8833107那样进行水洗涤和处理(表5)。
用半胱氨酸溶液处理的{CaCO3}固体：批号8833110
将半胱氨酸(2.0111 g)溶解在水中并将pH调至pH 8.18，从而形成168 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入277.4mg CaCO3固体颗粒(OMYA®)。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表5)。
用N-乙酰半胱氨酸溶液处理的{CaCO3}固体: 批号8833139
将N-乙酰半胱氨酸(3.1058 g)溶解在水中并将pH调至pH 8.11，从而形成180 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入266.3mg CaCO3固体(Sigma-Aldrich)。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表5)。
用硫甘油处理的{CaCO3}固体：批号8833114
将硫甘油(1.5ml)溶解在水中并将pH调至pH 9.50，从而形成168 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入263.5 mg (2.63mmol) CaCO3固体(OMYA®)。如所述的，进行水洗涤(方案2)。在表6中给出了上清液pH。
用磷酸乙醇胺处理的{CaCO3}固体：批号8833109
将磷酸乙醇胺(2.3582 g)溶解在水中并将pH调至pH 6.54，从而形成168 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入270.6 mg CaCO3固体颗粒(OMYA®)。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表6)。
{CaF2}固体水洗涤: 批号8833141
如所述的，用250ml水处理316.0mg氟化钙(方案1)。给出了上清液pH(参见表6)。
用半胱氨酸溶液处理的{CaF2}固体：批号8833142
将半胱氨酸(2.0735 g) (Merck)溶解在水中并将pH调至pH 8.15，从而形成182 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入353.1 mg氟化钙。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表6)。
用N-乙酰半胱氨酸溶液处理的{CaF2}固体：批号8833148
将N-乙酰半胱氨酸(3.01924 g)溶解在水中并将pH调至pH 8.20，从而形成180 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入362.89 mg氟化钙。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表6)。
在pH 8.26用碳酸盐处理的{CaF2}固体：批号8833149
将碳酸氢钠(1.51058 g)溶解在180ml水中，得到pH 8.28。将该溶液通过过滤灭菌。向该溶液中，加入377.99 mg氟化钙。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表6)。
在pH 11.54用碳酸盐处理的{CaF2}固体：批号8833150
将碳酸钠(1.88348 g)溶解在180ml水中，得到pH 11.54。将该溶液通过过滤灭菌。向该溶液中，加入383.85 mg氟化钙。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH(参见表6)。
用磷酸乙醇胺处理的{CaF2}固体：批号9923130
将磷酸乙醇胺(2.3517 g)溶解在水中并将pH调至pH 6.55，从而形成180 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入351.41 mg氟化钙。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH和渗透压(参见表6)。
用硫甘油处理的{CaF2}固体：批号9923131
将硫甘油(1.5ml)溶解在水中并将pH调至pH 9.44，从而形成180 ml的总体积，将其通过过滤灭菌。向该溶液中，加入350.6 mg氟化钙。如所述的，进行水洗涤(方案2)。给出了上清液pH和渗透压(参见表6)。
2°溶胶-凝胶沉淀
加入CaCl2溶液中的Na2HPO4溶液：批号391080
将二水合氯化钙(1.8370g)溶解在900ml水中，得到6.37的pH。通过过滤灭菌以后，将该溶液放在2升无菌的Duran-Schott中。将二水合磷酸氢二钠(2.2250g)溶解在900ml水中，得到9.32的pH。通过过滤灭菌以后并在无菌条件下，将该溶液加入CaCl2溶液中。倾析过夜以后，抛弃1500ml上清液并用1500ml无菌水替换。将那些洗涤重复12次。最后将悬浮液通过离心浓缩至200ml的总体积。那些颗粒表现出7.8的E.C.P. H2O/KCL (参见表7)。
加入Na2HPO4溶液中的CaCl2溶液：批次391082
将二水合磷酸氢二钠(2.22382g)溶解在900ml水中。通过过滤灭菌以后，将该溶液放在2升无菌的Duran-Schott中。将二水合氯化钙(1.83972g)溶解在900ml中。通过过滤灭菌以后并在无菌条件下，将该溶液加入磷酸氢二钠中。以下处理类似于批号391080 (表7)。
加入CaCl2溶液中的Na2HPO4和柠檬酸盐溶液：批号391084
将二水合氯化钙(1.8413g)溶解在900ml水中。通过过滤灭菌以后，将该溶液放在2升无菌的Duran-Schott中。将二水合磷酸氢二钠(2.2247g)溶解在900ml水中并通过过滤灭菌。将柠檬酸三钠(4.0259g)溶解在180ml水中，产生8.49的pH，并通过过滤灭菌。在无菌条件下，将柠檬酸盐溶液加入磷酸氢二钠溶液中并将该混合物加入CaCl2溶液中。以下处理类似于批号391080 (表7)。
加入CaCl2溶液中的Na2HPO4和赖氨酸溶液：批号391086
将二水合氯化钙(1.8350g)溶解在900ml水中。通过过滤灭菌以后，将该溶液放在2升无菌的Duran-Schott中。将二水合磷酸氢二钠溶解在900ml水中并通过过滤灭菌。向100ml水中加入15g赖氨酸碱。加入盐酸(0.1N) (40ml)以得到10.1的pH。将该溶液通过过滤灭菌并加入磷酸氢二钠溶液中，并将该混合物加入CaCl2溶液中。以下处理类似于批号391080 (表7)。
CaF2：批号8833172D
将氟化钠(8.4158g)溶解在500ml水中并调至pH 7.25。将溶液通过过滤灭菌，并将100ml该溶液放在无菌的250ml Duran-Schott烧瓶中。
将氯化钙(13.3555g)溶解在600ml水中并调至pH 7.07。将溶液通过过滤灭菌，并将100 ml该溶液加入NaF溶液中。根据方案3进行水洗涤。给出了上清液pH(参见表8)。
CaF2：批号8833190
将氟化钠(8.4231g)溶解在500ml水中。将溶液通过过滤灭菌，并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1093g)溶解在500ml水中。将溶液通过过滤灭菌，并加入NaF溶液中。根据方案3进行水洗涤。在表8中给出了上清液pH。
CaF2：批号9440194
将氟化钠(8.4273g)溶解在500ml水中。将溶液通过过滤灭菌，并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1174g)溶解在500ml水中。将溶液通过过滤灭菌，并加入NaF溶液中。根据方案3进行水洗涤。在表8中给出了上清液pH。
Ca/F/OH：批号11000123
将氟化钠(4.2055g)溶解在504.2ml水中，pH为9.40。将溶液通过过滤灭菌，并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1107g)溶解在508.2ml水中。将溶液通过过滤灭菌，并加入NaF溶液中。根据方案3进行水洗涤。在表8中给出了上清液pH。
在碳酸盐域中的Ca/F/CO3：批次8833152-8833157
Na2CO3溶液：将10.6031g溶解在500ml水中(得到pH 11.61)并通过0.2µm过滤灭菌。NaF溶液：将8.41413g溶解在500ml水中(得到pH 9.66)并通过0.2µm过滤灭菌。CaCl2溶液：将13.3250g溶解在600ml水中(得到pH 10.07)并通过0.2µm过滤灭菌。
从那些溶液起始，通过遵循根据表9的步骤1-3，进行Ca/F/CO3批次8833152-8833157。
根据方案6进行水洗涤。在表10中给出了上清液pH。
因而，降低CO3- 浓度(或增加F- 浓度)产生越来越少的产品量和更低的W10 pH值。
在最高F- 浓度得到的样品(#8833157)产生了最低E.C.P. 值。这提示，那些得到的沉淀物由CaCO3颗粒组成，可能随着F- 浓度增加而含有递增的CaF2含量。
因而，在系列Ca/F/CO38833152→8833157中，我们具有：
- 越来越少的CO3-，其被越来越多的F-补偿(通过起始摩尔比)；
- 类似的浓度，用干重mg/ml来表示(除了低得多的8833157以外)；
- CO3- 含量的下降(通过滴定和通过IR (870cm-1参见图8)证实；
-方解石形式的减少(IR 1430 cm-1参见图8)，球霰石较多(IR 1490和1420 cm-1参见图8)；#8833155、#8833156和#8833157含球霰石型很多；#8833152含球霰石很少且含方解石很多。球霰石给出在750cm-1的弱IR信号，且在713-715cm-1没有给出信号；而方解石表现出在713-715cm-1的IR信号，且在750cm-1没有表现出IR信号(M. Sato和S. Matsuda;Zeitschrift für Kristallographie, 1969第129卷第405-410页)；
- 类似的E.C.P. H2O/KCL值(除了较低的8833157以外)；
- 在较低碳酸盐含量，E.C.P. H2O/KNO3值的下降。
在碳酸氢盐域中的Ca/F/CO3：
碳酸氢钠溶液：将碳酸氢钠(8.4098g)溶解在500ml水中(在该阶段，pH为8.14)并通过过滤灭菌。氟化钠溶液：将氟化钠(8.4158g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.25。将溶液通过过滤灭菌。氯化钙溶液：将氯化钙(13.3555g)溶解在600ml水中，并将pH调至8.07。将溶液通过过滤灭菌。
在碳酸氢盐域中的Ca/F/CO3：批号8833172A
将10 ml碳酸氢钠溶液放在无菌的250 ml Duran-Schott烧瓶中并加入90 ml氟化钠溶液，在该阶段，pH为8.53。
将氯化钙溶液(100ml)加入NaHCO3和NaF溶液中。根据方案4进行水洗涤。在表8中给出了上清液pH。
在碳酸氢盐域中的Ca/F/CO3：批号8833172B
将5 ml碳酸氢钠溶液放在无菌的250 ml Duran-Schott烧瓶中并加入95 ml氟化钠溶液，在该阶段，pH为8.44。
将氯化钙溶液(100ml)加入NaHCO3和NaF溶液中。根据方案4进行水洗涤。在表8中给出了上清液pH。
在碳酸氢盐域中的Ca/F/CO3：批号8833172C
将1 ml碳酸氢钠溶液放在无菌的250 ml Duran-Schott烧瓶中并加入99 ml氟化钠溶液，在该阶段，pH为8.21。
将氯化钙溶液(100ml)加入NaHCO3和NaF溶液中。根据方案4进行水洗涤。在表8中给出了上清液pH。
对批次8833172A、8833172B、8833172C和8833172D进行HCl滴定。
通过HCl滴定，可以监控碳酸盐的存在。通过交付类似量的纳米颗粒进行对比，例如：3.0ml 8833172A (在8.28mg/ml)、2.7ml 8833172B (在9.37mg/ml)、1.36ml 8833172C(在18.52mg/ml)和1ml 8833172D (在25.27mg/ml)，在必要时在水中稀释至各自3ml的总体积，并用0.3N HCl溶液滴定(表8)。
Ca/F/CO3：批号9440195
将碳酸氢钠(8.4109g)溶解在500ml水中(在该阶段，pH为8.17)并通过过滤灭菌。将氟化钠(8.4203g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.29。将溶液通过过滤灭菌。在无菌条件下，将50ml碳酸氢盐溶液和450ml氟化钠溶液放在无菌的1L Duran-Schott中。将氯化钙(11.1089g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.96。将溶液通过过滤灭菌，并加入Duran-Schott容器中。根据方案4进行水洗涤。给出了上清液pH和HCl滴定的结果(表11)。
Ca/F/CO3：批号9923123
将碳酸氢钠(8.4122g)溶解在500ml水中(在该阶段，pH为8.12)并通过过滤灭菌。将50ml该溶液放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氟化钠(8.42488g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.25。将溶液通过过滤灭菌，并将450ml加入已经含有碳酸氢盐溶液的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1275g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.72。将溶液通过过滤灭菌，并加入NaHCO3和NaF溶液中。根据方案4进行水洗涤。上清液pH和HCl滴定的结果: 参见表11。
Ca/F/CO3 # 9923124
将50 ml为批次9923123制备的碳酸氢钠溶液放在1升无菌的Duran-Schott烧瓶中。将氟化钠(8.42253g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.27。将溶液通过过滤灭菌，并将450ml加入已经含有碳酸氢盐溶液的1升Duran-Schott烧瓶中。
将氯化钙(11.1111g)溶解在500ml水中，并将pH调至7.70。将溶液通过过滤灭菌，并加入NaHCO3和NaF溶液中。根据方案4进行水洗涤。给出了上清液pH和HCl滴定的结果(表11)。
在碳酸盐域中的Ca/F/CO3:11000080-83
碳酸钠溶液：将碳酸氢钠(17.11 g)溶解在1000ml水中，并加入NaOH以达到pH 10.09。将该溶液通过过滤灭菌。氟化钠溶液：将氟化钠(20.16g)溶解在1200ml水中，且pH为9.84。将溶液通过过滤灭菌。CaCl2溶液：将44.4g溶解在2000ml水中(得到pH 10.17)并通过0.2µm过滤灭菌。
Ca/F/CO3 11000080：
使用1L无菌的Duran-Schott: 将450ml碳酸盐溶液加入50ml氟化钠溶液中，产生pH10.09。在层流下，加入500ml氯化钙溶液。根据方案4进行水洗涤。在表11中给出了上清液pH。
Ca/F/CO3 11000081：
使用1L无菌的Duran-Schott: 将250ml碳酸盐溶液加入250ml氟化钠溶液中，产生pH10.07。在层流下，加入500ml氯化钙溶液。根据方案4进行水洗涤。在表11中给出了上清液pH。
Ca/F/CO3 11000082：
使用1L无菌的Duran-Schott: 将150ml碳酸盐溶液加入350ml氟化钠溶液中，产生pH10.06。在层流下，加入500ml氯化钙溶液。根据方案4进行水洗涤。在表11中给出了上清液pH。
Ca/F/CO3 11000083：
使用1L无菌的Duran-Schott: 将50ml碳酸盐溶液加入450ml氟化钠溶液中，产生pH10.05。在层流下，加入500ml氯化钙溶液。根据方案8进行水洗涤。在表19中给出了上清液pH。
Ca/F/抗坏血酸：批号9440198
将抗坏血酸钙(42.6001g)溶解在400ml水中(得到pH = 7.35)。加入17ml氢氧化钠(0.5M)以达到pH8.99。加入水(83ml)产生pH 9.08，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氟化钠(4.2063g)溶解在500ml水中(得到pH 9.49)并通过过滤灭菌。将该溶液加入抗坏血酸钙溶液中。次日，将混合物转移进2L无菌的Duran Schott烧瓶中，并加入另外1升无菌水。应用另外15天静置期。根据方案7进行水洗涤。在表12中给出了上清液pH。
Ca/F/半胱氨酸：批号944055
将0.84108g氟化钠和2.42216g半胱氨酸(Merck)溶解在84ml水中。加入0.5N氢氧化钠(16ml)以达到pH 8.18。将溶液通过过滤灭菌，并放在250ml无菌的Duran-Schott烧瓶中。将2.22197g氯化钙溶解在100ml水中，产生pH 10.03溶液，将其通过过滤灭菌。在无菌条件下，将该CaCl2溶液加入(NaF + 半胱氨酸)溶液中。在表3中给出了水洗涤和上清液pH。
Ca/F/半胱氨酸：批号944056
将2g氯化钙和2.42838g半胱氨酸(Merck)溶解在80ml水中。加入0.5N氢氧化钠(21ml)以达到pH 8.18。将溶液通过过滤灭菌，并放在250ml无菌的Duran-Schott烧瓶中。将0.84168g氟化钠溶解在100ml水中，产生pH 8.78溶液，将其通过过滤灭菌。在无菌条件下，将该NaF溶液加入(CaF2 + 半胱氨酸)溶液。给出了水洗涤和上清液pH (表3)。
Ca/F/半胱氨酸：批号944057
将0.84196g氟化钠溶解在100ml水中，产生pH 8.98溶液，将其通过过滤灭菌，并放在250ml无菌的Duran-Schott烧瓶中。将2.2265g氯化钙和2.42194g半胱氨酸(Merck)溶解在80ml水中。加入0.5N氢氧化钠(21ml)以达到pH 8.19。将溶液通过过滤灭菌。在无菌条件下，将该(CaF2 + 半胱氨酸)溶液加入NaF溶液中。给出了水洗涤和上清液pH (表3)。
Ca/F/半胱氨酸：批号944058
将氯化钙2.2242g溶解在100ml水中，产生pH 10.04溶液，将其通过过滤灭菌，并放在250ml无菌的Duran-Schott烧瓶中。将0.84254g氟化钠和2.42793g半胱氨酸(Merck)溶解在83.5ml水中。加入0.5N氢氧化钠(16.5ml)以达到pH 8.19。将溶液通过过滤灭菌。在无菌条件下，将该(NaF + 半胱氨酸)溶液加入CaF2溶液中。水洗涤和上清液pH：参见表3。
Ca/F/半胱氨酸：批号9440099
将氟化钠(4.2287 g)溶解在500ml水中，pH在该阶段为9.22，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。加入氯化钙(11.1582g)和半胱氨酸(12.1086 g) (Merck)并溶解于400ml水中(得到浅紫色，且pH = 5.58)。加入0.5N氢氧化钠(117ml)以达到pH 8.22，并将该浅紫色溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。给出了上清液pH和渗透压(参见表12)。
Ca/F/半胱氨酸：批号9440197
将氟化钠(4.215 g)溶解在400ml水中(得到pH = 9.62), 通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1037g)溶解在400ml水中(得到pH = 10.06)并加入半胱氨酸(12.1060 g) (Merck) (得到浅紫色pH = 5.6)。加入0.5N氢氧化钠(107ml)以达到pH 8.21，并将该浅紫色溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表12中给出了上清液pH)。
Ca/F/N-乙酰半胱氨酸：批号9440110
将氟化钠(4.2058g g)溶解在400ml水中(得到pH = 9.26)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.10976g)溶解在400ml水中并加入N-乙酰半胱氨酸(16.37876 g) (得到pH = 1.67)。加入氢氧化钠(0.550 g)并加入0.5N氢氧化钠(196ml)以达到pH 8.35，并将该浅紫色溶液(着色在pH 5以上出现)通过过滤灭菌。将CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表12中给出了上清液pH。
Ca/F/N-乙酰半胱氨酸：批号9440196
将氟化钠(4.2026g)溶解在400ml水中(得到pH = 9.66)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1139g)溶解在400ml水中(得到pH = 10.04)并加入N-乙酰半胱氨酸(16.3025 g) (得到pH = 1.4)。加入氢氧化钠(固体丸，Merck产品1064981000批次B0467298) (0.848 g)，并加入0.5N氢氧化钠(172 ml)以达到pH 8.35，并将该浅紫色溶液(着色在pH 5以上出现)通过过滤灭菌。将CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表12中给出了上清液pH)。
Ca/F/N-乙酰半胱氨酸：批号10616125
将氟化钠(4.2026g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.01)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1362g)溶解在500ml水中(得到pH = 10.04)并加入N-乙酰半胱氨酸(16.3313 g) (得到pH = 1.63)。加入氢氧化钠(固体丸，Merck产品1064981000批次B0467298008)直到pH 8.02，并加入0.5N氢氧化钠(5 ml)以达到pH 8.30，并将该浅紫色溶液(着色在pH 5以上出现)通过过滤灭菌。将CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。上清液pH：参见表12。
Ca/F/N-乙酰半胱氨酸：批号11000101
将氟化钠(4.2101g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.35)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1715g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.97)并加入N-乙酰半胱氨酸(16.3469 g) (得到pH = 1.79)。加入氢氧化钠直到pH 7.69并加入0.5N氢氧化钠(5 ml)以达到pH 8.36，并将该浅紫色溶液(着色在pH 5以上出现)通过过滤灭菌。将CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表12中给出了上清液pH)。
Ca/F/谷胱甘肽：批号10616185
将氟化钠(4.2098g)溶解在500ml水中(得到pH = 8.9)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1025g)溶解在500ml水中(得到pH = 10.00)，并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(得到pH = 2.67)。加入氢氧化钠以达到pH 8.57，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表13中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽：批号11000030
将氟化钠(4.2260g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.47)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.120g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.92)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(3.0726 g) (得到pH =2.72)。加入氢氧化钠和0.5M氢氧化钠以达到pH 8.59，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表13中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽：批号11000033
将氟化钠(4.2097g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.35)，加入0.3M HCl以达到pH 6.94并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。
将氯化钙(11.117g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.91)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(30.7 g) (得到pH = 2.64)。加入氢氧化钠和0.3M HCl以达到pH 7.04，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表13中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽：批号11000086
将氟化钠(4.2235g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.34)，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1431g)溶解在500ml水中(得到pH =9.92)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(3.0782g) (得到pH = 2.84)。加入氢氧化钠和0.5M氢氧化钠以达到pH 8.59，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表13中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽：批号11000099
将氟化钠(4.1101g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.58)，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(1101228g)溶解在500ml水中并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中(得到pH = 10.05)。加入谷胱甘肽(3.0716g) (得到pH = 2.79)。加入氢氧化钠和0.5M氢氧化钠以达到pH 8.57，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表13中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽：批号11000194
将氟化钠(4.2059g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.24)，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1371g)溶解在500ml水中(得到pH =9.99)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(3.0912g) (得到pH = 3.07)。加入氢氧化钠和0.5M氢氧化钠以达到pH 8.58，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表13中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽氧化物：批号10616198
将氟化钠(0.4220g)溶解在50ml水中(得到pH = 8.64)，并通过过滤灭菌并放在无菌的100ml Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(1.1112g)溶解在30ml水中(得到pH = 9.97)并加入谷胱甘肽氧化物(6.5611 g) (得到pH = 6.27)。加入0.5N和0.05M氢氧化钠以达到pH7.55，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽氧化物溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表14中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽氧化物：批号11000139
将氟化钠(4.20838g)溶解在50ml水中(得到pH = 9.82)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(1.1528g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.97)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽氧化物(3.2255 g) (得到pH = 6.84)。加入氢氧化钠和0.5M氢氧化钠以达到pH 8.21，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽氧化物溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表14中给出了上清液pH。
Ca/F/谷胱甘肽氧化物：批号11000140
将氟化钠(4.20027g)溶解在50ml水中(得到pH = 9.82)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(1.1068g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.94)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入谷胱甘肽氧化物(6.56150 g)(得到pH = 6.55)。加入氢氧化钠和0.5M氢氧化钠以达到pH 8.12，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-谷胱甘肽氧化物溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表14中给出了上清液pH。
Ca/F/硫羟乳酸盐：批号11000031
将氟化钠(4.2078g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.56)，并通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1187g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.89)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800ml Becker中。加入硫羟乳酸(8.5ml) (得到pH =1.96)。加入氢氧化钠以达到pH 9.54，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-硫羟乳酸盐溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表15中给出了上清液pH。
Ca/F/硫羟乳酸盐：批号11000059
将氟化钠(4.2146g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.47)，并加入0.03N HCl以达到pH7.16。将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1780g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.98)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800mlBecker中。加入硫羟乳酸(8.5ml) (得到pH = 2.05)。加入氢氧化钠和0.03M NaOH以达到pH7.16，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-硫羟乳酸盐溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表15中给出了上清液pH。
Ca/F/硫羟乳酸盐：批号11000060
将氟化钠(4.2161g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.45)，并加入0.03N HCl以达到pH7.93。将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1786g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.96)并将该溶液0.22µm过滤和重新放在清洁的800mlBecker中。加入硫羟乳酸(8.5ml) (得到pH = 1.96)。加入钠和0.03M NaOH以达到pH 8.07，并将该溶液通过过滤灭菌。将CaCl2-硫羟乳酸盐溶液加入NaF溶液中。根据方案5进行水洗涤。在表15中给出了上清液pH。
Ca/F/己二酸：批号11000129
将己二酸(7.3070g)溶解在500ml水中(得到pH = 2.81)。加入氢氧化钠以达到pH5.39。加入氟化钠(4.1967g)；pH在该阶段为5.59。加入更多NaOH以达到pH 8.02，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。
将氯化钙(11.1481g)溶解在500ml水中(得到pH =10.81)。将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/己二酸盐无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。在表15中给出了上清液pH。
Ca/F/己二酸：批号11481026
将己二酸(7.3174g)溶解在500ml水中(得到pH = 2.99)。加入氢氧化钠以达到pH5.11。加入氟化钠(4.1979g)；pH在该阶段为5.48。加入更多NaOH以达到pH 5.94，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。
将氯化钙(11.1163g)溶解在500ml水中(得到pH =9.82)。将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/己二酸盐无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。在表15中给出了上清液pH。
Ca/F/己二酸：批号11481027
将己二酸(7.3151g)溶解在500ml水中(得到pH = 2.98)。加入钠以达到pH5.36。加入氟化钠(4.1995g)；pH在该阶段为5.48。加入更多NaOH以达到pH 7.18，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。
将氯化钙(11.1209g)溶解在500ml水中(得到pH =9.82)。将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/己二酸盐无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。在表15中给出了上清液pH。
Ca/F/尿酸：批号11000182
将氟化钠(4.1650g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.52)。将尿酸(0.13223g)分成几小份加入，给出时间(过夜)用于溶解，并在需要时加入NaOH (0.5M)以补偿pH下降；pH在该阶段为8.60。将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将六水合氯化钙(21.9929g)溶解在500ml水中(得到pH =6.24)。将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/尿酸盐无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH：参见表14。
Ca/F/叶酸(维生素M)：批号11481018
将氟化钠(4.2026g)溶解在500ml水中(得到pH = 9.33)。加入叶酸(0.4481g)，且pH下降至5.74。加入0.5M NaOH以达到pH 6.98，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将氯化钙(11.1183g)溶解在500ml水中(得到pH =9.73)。将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/叶酸盐无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH：参见表14。
Ca/F/次黄嘌呤批次11481198
将氟化钠(4.21g)溶解在500ml水中，加入1.36g次黄嘌呤，加入0.5M NaOH以达到pH9.83，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将二水合氯化钙(14.73g)溶解在500ml水中并加入1ml的0.05M NaOH以达到pH 9.31，并将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/次黄嘌呤无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH参见表15A。
Ca/F/黄嘌呤批次11481199
将氟化钠(4.22g)溶解在500ml水中，加入1.52g黄嘌呤，加入0.5M NaOH以达到pH10.75，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将二水合氯化钙(14.71g)溶解在500ml水中并加入1ml的0.05M NaOH以达到pH 9.39，并将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/黄嘌呤无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH参见表15A。
Ca/F/鸟嘌呤批次11481195
向在50ml水中的1.52g鸟嘌呤中加入NaOH (固体丸) (1.4g)。溶解以后，加入4.21 g氟化钠和450ml水。该溶液的pH为12.52。将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将二水合氯化钙(14.71g)溶解在500ml水中并加入0.5ml的0.05M NaOH以达到pH 8.48，并将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/鸟嘌呤无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH参见表15A。
Ca/F/胞嘧啶批次11954009
将氟化钠(4.22g)溶解在500ml水中，加入1.10g胞嘧啶(得到pH 9.03)，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将二水合氯化钙(14.73g)溶解在500ml水中并加入1ml的0.05M NaOH以达到pH 9.18，并将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/胞嘧啶无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH参见表15A。
Ca/F/胸腺嘧啶批次11954064
将氟化钠(4.22g)溶解在500ml水中，加入1.26g次黄嘌呤，加入0.5M NaOH以达到pH9.11，并将该溶液通过过滤灭菌并放在无菌的1升Duran-Schott烧瓶中。将二水合氯化钙(14.75g)溶解在500ml水中并加入0.5ml的0.05M NaOH以达到pH 8.31，并将该溶液通过过滤灭菌和倒入NaF/胸腺嘧啶无菌溶液中。根据方案6进行水洗涤。上清液pH参见表15A。
Ca己二酸盐批次11954096
将碳酸钙(5g)悬浮于500ml水中。加入己二酸(7.3g)。加入另外的水量直到体积达到750ml，并将混合物在60℃加热1小时。将该溶液通过过滤灭菌(0.22µm过滤器)。将得到的溶液加热并通过蒸发浓缩直到约280ml总体积。将晶体从上清液分离并在80℃干燥5天。在热重量分析法测量过程中将该产物用作己二酸钙参比物。
通过热重量分析法分析复合材料的有机物含量.
对干燥材料样品进行热重量分析法。记录到在N2下从室温至600℃和在O2下从600℃至800℃的重量减轻，并用燃烧的有机材料的量的差异来表示。
实施例3A. MPL的吸附
在无菌条件下进行MPL (在水中的纳米颗粒)在各种无机颗粒上的吸附，并使用LumiSizer®仪器通过STEP®技术(空间和时间分辨的消光曲线)测量MPL吸附的百分比。表16总结了那些吸附数据，并表明球霰石型的碳酸盐在钙-氟化物-碳酸盐复合材料中的存在允许100µg MPL在500µg无机复合材料（在1ml水中）上的100%吸附。Ca/F/N-乙酰半胱氨酸(批次10616125)给出了类似的结果。
实施例3B. 吸附的抗原的稳定性和热稳定性
用F4T（一种相当不稳定的抗原）证实了吸附的抗原的稳定性和热稳定性的提高。表17总结了抗原吸附条件和最终组合物。
通过在离心(以抛弃抗原/无机物部分)后的上清液上进行的HPLC定量，确定抗原吸附。上清液中无抗原被解释为等于100%的吸附的抗原。在t=0和在t=1个月4℃测量吸附的稳定性，而在1个月30℃以后确定热稳定性(表18)。
通过在t=0的SDS-PAGE分析进行F4T抗原稳定性概况评价(图4)，并在t=1个月4℃进行对比(图5)，而在30℃1个月以后确定热稳定性(图6)。通过静电力吸附后，抗原被SDS-PAGE凝胶环境和应用的实验迁移条件释放。在该稳定性和热稳定性测量的所有情况下，吸附的材料的抗原概况与未吸附的对照样品相比存在给人深刻印象的保持。
实施例4. 对ClfA N123 和HepB抗原的免疫应答
复合材料-ClfAN123吸附的抗原的免疫应答
复合材料-ClfAN123的吸附呈现在表19中，且制剂组成呈现在表20中。
如显示的(图7)，当将抗原吸附在不同的载体上时，维持抗原的免疫原性。
HepB吸附的抗原的免疫应答
呈现了制剂组成(表21)。
表21动物经历LIMS 20130115，除了在磷酸盐缓冲液和150mM NaCl中配制的Engerix以外，都在10mM TRIS pH 6.8和山梨糖醇4.7%中配制。根据方案1和表14，水洗涤得自Brenntag的磷酸钙。
如显示的，当将抗原吸附在本文描述的CaF2家族的不同载体上时，维持抗原的应答的抗体测量(抗-HBs 14pII) (图1)。
实施例5: 免疫应答
HepB吸附的抗原的免疫应答
对于该氟化钙复合材料体内研究，使用与在实施例4中所用相同的氟化钙复合材料批次，从实施例4选择5种氟化钙复合材料和AlOOH用于重复；另外，选择吸附在½最初氟化钙复合材料量上的HepB用于研究(1240mg相对于600mg氟化钙复合材料)。此外，选择以前未试过的氟化钙复合材料(含有Z，不同于以前试验过的批次)用于该研究。试验的复合材料如下：
● 1°AlOOH 1240µg
● 2°AlOOH 600µg
● 3°CaF2/CO31240µg
● 4°CaF2/CO3600µg
● 5°CaF2N-乙酰半胱氨酸1240µg
● 6°CaF2N-乙酰半胱氨酸600µg
● 7°CaF2/谷胱甘肽1240µg
● 8°CaF2/谷胱甘肽氧化物1240µg
● 9°CaF2/己二酸盐1240µg
● 10°CaF2/尿酸1240µg (新氟化钙复合材料)
● 11°CaF2/尿酸600µg (新氟化钙复合材料)
● 12°CaF2/叶酸1240µg (新氟化钙复合材料)
● 13°CaF2/叶酸600µg (新氟化钙复合材料)
● 14°仅HepB (无载体)
初步结果(未经统计学处理)以从上(#1 = “Engerix-样”配方)至(# 14单独的hepB)的相同次序总结在图9中。
实施例6：用吸附在不同复合材料上的重组F蛋白对Balb/c小鼠的免疫接种诱导与 氢氧化铝类似水平的RSV中和抗体和rF结合抗体.
用重组RSV F蛋白(rF)进行复合材料的吸附测量：与氢氧化铝-或磷酸钙-吸附的rF相比，选择5种rF-复合材料制剂用于在Balb/C小鼠中的免疫原性试验(参见表22)。
将Balb/c小鼠组(n=9/组)用表22的制剂以3-周间隔肌内地免疫2次。与选择的佐剂的每一种一起以两种不同剂量使用rF抗原。
在第35天(第二次免疫接种以后14天)单独地收集来自所有小鼠的血清，并使用空斑数降低测定来试验RSV中和抗体的存在，和通过ELISA来试验抗-rF IgG浓度。
对于中和测定，将每种血清的系列稀释物与RSV A (Long毒株)一起在33℃预温育20 min。温育以后，将病毒-血清混合物转移至预先接种了Vero细胞的平板。在每个平板上，将在一列中的细胞与仅病毒(100%感染性)一起温育，且2个孔不接受病毒或血清(细胞对照)。将平板在33℃温育2小时，除去培养基，并将含有0.5%CMC (低粘度羧甲纤维素)的RSV培养基加入所有孔中。在免疫荧光染色之前将平板在33℃温育3天。
对于ELISA，用来对比不同组的统计学方法为在log10值上的方差分析(ANOVA 1或ANOVA 2)。
在图11中呈现的结果显示，在试验的抗原的两种剂量，在复合材料和氢氧化铝中的任一种诱导的中和抗体应答之间没有观察到显著差异。另外，在2µg抗原剂量，复合材料己二酸盐与复合材料N-乙酰半胱氨酸和复合材料尿酸相比诱导显著更高的中和抗体滴度。磷酸钙是更低免疫原性的佐剂，这是因为它与氢氧化铝(0.1µg rF)、复合材料己二酸盐(2µg rF)、复合材料半胱氨酸(2µg rF)和复合材料尿酸(0.1µg rF)相比诱导显著更低的中和抗体滴度。
当关于抗-rF IgG的浓度试验血清样品时，得到非常类似的结果(图12)。
实施例7：用吸附在不同复合材料上的重组F蛋白对Balb/c小鼠的免疫接种能够在 RSV攻击以后显著减小肺中的RSV病毒量.
基于在实施例6中描述的实验，选择复合材料己二酸盐、复合材料半胱氨酸和复合材料尿酸用于小鼠效力研究，与氢氧化铝进行对比。在表23中描述了实验设计。
将Balb/c小鼠组(n=8/组)用表23的制剂以3-周间隔肌内地免疫2次。在第二次免疫接种以后14天，用1.54 x 106 pfu的RSV鼻内地攻击动物。为了测量这些示例性疫苗的效力，在RSV攻击后4天收获肺，并个别地称重和匀浆。将每种肺匀浆物的系列稀释物(各8个副本)与Vero细胞一起温育，并在接种后6天通过免疫荧光鉴定含有空斑的孔。使用Spearman-Kärber方法确定病毒滴度用于TCID50计算，并按每克肺表示。用于对比不同组的统计学方法是在log10值上的ANOVA 1。
在图13中呈现的结果显示，用2µg rF + 复合材料己二酸盐的疫苗接种是能够完全消除小鼠肺中的RSV复制的唯一复合材料制剂，用2µg rF + 氢氧化铝的疫苗接种也是。其它两种试验的复合材料(复合材料/半胱氨酸和复合材料/尿酸)没有完全阻止肺中病毒的复制，但是显著地(P<0.001)减少肺中病毒的复制。这些结果表明，尽管存在类似的抗体应答，但不同复合材料可以诱导不同质的疫苗应答，如通过RSV攻击的Balb/c小鼠中病毒复制的不同抑制程度所显示的。
实施例8：在Balb/c小鼠免疫原性模型中评价复合材料19F-DT制剂.
通过2个实验在Balb/c小鼠免疫原性模型中试验了10种不同的19F-DT制剂。在第0、14和28天以0.1µg 19F-DT的剂量肌内地施用复合材料制剂。在第28天(ELISA和OPA，除了在合并的血清上做出的经历20140179以外)和第42天(ELISA和OPA)收集的各个血清中确定IgG水平和OPA滴度。除了Ca/F/尿酸和Ca3(PO4)2 (用作对照)制剂以外的所有候选物相对于AlPO4达到非劣等标准。参见图14-17。
实施例9：复合材料PRN的动物结果.
简而言之，将BALB/c小鼠组(n=16/组)以2-周间隔肌内地免疫2次；在第一次免疫接种以后14天和第二次免疫接种以后7天，单独地收集得自所有小鼠的血清，并根据下述规程针对抗-PRN IgG抗体的存在进行试验。
将96-孔平板用在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(50mM)中的PRN (6µg/ml)包被，并在4℃温育过夜。用PBS-BSA 1%缓冲液的饱和步骤以后，将小鼠血清在PBS-BSA 0.2%吐温0.05%中以1/100稀释，并在来自平板的孔中系列稀释(12个稀度，步骤½)。加入与过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgG (1/5000稀度)。加入过氧化物酶底物(OPDA)以后观察比色反应，并在通过分光光度法(波长: 490-620 nm)读出之前用1M HCL停止。对于试验的每种血清和加在每个平板上的标准品，将4-参数逻辑增长曲线拟合至OD和稀度之间的关联(Softmaxpro)。这允许衍生出以STD滴度表达的每个样品滴度。
实施例10: Denge/复合材料
将在4.7%的山梨糖醇在TRIS缓冲液（pH 8.0）中的溶液中配制的Denge-4吸附在不同复合材料上以达到4µg抗原/ml的终浓度。离心以后，通过ELISA在上清液中测量抗原。将100%ELISA值赋予离心后测量的类似Denge-4制剂。因而，低ELISA值显示抗原在复合材料上的高吸附。表25显示在每种制剂中涉及的复合材料量。

Claims (65)

1.氟化钙组合物，其包含氟化钙复合材料，所述复合材料包含Ca、F和Z，其中Z是有机分子。
2.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述复合材料包含等百分比w/w的Ca和F。
3.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述复合材料包含比F百分比w/w更大的Ca百分比w/w。
4. 前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述复合材料具有式(I)：
CaF(2-x)Z(x)/Z(y)
(I)
且其中x是0至2的非负数，包括0和2，且y是0至2的非负数，包括0和2。
5. 前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述复合材料具有式(II)：
CaF(2-x)Z(x)/HZ(y)
(II)
且其中x和y在一起的总和是等于或小于2的非负数，且x和y都不为0。
6. 前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述复合材料具有式(III)：
CaF(2-x)Z(x)/AZ(y)
(III)
且其中x和y在一起的总和是等于或小于2的非负数，x和y都不为0，且A是抗衡离子。
7. 前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中Z (i) 是阴离子有机分子和/或(ii)包含在离子化时形成阴离子的官能团。
8.权利要求7的氟化钙组合物，其中Z是对钙具有亲合力并与钙和氟化物形成水不溶性复合材料的有机分子。
9.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中Z包含一个或多个选自以下的官能团：羟基、羟基化物、配位羟离子、氧代、N-羟基化物、氧肟酸盐、N-氧化物、碳酸氢盐、碳酸盐、羧酸盐、脂肪酸、硫醇盐、有机磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢盐、磷酸的单酯、磷酸的二酯、磷脂的酯、硫代磷酸酯、硫酸盐、硫酸氢盐、烯醇化物、抗坏血酸盐、含磷抗坏血酸盐、酚盐和亚胺-醇盐。
10.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中Z可以归类为包含选自以下的化学种类的成员：羟基、羟基化物、配位羟离子、氧代、N-羟基化物、氧肟酸盐、N-氧化物、碳酸氢盐、碳酸盐、羧酸盐和二羧酸盐、羧酸的盐、QS21的盐、皂皮树树皮的提取物、免疫活性皂苷的提取物、饱和或不饱和脂肪酸的盐、油酸的盐、氨基酸的盐、硫醇盐、硫羟乳酸盐、硫醇-化合物的盐、半胱氨酸的盐、N-乙酰半胱氨酸的盐、L-2-氧代-4-噻唑烷羧酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢盐、磷酸的盐、磷酸的单酯和它们的盐、磷酸的二酯和它们的盐、3-O-脱酰基-4’-单磷酰基脂质A的酯、3D-MLA的酯、MPL、磷脂的酯、DOPC、二油酰基磷脂衍生物、来自CPG基序的磷酸盐、来自CpG家族的硫代磷酸酯、硫酸盐、硫酸氢盐、硫酸的盐、烯醇化物、抗坏血酸盐、含磷抗坏血酸盐、酚盐、α-生育酚、亚胺-醇盐、胞嘧啶、甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、巴比妥酸、次黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤、鸟苷、8-氧代-腺嘌呤、黄嘌呤、尿酸、蝶酸、蝶酰谷氨酸、叶酸、核黄素和光黄素。
11.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中Z选自：N-乙酰半胱氨酸；硫羟乳酸盐；己二酸盐；碳酸盐；叶酸；谷胱甘肽；和尿酸。
12.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中Z选自：N-乙酰半胱氨酸；己二酸盐；碳酸盐；和叶酸。
13.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，
其中Z是N-乙酰半胱氨酸，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F、不超过1% N-乙酰半胱氨酸(w/w)至37% Ca、26% F和37% N-乙酰半胱氨酸(w/w)。
14.权利要求1-11任一项的氟化钙组合物，
其中Z是硫羟乳酸盐，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F、不超过1%硫羟乳酸盐(w/w)至42% Ca、30% F、28%硫羟乳酸盐(w/w)。
15.权利要求1-11任一项的氟化钙组合物，
其中Z是己二酸盐，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F、不超过1%己二酸盐(w/w)至38% Ca、27% F、35%己二酸盐(w/w)。
16.权利要求1-11任一项的氟化钙组合物，
其中Z是碳酸盐，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F、不超过1%碳酸盐(w/w)至48% Ca、34% F、18%碳酸盐(w/w)。
17.权利要求1-11任一项的氟化钙组合物，
其中Z是叶酸，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F、不超过1%叶酸(w/w)至22% Ca、16% F、62%叶酸(w/w)。
18.权利要求1-11任一项的氟化钙组合物，
其中Z是谷胱甘肽，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F、不超过1%谷胱甘肽(w/w)至28% Ca、20% F、52%谷胱甘肽(w/w)。
19.权利要求1-11任一项的氟化钙组合物，
其中Z是尿酸，
且其中所述复合材料包含51% Ca、48% F和不超过1%尿酸(w/w)至36% Ca、26% F和38%尿酸(w/w)。
20.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述组合物是药物上可接受的。
21.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其中所述氟化钙复合材料为颗粒状形式。
22.权利要求21的氟化钙组合物，其中所述复合材料颗粒是在纳米颗粒或微米颗粒尺寸范围内。
23. 前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其包含一种或多种附加复合材料，其中一种或多种附加复合材料各自包含如前述权利要求任一项所述的Ca、F和Z，且其中一种或多种附加复合材料各自在Ca、F或Z的百分比 w/w或Z的化学结构方面彼此不同。
24.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其包含抗原，其中所述抗原吸附至氟化钙复合材料。
25.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其用于稳定抗原。
26.根据权利要求25的用于稳定抗原的氟化钙组合物，其中所述抗原是热稳定的。
27.如权利要求25至26任一项中所述的用于稳定抗原的氟化钙组合物，其中所述抗原吸附至氟化钙复合材料。
28.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其用于药品。
29.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其用于引发哺乳动物的免疫应答。
30.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其用于引发人的免疫应答。
31.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物免于由病毒、细菌或寄生虫造成的疾病。
32.前述权利要求任一项的氟化钙组合物，其用于预防和/或治疗人免于由病毒、细菌或寄生虫造成的疾病。
33.通过溶胶凝胶沉淀制备氟化钙复合材料的方法，其包括在沉淀条件下组合CaCl2、NaF和NaZ并收集水不溶性氟化钙复合材料的步骤。
34.权利要求33的通过溶胶凝胶沉淀制备氟化钙复合材料的方法，其包括洗涤所述氟化钙复合材料的步骤。
35. 权利要求33的通过溶胶凝胶沉淀制备氟化钙复合材料的方法，其包括根据下列方案：CaCl2 + NaF + NaZ → CaF(2-x)Zx/Zy + NaCl，在沉淀条件下组合CaCl2、NaF和NaZ并收集水不溶性氟化钙复合材料的步骤。
36.通过权利要求33至35任一项的方法制备的产物。
37. 佐剂组合物，其包含如前述权利要求1 – 32和36任一项中所述的氟化钙组合物。
38.权利要求37的佐剂组合物，其进一步包含免疫刺激剂。
39.权利要求38的佐剂组合物，其中所述免疫刺激剂吸附至氟化钙复合材料。
40.权利要求39的佐剂组合物，其中吸附至氟化钙复合材料的所述免疫刺激剂是MPL。
41. 权利要求37 – 40任一项的佐剂组合物，与当将所述抗原与磷酸钙一起或单独地施用时针对所述抗原产生的免疫相比，所述佐剂组合物用于增加对所述抗原的免疫应答。
42.用于制备根据权利要求37至41任一项的佐剂组合物的方法，其包括将免疫刺激剂与如权利要求1至32任一项中所述的氟化钙复合材料组合的步骤。
43.用于制备根据权利要求37至41任一项的佐剂组合物的方法，其包括将抗原吸附至如权利要求1至32任一项中所述的氟化钙复合材料的步骤。
44.免疫原性组合物，其包含抗原和如权利要求37至41任一项中所述的佐剂组合物。
45.权利要求44的免疫原性组合物，其肌内地、皮下地、皮内地、舌下地、向扁桃体或鼻内地递送。
46.权利要求44至45任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物的pH为约pH5至pH9。
47.权利要求44至46任一项的免疫原性组合物，其适合人施用。
48.权利要求44至47任一项的免疫原性组合物，其包含一种或多种药物上可接受的赋形剂，尤其是缓冲剂、Tris缓冲剂；或组氨酸缓冲剂。
49.权利要求44至48任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物在无菌条件下制备。
50.权利要求44至49任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物是无致热原的。
51.权利要求44至50任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物是等渗的。
52.权利要求51的免疫原性组合物，其中所述组合物包含糖或多元醇。
53. 权利要求44至52任一项的免疫原性组合物，其中至少一种抗原和至少一种免疫刺激剂吸附至如通过百分比w/w Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的单一类型的复合材料。
54. 权利要求44至52任一项的免疫原性组合物，其中多于一种抗原和多于一种免疫刺激剂吸附至如通过百分比w/w Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的单一类型的复合材料。
55. 权利要求44至52任一项的免疫原性组合物，其包含至少如通过百分比w/w Ca、F和Z以及Z的化学结构所定义的第一和第二类型的复合材料，其中至少一种抗原、至少一种免疫刺激剂或两者吸附至所述第一类型的复合材料，且其中至少一种抗原、至少一种免疫刺激剂或两者吸附至所述第二类型的复合材料。
56.用于制备根据权利要求44至55任一项的免疫原性组合物的方法，其包括将权利要求1至32任一项的氟化钙组合物与权利要求37至41任一项的佐剂组合物组合的步骤。
57.权利要求33的方法，其中所述组合步骤进一步包括在沉淀条件下将一种或多种抗原与CaCl2、NaF和NaZ组合。
58.权利要求34的方法，其中所述洗涤步骤进一步包括将一种或多种抗原与氟化钙复合材料组合。
59.权利要求35的方法，其进一步包括将氟化钙复合材料与一种或多种抗原混合的步骤。
60.用于制备权利要求24的氟化钙组合物的方法，其中在氟化钙复合材料的形成过程中将所述抗原吸附至氟化钙复合材料。
61.用于制备权利要求24的氟化钙组合物的方法，其中在形成氟化钙复合材料后将所述抗原吸附至氟化钙复合材料。
62.用于治疗或预防哺乳动物中由病毒、细菌或寄生虫造成的感染或疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1-24和36任一项的氟化钙组合物、权利要求37-41任一项的佐剂组合物或权利要求44-55任一项的免疫原性组合物给药至所述哺乳动物。
63.用于治疗或预防人中由病毒、细菌或寄生虫造成的感染或疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1-24和36任一项的氟化钙组合物、权利要求37-41任一项的佐剂组合物或权利要求44-55任一项的免疫原性组合物给药至所述人。
64.用于在有此需要的哺乳动物中诱导免疫原性应答的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-24和36任一项的氟化钙组合物、权利要求37-41任一项的佐剂组合物或权利要求44-55任一项的免疫原性组合物给药至所述哺乳动物。
65.用于在有此需要的人中诱导免疫原性应答的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-24和36任一项的氟化钙组合物、权利要求37-41任一项的佐剂组合物或权利要求44-55任一项的免疫原性组合物给药至所述人。
CN201480070872.3A 2013-10-25 2014-10-23 氟化钙组合物 Pending CN105873605A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201318858A GB201318858D0 (en) 2013-10-25 2013-10-25 Calcium fluoride compositions
GB1318858.6 2013-10-25
US201461946033P 2014-02-28 2014-02-28
US61/946033 2014-02-28
PCT/EP2014/072738 WO2015059224A1 (en) 2013-10-25 2014-10-23 Calcium fluoride compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105873605A true CN105873605A (zh) 2016-08-17

Family

ID=49767142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480070872.3A Pending CN105873605A (zh) 2013-10-25 2014-10-23 氟化钙组合物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20160263214A1 (zh)
EP (1) EP3060248A1 (zh)
JP (1) JP2016535023A (zh)
CN (1) CN105873605A (zh)
BR (1) BR112016009076A2 (zh)
CA (1) CA2927652A1 (zh)
GB (1) GB201318858D0 (zh)
WO (1) WO2015059224A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111956863A (zh) * 2020-07-20 2020-11-20 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种含阴阳离子共掺杂纳米磷酸钙抗菌材料及制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1377252A (zh) * 1999-08-05 2002-10-30 布洛克医药公司 恢复钙化组织中的缺陷的组合物
US20030082232A1 (en) * 1995-05-19 2003-05-01 D. Duke Lee Calcium phosphate delivery vehicle and adjuvant
US20070218049A1 (en) * 2006-02-02 2007-09-20 Wei Chen Nanoparticle based photodynamic therapy and methods of making and using same
CN101160116A (zh) * 2005-03-31 2008-04-09 利德斯公司 基于局部递送活性物质治疗前列腺疾病的方法
CN101951950A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗
CN102802660A (zh) * 2009-06-10 2012-11-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有低氯化钠浓度的免疫原性组合物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2171639C (en) * 1993-09-13 1999-11-02 Laurence C. Chow Complex calcium and fluoride containing mouth rinses, dentifrices, and chewable tablets
US6312734B1 (en) * 1998-11-23 2001-11-06 Novelos Therapeutics, Inc. Methods for production of the oxidized glutathione composite with cis-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells
US20020068090A1 (en) * 1999-02-03 2002-06-06 Bell Steve J. D. Calcium phosphate particles as mucosal adjuvants
MX2007015639A (es) * 2005-06-08 2008-02-15 Newbiomed Pika Pte Ltd Adyuvante basado en acido poliinosinico-acido policitidilico.

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030082232A1 (en) * 1995-05-19 2003-05-01 D. Duke Lee Calcium phosphate delivery vehicle and adjuvant
CN1377252A (zh) * 1999-08-05 2002-10-30 布洛克医药公司 恢复钙化组织中的缺陷的组合物
CN101160116A (zh) * 2005-03-31 2008-04-09 利德斯公司 基于局部递送活性物质治疗前列腺疾病的方法
US20070218049A1 (en) * 2006-02-02 2007-09-20 Wei Chen Nanoparticle based photodynamic therapy and methods of making and using same
CN101951950A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗
CN102802660A (zh) * 2009-06-10 2012-11-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有低氯化钠浓度的免疫原性组合物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111956863A (zh) * 2020-07-20 2020-11-20 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种含阴阳离子共掺杂纳米磷酸钙抗菌材料及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015059224A1 (en) 2015-04-30
BR112016009076A2 (pt) 2017-10-03
EP3060248A1 (en) 2016-08-31
JP2016535023A (ja) 2016-11-10
US20160263214A1 (en) 2016-09-15
GB201318858D0 (en) 2013-12-11
CA2927652A1 (en) 2015-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103313725B (zh) 免疫增强剂吸附不溶性金属离子
CN103002891B (zh) 比例计量型组合药物递送
UA59358C2 (uk) Спосіб приготування порошкоподібного пульмонологічного порошкоподібного препарату та препарат, одержаний в такий спосіб
Chang et al. Preparation of ROS active and photothermal responsive hydroxyapatite nanoplatforms for anticancer therapy
US11583585B2 (en) Gold nanoparticles and ecological method of production
CN102018714A (zh) 制剂
CN104093418A (zh) 金黄色葡萄球菌抗原的含佐剂制剂
ES2650740T3 (es) Composición de vacuna con unas nanopartículas de hidróxido de aluminio
US8697133B2 (en) Slow release compositions
CN105873941A (zh) 生存素导向的癌症疫苗治疗
CN105873605A (zh) 氟化钙组合物
CN104582726A (zh) 狂犬病病毒免疫原的含佐剂制剂
Liu et al. Unlocking the potential of amorphous calcium carbonate: A star ascending in the realm of biomedical application
Huang et al. Boosting humoral and cellular immunity with enhanced STING activation by hierarchical mesoporous metal-organic framework adjuvants
CN105682681A (zh) 氟化钙组合物
TW201609089A (zh) 塗覆方法及材料
CN1913897B (zh) 新颖化合物及其组合物、制备方法和/或治疗方法
CN113998679B (zh) 一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用
CN102250179A (zh) 稳定的蛋白激酶激活剂及其制备方法和用途
Alshanqiti et al. Adjuvants for Clostridium tetani and Clostridium diphtheriae vaccines updating
JP2002543209A (ja) 抗酸化物ビタミンｂ６類似体
CN102946889B (zh) 钙剂及其制造方法
Ortega Arroyo Preparation and characterization of composite materials for medical applications
Kaixiong et al. Preparation of adriamycin magnetic albumin microspheres and their experimental antitumor effects in vitro and in vivo
Su et al. Next-generation aluminum adjuvants: Immunomodulatory layered double hydroxides NanoAlum reengineered from first-line drugs

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160817

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication