CN102802660A

CN102802660A - 具有低氯化钠浓度的免疫原性组合物

Info

Publication number: CN102802660A
Application number: CN2010800264160A
Authority: CN
Inventors: V·亨德里克斯; D·I·勒穆瓦纳
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2012-11-28
Also published as: CA2764251A1; EP2440243A1; SG176091A1; MX2011013161A; AU2010257539A1; EA201190285A1; JP2012529465A; ZA201108504B; WO2010142686A1; BRPI1013051A2; KR20120031498A; US20120093921A1; IL216028A0; GB0910045D0

Abstract

本发明提供了包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的氯化钠浓度或离子强度小于100mM，并且提供了它们在药物中的用途。

Description

具有低氯化钠浓度的免疫原性组合物

发明领域

本发明涉及包含蛋白质抗原且氯化钠浓度小于等于100mM的免疫原性组合物。本发明也涉及包含抗原或抗原制剂、并且还包含一种或多种免疫刺激剂的这类免疫原性组合物。

发明背景

为了确保能维持免疫原性，蛋白质抗原的配制尤为重要。有时使用免疫刺激剂以改善针对任何给定抗原而产生的免疫应答。然而，在疫苗或免疫原性组合物中包含佐剂会增加成分制备的复杂性以及疫苗组合物的分布和配制的复杂性。配制者必须考虑每种佐剂成分以及抗原性成分的制备。具体地讲，应当考虑抗原性成分与佐剂成分的相容性。这尤其是在预期将冻干抗原或抗原制剂与佐剂制剂重配的情况下。在这种情况下，重要的是，佐剂制剂的缓冲液对于抗原或抗原制剂而言是合适的并且抗原的免疫原性或溶解度不会受到佐剂的影响。

蛋白质抗原PRAME和NY-ESO-1(分别描述于US5830753和US5804381)或其片段或衍生物都是对癌症治疗具有潜在益处的蛋白质抗原。

发明概述

本发明人已经发现某些抗原例如PRAME和NY-ESO-1对被称为“盐析”的现象特别敏感，该现象可定义为通过盐例如氯化钠的饱和而使蛋白质从其溶液中沉淀下来。本发明人已经发现，当氯化钠浓度低至150mM时，这些抗原就会聚集和沉淀。

因此，在一个实施方案中，抗原或抗原制剂是当溶于含氯化钠(NaCl)浓度或离子强度大于5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。

本发明提供包含PRAME或NY-ESO-1的免疫原性组合物，其中所述组合物的氯化钠浓度小于100mM。

附图简述

图1.QS21溶解活性曲线。

图2.在不同ASA制剂中，每种3D-MPL同类物(congener)的百分率。

图3.用于冻干PRAME/CpG的冻干周期。

图4.在ASA(150mM NaCl)和ASA(山梨醇)中重配的PRAME和NYESO-1之间的图示比较。

图5.在实验1中经用不同佐剂组合物配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的体液应答。

图6.在实验1中经用不同佐剂组合物配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的肿瘤保护作用。

图7.在实验2中经用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的体液应答。

图8.在实验2中经用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的CD4+应答。

图9.在实验2中经用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的肿瘤保护作用。

发明详述

本发明提供包含本文所述的抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于100mM。具体地讲，本发明提供包含抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于约100mM，例如小于约90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或15mM。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物中的氯化钠浓度小于10mM或小于等于5mM。在另一个具体的实施方案中，免疫原性组合物基本不含氯化钠。基本不含是指氯化钠浓度为或非常接近0mM。

使用已知技术和试剂盒，技术人员可以容易地测试钠离子(Na⁺)和氯离子(Cl^-)的浓度。例如，可使用试剂盒例如来自Biosupply的钠的酶学测定试剂盒(Sodium Enzymatic Assay Kit)(目录号：BQ011EAEL)来检测钠。可使用试剂盒例如来自Biosupply的氯的酶学测定试剂盒(Chloride Enzymatic Assay Kit)(目录号：BQ006EAEL)来检测氯。

在本发明的又一个实施方案中，提供包含本文所述的抗原的免疫原性组合物，其中离子强度小于100mM，例如小于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或15mM。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物中的离子强度小于10mM或小于等于5mM。在又一个具体的实施方案中，免疫原性组合物的离子强度为或非常接近0mM(即1、2、3mM)。

可使用技术人员已知的技术来测定本发明的佐剂或免疫原性组合物的离子强度，例如使用电导仪。

因此，在一个实施方案中，抗原或抗原制剂是当溶于含氯化钠(NaCl)浓度的溶液或其中溶液离子强度大于5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。本领域技术人员可以通过将抗原溶于和/或混合于该溶液中来确定抗原是否满足该定义。不满足该定义的抗原在溶解和/或混合后24小时将仍留在溶液中，即液体仍澄清而无沉淀。在溶于含100mM氯化钠浓度的溶液中之后沉淀、凝结或聚集的抗原，在24小时或更短时间之后，可通过溶液的浊度而观察到沉淀。另外，无法目测的聚集也可使用技术人员已知的方法来观察，所述方法包括但不限于SEC-HPLC。

在一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于100mM，例如小于约90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM、10或5mM，并且其中所述抗原是PRAME(也称为DAGE)或其片段或衍生物。

在本发明的又一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的离子强度小于100mM，例如小于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或15mM，并且其中所述抗原是PRAME(也称为DAGE)或其片段或衍生物。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物的离子强度小于10mM或小于等于5mM，并且其中所述抗原是PRAME或其片段或衍生物。

抗原及其制备描述于美国专利号5,830,753。PRAME以下列登录号存在于注释的人类基因数据库(Annotated Human Gene Database，H-Inv DB)：U65011.1、BC022008.1、AK129783.1、BC014974.2、CR608334.1、AF025440.1、CR591755.1、BC039731.1、CR623010.1、CR611321.1、CR618501.1、CR604772.1、CR456549.1和CR620272.1。

也可使用包含PRAME抗原的融合蛋白。可使用PRAME或其片段或衍生物，任选其形式是与异源融合伴侣融合的融合蛋白。具体地讲，可适当地使用PRAME抗原，其形式是与B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae B)的蛋白D或其部分或其衍生物的融合蛋白。可适当使用的蛋白D部分并不包含分泌序列或信号序列。适当地，融合伴侣蛋白包括在融合蛋白序列N端上或其中的氨基酸Met-Asp-Pro并且其中融合伴侣蛋白不包含蛋白D的分泌序列或信号序列。例如融合伴侣蛋白可包括蛋白D的大约或正好氨基酸17-127、18-127、19-127或20-127或者由它们组成。基于与蛋白D的融合蛋白的合适PRAME抗原描述于WO2008/087102，所述文献通过引用全部结合到本文中。

在一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于100mM，例如小于约90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM、10或5mM，并且其中所述抗原是NY-ESO-1或其片段或衍生物。

在本发明的又一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的离子强度小于100mM，例如小于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或15mM，并且其中所述抗原是NY-ESO-1或其片段或衍生物。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物的离子强度小于10mM或小于等于5mM，并且其中所述抗原是NY-ESO-1或其片段或衍生物。

NY-ESO-1可以是全长的或者可使用其片段或其衍生物，任选其形式是与异源融合伴侣的融合蛋白。NY-ESO-1描述于US5804381，所述文献通过引用全部结合到本文中。蛋白NY-ESO-1的长度大约为180个氨基酸并被描述成由3个区域组成：(a)约氨基酸1-70的N-端区，(b)约氨基酸71-134的中央区，和(c)约氨基酸135-180的C端区。NY-ESO-1可用作融合蛋白，例如作为与LAGE-1或其片段的融合物，参见WO2008/089074，所述文献通过引用全部结合到本文中。当使用NY-ESO-1片段时，这些适当地包括一个或多个MHC1类或2类表位，例如被称为A31、DR1、DR2、DR4、DR7、DP4、B35、B51、Cw3、Cw6和A2的那些(参见WO2008/089074)。

尽管并非同样对NaCl敏感，但是可用于本发明的又一种抗原是例如MAGE-3家族例如MAGE-A3的MAGE抗原。MAGE-3抗原已被描述为例如可适宜地与NY-ESO-1配制在一起—参见WO2005/105139，所述文献通过引用全部结合到本文中。

MAGE抗原例如MAGE-A3可按原样使用或者以衍生物(例如经化学修饰的衍生物)形式和/或以与异源融合伴侣融合的融合蛋白形式使用。例如MAGE抗原可含有还原型二硫桥，以构成游离巯基，其可用例如甲酰胺或羧甲基衍生，参见WO99/40188，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，MAGE抗原可适宜地以与B型流感嗜血杆菌的蛋白D或其部分或其衍生物融合的融合蛋白形式使用。例如蛋白D的大约1/3或蛋白D的N-端100-110氨基酸可用作融合伴侣，参见WO99/40188。

在又一实施方案中，抗原或抗原性组合物可以是本文所述抗原的任何衍生物。本文所用的术语“衍生物”是指相对于其天然存在形式而言被修饰的抗原。本发明的衍生物与天然抗原非常类似，保持了抗原性并保留了允许针对天然抗原而产生免疫应答的能力。给定衍生物是否产生这样的免疫应答，可通过合适免疫学测定例如ELISA或流式细胞术来检测。

本文所用的术语“片段”是指肿瘤相关抗原的片段或抗原衍生物，其含有至少一个表位，例如CTL表位，通常是至少8个氨基酸的肽。认为长度为至少8个氨基酸，例如8-10个氨基酸或至多20、50、60、70、100、150或200个氨基酸的片段落入本发明范围之内，只要所述片段具有抗原性，也就是说该片段保留了主要表位(例如CTL表位)并且该片段能够诱导与天然存在的肿瘤相关抗原交叉反应的免疫应答。示例性片段的长度可以是8-10、10-20、20-50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200个氨基酸残基(包括这些范围之内的任何数值)。

免疫原性组合物可包含一种或多种抗原。

众所周知的是，对于胃肠外给予，溶液应当是生理等渗的(即具有药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度)，以避免细胞变形或裂解。“等渗剂”是生理上可耐受的并赋予制剂(例如本发明的免疫原性组合物)合适张力的化合物，以防跨越与制剂接触的细胞膜的水的净流动。

通常，氯化钠(NaCl)用作等渗剂。本发明人已经证明某些抗原对“盐析”特别敏感，盐析是指溶液中的蛋白质在含高浓度盐的溶液中聚集或凝结的过程，是用于制备本文描述为等渗的本发明免疫原性组合物的替代方式。

在一个具体的实施方案中，提供还包含非离子型等渗剂的免疫原性组合物。用于免疫原性组合物的合适的非离子型等渗剂应当适用于人类，并且与抗原性组合物中的抗原相容并且还与其它成分例如免疫刺激剂相容。

在本发明的一个实施方案中，合适的非离子型等渗剂是多元醇、糖类(尤其是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖)或氨基酸例如甘氨酸。在一个实施方案中，多元醇是糖醇，尤其是C3-6糖醇。示例性的糖醇包括甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、本糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、卫矛醇和艾杜糖醇。在该实施方案的一个具体实例中，合适的非离子型等渗剂是山梨醇。在本发明的一个具体的实施方案中，本发明组合物中的非离子型等渗剂是蔗糖和/或山梨醇。

在一个实施方案中，免疫原性组合物中多元醇的合适浓度介于约3至约15％(w/v)之间，尤其是介于约3至约10％(w/v)例如介于约3至约7％(w/v)之间，例如介于约4至约6％(w/v)之间。在该实施方案的一个具体实例中，多元醇是山梨醇。

在本发明的一个具体的实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种免疫刺激剂。

在一个实施方案中，该免疫刺激剂可以是皂苷。用于本发明的一种尤其合适的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美树Quillaja saponaria Molina的一种皂苷制剂，首次由Dalsgaard等人描述于1974(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamte Virusforschung，第44卷，Springer Verlag，Berlin，第243-254页)，其具有佐剂活性。Quil A的纯化片段已通过HPLC分离，其保留佐剂活性，而没有与Quil A(EP 0 362 278)例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)相关的毒性。QS-21是源自Quillaja saponaria Molina的一种天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒T细胞(CTL)、Th1细胞和主要IgG2a抗体应答。QS21是本发明的优选皂苷。

在本发明的合适形式中，免疫原性组合物中的皂苷佐剂是saponaria molina quil A的衍生物，优选Quil A的免疫活性片段，例如QS-17或QS-21，适宜的是QS-21。

在一个具体的实施方案中，在其反应原性较低的组合物中提供QS21，其中它被外源固醇例如胆固醇猝灭。存在着其中QS21被外源胆固醇猝灭的反应原性较低的组合物的若干种具体形式。在一个具体的实施方案中，皂苷/固醇呈脂质体结构的形式(WO 96/33739，实施例1)。在该实施方案中，脂质体适宜含有天然脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下适宜为非晶性的，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂基磷脂酰胆碱。脂质体也可含有带电荷的脂质，其对于由饱和脂质构成的脂质体而言能增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电荷脂质的量适宜为1-20％w/w，优选5-10％。固醇与磷脂的比率为1-50％(mol/mol)，适宜地为20-25％。

合适的固醇包括β-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物包含胆固醇作为固醇。这些固醇是本领域众所周知的，例如胆固醇公开于默克索引(MerckIndex，第11版，第341页)，是存在于动物脂肪中的天然存在的固醇。

当活性皂苷部分是QS21时，QS21∶固醇的比率通常为约1∶100至1∶1(w/w)，适宜地介于1∶10至1∶1(w/w)之间，优选1∶5至1∶1(w/w)。适当过量的固醇存在，QS21∶固醇的比率为至少1∶2(w/w)。在一个实施方案中，QS21∶固醇的比率为1∶5(w/w)。固醇适宜为胆固醇。

在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含免疫刺激剂，其是Toll-样受体4(TLR4)激动剂。“TLR激动剂”是指能通过TLR信号转导途径而引起信号转导反应的成分，或者是作为直接配体或者间接通过产生内源或外源配体(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。TLR4激动剂能通过TLR-4信号转导途径而引起信号转导反应。TLR4激动剂的合适实例是脂多糖，适宜的是脂质A的无毒衍生物，尤其是单磷酰脂质A或更尤其是3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。

3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.售卖，名称是MPL，并且在全文中都称为MPL或3D-MPL。参见例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要是促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。可按照GB 2220211A所公开的方法制备3D-MPL。从化学上说，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，小颗粒3D-MPL可用于制备免疫原性组合物。小颗粒3D-MPL的粒径使其可通过0.22μm滤器进行除菌过滤。这样的制剂描述于WO 94/21292。优选地，粉状3D-MPL用于制备本发明的免疫原性组合物。

可使用的其它TLR4激动剂是氨基葡糖苷磷酸烷基酯(AGP)，例如公开于WO98/50399或美国专利号6,303,347(也公开了AGP的制备工艺)的那些，适宜的是RC527或RC529或美国专利号6,764,840所公开的AGP的药学上可接受的盐。某些AGP是TLR4激动剂，而某些则是TLR4拮抗剂。认为这两类都可用作免疫刺激剂。

其它合适的TLR-4激动剂描述于WO2003/011223和WO2003/099195，例如WO2003/011223的第4-5页或WO2003/099195的第3-4页上公开的化合物I、化合物II和化合物III，尤其是公开于WO2003/011223的那些化合物ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764。例如，一种合适的TLR-4激动剂是ER804057。

在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物同时包含皂苷和TLR4激动剂。在一个具体的实例中，免疫原性组合物包含QS21和3D-MPL。

每份人用剂量的免疫原性组合物中可以使用的TLR-4激动剂例如脂多糖例如3D-MPL的量介于1-100μg之间。可使用的3D-MPL的水平为约50μg，例如介于40-60μg之间，适宜地为介于45-55μg之间或介于49-51μg之间或50μg。在又一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含3D-MPL的水平为约25μg，例如介于20-30μg之间，适宜地为介于21-29μg之间或介于22-28μg之间或介于28-27μg之间或介于24-26μg之间或25μg。

每份人用剂量的免疫原性组合物中可以使用的皂苷例如QS21的量介于1-100μg之间。可使用的QS21水平为约50μg，例如介于40-60μg之间，适宜地为介于45-55μg之间或介于49-51μg之间或50μg。在又一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含QS21的水平为约25μg，例如介于20-30μg之间，适宜地为介于21-29μg之间或介于22-28μg之间或介于28-27μg之间或介于24-26μg之间或25μg。

当TLR4激动剂和皂苷同时存在于免疫原性组合物中时，TLR4激动剂与皂苷的重量比适宜地为介于1∶5-5∶1之间，适宜地为1∶1。例如，在每份人用剂量的免疫原性组合物中，当3D-MPL含量为50μg或25μg时，适宜地QS21的含量也可分别为50μg或25μg。

在一个实施方案中，免疫刺激剂是TLR9激动剂，例如WO2008/142133所给出的那些。在一个具体的实例中，所述TLR9激动剂是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。这样的寡核苷酸是众所周知的并描述于例如WO 96/02555、WO99/33488和US 5,865,462。用于本文所述的免疫原性组合物的合适的TLR9激动剂是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个、适宜地为至少6个或更多个核苷酸分隔的两个或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鸟嘌呤核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键(internucleotidebond)是二硫代磷酸键，或可能是硫代磷酸键，但磷酸二酯键和其它核苷酸间键也可使用，包括具有混合核苷酸间键的寡核苷酸。制备硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。考虑了包含不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯类。可使用能稳定寡核苷酸的其它核苷酸间键。

适合本文所述的免疫原性组合物所包含的CpG寡核苷酸的实例具有以下序列。在一个实施方案中，这些序列含有经硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。

OLIGO 1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)

OLIGO 2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG1758)

OLIGO 3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GACGGC ACC ACG

OLIGO 4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT(CpG 2006)

OLIGO 5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)

可选择的CpG寡核苷酸可包含上述序列，其中它们可具有不连续缺失或添加。

在一个实施方案中，免疫刺激剂是母育酚。母育酚是本领域众所周知的并描述于EP0382271。在一个具体的实施方案中，母育酚是α-生育酚或其衍生物例如α-生育酚琥珀酸酯(也称为琥珀酸维生素E)。

本发明也提供本发明免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.将本文所述的抗原冻干，任选与本文所述的免疫刺激性寡核苷酸一起；和

b.将步骤a)的冻干组合物与含水佐剂组合物重配，其中所述含水佐剂组合物的NaCl浓度或离子强度小于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM或10mM。

在一个具体的实施方案中，冻干抗原是当溶于含氯化钠浓度或离子强度大于10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。在又一实施方案中，冻干抗原选自PRAME或NY-ESO-1。

在一个实施方案中，步骤b)的佐剂组合物(上述)包含如上所述的皂苷和/或TLR-4激动剂，例如QS21和/或3D-MPL。在又一个实施方案中，皂苷和/或TLR4激动剂在脂质体制剂中。在一个实施方案中，佐剂组合物包含在脂质体制剂中的TLR4激动剂和皂苷，以及本文所述的非离子型等渗剂。尤其是本发明的佐剂组合物可包含山梨醇。

在本发明的又一个实施方案中，提供包含以下成分的药盒：

a.冻干抗原，任选与CpG一起冻干；和

b.含水佐剂组合物，其中NaCl浓度或离子强度小于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM或10mM。

在本发明的一个具体的实施方案中，本文所述药盒中的抗原包含PRAME或者NY-ESO-1和它们的片段和/或衍生物。

在一个替代实施方案中，提供药盒，其中CpG不与抗原一起冻干。可将CpG与含水佐剂组合物混合，或者以含水或冻干形式装入单独小管中。

用于本发明药盒的含水佐剂可以是本文所定义的任何佐剂组合物。在本发明的一个具体的实施方案中，含水佐剂组合物包含TLR4激动剂和/或呈脂质体形式的皂苷。在一个具体的实施方案中，TLR4激动剂是3D-MPL，皂苷是QS21。本文所用的含水佐剂可包含等渗剂，例如多元醇，例如山梨醇。

本发明还提供用于癌症的免疫治疗性治疗的本文所述的免疫原性组合物。

在该实施方案的具体实例中，本发明提供用于选自以下的一种或多种癌症的免疫治疗性治疗的本文所述的免疫原性组合物：前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或黑素瘤。

本发明还提供在有需要的个体中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给所述个体提供有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。

在该实施方案的具体实例中，本发明提供选自以下的癌症的治疗或预防方法：前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或黑素瘤。

根据以下非限制性实例将进一步描述本发明。

实施例

实施例1：佐剂组合物ASA(山梨醇)的制备

制备佐剂组合物，其中包含脂质体制剂中的3-脱酰MPL和QS21。其制备如下：

A.脂质体的制备方法：

将脂质(例如合成磷脂酰胆碱)、胆固醇和3-O-脱酰MPL的有机溶液的混合物真空干燥。再加入含水溶液(例如磷酸缓冲盐水[100mMNaCl、20mM磷酸盐pH 6.1])并搅拌容器直到所有脂质呈悬浮状态。用高剪切混合器将该悬浮液预均质，再进行高压均质，直到脂质体大小降低到经DLS测定约为90nm+/-10nm。然后将脂质体除菌过滤。

B.ASA的配制：

步骤1：浓缩脂质体的稀释

当稀释10倍时，将Na₂/K磷酸盐缓冲液100mM pH6.1加入到注射用水中，在终制剂中达到10mM磷酸盐缓冲液浓度。再加入30％(w/v)山梨醇的注射用水(WFI)溶液，在终制剂中达到4.7％的浓度。将其在室温下搅拌15-45分钟。

再将浓缩脂质体(分别由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、胆固醇和MPL制成)加入到该混合物中，在终制剂中达到100μg/mlMPL的浓度。

然后将混合物在室温下搅拌15-45分钟。

步骤2：加入QS21

使用蠕动泵，以200ml/min蠕动泵的速率将QS21贮液(在室温下融化24小时或在4℃融化2天，200ml)加入到稀释的脂质体中，同时磁力搅拌，在终制剂中达到100μg/ml的浓度。将混合物搅拌15-45分钟。

最终ASA制剂中含有100μg MPL/ml和100μg QS21/ml。

步骤3：检查pH为6.1+/-0.3

步骤4：除菌过滤

以400ml/min的恒定流速，在来自PALL Corporation的聚醚砜(PES)滤器上进行除菌过滤。

步骤5：在+2℃至+8℃贮存

获得佐剂组合物，其中包含在在脂质体制剂中的3-O-脱酰MPL和QS21并含有山梨醇(称为ASA(山梨醇))，然后贮存在4℃。

实施例2：佐剂组合物ASA(150mM NaCl)的制备

A.脂质体的制备方法：

将脂质(例如合成磷脂酰胆碱)、胆固醇和3-O-脱酰MPL的有机溶液的混合物真空干燥。再加入磷酸缓冲盐水并搅拌容器直到所有脂质呈悬浮状态。再用高剪切混合器将该悬浮液预均质，然后进行高压均质，直到脂质体大小降低到经DLS测定约为90nm+/-10nm。然后将脂质体在0.22μm PES膜上除菌过滤。

B.ASA的配制：

步骤1：浓缩脂质体的稀释

当稀释10倍时，将Na₂/K磷酸盐缓冲液100mM pH6.45和NaCl1.5M加入到注射用水中，在终制剂中分别达到10mM磷酸和NaCl150mM的浓度。将该混合物在室温下搅拌5分钟。再将浓缩脂质体(分别由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、胆固醇和MPL制成)加入到该混合物中，在终制剂中达到100μg/ml MPL的浓度。然后将所得混合物在室温下搅拌5-15分钟。

步骤2：加入QS21

将QS21贮液(在室温下融化24小时或在4℃融化2天，200ml)加入到稀释的脂质体中，同时磁力搅拌，在终制剂中达到100μg/ml的浓度。将混合物在室温下搅拌。

步骤3：检查pH为6.1+/-0.1.

步骤4：除菌过滤

在来自PALL Corporation的聚醚砜(PES)滤器上进行除菌过滤。

步骤5：在+2℃至+8℃贮存

最终ASA组合物是每毫升2mg DOPC、500μg胆固醇、100μg3-O-脱酰MPL、100μg QS21。

实施例3.QS21裂解活性

已知QS21能裂解红细胞(RBC)。测试实施例1中制备的ASA(山梨醇)佐剂组合物，以确保QS21的裂解活性以与包含150mM NaCl的等量佐剂组合物(ASA(150mM NaCl))中所观察到的同样方式被猝灭。

通过溶血测定，使用鸡红细胞(chicken Red Blood cell，RBC)测定QS21的裂解活性。将RBC在550g于4℃离心。弃去上清液。将沉淀小心重悬于PBS缓冲液中达原先体积并且重复同样操作，直到上清液不再呈红色(通常3次)。如果不直接使用的话，将沉淀贮存于4℃最多3-4天(并在使用当天再次洗涤)，或者如果在同一天使用的话，将其在缓冲液中稀释大约10倍。

临时在ASA缓冲液(在测定ASA样品后在盐或在山梨醇缓冲液中)中制作QS21剂量范围曲线并且制备佐剂样品(含50μg或90μg等量QS21，即相当于500μl或900μl ASA)。在标准品和样品中用适当缓冲液(含或不含山梨醇，随所测试样品的缓冲液而定)将终体积调节至900μl。因为其为乳白色，ASA干扰光密度(OD)。因此制备ASA“空白”并从ASA测试样品的OD值中减去“空白”OD。这些空白相当于与样品中测试的体积相同的ASA体积，但用缓冲液调节至1ml。这些空白中不加RBC。然后将标准品和样品与RBC一起(将100μl稀释RBC加入到900μl标准品和样品中)在室温下(RT)温育30分钟。再将样品在900g离心5分钟。离心后在540nm处测定光密度。

通过界限试验(limit test)进行裂解活性的测定。

1.检测限(LOD)定义为导致OD的最低QS21浓度：

-比基础水平更高(OD＞0.1)

-比缓冲液(“oμg”QS21)的OD高约3倍

-在曲线的上升部分

-对每次试验进行测定。

2.如果佐剂样品的OD大于OD_LOD，则佐剂样品中QS21的裂解活性始终是正的。

QS21曲线的实例：

^*50ug QS21等量测试。150mM氯化钠缓冲液。

该测定的检测限是0.9ug QS21，OD为0.12。

对于所测试的等量50μg QS21而言，估计在包含150mM氯化钠的佐剂组合物中QS21的猝灭大于98.2％。在所测试的等量90μg的情况下，结论大于99％。

然后将QS21猝灭与包含山梨醇和仅含5mM氯化钠的等量佐剂组合物进行比较。在4℃贮存ASA之后或在加速稳定(7天，在37℃)之后产生数据。对于山梨醇中的ASA，在含山梨醇的缓冲液中得到QS21标准曲线。

测试等量50μg QS21，除了^*测试等量90μg QS21之外。

结论是QS21在低氯化钠缓冲液中被足够地猝灭。

实施例4：MPL同类物

从化学上说，3D-MPL是具有4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。每个单独的3D-MPL分子都称为同类物。重要的是，同类物组成保持恒定，在同类物比例上没有变化。也重要的是，所用的任何缓冲液都能使同类物组成与用于制备佐剂组合物的浓缩脂质体中的组成相同。

如图2所示，在3D-MPL浓缩脂质体(浓缩脂质体LIP07-217，图2的第1栏)、包含3D-MPL脂质体和QS21的150mM NaCl缓冲液的佐剂组合物(佐剂150mM NaCl或ASA(150mM NaCl)，第2栏)，以及包含3D-MPL脂质体和QS21的山梨醇和5mM NaCl缓冲液的佐剂组合物(佐剂山梨醇，或ASA(山梨醇)，第3-7栏)中，检查同类物组成。

也在制备后第0天和第7天在37℃维持下在两批次的ASA(山梨醇)佐剂中检查同类物组成，以确保随时间无变化(参见图2的最后4栏)。

通过IP-HPLC-Fluo检测(ARD)，在浓缩脂质体或ASA(山梨醇)样品中检测MPL的4-、5-和6-酰化同类物的相对分布。标准品和样品都用丹酰肼衍生，其在二糖主链上引入Fluo-活性生色团。在C18反相柱上，用叔丁基氢氧化铵(TBAOH)作为离子对试剂，分析衍生样品。在不同组(四酰基、五酰基和六酰基)中洗脱含有相同数量的脂酰基的同类物。通过将各组的峰面积与所有MPL同类物的总峰面积进行比较，推导出同类物的分布。

图2显示各同类物的百分率。在佐剂缓冲液之间，未发现同类物组合物的显著差异，并且同类物组合物在山梨醇缓冲液中随时间变化而保持不变。

实施例5：组合物的制备并用于实施例6和7

5.1 PRAME与CpG(CpG 2006用于所有实施例中)的制备

5.1.1用ASA(150mM NaCl)制备PRAME与CpG，用于实施例6和实施例7的实验1和实验2

将30％(w/v)蔗糖溶液(在注射用水中制备)加入到注射用水中，达到5％的蔗糖浓度。再加入Tris-HCl缓冲液100mM pH 9.5，达到75mMTris缓冲液浓度。再加入硼酸盐缓冲液100mM pH 9.8，达到5mM硼酸盐缓冲液浓度。再加入10％(w/v)泊洛沙姆188溶液(在注射用水中制备)，达到0.313％的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入浓度约20mg/ml的CpG溶液(溶于注射用水中)，在终制剂中达到1050μg/ml的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入PRAME抗原，达到1250μg/ml的蛋白质浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)15分钟。检查pH(9.51)。将所得混合物0.5ml装入3ml玻璃管中，然后冻干。

图3显示用于PRAME的冻干周期(持续时间＝40h)。

所得冻干饼用实施例2中制备的含150mM NaCl的625μl含水佐剂组合物重配。冻干饼含有1.25倍过量抗原剂量，从而在用最终组合物(16mM Tris、4mM硼酸盐、4％蔗糖、0.24％泊洛沙姆188、840μg/mlCpG和1000μg/ml PRAME)重配之后具有适当的抗原/佐剂比例。

5.1.2 PRAME与CpG的制备，用于实施例7的实验1的“液体制剂”(70mM NaCl)。

浓缩佐剂的制备

当稀释10倍时，将PBS mod 10倍浓缩pH 6.1加入到注射用水中，在终制剂中达到1倍浓缩的缓冲液。分别制备由脂质体和预稀释到400μg/ml的QS21组成的预混合溶液。预混液在室温下经磁力搅拌15分钟。用于预混液的浓缩脂质体是由40mg/ml DOPC、10mg/ml胆固醇和2mg/ml 3-脱酰MPL组成。将预混液加入到PBS中，在终制剂中MPL浓度为200μg/ml，QS21浓度为200μg/ml。所得混合物在室温下经磁力搅拌15-30分钟。再加入约23mg/ml的CpG，达到1680μg/ml的终浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌15-30分钟。检查pH使其为6.1+/-0.1。在0.22μm PES滤器上过滤AS并贮存于4℃，直到使用。

终制剂

将蔗糖25％、硼酸盐25mM pH9.8和Lutrol 10％加入到WFI中，在终制剂中分别达到9.25％、5mM和0.24％。加入2倍浓缩的AS+CpG制剂，在终制剂中得到1倍浓缩物。混合物在室温下搅拌5分钟。再加入含PRAME抗原的蔗糖3.15％、硼酸盐5mM，并将所得混合物在室温下搅拌5分钟。

5.1.3 PRAME与CpG的制备，用于实施例7的实验2的“液体制剂” 浓缩佐剂的制备

用于液体制剂的ASA制备如下：在磁力搅拌下，将磷酸盐缓冲液1M(pH 6.1，当稀释100倍时)加入到WFI中，在浓缩脂质体中的50mM磷酸盐浓度中达到45mM终浓度。再加入山梨醇35％，达到21.15％终浓度。将由40mg/ml DOPC、10mg/ml胆固醇和2mg/ml 3-脱酰MPL构成的浓缩脂质体加入到所得混合物中，达到450μg/ml的MPL终浓度。加入QS21贮液(大约5000μg/ml)，达到450μg/ml的QS21终浓度。所得混合物在室温下搅拌15分钟。检查pH并调节到pH6.1+/-0.1。在该ASA中的终浓度分别是：450μg/ml MPL、450μg/mlQS21、45mM磷酸盐、22.5mM NaCl、21.15％山梨醇。

终制剂

将30％(w/v)蔗糖溶液(在注射用水中制备)加入到注射用水中，在终制剂中达到4％蔗糖浓度。再加入Tris-HCl缓冲液1M pH 9.0，在终制剂中达到16mM Tris缓冲液浓度。再加入硼酸盐缓冲液100mM pH9.8，在终制剂中达到4mM硼酸盐缓冲液浓度。再加入10％(w/v)泊洛沙姆188溶液(在注射用水中制备)，在终制剂中达到0.24％浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入浓度约20mg/ml的CpG溶液(溶于注射用水中)，在终制剂中达到840μg/ml的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入PRAME抗原缓冲液(硼酸盐5mM-蔗糖3.15％pH 9.8)，将PRAME抗原浓度调整为1000μg/ml。再加入PRAME抗原，在终制剂中达到8μg/ml的蛋白质浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)15分钟。加入含4.5倍浓缩的AS的山梨醇，达到终浓度为100μg/ml MPL和QS21。检查pH(+/-8.0)。

5.1.4 PRAME与CpG的制备，用于实施例7的实验1的ASA(山梨醇) 和ASA(蔗糖)

将30％(w/v)蔗糖溶液(在注射用水中制备)加入到注射用水中，在制剂中达到蔗糖浓度为5％，再加入硼酸盐缓冲液100mM pH9.8，在该制剂中达到5mM硼酸盐缓冲液浓度。当稀释20倍时再加入Tris-HCl缓冲液100mM pH 9.0，在该制剂中达到5mM Tris缓冲液浓度。再加入10％(w/v)泊洛沙姆188溶液(在注射用水中制备)，在制剂中达到0.3％的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入浓度约20mg/ml的CpG溶液(溶于注射用水中)，在制剂中达到1050μg/ml的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入PRAME抗原，在终制剂中达到1250μg/ml的蛋白质浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)15分钟。测定pH为9.4。将所得混合物0.5ml装入3ml玻璃管中，然后冻干。

按照实施例1所述，制备ASA(山梨醇)，除了以下差异之外：山梨醇浓度为4.6％并将QS21预稀释到400μg/ml，然后再加入到稀释的浓缩脂质体中。

按照实施例1所述，制备ASA(蔗糖)，除了以下差异之外：山梨醇替换为蔗糖(使用30％w/v蔗糖溶液的贮液，最终蔗糖浓度为8.3％)并将QS21预稀释到400μg/ml，然后再加入到稀释的浓缩脂质体中。

所得冻干饼用625μl含水佐剂组合物重配，最终组合物包含4mMTris、4mM硼酸盐、4％蔗糖、0.24％泊洛沙姆188、840μg/ml CpG和1000μg/ml PRAME。

5.1.5 PRAME与CpG的制备，用于实施例7的实验2的ASA(山梨醇)

将30％(w/v)蔗糖溶液(在注射用水中制备)加入到注射用水中，在制剂中达到5％的蔗糖浓度，当稀释50倍时再加入Tris-HCl缓冲液1MpH 9.0，在该制剂中达到20mM Tris缓冲液浓度，当稀释20倍时再加入硼酸盐缓冲液100mM pH 9.8，在该制剂中达到5mM硼酸盐缓冲液浓度。再加入10％(w/v)泊洛沙姆188溶液(在注射用水中制备)，在制剂中达到0.3％的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入浓度约20mg/ml的CpG溶液(溶于注射用水中)，在制剂中达到1050μg/ml的浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)5分钟。再加入PRAME抗原，在终制剂中达到1250μg/ml的蛋白质浓度。所得混合物在室温下经磁力搅拌(150rpm)15分钟。测量pH为9.1。将所得混合物0.5ml装入3ml玻璃管中，然后冻干。

按照实施例1所述，制备ASA山梨醇。所得冻干饼用625μl含水佐剂组合物重配，最终组合物包含16mM Tris、4mM硼酸盐、4％蔗糖、0.24％泊洛沙姆188、840μg/ml CpG和1000μg/ml PRAME。

5.2 NY-ESO1与CpG的制备

5.2.1实施例6中NY-ESO1与CpG的制备

当稀释20倍时，将Na₂/K磷酸盐缓冲液200mM pH 6.3在磁力搅拌下加入到注射用水中，在终制剂中达到12.5mM。然后将下列赋形剂加入到所得混合物中并按照以下顺序：加入10％w/v一硫代甘油，最终达到0.3125％，加入5％w/v泊洛沙姆188，达到0.0625％，加入蔗糖25％，最终达到5％，加入L-精氨酸碱287mM，达到6.25mM。再将约20mg/ml的CpG贮液加入到该混合物中，在终制剂中达到1050μg/ml的浓度。所得混合物在室温下在磁力搅拌(大约150rpm)下保持10分钟。检查pH，使其为7.1+/-0.3。增强磁力搅拌，以产生涡旋。再加入NY-ESO1，达到750μg/ml的终浓度。再将磁力搅拌降低至大约150rpm，所得混合物在室温下搅拌5分钟。取出一份等分试样，检查最终pH(为7.02)。再将最终贮液(final bulk)冻干。

所得冻干饼用625μl ASA缓冲液(150mM NaCl和山梨醇)重配。

实施例6.在包含山梨醇作为缓冲液的佐剂组合物中阻止“盐析”.

图4表明将盐浓度降低至5mM并且在佐剂组合物中包含山梨醇，可阻止免疫原性组合物(分别按照实施例5.1.1和5.2.1制备)中PRAME和NY-ESO-1的“盐析”。在图4中：

1.PRAME抗原在ASA 150mM NaCl缓冲液中重配。

2.PRAME抗原在ASA山梨醇缓冲液中重配。

3.NYESO-1抗原在ASA 150mM NaCl缓冲液中重配。

4.NYESO-1抗原在ASA山梨醇缓冲液中重配。

图4是在ASA(150mM NaCl)和ASA(山梨醇)中重配的PRAME与NYESO-1的图示比较。如图所示，在ASA(150mM NaCl)中重配的PRAME比在ASA(山梨醇)中重配的PRAME看上去更浑浊。同样，在ASA(150mM NaCl)中重配的NY-ESO比在ASA(山梨醇)中重配的NY-ESO抗原看上去更浑浊。

实施例7.体内小鼠模型

实验1：

使用在对应于1/10人用剂量的ASA+CpG固定剂量中配制的PRAME蛋白(50μL含有5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG7909)，对7组20只6-8周龄的雌性CB6F1小鼠(C57BL/6和Balb/C小鼠的杂种)进行2次肌内免疫接种(每2周一次，在左右腓肠肌交替注射)。在最后一次免疫接种后14天，4组小鼠(每组n＝8)用10e5CT26-PRAME肿瘤细胞进行皮下攻击，如下文所述。7组小鼠是：

-组1：缓冲液

-组2：一起冻干的PRAME+CpG重悬于“传统”ASA(150mMNaCl)，其中PRAME蛋白沉淀

-组3：一起冻干的PRAME+CpG重悬于ASA(蔗糖)

-组4：一起冻干的PRAME+CpG重悬于ASA(蔗糖-在25℃温育48小时)

-组5：一起冻干的PRAME+CpG重悬于ASA(山梨醇)

-组6：PRAME+ASA-含70mM NaCl+CpG的“液体”制剂

-组7：PRAME+ASA-含70mM NaCl+CpG(+泊洛沙姆)的“液体”制剂

最后一次免疫接种后7天，通过T细胞分泌细胞因子的能力来分析细胞应答(n＝4组，3只小鼠)。

所有小鼠接受含0.4μg PRAME的1/10人用剂量的ASA+CpG佐剂系统(5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG)。

结果：

肿瘤生长

用表面积(mm²)(+SD)来测定的每组随时间而变的平均肿瘤生长，示于图6。与PRAME ASA(山梨醇)+CpG相比，在ASA(150mM NaCl)+CpG中配制的PRAME和在ASA液体制剂中配制的PRAME诱导更低的肿瘤保护作用(更大的肿瘤生长)。

细胞应答(在2次免疫接种后7天-n＝4组，每组治疗3只小鼠)：

在用PRAME ASA-CpG肿瘤抗原免疫接种小鼠之后，能产生例如IFNγ和TNFα等细胞因子的CD4和CD8T细胞的频率用于反映不同制剂诱导功能性细胞应答的能力。第2次免疫接种后7天，通过在已免疫小鼠的脾细胞上进行胞内细胞因子染色(ICS)，测定产生细胞因子(IFNγ和TNFα)的CD4和CD8T细胞的百分率。

产生IFNγ和TNFα的CD4百分率(平均值+/-标准差)见图5。

在本次实验中未见可检测的CD8反应。

与在ASA(山梨醇)+CpG中配制的PRAME相比，在ASA(150mM NaCl)+CpG中配制的PRAME蛋白显示出沉淀并诱导出更低的特异性T细胞应答。当PRAME蛋白配制在ASA(山梨醇)+CpG中和配制在ASA“液体”制剂(70mM NaCl)+CpG(无统计学差异)中时，得到同样的良好PRAME特异性CD4应答。也测试了体液免疫应答，但2次注射之后的数据不可解释。

实验2：

使用在对应于1/10人用剂量的ASA+CpG固定剂量中配制的PRAME蛋白(50μL含有5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG7909)，对4组24只6-8周龄的雌性CB6F1小鼠(C57BL/6和Balb/C小鼠的杂种)进行4次肌内免疫接种(每2周一次，在左右腓肠肌交替注射)。在最后一次免疫接种后14天，对4组小鼠(每组n＝12)用10e5 CT26-PRAME肿瘤细胞进行皮下攻击，如下文所述。4组小鼠是：

-组1：缓冲液

-组3：一起冻干的PRAME+CpG重悬于ASA(山梨醇)

-组4：PRAME+ASA-“液体”制剂+CpG(+泊洛沙姆)

最后一次免疫接种后14天，使用不同读出(read out)如下分析免疫应答：

-体液应答(n＝12)

-通过T细胞分泌细胞因子的能力分析细胞应答(n＝4组，3只小鼠)

-针对肿瘤攻击的保护作用(n＝12)

结果：

肿瘤生长

用表面积(mm²)(+SD)来测定的每组随时间而变的平均肿瘤生长，示于图9。与PRAME ASA(山梨醇)+CpG相比，在ASA(150mM NaCl)+CpG中配制的PRAME诱导更低的肿瘤保护作用(更大的肿瘤生长)。对于PRAME ASA(山梨醇)+CpG以及在ASA液体制剂+CpG中配制的PRAME，也观察到同样的保护作用。

样品分析：体液应答：

在4次免疫接种的最后一次之后14天，通过ELISA测定小鼠血清(n＝12)中PRAME特异性抗体的存在，如下所述。通过ELISA，使用纯化的重组PRAME蛋白作为包被抗原，评价了抗体应答(总Ig)。分析来自已免疫动物的血清中PRAME特异性抗体的存在。在4次免疫接种之后获取的标准滴度的几何平均值(n＝12只小鼠)+/-95％置信区间见图7。含有传统ASA(150mM NaCl)的PRAME/ASA+CpG诱导非常小的抗体应答，而含有ASA(山梨醇)的PRAME/ASA+CpG却诱导非常高的抗体滴度。该应答类似于液体制剂ASA所诱导的那样。

细胞应答(第4次免疫接种后14天-n＝4组，每组治疗3只小鼠)：

在用PRAME ASA-CpG肿瘤抗原免疫接种小鼠之后，能产生例如IFNγ和TNFα等细胞因子的CD4和CD8T细胞的频率用于反映不同制剂诱导功能性细胞应答的能力。第4次免疫接种后14天，通过在已免疫小鼠的脾细胞上进行胞内细胞因子染色(ICS)，测定产生细胞因子(IFNγ和TNFα)的CD4和CD8T细胞的百分率。

产生IFNγ和TNFα的CD4百分率(平均值+/-标准差)见图8。p-值远低于0.05，表明组2与组3和组4之间的显著差异。

在本次实验中未见可检测的CD8应答。

与在ASA(山梨醇)+CpG中配制的PRAME相比，在ASA(150mM NaCl)+CpG中配制的PRAME蛋白显示出沉淀并诱导出统计学上更低的特异性T细胞应答。与此相反，当PRAME蛋白配制在ASA(山梨醇)+CpG中和配制在ASA“液体”制剂+CpG中时，得到同样的良好PRAME特异性CD4应答。

方法

CT26-PRAME肿瘤模型和肿瘤生长

经用编码PRAME的cDNA的哺乳动物表达质粒pCDNA3转染CT26结肠癌细胞系(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生CT26-PRAME细胞系。经定量实时PCR测定，用G418(200μg/ml)选择和有限稀释克隆，得到表达PRAME的克隆(CT26-PRAME)(10e-3PRAME mRNA拷贝/小鼠β肌动蛋白拷贝，其在人类肿瘤的PRAME表达水平范围之内)。

在体外，在37℃和5％CO₂中，在含有以下成分的RPMI培养基中培养CT26PRAME细胞：10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠和0.1％β-巯基乙醇。将细胞经胰蛋白酶水解，在无血清培养基中洗涤2次，并在如上所述地用PRAME进行最后一次免疫接种后14天，在200μl RPMI培养基中经皮下注射到4组CB6F1小鼠的右侧。每周2次测量个体的肿瘤生长。随时间记录各肿瘤的2个主要直径的乘积并将数据作为每组动物的平均肿瘤表面积(mm²)。

样品分析：体液应答

在加入血清之前，用PRAME抗原在4℃将免疫板包被过夜。在37℃与血清反应90分钟后，加入针对小鼠免疫球蛋白的生物素化兔完整抗体，在37℃持续90分钟。通过与链霉抗生物素-生物素化过氧化物酶复合物一起在37℃温育30分钟，显示抗原-抗体复合物。再通过加入四甲基联苯胺(TMB)在室温下持续10分钟并用0.2M H₂SO₄终止反应，来显示该复合物。在450nm处记录光密度。

样品分析方法：细胞应答(IFNγ/TNFα的产生)

用覆盖整个PRAME蛋白序列的重叠15聚体肽合并物(pool)刺激2小时之后，通过流式细胞术(LSR2来自Becton Dickinson)，使用在已免疫小鼠(4组，每组3只小鼠)的脾细胞上进行的胞内细胞因子染色(ICS)，测定CD4和CD8T细胞对IFNγ和TNFα的产生。

T细胞的刺激：

已免疫动物的脾细胞用覆盖整个PRAME序列的有11个氨基酸重叠的123个15聚体肽合并物再次刺激。在96孔板(U)中，在含有2μg/ml抗CD49d和2μg/ml抗CD28的200μl RPMI 5％FCS的终体积中，将肽(1μg/ml/peptide)与10e6T细胞(脾细胞)一起在37℃混合2小时。

-温育之后，将50μl布雷菲德菌素(1/1000)加入到RPMI 5％FCS中。

胞内染色：

●CD4/CD8染色：

-将细胞移至96孔板(锥形孔)

-在4℃于1000rpm离心5分钟

-用250μl FACS缓冲液(PBS 1％FCS)洗涤

-将细胞沉淀与50μl含2.4G2 1/50的FACS缓冲液一起在4℃温育10分钟

-在4℃在30分钟内加入50μl含Master mix CD4-PE(稀释Mab：1/200)和CD8PerCP(稀释Mab：1/200)的FACS缓冲液

-在FACS缓冲液中洗涤(1200RPM-10分钟)。

●细胞渗透性：

-在4℃，将沉淀与200μl cytoFix-cytoPerm溶液一起温育20分钟

-用permWASH 1x洗涤(1200RPM-10分钟)-permWASH溶液是10倍浓缩的，在无菌水中稀释。

●I IFNγ和TNFα胞内染色：

-在4℃，将沉淀与50μl Mix IFNγAPC(稀释Mab：1/50)和TNFαFITC(稀释Mab：1/50)的permWASH1x溶液一起温育2小时

-用permWASH 1x洗涤(1200RPM-10分钟)

-将沉淀重悬于FACS缓冲液

-FACS分析。

布雷菲德菌素(Gologi Plug)：BD目录号555029

Cytofix/cytoperm：Pharmingen(BD)目录号554722

Perm/wash缓冲液：Pharmingen(BD)目录号554723

大鼠抗小鼠CD49d纯化NA LE：BD目录号553154

大鼠抗小鼠CD28纯化NA LE：BD目录号553295

大鼠抗小鼠CD8a perCp：BD目录号553036

大鼠抗小鼠CD4PE：BD目录号556616

大鼠抗小鼠IFNγAPC：BD目录号554413

大鼠抗小鼠TNFαFITC：BD目录号554418

抗小鼠CD16/CD32(2.4G2)Becton Dickinson目录号553142(0.5mg/ml)。

Claims

1.包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的氯化钠浓度或离子强度小于100mM。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原制剂是在溶于含氯化钠浓度或离子强度大于5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。

3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于100mM并且其中所述抗原是PRAME或其片段或衍生物。

4.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于100mM并且其中所述抗原是NY-ESO-1或其片段或衍生物。

5.权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度或离子强度小于约100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或15mM。

6.权利要求5的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度或离子强度小于10mM。

7.权利要求6的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度或离子强度小于5mM。

8.权利要求7的免疫原性组合物，其基本不含氯化钠。

9.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述组合物还包含非离子型等渗剂。

10.权利要求9的免疫原性组合物，其中所述非离子型等渗剂是多元醇。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述多元醇是山梨醇。

12.权利要求11的免疫原性组合物，其中山梨醇浓度介于约3％至约15％(w/v)之间。

13.权利要求12的免疫原性组合物，其中山梨醇浓度介于约4％至约10％(w/v)之间。

14.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述组合物包含约5mM氯化钠和介于5％至6％w/v之间的山梨醇。

15.权利要求1-14中任一项的免疫原性组合物，所述组合物包含一种或多种免疫刺激剂。

16.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激剂是皂苷和/或TLR-4激动剂。

17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激剂呈脂质体形式。

18.权利要求16或17的免疫原性组合物，其中所述皂苷是QuilA或其衍生物。

19.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述QuilA的衍生物是QS21。

20.权利要求16-19中任一项的免疫原性组合物，其中所述TLR-4激动剂是3D-MPL。

21.权利要求16-20中任一项的免疫原性组合物，所述组合物还包含CpG寡核苷酸。

22.用于药物的权利要求1-21中任一项的免疫原性组合物。

23.用于治疗癌症的权利要求1-21中任一项的免疫原性组合物。

24.权利要求1-21中任一项的免疫原性组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

25.权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.将抗原冻干，任选与免疫刺激性寡核苷酸一起；和

b.将步骤a)的冻干组合物与含水佐剂组合物重配，其中NaCl浓度或离子强度小于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM或10mM。

26.药盒，所述药盒包含：

a.冻干抗原，任选与CpG一起冻干；和

27.权利要求26的方法或权利要求27的药盒，其中所述含水佐剂组合物包含TLR-4激动剂、以及呈脂质体形式的皂苷和非离子型等渗剂。

28.权利要求27的方法或药盒，其中所述非离子型等渗剂是山梨醇。

29.权利要求28的方法或药盒，其中山梨醇浓度介于约3％至15％(w/v)之间，介于4％至10％(w/v)之间或介于约5％至6％(w/v)之间。

30.权利要求27或28的方法或药盒，其中所述皂苷是QS21。

31.权利要求27-30中任一项的方法或药盒，其中所述TLR-4激动剂是3D-MPL。

32.权利要求25-31中任一项的方法或药盒，其中在所述含水佐剂组合物中NaCl浓度为约5mM。

33.权利要求25-32中任一项的方法或药盒，其中所述抗原在溶于含氯化钠浓度或溶液离子强度大于10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的溶液之后沉淀、凝结或聚集。

34.权利要求25-33中任一项的方法或药盒，其中所述抗原选自PRAME或NY-ESO-1。