MX2011013161A

MX2011013161A - Composiciones inmunogenicas que tienen una baja concentracion de cloruro de sodio.

Info

Publication number: MX2011013161A
Application number: MX2011013161A
Authority: MX
Inventors: Dominique Ingrid Lemoine; Veronique Henderickx
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2012-01-30
Also published as: CA2764251A1; EP2440243A1; SG176091A1; AU2010257539A1; EA201190285A1; JP2012529465A; ZA201108504B; WO2010142686A1; BRPI1013051A2; KR20120031498A; US20120093921A1; IL216028A0; CN102802660A; GB0910045D0

Abstract

Se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno, en donde la concentración de cloruro de sodio o la concentración iónica de la composición es menor de 100 mM, y su uso en medicina.

Description

COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS QUE TIENEN UNA BAJA CONCENTRACIÓN DE CLORURO DE SODIO Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de proteína y que tienen concentraciones de cloruro de sodio en o por debajo de 100 mM. La presente invención también se refiere a las composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno o una preparación de antígeno, y las cuales además comprenden uno o más inmunoest ¡mulantes.

Antecedentes de la Invención La formulación de los antígenos de proteína es extremadamente importante para asegurar que se mantenga la inmunogenicidad. Los inmunoestimulantes se utilizan algunas veces con el fin de mejorar la respuesta inmunitaria producida a cualquier antígeno dado. Sin embargo, la inclusión de adyuvantes en una vacuna o en la composición inmunogénica aumenta la complejidad de la preparación de los componentes, así como la complejidad de la distribución y formulación de la composición de vacuna. La preparación de cada uno de los componentes adyuvantes, así como el componente antigénico, deben ser considerados por los formuladores. En particular, se debe considerar la compatibilidad del componente antigénico con el componente adyuvante. Éste es en particular el caso en donde se pretende que los antígenos o las preparaciones antigénicas liofilizadas se reconstituyan con una preparación de adyuvante. En esta circunstancia, es importante que el regulador de la preparación de adyuvante sea adecuado para el antígeno o para la preparación antigénica, y que la inmunogenicidad o la solubilidad del antígeno no sea afectada por el adyuvante.

Los antígenos de proteína PRAME y NY-ESO-1 (descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US5830753 y US5804381, respectivamente), o los fragmentos o los derivados de los mismos, son los antígenos de proteína de un beneficio potencial para el tratamiento de cáncer.

Breve Descripción de la Invención Los presentes inventores han encontrado que algunos antígenos, tales como PRAME y NY-ESO-1, son particularmente sensibles a un fenómeno conocido como "extracción cón sal", el cual se puede definir como la precipitación de una proteína a partir de su solución mediante su saturación con una sal, tal como cloruro de sodio. Los presentes inventores han encontrado que estos antígenos se aglomeran y se precipitan en una concentración de cloruro de sodio tan baja como de 150 mM.

De conformidad con lo anterior, en una modalidad, el antígeno o la preparación antigénica es cualquier antígeno que se precipite, se coagule, o se aglomere después de disolverse en una solución que comprende una concentración de cloruro de sodio (NaCI) o con una concentración iónica mayor de 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó 100 mM.

La presente invención proporciona una composición inmunogénica, la cual comprende PRAME o NY-ESO-1, en donde la concentración de cloruro de sodio en esta composición es menor de 100 mM.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Curva de actividad lítica de QS21.

Figura 2. Porcentaje de cada congénere de 3D-MPL en las diferentes formulaciones de ASA.

Figura 3. Ciclo de secado por congelación empleado para la liofilización de PRAME/CpG.

Figura 4. Una comparación pictórica entre PRAME y NYESO-1 reconstituidos en ASA (NaCI 150 mM), y ASA (sorbitol).

Figura 5. Respuesta humoral de los ratones inmunizados con PRAME/CpG formulada con diferentes composiciones de adyuvante en el Experimento 1.

Figura 6. Protección contra tumores en los ratones inmunizados con PRAME/CpG formulada con diferentes composiciones de adyuvante en el Experimento 1.

Figura 7. Respuesta humoral de los ratones inmunizados con PRAME/CpG formulada con ASA (NaCI 150 mM), ASA (sorbitol) o la formulación líquida de ASA en el Experimento 2.

Figura 8. Respuesta de CD4+ de los ratones inmunizados con PRAME/CpG formulada con ASA (NaCI 150 mM), ASA (sorbitol) o la formulación líquida de ASA en el Experimento 2.

Figura 9. Protección contra tumores en los ratones inmunizados con PRAME/CpG formulada con ASA (NaCI 150 mM), ASA (sorbitol) o la formulación líquida de ASA en el Experimento 2. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno como se describe en la presente, en donde la concentración de cloruro de sodio es menor de 100 mM. En particular, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno, en donde la concentración de cloruro de sodio está por debajo de aproximadamente 100 mM, por ejemplo, por debajo de aproximadamente 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM ó 15 mM. En una modalidad particular, la concentración de cloruro de sodio en la composición inmunogénica está por debajo de 10 mM o está en o por debajo de 5 mM. En una modalidad específica adicional, la composición inmunogénica está esencialmente libre de cloruro de sodio. Esencialmente libre significa que la concentración de cloruro de sodio está en o muy cerca de cero mM.

La persona experta puede probar fácilmente la concentración de iones tanto de sodio (Na+) como de cloruro (Cl"), utilizando las técnicas y los kits conocidos. Por ejemplo, el sodio se puede determinar utilizando un kit, tal como el Kit de Ensayo Enzimático de Sodio (Número de Catálogo: BQ011EAEL) de Biosupply. El cloruro se puede determinar utilizando un kit, tal como el Kit de Ensayo Enzimático de Cloruro (Número de Catálogo: BQ006EAEL) de Biosupply.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno como se describe en la presente, en donde la concentración iónica es menor de 100 mM, por ejemplo, está por debajo de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM ó 15 mM. En una modalidad particular, la concentración iónica en la composición inmunogénica está por debajo de 10 mM, o está en o por debajo de 5 mM. En una modalidad específica adicional, la composición inmunogénica tiene una concentración iónica que está en o muy cerca de cero mM (es decir, 1, 2, 3 mM).

La concentración iónica del adyuvante o de la composición inmunogénica de la invención, se puede medir empleando las técnicas conocidas por la persona experta, por ejemplo, utilizando un medidor de conductividad.

De conformidad con lo anterior, en una modalidad, el antígeno o la preparación antigénica es cualquier antígeno que se precipite, se coagule, o se aglomere después de disolverse en una solución que comprende una concentración de cloruro de sodio (NaCI), o en donde la concentración iónica de la solución sea mayor de 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó 100 mM. La persona experta en la materia puede determinar si un antígeno cumple con esta definición mediante la disolución y/o la mezcla de un antígeno en esta solución. Un antígeno que no cumpla con esta definición, todavía estará en solución, es decir, el líquido todavía estará transparente sin precipitación, 24 horas después de disolverse y/o de mezclarse. Un antígeno que se precipita, se coagula, o se aglomera después de disolverse en una solución que comprende una concentración de cloruro de sodio de 100 mM, es uno que, después de 24 horas o menos, se puede ver que se está precipitando, por la nebulosidad de la solución. En adición, la aglomeración que no es detectable visualmente se puede observar empleando los métodos conocidos por la persona experta, los cuales incluyen, pero no se limitan a, SEC-HPLC.

En una modalidad, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno, en donde la concentración de cloruro de sodio es menor de 100 mM, por ejemplo, por debajo de aproximadamente 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 15 mM, 10 ó 5 mM, y en donde el antígeno es PRAME (también conocido como DAGE) o un fragmento o un derivado del mismo.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno, en donde la concentración iónica de esta composición es menor de 100 mM, por ejemplo, está por debajo de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM ó 15 mM, y en donde el antígeno es PRAME (también conocido como DAGE), o un fragmento o un derivado del mismo. En una modalidad particular, la concentración iónica en la composición inmunogénica está por debajo de 10 mM, o está en o por debajo de 5 mM, y en donde el antígeno es PRAME o un fragmento o un derivado del mismo.

El antígeno y su preparación se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,830,753. El PRAME se encuentra en la base de datos Annotated Human Gene Datábase H-Inv DB bajo los números de acceso: U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1, y CR620272.1.

También se pueden utilizar las proteínas de fusión que comprenden el antígeno PRAME. El PRAME o un fragmento o un derivado del mismo, se puede emplear, opcionalmente en la forma de una proteína de fusión con un componente de fusión heterólogo. En particular, el antígeno PRAME se puede emplear adecuadamente en la forma de una proteína de fusión con la proteína D de Haemophilus influenzae B, o una porción de la misma, o un derivado de la misma. La porción de la proteína D que se puede emplear de una manera adecuada no incluye la secuencia de secreción o la secuencia de señal. De una manera adecuada, la proteína del componente de fusión comprende los aminoácidos Met-Asp-Pro en o dentro del término N de la secuencia de la proteína de fusión, y en donde la proteína del componente de fusión no incluye la secuencia de secreción o la secuencia de señal de la proteína D. Por ejemplo, la proteína del componente de fusión puede comprender o puede consistir en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 17 a 127, 18 a 127, 19 a 127, ó 20 a 127 de la proteína D. Los antígenos PRAME adecuados basados en proteínas de fusión con la proteína D, se describen en la Publicación Internacional Número WO2008/ 087102, cuyo documento se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno, en donde la concentración de cloruro de sodio es menor de 100 mM, por ejemplo, por debajo de aproximadamente 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 15 mM, 10 ó 5 mM, y en donde el antígeno es NY-ESO-1 o un fragmento o un derivado del mismo.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno, en donde la concentración iónica de estas composiciones es menor de 100 mM, por ejemplo, está por debajo de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM ó 15 mM, y en donde el antígeno es NY-ESO-1 o un fragmento o un derivado del mismo. En una modalidad particular, la concentración iónica en la composición inmunogénica está por debajo de 10 mM, o está en o por debajo de 5 mM, y en donde el antígeno es NY-ESO-1 o un fragmento o un derivado del mismo.

El NY-ESO-1 puede ser de longitud completa, o se puede emplear un fragmento o un derivado del mismo, opcionalmente en la forma de una proteína de fusión con un componente de fusión heterólogo. El NY-ESO-1 se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US5804381, cuyo documento se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. La proteína NY-ESO-1 es de aproximadamente 180 aminoácidos de longitud, y se puede describir como compuesta de tres regiones: (a) una región N-terminal que está alrededor de los aminoácidos 1 a 70, (b) una región central que está alrededor de los aminoácidos 71 a 134, y (c) una región C-terminal que está alrededor de los aminoácidos 135 a 180. El NY-ESO-1 se puede emplear como una proteína de fusión, por ejemplo, como una fusión con LAGE-1 o con un fragmento del mismo, véase la Publicación Internacional Número WO2008/089074, cuyo documento se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Cuando se emplean los fragmentos de NY-ESO-1, éstos incluyen adecuadamente uno o más epítopos MHC Clase 1 o Clase 2, por ejemplo, aquéllos conocidos como A31, DR1, DR2, DR4, DR7, DP4, B35, B51, Cw3, Cw6 y A2 (véase la Publicación Internacional Número WO2008/089074).

Aunque no es sensible al NaCI como tal, un antígeno adicional que se puede emplear de acuerdo con la presente invención es un antígeno MAGE, por ejemplo, de la familia MAGE-3, tal como MAGE-A3. Los antígenos MAGE-3, por ejemplo, se han descrito como adecuados para formularse en combinación con NY-ESO-1 - véase la Publicación Internacional Número WO2005/105139, cuyo documento se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Los antígenos MAGE, tales como MAGE-A3, se pueden utilizar como tales o en la forma de un derivado, por ejemplo, un derivado químicamente modificado y/o en la forma de una proteína de fusión con un componente de fusión heterólogo. Por ejemplo, el antígeno MAGE puede contener puentes de disulfuro reducidos para formar tioles libres, los cuales se hayan derivado, por ejemplo, con grupos carboxamida o carboxi-metilo , véase la Publicación Internacional Número WO99/40188, cuyo documento se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. En particular, los antígenos MAGE se pueden emplear adecuadamente en la forma de una proteína de fusión con la proteína D de Haemophilus influenzae B, o una porción de la misma, o un derivado de la misma. Por ejemplo, aproximadamente la primera tercera parte de la proteína D o los 100 a 110 aminoácidos N-terminales de la proteína D se pueden emplear como el componente de fusión, véase la Publicación Internacional Número WO99/40188.

En una modalidad adicional, el antígeno o la composición antigénica puede ser un derivado de cualquiera de los antígenos descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "derivado" se refiere a un antígeno que se modifica en relación con su forma que se presenta naturalmente. Los derivados de la presente invención son suficientemente similares a los antígenos nativos para conservar las propiedades antigénicas y seguir siendo capaces de permitir que se proporcione una respuesta inmunitaria contra el antígeno nativo. El que un derivado dado proporcione o no dicha respuesta inmunitaria se puede medir mediante un ensayo inmunológico adecuado, tal como un ELISA o citometría de flujo.

El término "fragmento", como se utiliza en la presente, se refiere a los fragmentos de un antígeno asociado con tumor o un derivado del antígeno que contenga cuando menos un epítopo, por ejemplo, un epítopo de CTL, típicamente un péptido de cuando menos 8 aminoácidos. Se considera que los fragmentos de cuando menos 8, por ejemplo, de 8 a 10 aminoácidos, o de hasta 20, 50, 60, 70, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud, caen dentro del alcance de la invención, siempre que el fragmento demuestre antigenicidad, es decir, que el fragmento conserve los epítopos mayores (por ejemplo, los epítopos CTL), y que el fragmento sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria que reaccione cruzadamente con el antígeno asociado con tumor que se presente naturalmente. Los fragmentos de ejemplo pueden ser de 8 a 10, de 10 a 20, de 20 a 50, de 50 a 60, de 60 a 70, de 70 a 100, de 100 a 150, o de 150 a 200 residuos de aminoácidos de longitud (inclusive cualquier valor dentro de estos intervalos).

Las composiciones inmunogénicas pueden comprender uno o más antígenos adicionales.

Es bien sabido que, para su administración parenteral, las soluciones deben ser fisiológicamente isotónicas (es decir, deben tener una osmolaridad farmacéuticamente aceptable), para evitar la distorsión o la lisis celular. Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que es fisiológicamente tolerado e imparte una tonicidad adecuada a una formulación (por ejemplo, las composiciones inmunogénicas de la invención), para prevenir el flujo de agua neto a través de las membranas celulares que estén en contacto con la formulación.

En términos generales, se utiliza cloruro de sodio (NaCI) como un agente de tonicidad. Los presentes inventores han demostrado que ciertos antígenos son particularmente sensibles a "la extracción con sal", un proceso en donde se aglomeran o se coagulan las proteínas en solución cuando están en soluciones que contienen altas concentraciones de sal; y los medios alternativos para la elaboración de las composiciones inmunogénicas de la invención, descritas en la presente como isotónicas.

En una modalidad particular, se proporcionan composiciones inmunogénicas que además comprenden un agente de isotonicidad no iónico. Un agente de isotonicidad no iónico adecuado para utilizarse en una composición inmunogénica necesitará ser adecuado para utilizarse en los seres humanos, así como necesitará ser compatible con los antígenos dentro de la composición antigénica y además compatible con otros componentes, tales como los inmuno estimulan tes.

En una modalidad de la presente invención, los agentes de isotonicidad no iónicos adecuados son los polioles, azúcares (en particular sacarosa, fructosa, dextrosa o glucosa), o aminoácidos, tales como glicina. En una modalidad, el poliol es un alcohol de azúcar, en especial un alcohol de azúcar de 3 a 6 átomos de carbono. Los alcoholes de azúcar de ejemplo incluyen glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, sorbitol, manitol, dulcitol y iditol. En un ejemplo específico de esta modalidad, un agente de isotonicidad no iónico adecuado es sorbitol. En una modalidad particular de la invención, el agente de isotonicidad no iónico de las composiciones de la invención es sacarosa y/o sorbitol.

En una modalidad, una concentración adecuada de poliol dentro de la composición inmunogénica es de entre aproximadamente el 3 y aproximadamente el 15 por ciento (peso/volumen), en particular de entre aproximadamente el 3 y aproximadamente el 10 por ciento (peso/volumen), por ejemplo, de entre aproximadamente el 3 y aproximadamente el 7 por ciento (peso/volumen), por ejemplo, de entre aproximadamente el 4 y aproximadamente el 6 por ciento (peso/volumen). En un ejemplo específico de esta modalidad, el poliol es sorbitol.

En una modalidad particular de la invención, la composición inmunogénica comprende uno o más inmunoestimulantes.

En una modalidad, este inmunoestimulante puede ser una saponina. Una saponina particularmente adecuada para utilizarse en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada a partir del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina y fue primeramente descrita por Daisgaard y colaboradores, en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Volumen 44,. Springer Verlag, Berlín, páginas 243-254) por tener actividad de adyuvante. Se han aislado fragmentos purificados de Quil A mediante HPLC que conservan actividad de adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (Patente Europea Número EP 0 362 278), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural derivada a partir de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce a las células-T citotóxicas (CTLs) CD8+, a las células Th1, y una respuesta de anticuerpo lgG2a predominante. QS21 es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

En una forma adecuada de la presente invención, el adyuvante de saponina dentro de la composición inmunogénica es un derivado de saponaria molina quil A, de preferencia una fracción inmunológicamente activa de Quil A, tal como QS-17 o QS-21, de una manera adecuada QS-21.

En una modalidad específica, QS21 se proporciona en su composición menos reactogénica, en donde se apaga con un esterol exógeno, tal como colesterol, por ejemplo. Existen varias formas particulares de composiciones menos reactogénicas en donde QS21 se apaga con un colesterol exógeno. En una modalidad específica, la saponina/esterol está en la forma de una estructura de liposoma (Publicación Internacional Número WO 96/33739, Ejemplo 1). En esta modalidad, los liposomas de una manera adecuada contienen un I íp ido neutro, por ejemplo, fosfatidil-colina, la cual es adecuadamente non-cristalina a temperatura ambiente, por ejemplo, fosfatidil-colina de yema de huevo, fosfatidil-colina de yema de dioleoílo (DOPC) o fosfatidil-colina de dilaurilo. Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura del liposoma-QS21 para los liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado es adecuadamente del 1 al 20 por ciento en peso/peso, de preferencia del 5 al 10 por ciento. La proporción del esterol al fosfolípido es del 1 al 50 por ciento (mol/mol), de una manera adecuada del 20 al 25 por ciento.

Los esteróles adecuados incluyen ß-sitosteroi, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una modalidad particular, la composición inmunogénica comprende colesterol como el esterol. Estos esteróles son bien conocidos en la materia, por ejemplo, el colesterol se da a conocer en el Merck Index, 11a Edición, página 341, como un esterol que se presenta naturalmente, el cual se encuentra en la grasa animal.

Cuando la fracción de saponina activa es QS21, la proporción de QS21 esterol típicamente será del orden de 1:100 a 1:1 (peso/peso), de una manera adecuada de entre 1:10 y 1:1 (peso/peso), y de preferencia de entre 1:5 y 1:1 (peso/peso). De una manera adecuada, está presente un exceso de esterol, siendo la proporción de QS21:esterol de cuando menos 1:2 (peso/peso). En una modalidad, la proporción de QS21:esterol es 1:5 (peso/peso). El esterol es adecuadamente colesterol.

En otra modalidad, la composición inmunogénica comprende un inmunoestimulante, el cual es un agonista del receptor 4 tipo Toll (TLR4). "Agonista de TLR" significa el componente que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de una senda de señalización de TLR, ya sea como un ligando directo, o bien indirectamente a través de la generación de un ligando endógeno o exógeno (Sabroe y colaboradores, Jl 2003, página 1630-5). Un agonista de TLR4 es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de una senda de señalización de TLR-4. Un ejemplo adecuado de un agonista de TLR4 es un lipopolisacárido, de una manera adecuada, un derivado no tóxico del lípido A, en particular monofosforilo-lípido A, o más particularmente, monofosforilo-lípido A 3-desacilado (3D - MPL).

El 3D-MPL es vendido bajo el nombre de MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y es referido a través de todo el documento como MPL ó 3D-MPL. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094. El 3D-MPL promueve primordialmente las respuestas de células-T CD4+ con un fenotipo de IFN-g (Th1). El 3D-MPL se puede producir de acuerdo con los métodos que se dan a conocer en la Patente Británica Número GB 2 220 211 A. Químicamente, es una mezcla de monofosforilo-lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. En las composiciones de la presente invención, el 3D-MPL de partículas pequeñas se puede utilizar para preparar la composición inmunogénica. El 3D-MPL de partículas pequeñas tiene un tamaño de partículas tal que se puede filtrar para esterilizarse a través de un filtro de 0.22 mieras. Estas preparaciones se describen en la Publicación Internacional Número WO 94/21292. De preferencia, se utiliza el 3D-MPL en polvo para preparar las composiciones inmunogénicas de la presente invención.

Otros agonistas de TLR4 que se pueden utilizar son los fosfatos de alquil-glucosamidina (AGPs), tales como aquéllos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO98/50399 o en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,303, 347 (también se dan a conocer los procesos para la preparación de AGPs), de una manera adecuada RC527 o RC529, o las sales farmacéuticamente aceptables de los fosfatos de alquil-glucosamidina (AGPs), como se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,764,840. Algunos fosfatos de alquil-glucosamidina (AGPs) son los agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Se piensa que ambos son útiles como inmunoestimulantes.

Otros agonistas de TLR-4 adecuados son como se describen en la Publicación Internacional Número WO2003/011223 y en la Publicación Internacional Número WO 2003/099195, tales como el compuesto I, el compuesto II y el compuesto III que se dan a conocer en las páginas 4-5 de la Publicación Internacional Número WO2003/011223 o en las páginas 3-4 de la Publicación Internacional Número WO2003/099195, y en particular los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO2003/011223 como ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057m ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 y ER804764. Por ejemplo, un agonista de TLR-4 adecuado es el ER804057.

En una modalidad particular, la composición inmunogénica comprende tanto saponina como un agonista de TLR4. En un ejemplo específico, la composición inmunogénica comprende QS21 y 3D-MPL.

Un agonista de TLR-4, tal como un lipopolisacárido, tal como el 3D-MPL, se puede utilizar en cantidades de entre 1 y 100 microgramos por dosis humana de la composición inmunogénica. El 3D-MPL se puede utilizar en un nivel de aproximadamente 50 microgramos, por ejemplo, de entre 40 y 60 microgramos, de una manera adecuada de entre 45 y 55 microgramos, o de entre 49 y 51 microgramos, o de 50 microgramos. En una modalidad adicional, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL en un nivel de aproximadamente 25 microgramos, por ejemplo, de entre 20 y 30 microgramos, adecuadamente de entre 21 y 29 microgramos, o de entre 22 y 28 microgramos, o de entre 28 y 27 microgramos, o de entre 24 y 26 microgramos, o de 25 microgramos.

Una saponina, tal como QS21, se puede utilizar en cantidades de entre 1 y 100 microgramos por dosis humana de la composición inmunogénica. El QS21 se puede utilizar en un nivel de aproximadamente 50 microgramos, por ejemplo, de entre 40 y 60 microgramos, de una manera adecuada de entre 45 y 55 microgramos, o de entre 49 y 51 microgramos, o de 50 microgramos. En una modalidad adicional, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende QS21 en un nivel de aproximadamente 25 microgramos, por ejemplo, de entre 20 y 30 microgramos, adecuadamente de entre 21 y 29 microgramos, o de entre 22 y 28 microgramos, o de entre 28 y 27 microgramos, o de entre 24 y 26 microgramos, o de 25 microgramos.

Cuando están presentes tanto el agonista de TLR4 como la saponina en la composición inmunogénica, entonces la proporción en peso del agonista de TLR4 a la saponina, es adecuadamente de entre 1:5 y 5:1, de una manera adecuada de 1:1. Por ejemplo, cuando el 3D-MPL está presente en una cantidad de 50 microgramos o de 25 microgramos, entonces, de una manera adecuada, el QS21 también puede estar presente en una cantidad de 50 microgramos o de 25 microgramos, respectivamente, por dosis humana de la composición inmunogénica.

En una modalidad, el inmunoestimulante es un agonista de TLR9, por ejemplo, como se estipula en la Publicación Internacional Número WO 2008/142133. En un ejemplo específico, el agonista de TLR9 es un oligonucleótido inmunoestimulante, en particular un oligonucleótido que contiene un motivo CpG no metilado. Estos oligonucleótidos son bien conocidos, y se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 96/02555, en la Publicación Internacional Número WO 99/33488, y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 5,865, 462. Los agonistas de TLR9 adecuados para utilizarse en las composiciones ¡nmunogénicas descritas en la presente, son los oligonucleótidos que contienen CpG, que opcionalmente contienen dos o más motivos de dinucleótidos CpG separados por cuando menos tres, de una manera adecuada cuando menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG es un nucleotido de citosina seguido por un nucleotido de guanina.

En una modalidad, el enlace internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o posiblemente un enlace de fosforotioato, aunque también se podrían utilizar los enlaces de fosfodiéster y otros enlaces internucleótidos, incluyendo los oligonucleótidos con enlaces internucleótidos mixtos. Los métodos para producir los oligonucleótidos de fosforotioato o de fosforoditioato se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US5,666,153 y US5,278,302, y en la Publicación Internacional Número WO95/26204. Se contemplan oligonucleótidos que comprenden diferentes enlaces internucleótidos, por ejemplo, fosforotioato-fosfodiésteres mixtos. Se pueden utilizar otros enlaces internucleótidos que estabilicen el oligonucleótido.

Los ejemplos de los oligonucleótidos de CpG adecuados para incluirse en las composiciones inmunogénicas descritas en la presente, tienen las siguientes secuencias. En una modalidad, estas secuencias contienen enlaces internucleótidos modificados por fosforotioato.

OLIGO 1 (SEQ ID NO: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) Los oligonucleótidos de CpG alternativos pueden comprender las secuencias anteriores, porque tienen supresiones o adiciones inconsecuenciales a las mismas.

En una modalidad, el inmunoestimulante es un tocol. Los tocóles son bien conocidos en la materia, y se describen en la Patente Europea Número EP0382271. En una modalidad particular, el tocol es alfa-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (también conocido como succinato de Vitamina E).

La presente invención también proporciona un proceso para la elaboración de una composición inmunogénica de la invención, el cual comprende los pasos de: a. Liofilizar un antígeno como se describe en la presente, opcionalmente con un oligonucleótido inmunoestimulante como se describe en la presente; y b. Reconstituir la composición liofilizada del paso a) con una composición adyuvante acuosa, en donde la concentración de NaCI o la concentración iónica de la composición adyuvante acuosa es menor de 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20mM, 15 mM ó 10 mM.

En una modalidad particular, el antígeno liofilizado es cualquier antígeno que se precipite, se coagule, o se aglomere después de disolverse en una solución que comprende una concentración de cloruro de sodio, o en una solución con una concentración iónica mayor de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó 100 mM. En una modalidad adicional, el antígeno liofilizado se selecciona a partir del grupo de PRAME o NY-ESO-1.

En una modalidad, la composición adyuvante del paso b) (anterior) comprende una saponina y/o un agonista de TLR-4 como se describe en la presente, por ejemplo, QS21 y/o 3D-MPL. En una modalidad adicional, la saponina y/o el agonista de TLR4 están en una formulación liposomal. En una modalidad, la composición adyuvante comprende un agonista de TLR4 y una saponina en una formulación liposomal, y un agente de isotonicidad no iónico como se describe en la presente. En particular, la composición adyuvante de la presente invención puede comprender sorbitol.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona un kit que comprende: a. un antígeno liofilizado, opcionalmente co-liof ilizado con CpG; y b. una composición adyuvante acuosa, en donde la concentración de NaCI o la concentración iónica es menor de 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 15 mM ó 10 mM.

En una modalidad particular de la invención, el antígeno en los kits como se describen en la presente, comprende cualquiera de PRAME o NY-ESO-1 y sus fragmentos y/o derivados.

En una modalidad alternativa, se proporciona un kit en donde el CpG no se co-liofiliza con el antígeno. El CpG se puede ya sea mezclar con la composición adyuvante acuosa, o bien puede estar en un frasco separado en una forma acuosa o liofilizada.

Los adyuvantes acuosos utilizados en los kits de la invención pueden ser cualquiera de las composiciones de adyuvante como se definen en la presente. En una modalidad específica de la invención, la composición adyuvante acuosa comprende un agonista de TLR4 y/o una saponina en la forma de liposomas. En una modalidad particular, el agonista de TLR4 es 3D-MPL, y la saponina es QS21. Los adyuvantes acuosos utilizados en la presente pueden comprender un agente de isotonicidad, por ejemplo, un poliol, tal como un sorbitol.

La presente invención proporciona además una composición inmunogénica como se describe en la presente, para utilizarse en el tratamiento inmunoterapéutico de cáncer.

En los ejemplos específicos de esta modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica como se describe en la presente, para utilizarse en el tratamiento inmunoterapéutico de uno o más cánceres seleccionados a partir del grupo que consiste en cánceres de próstata, de mama, colo-rectal, de pulmón, pancreático, renal, de ovario o melanoma.

La presente invención proporciona además un método de terapia o profilaxis de cáncer en un individuo que lo necesite, el cual comprende el paso de proporcionar al individuo, una cantidad efectiva de una composición inmunogénica como se describe en la presente.

En los ejemplos específicos de esta modalidad, la invención proporciona un método de terapia o profilaxis de un cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste en cánceres de próstata, de mama, colo-rectal, de pulmón, pancreático, renal, de ovario o melanoma.

La presente invención se describirá ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 : Preparación de la composición adyuvante de ASA (sorbitol) Se preparó una composición adyuvante que comprendía el MPL 3-desacilado y QS21 en una formulación liposomal. Ésta se preparó como sigue: A. Método de preparación de liposomas: Una mezcla de lípido (tal como fosfatidil-colina sintética), colesterol y MPL 3-O-desacilado en un solvente orgánico, se secó al vacío. Entonces se agregó una solución acuosa (tal como suero regulado con fosfato [NaCI 100 mM, Fosfato 20 mM, pH de 6.1]), y el recipiente se agitó hasta que todo el lípido estuvo en suspensión. Esta suspensión se pre-homogeneizó entonces con una mezcladora de alto esfuerzo cortante, y luego se homogeneizó a alta presión hasta que se redujo el tamaño de los liposomas hasta alrededor de 90 nanómetros +/- 10 nanómetros medidos mediante DLS. Entonces se filtraron los liposomas para esterilizarse.

B. Formulación de ASA: Paso 1: Dilución de liposomas concentrados Se agregó el regulador de Fosfato de Na2/K 100 mM, pH de 6.1, diluido 10 veces, a agua para inyección hasta alcanzar una concentración de regulador de fosfato 10 mM en la formulación final. Entonces se agregó una solución de sorbitol al 30 por ciento (peso/volumen) en agua para inyección (WFI), hasta alcanzar una concentración del 4.7 por ciento en la formulación final - ésta se agitó durante 15 a 45 minutos a temperatura ambiente.

Entonces se agregaron a la mezcla los liposomas concentrados (hechos de DOPC, colesterol y MPL a 40 miligramos/mililitro, 10 miligramos/mililitro, y 2 miligramos/mililitro, respectivamente), hasta alcanzar una concentración de 100 microgramos/mililitro de MPL en la formulación final.

La mezcla subsiguientemente se agitó durante 15 a 45 minutos a temperatura ambiente.

Paso 2: Adición de QS21 Utilizando una bomba peristáltica, se agregó un suministro a granel de QS21 (descongelado durante 24 horas a temperatura ambiente o durante 2 días a 4°C para 200 mililitros), con una bomba peristáltica, a una velocidad de 200 mililitros/minuto, a los liposomas diluidos, bajo agitación magnética, hasta alcanzar una concentración de 100 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó durante 15 a 45 minutos.

La formulación de ASA final contuvo 100 microgramos de MPL/mililitro, y 100 microgramos de QS21 /mililitro.

Paso 3: El pH se verificó en 6.1 +/- 0.3.

Paso 4: Filtración de esterilización La filtración de esterilización se llevó a cabo a una velocidad constante de 400 mililitros/minuto sobre un filtro de poliéter-sulfona (PES) de PALL Corporation.

Paso 5: Almacenamiento de +2°C a +8°C.

Se obtuvo la composición adyuvante, que comprendía el MPL 3-O-desacilado y QS21 en una formulación liposomal, y que contenía sorbitol (designado como ASA (sorbitol)), y entonces se almacenó a 4°C.

Ejemplo 2: Preparación de la composición adyuvante de ASA (NaCI 150 mM) A. Método de preparación de liposomas: Una mezcla de lípido (tal como fosfatidil-colina sintética), colesterol, y MPL 3-desacilado (3D-MPL) en un solvente orgánico se secó al vacío. Entonces se agregó suero regulado con fosfato, y el recipiente se agitó hasta que todo el lípido estuvo en suspensión. Esta suspensión se pre-homogeneizó entonces con una mezcladora de alto esfuerzo cortante, y luego se homogeneizó a alta presión hasta que se redujo el tamaño de los liposomas hasta alrededor de 90 nanómetros +/- 10 nanómetros medidos mediante DLS. Entonces se filtraron los liposomas para esterilizarse sobre una membrana de PES de 0.22 mieras.

B. Formulación de ASA: Paso 1: Dilución de liposomas concentrados Se agregó regulador de Fosfato de Na2/K 100 mM, pH de 6.45, diluido 10 veces, y NaCI 1.5 M, a agua para inyección, hasta alcanzar respectivamente las concentraciones de fosfato 10 mM y de NaCI 150 mM en la formulación final. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agregaron a la mezcla los liposomas concentrados (hechos de DOPC, colesterol, y MPL a 40 miligramos/mililitro, 10 miligramos/mililitro, y 2 miligramos/ mililitro, respectivamente), hasta alcanzar una concentración de 100 microgramos/mililitro de MPL en la formulación final. La mezcla subsiguientemente se agitó durante 5 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Paso 2: Adición de QS21 Se agregó el suministro a granel de QS21 (descongelado durante 24 horas a temperatura ambiente, o durante 2 días a 4°C para 200 mililitros) a los liposomas diluidos, bajo agitación magnética, hasta alcanzar una concentración de 100 microgramos/ mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó a temperatura ambiente.

Paso 3: El pH se verificó para ser de 6.1 +/- 0.1.

Paso 4: Filtración de esterilización La filtración de esterilización se llevó a cabo sobre un filtro de poliéter-sulfona (PES) de PALL Corporation.

Paso 5: Almacenamiento de + 2°C a +8°C La composición final de ASA fue de 2 miligramos de DOPC, 500 microgramos de colesterol, 100 microgramos de MPL 3-O-desacilado, y 100 microgramos de QS21 por 1 mililitro.

Ejemplo 3. Actividad lítica del QS21 Se sabe que el QS21 lisa los glóbulos rojos sanguíneos (RBC). Se probó la composición adyuvante de ASA (sorbitol) preparada como en el Ejemplo 1, para asegurar que se apagara la actividad lítica del QS21, de la misma manera en que se vio con la composición adyuvante equivalente, la cual comprendía NaCI 150 mM (ASA (NaCI 150 mM)).

La actividad lítica del QS21 se midió mediante un ensayo de hemolisis utilizando glóbulos rojos sanguíneos de pollo (RBC). Los RBC se centrifugaron a 550 g a 4°C. El sobrenadante se desechó. El aglomerado se volvió a suspender cuidadosamente en regulador de suero regulado con fosfato hasta alcanzar el volumen inicial, y se repitió la misma operación hasta que el sobrenadante ya no fue rojo (en términos generales, 3 veces). El aglomerado se almacenó a 4°C durante 3 a 4 días como máximo si no se utilizaba directamente (y se lavó de nuevo el día de su uso), o se diluyó alrededor de 10 veces en el regulador si se usaba el mismo día! Se preparó una curva de intervalo de dosis de QS21 en regulador de ASA (en sal o en regulador de sorbitol en seguida de la prueba de la muestra de ASA) extemporáneamente, y se prepararon las muestras de adyuvante (que contenían un equivalente de 50 microgramos o de 90 microgramos de QS21, significando el equivalente de 500 microlitros o de 900 microlitros de ASA). El volumen final se ajustó a 900 microlitros en los estándares y en las muestras con un regulador adecuado (que contenía o no, sorbitol como una función del regulador de la muestra probada). Debido a su opalescencia, el ASA interfiere en la densidad óptica (OD). Por consiguiente, se prepararon "controles de referencia" de ASA, y se sustrajo su densidad óptica (OD) de la densidad óptica (OD) de las muestras de ASA probadas. Estos controles de referencia correspondieron al mismo volumen de ASA que el volumen probado en las muestras, pero se ajustaron a 1 mililitro con el regulador. No se agregaron glóbulos rojos sanguíneos (RBC) a estos controles de referencia. Los estándares y las muestras se incubaron entonces con los glóbulos rojos sanguíneos (RBC) (se agregaron 100 microlitros de glóbulos rojos sanguíneos (RBC) diluidos a 900 microlitros de los estándares y las muestras) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Las muestras se centrifugaron entonces durante 5 minutos a 900 g. La densidad óptica a 540 nanómetros se midió después de la centrifugación.

La determinación de la actividad lítica se llevó a cabo mediante una prueba de límite. 1. El límite de detección (LOD) se definió como la concentración más baja de QS21 que conduce a una densidad óptica (OD): - Más alta que el nivel basal (OD>0.1).

Alrededor de tres veces más alta que la densidad óptica (OD) del regulador (la "o Mg" de QS21).

En la parte ascendente de la curva.

- Determinada para cada prueba. 2. La actividad lítica del QS21 se mantuvo positiva en las muestras de adyuvante si la densidad óptica (OD) para la muestra de adyuvante era mayor de la ODLOD- Ejemplo de la curva de QS21 de QS21 OD QS21 apagado 0 0.029 NA 0.5 0.052 < LOD 0.6 0.073 < LOD 0.7 0.091 < LOD 0.8 0.096 < LOD 0.9 0.12 > 98.2% 1 0.195 > 98% 1.1 0.212 > 97.8% 1.2 0.348 > 97.6% 1.3 0.479 > 97.4% 1.4 0.612 > 97.2% 1.5 0.669 > 97% 2 1.139 > 96% g de QS21 OD QS21 apagado 2.5 1.294 > 95% 3 1.391 > 94% 5 1.416 > 90% Adyuvante * 0.03 > 98.2% * Equivalente a 50 microgramos de QS21 probado. Regulador de cloruro de sodio 150 mM.

El Límite de Detección en este ensayo está en 0.9 microgramos de QS21, y a una densidad óptica (OD) de 0.12.

Se estimó que el apagado del QS21 en una composición adyuvante, la cual comprendía cloruro de sodio 150 mM, era mayor del 98.2 por ciento para el equivalente de 50 microgramos de QS21 probado. En el caso de un equivalente de 90 microgramos probado, la conclusión es mayor del 99 por ciento.

Entonces se comparó el apagado del QS21 con una composición adyuvante equivalente, la cual comprendía sorbitol y solamente 5 mM de cloruro de sodio. Los datos se generaron después del almacenamiento del ASA a 4°C o después de la estabilidad acelerada (7 días a 37°C). Para el ASA en sorbitol, la curva estándar de QS21 se llevó a cabo en un regulador que contenía sorbitol.

Punto del Muestra LOD QS21 apagado tiempo Composición TO < 1.4 > 97.2% adyuvante (ASA) NaCI 150 mM 7d 37°C < 0.9 > 98.2% Composición adyuvante (ASA) TO < 2 > 97.8% sorbitol, NaCI 5 mM 7d 37°C <1 > 96% 11 M 4°C <2 > 97.8%* Equivalente de 50 microgramos de QS21 probado excepto * equivalente de 90 microgramos de QS21 probado.

Se concluyó que el QS21 se apagaba adecuadamente en un regulador bajo en cloruro de sodio.

Ejemplo 4: Congéneres de MPL.

Químicamente, el 3D-MPL es una mezcla de monofosforilo-lípido A 3-desacilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Cada molécula de 3D-MPL separada se denomina como un congénere. Es importante que la composición congénere siga siendo constante, sin cambios entre la proporción de los congéneres. También es importante que cualquier regulador utilizado haga posible que la composición congénere sea la misma que en los liposomas concentrados utilizados para elaborar la composición adyuvante.

Como se muestra en la Figura 2, la composición congénere se examinó en liposomas 3D-MPL concentrados (Liposomas concentrados LIP07-217, primera columna de la Figura 2), una composición adyuvante, la cual comprendía los liposomas 3D-MPL y QS21 en un regulador de NaCI 150 mM (Adyuvante de NaCI 150 mM, o ASA (NaCI 150 mM), segunda columna), y una composición adyuvante, la cual comprendía los liposomas 3D-MPL y QS21 en un regulador de sorbitol y NaCI 5 mM (Adyuvante de Sorbitol, o ASA (sorbitol), columnas 3-7).

La composición congénere también se examinó en dos lotes de adyuvante de ASA (sorbitol) en el día 0, y 7 días después de la preparación, y mantenimiento a 37°C para asegurar que no hubiera desprendimiento a través del tiempo (véanse las cuatro columnas finales de la Figura 2).

Se determinó la distribución relativa de los congéneres tetra-, penta- y hexa-acilados de MPL en los liposomas concentrados o en las muestras de ASA (sorbitol) mediante detección con IP-HPLC-Fluo (ARD). Tanto los estándares como las muestras se derivaron con dansil-hidrazina, la cual introduce un cromóforo Fluo-activo sobre la estructura base del disacárido. Las muestras derivadas se analizaron sobre una columna C18 en fase inversa, utilizando hidróxido de tetrabutil-amonio (TBAOH) as un reactivo de emparejamiento de iones. Los congéneres que contenían los mismos números de grupos acilo graso se eluyeron en distintos grupos (tetra-acilo, penta-acilo, y hexa-acilo). La distribución de los congéneres se deduce mediante la comparación el área pico de cada grupo con el área pico total de todos los congéneres de PL.

La Figura 2 muestra el porcentaje de cada congénere. No se encontró ninguna diferencia significativa en la composición de los congéneres entre los reguladores adyuvantes, y la composición congénere fue consistente a través del tiempo en el regulador de sorbitol.

Ejemplo 5; Preparación de composiciones y uso en los Ejemplos 6 Y 7. 5.1 Preparación de PRAME con CpG (en todos los Ejemplos se utiliza CpG 2006) 5.1.1 Preparación de PRAME con CpG con ASA ( aCl 150 mM) usada en el experimento 1 y en el experimento 2 del Ejemplo 6 y del Ejemplo 7 Una solución de sacarosa al 30 por ciento (peso/volumen) (preparada en agua para inyección) se agregó a agua para inyección hasta alcanzar una concentración de sacarosa del 5 por ciento. Entonces se agregó regulador Tris-HCI 100 mM, pH de 9.5, hasta alcanzar una concentración de regulador Tris de 75 mM. Luego se agregó regulador de borato 100 mM, pH de 9.8, hasta alcanzar una concentración de regulador de borato 5 mM. Entonces se agregó una solución de Poloxámero 188 al 10 por ciento (peso/volumen) (preparado en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración del 0.313 por ciento. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agregó una solución de CpG en una concentración de aproximadamente 20 miligramos/mililitro (en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración de 1,050 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó el antígeno PRAME, hasta alcanzar una concentración de proteína de 1,250 microgramos/ mililitro. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El pH se verificó (9.51). La mezcla obtenida se rellenó a 0.5 mililitros en frascos de vidrio de 3 mililitros, y entonces se secó por congelación.

La Figura 3 ilustra el ciclo de secado por congelación empleado para PRA E (duración = 40 horas).

La torta de la liofilización resultante se reconstituyó con 625 microlitros de la composición adyuvante acuosa preparada como en el Ejemplo 2, la cual comprendía NaCI 150 mM. La torta de la liofilización contenía un exceso de la dosis de antígeno de 1.25 veces, para tener la proporción correcta de antígeno/adyuvante después de la reconstitución con una composición final de Tris 16 mM, borato 4 mM, sacarosa al 4 por ciento, Poloxámero 188 al 0.24 por ciento, 840 microgramos/mililitro de CpG y 1,000 microgramos/ mililitro de PRAME. 5.1.2 Preparación de PRAME con CpG para la "formulación líquida" (NaCI 70 mM) en el Experimento 1 del Ejemplo 7.

Preparación concentrada de adyuvante El suero regulado con fosfato (PBS) mod concentrado 10 veces, pH de 6.1, cuando se diluyó 10 veces, se agregó a agua para inyección hasta alcanzar un regulador concentrado 1 vez en la formulación final. Por separado, se preparó una solución previamente mezclada hecha de liposomas y QS21 previamente diluidos a 400 microgramos/mililitro. La pre-mezcla se mezcló magnéticamente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los liposomas concentrados utilizados en la pre-mezcla se hacen de 40 miligramos/ mililitro de DOPC, 10 miligramos/mililitro de colesterol, y 2 miligramos/mililitro de MPL 3-desacilado. La pre-mezcla se agregó al suero regulado con fosfato (PBS) hasta alcanzar una concentración de MPL de 200 microgramos/mililitro, y una concentración de QS21 de 200 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agregó CpG a alrededor de 23 miligramos/ mililitro, hasta alcanzar una concentración final de 1,680 microgramos/mililitro. La mezcla se agitó magnéticamente durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. El pH se verificó para ser de 6.1 +/- 0.1. La sustancia activa (AS) se filtró sobre un filtro de PES de 0.22 mieras, y se almacenó a 4°C hasta su uso.

Formulación final Se agregaron sacarosa al 25 por ciento, borato 25 mM, pH de 9.8, y Lutrol al 10 por ciento, a agua para inyecciones (WFI), hasta alcanzar respectivamente el 9.25 por ciento, 5 mM, y el 0.24 por ciento en la formulación final. Se agregó la preparación de AS + CpG concentrada 2 veces, dando como resultado una concentración de 1 vez en la formulación final. La mezcla se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agregó el antígeno PRAME en sacarosa al 3.15 por ciento, y borato 5 mM, y la mezcla se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. 5.1.3 Preparación de PRAME con CpG para la "formulación líquida" en el Experimento 2 del Ejemplo 7.

Preparación concentrada de adyuvante El ASA para la formulación líquida se preparó como sigue. Se agregó regulador de fosfato 1M (pH de 6.1, diluido 100 veces), bajo agitación magnética, a agua para inyecciones (WFI), hasta alcanzar una concentración final de 45 mM, tomando en cuenta la concentración de fosfato 50 mM en los liposomas concentrados. Luego se agregó sorbitol al 35 por ciento, hasta alcanzar una concentración final del 21.15 por ciento. Se agregaron a la mezcla los liposomas concentrados hechos de 40 miligramos/mililitro de DOPC, 10 miligramos/mililitro de colesterol, y 2 miligramos/mililitro de MPL 3-desacilado, hasta alcanzar una concentración final de MPL de 450 microgramos/mililitro. Se agregó QS21 a granel (a alrededor de 5,000 microgramos/mililitro), hasta alcanzar una concentración final de QS21 de 450 microgramos/mililitro. La mezcla se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El pH se verificó y se ajustó a un pH de 6.1 +/- 0.1. La concentración final en este ASA fue, respectivamente, de 450 microgramos/mililitro para el MPL, de 450 microgramos/mililitro para el QS21, fosfato 45 mM, NaCI 22.5 mM, y sorbitol al 21.15 por ciento.

Formulación final Una solución de sacarosa al 30 por ciento (peso/volumen) (preparada en agua para inyección) se agregó a agua para inyección, hasta alcanzar una concentración de sacarosa del 4 por ciento en la formulación final. Entonces se agregó el regulador de Tris-HCI 1M, pH de 9.0, hasta alcanzar una concentración del regulador de Tris 16 mM en la formulación final. Luego se agregó el regulador de borato 100 mM, pH de 9.8, hasta alcanzar una concentración del regulador de borato 4 mM en la formulación final. Entonces se agregó la solución de Poloxámero 188 al 10 por ciento (peso/volumen) (preparado en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración del 0.24 por ciento en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó una solución de CpG en una concentración de aproximadamente 20 miligramos /mililitro (en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración de 840 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó el regulador de antígeno PRAME (Borato 5 mM - Sacarosa al 3.15 por ciento, pH de 9.8), para ajustar la concentración del antígeno PRAME a 1,000 microgramos/mililitro. Entonces se agregó el antígeno PRAME hasta alcanzar una concentración de proteína de 8 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se agregó la sustancia activa (AS) concentrada 4.5 veces en sorbitol, hasta alcanzar las concentraciones finales de 100 microgramos/mililitro de MPL y QS21. El pH se verificó (+/-8.0). 5.1.4 Preparación de PRAME con CpG para el ASA (sorbitol), y ASA (sacarosa) en el Experimento 1 del Ejemplo 7 Una solución de sacarosa al 30 por ciento (peso/volumen) (preparada en agua para inyección) se agregó a agua para inyección, hasta alcanzar una concentración de sacarosa del 5 por ciento en la formulación, entonces se agregó regulador de borato 100 mM, pH de 9.8, hasta alcanzar una concentración de regulador de borato 5 mM en esta formulación, luego se agregó regulador de Tris-HCI 100 mM, pH de 9.0, cuando se diluyó 20 veces, hasta alcanzar una concentración de regulador de Tris 5 mM en esta formulación. Luego se agregó una solución de Poloxámero 188 al 10 por ciento (peso/volumen) (preparado en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración del 0.3 por ciento en la formulación. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó una solución de CpG en una concentración de aproximadamente 20 miligramos/ mililitro (en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración de 1,050 microgramos/mililitro en la formulación. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó el antígeno PRAME, hasta alcanzar una concentración de proteína de 1,250 microgramos/ mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El pH se midió a 9.4. La mezcla obtenida se rellenó a 0.5 mililitros en frascos de vidrio de 3 mililitros, y entonces se secó por congelación.

El ASA (sorbitol) se preparó como se menciona en el Ejemplo 1 con algunas ligeras diferencias: la concentración de sorbitol fue del 4.6 por ciento, y el QS21 se diluyó previamente a 400 microgramos/ mililitro antes de agregarse a los liposomas diluidos concentrados.

El ASA (sacarosa) se preparó como se menciona en el Ejemplo 1, con las siguientes diferencias: el sorbitol es reemplazado por sacarosa (se utilizó una solución de suministro del 30 por ciento en peso/volumen de solución de sacarosa, y la concentración final de sacarosa es del 8.3 por ciento), y el QS21 se diluyó previamente a 400 microgramos/mililitro antes de agregarse a los liposomas diluidos concentrados.

La torta de la liofilización resultante se reconstituyó con 625 microlitros de la composición adyuvante acuosa, y la composición final comprendió Tris 4 mM, borato 4 mM, sacarosa al 4 por ciento, Poloxámero 88 al 0.24 por ciento, 840 microgramos/mililitro de CpG, y 1,000 microgramos/mililitro de PRAME. 5.1.5 Preparación de PRAME con CpG para el ASA (sorbitol) en el Experimento 2 del Ejemplo 7 Una solución de sacarosa al 30 por ciento (peso/volumen) (preparada en agua para inyección) se agregó a agua para inyección, hasta alcanzar una concentración de sacarosa del 5 por ciento en la formulación, entonces se agregó regulador de Tris-HCI 1M, pH de 9.0, cuando se diluyó 50 veces, hasta alcanzar una concentración de regulador de Tris 20 mM en esta formulación, luego se agregó regulador de borato 100 mM, pH de 9.8, cuando se diluyó 20 veces, hasta alcanzar una concentración de regulador de borato 5 mM en esta formulación, entonces se agregó una solución de Poloxámero 188 al 10 por ciento (peso/volumen) (preparado en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración del 0.3 por ciento en la formulación. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se agregó una solución de CpG en una concentración de aproximadamente 20 miligramos/mililitro (en agua para inyección), hasta alcanzar una concentración de 1,050 microgramos/mililitro en la formulación. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó el antígeno PRAME, hasta alcanzar una concentración de proteína de 1,250 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se agitó magnéticamente (150 revoluciones por minuto) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El pH se midió a 9.1. La mezcla obtenida se rellenó a 0.5 mililitros en frascos de vidrio de 3 mililitros; entonces se secó por congelación.

El sorbitol ASA se preparó como se describe en el Ejemplo 1. La torta de la liofilización resultante se reconstituyó con 625 microlitros de la composición adyuvante acuosa, y la composición final comprendió Tris 16 mM, borato 4 mM, sacarosa al 4 por ciento, Poloxámero 188 al 0.24 por ciento, 840 microgramos/mililitro de CpG, y 1,000 microgramos/mililitro de PRAME. 5.2 Preparación de NY-ES01 con CpG 5.2.1 Preparación de NY-ESQ1 con CpG en el Ejemplo 6.

Se agregó el regulador de Fosfato de Na/K2 200 mM, pH de 6.3, diluido 20 veces, bajo agitación magnética, a agua para inyección, hasta alcanzar 12.5 mM en la formulación final. Entonces se agregaron a la mezcla los siguientes excipientes, y en el siguiente orden: monotioglicerol al 10 por ciento en peso/volumen hasta alcanzar el 0.3125 por ciento final, Poloxámero 188 al 5 por ciento en peso/volumen, hasta alcanzar el 0.0625 por ciento, sacarosa al 25 por ciento hasta alcanzar el 5 por ciento final, y base de L-arginina 287 mM, hasta alcanzar 6.25 mM. Entonces se agregó a esta mezcla CpG a granel a alrededor de 20 miligramos/mililitro, hasta alcanzar una concentración de 1,050 microgramos/mililitro en la formulación final. La mezcla se mantuvo bajo agitación magnética (alrededor de 150 revoluciones por minuto) a temperatura ambiente durante 10 minutos. El pH se verificó para ser de 7.1 +/- 0.3. La agitación magnética se incrementó para crear un vórtex. Entonces se agregó NY-ES01 hasta alcanzar una concentración final de 750 microgramos/mililitro. La agitación magnética se redujo entonces hasta alrededor de 150 revoluciones por minuto, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se tomó una alícuota para verificar el pH final (que tiene que ser de 7.02). Entonces se secó por congelación el volumen final.

La torta de la liofilización resultante se reconstituyó con 625 microlitros de reguladores de ASA (NaCI 150 mM y sorbitol).

Ejemplo 6. Prevención de "extracción con sal" en la composición adyuvante, la cual comprendía sorbitol como el regulador.

La Figura 4 demuestra que la reducción de la concentración de sal hasta 5 mM e incluyendo sorbitol en la composición adyuvante, previene la "extracción con sal" de tanto PRAME como NY-ESO-1 en las composiciones inmunogénicas (como se prepararon en los Ejemplos 5.1.1 y 5.2.1, respectivamente). En la Figura 4: 1. Antígeno PRAME reconstituido en regulador ASA de NaCI 150 mM. 2. Antígeno PRAME reconstituido en regulador ASA de sorbitol. 3. Antígeno NYESO-1 reconstituido en regulador ASA de NaCI 150 mM. 4. Antígeno NYESO-1 reconstituido en regulador ASA de sorbitol.

La Figura 4 es una comparación fotográfica entre PRAME y NYESO-1 reconstituidos en ASA (NaCI 150 mM), y ASA (sorbitol). Como se puede ver, el PRAME reconstituido en ASA (NaCI 150 mM) aparece nebuloso comparándose con el PRAME reconstituido en ASA (sorbitol). De una manera similar, el NY-ESO reconstituido en ASA (NaCI 150 mM) aparece nebuloso comparándose con el antígeno NY-ESO reconstituido en ASA (sorbitol).

Ejemplo 7. Modelo de Ratón In Vivo Experimento 1 : Siete grupos de veinte ratones CB6f1 hembras (híbridos de ratones C57BL/6 y Balb/C) de 6 a 8 semanas de edad, se inmunizaron dos veces intra-muscularmente (cada dos semanas, en inyecciones alternadas en el músculo gastrocnemio izquierdo y derecho) con la proteína de PRAME formulada en una dosis fija de ASA +CpG que corresponden a 1/10 de una dosis humana (50 microlitros que contenían 5 microgramos de MPL, 5 microgramos de QS21, y 42 microgramos de CpG7909). 14 días después de la última inmunización, cuatro grupos de ratones (n = 8 en cada grupo) se estimularon subcutáneamente con células tumorales 10e5 CT26-PRAME, como se describe más adelante. Los siete grupos de ratones fueron: g rp 1 : regulador. grp2: PRAME + CpG co-liofilizados, re-suspendidos en el ASA "clásico" (NaCI 150 mM), en donde se precipita la proteína de PRAME. grp3: PRAME + CpG co-liofilizados, re-suspendidos en ASA (sacarosa). grp4: PRAME + CpG co-liofilizados, re-suspendidos en ASA (sacarosa - incubación durante 48 horas a 25°C). grp5: PRAME + CpG co-liofilizados, re-suspendidos en ASA (sorbitol). grp6: PRAME + ASA -formulación "líquida" que contenía NaCI 70 mM + CpG. grp7: PRAME + ASA - formulación "líquida" que contenía NaCI 70 mM + CpG (+ poloxámero). 7 días después de la última inmunización, se analizó la respuesta celular por la capacidad de las células-T para secretar citoquinas (n = 4 grupos de 3 ratones).

Todos los ratones recibieron 0.4 microgramos de PRAME en 1/10 de la dosis humana del Sistema Adyuvante de ASA + CpG (5 microgramos de MPL, 5 microgramos de QS21, y 42 microgramos de CpG).

Resultados: Crecimiento tumoral El crecimiento tumoral promedio a través del tiempo, como se mide por la superficie (mm2) ( + SD) por grupo, está representado en la Figura 6. El ASA formulado con PRAME (NaCI 150 mM) + CpG y PRAME en el ASA en formulación líquida, induce una protección más baja contra los tumores (mayor crecimiento 'tumoral) que el ASA de PRAME (sorbitol) + CpG.

Respuesta celular (7 días después de 2 inmunizaciones - n = 4 grupos de 3 ratones por grupo de tratamiento): La frecuencia de células-T CD4 y CD8 capaces de producir citoquinas como IFNy y TNFa después de la inmunización de los ratones con el antígeno tumoral PRAME ASA-CpG se utiliza para reflejar la capacidad de las diferentes formulaciones con el objeto de inducir una respuesta celular funcional. 7 días después de la segunda inmunización, se midieron los porcentajes de células-T CD4 y CD8 productoras de citoquinas (IFNy y TNFa) mediante teñido de citoquina intracelular (ICS) en las células del bazo de los ratones inmunizados.

El porcentaje de CD4 que produjo IFNy y TNFa (promedio +/-desviación estándar) se muestra en la Figura 5.

No se encontró ninguna respuesta de CD8 mensurable en este experimento.

Se mostró que la proteína de PRAME formulada en ASA (NaCI 150 m ) +CpG se precipita e induce una respuesta de células-T específica más baja comparándose con la PRAME formulada en ASA (sorbitol) + CpG. Se obtuvo una respuesta de CD4 específica de PRAME similarmente buena cuando se formuló la proteína de PRAME en ASA (sorbitol) + CpG y en la formulación "líquida" de ASA (NaCI 70 mM) + CpG (ninguna diferencia estadística). También se probó la respuesta inmunitaria humoral, pero los datos después de 2 inyecciones no fueron interpretables.

Experimento 2: Cuatro grupos de veinticuatro ratones CB6f1 hembras (híbridos de ratones C57BLJ6 y Balb/C) de 6 a 8 semanas de edad, se inmunizaron cuatro veces intra-muscularmente (cada dos semanas, en inyecciones alternadas en el músculo gastrocnemio izquierdo y derecho) con la proteína de PRAME formulada en una dosis fija de ASA +CpG que corresponde a 1/10 de una dosis humana (50 microlitros que contenían 5 microgramos de MPL, 5 microgramos de QS21 y 42 microgramos de CpG7909). 14 días después de la última inmunización, cuatro grupos de ratones (n = 12 en cada grupo) se estimularon subcutáneamente con células tumorales 10e5 CT26-PRAME, como se describe más adelante. Los cuatro grupos de ratones fueron: grp1 : regulador. grp2: PRAME + CpG co-liofilizados resuspendidos en el ASA "clásico" (NaCI 150 mM), en donde se precipita la proteína de PRAME. grp3: PRAME + CpG co-liofilizados resuspendidos en ASA (sorbitol). grp4: PRAME + ASA - formulación "líquida" + CpG (+ poloxámero). 14 días después de la última inmunización, la respuesta inmunitaria se analizó utilizando diferentes lecturas como sigue: Respuesta humoral (n = 12).

Respuesta celular por la capacidad de las células-T para secretar citoquinas (n = 4 grupos de 3 ratones). Efecto protector contra un estímulo tumoral (n = 12).

Resultados: Crecimiento tumoral El crecimiento tumoral promedio a través del tiempo, como se mide por la superficie (mm2) (+SD), por grupo, está representado en la Figura 9. El ASA formulado con PRAME (NaCI 150 mM) + CpG induce una protección más baja contra tumores (mayor crecimiento tumoral) que el ASA de PRAME (sorbitol) + CpG. Se observó una protección similar para PRAME ASA (sorbitol) + CpG, y para PRAME en la formulación líquida de ASA + CpG).

Análisis de muestras: Respuesta humoral: Los sueros de los ratones (n = 12) se probaron mediante un ELISA para determinar la presencia de anticuerpos específicos de PRAME 14 días después de la última de las 4 inmunizaciones, como se describe más adelante. La respuesta del anticuerpo (Ig total) se evaluó mediante un ELISA utilizando la proteína de PRAME recombinante purificada como el antígeno de recubrimiento. Los sueros a partir de los animales inmunizados se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos específicos de PRAME. La media geométrica de las titulaciones estándares (n = 12 ratones) +/-los intervalos de confianza del 95 por ciento obtenidos después de 4 inmunizaciones se muestran en la Figura 7. La PRAME/ASA + CpG que contenía el ASA clásico (NaCI 150 mM) induce una respuesta de anticuerpos muy pequeña, mientras que la PRAME/ASA + CpG que contenía ASA (sorbitol) induce titulaciones de anticuerpos muy altas. Esta respuesta es similar a aquélla inducida por la formulación líquida de.

Respuesta celular (14 días después de 4 inmunizaciones - n = 4 grupos de 3 ratones por grupo de tratamiento): La frecuencia de células-T CD4 y CD8 capaces de producir citoquinas como IFNy y TNFa después de la inmunización de los ratones con el antígeno tumoral PRAME ASA-CpG se utiliza para reflejar la capacidad de las diferentes formulaciones con el objeto de inducir una respuesta celular funcional. 14 días después de la cuarta inmunización, se midieron los porcentajes de células-T CD4 y CD8 que producen citoquinas (IFNy y TNFa) mediante teñido de citoquina intracelular (ICS) en las células del bazo de los ratones inmunizados.

El porcentaje de CD4 que produce IFNy y TNFa (promedio +/-desviación estándar) se muestra en la Figura 8. Los valores-p son en gran parte inferiores a 0.05, demostrando una diferencia significativa entre el grupo 2 y los grupos 3 y 4.

No se encontró ninguna respuesta de CD8 mensurable en este experimento.

Se mostró que la proteína de PRAME formulada en ASA (NaCI 150 mM) + CpG se precipita e induce una respuesta de células-T específica estadísticamente más baja, comparándose con la PRAME formulada en ASA (sorbitol) + CpG. En contraste, se obtuvo una respuesta de CD4 específica de PRAME similarmente buena cuando la proteína de PRAME se formuló en ASA (sorbitol) + CpG, y en la formulación "líquida" de ASA + CpG.

Método Modelo de tumor CT26-PRAME y crecimiento tumoral La línea celular CT26-PRAME se generó mediante la transfección de la línea celular de carcinoma de colon CT26 con el plásmido de expresión de mamífero, pCDNA3, que codificaba el ADNc para PRAME (Invitrogen, Carlsbad, CA). La selección con G418 (200 microgramos/mililitro), y la clonación de dilución de límite proporcionó un clon que expresó la PRAME (CT26-PRAME) como se determinó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real (copias de ARNm de 10e-3 PRAME / copia de ß-actina de ratón, que está en el intervalo del nivel de expresión de PRAME por parte de los tumores humanos).

Las células CT26 PRAME se hicieron crecer in vitro a 37°C con C02 al 5 por ciento en el medio RPMI con suero fetal de becerro al 10 por ciento, L-glutamina al 1 por ciento, penicilina-estreptomicina al 1 por ciento, aminoácidos no esenciales al 1 por ciento, piruvato de sodio al 1 por ciento, y ß-mercapto-etanol al 0.1 por ciento. Las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces en el medio sin suero, y se inyectaron en 200 microlitros del medio RPMI subcutáneamente en el flanco derecho de cuatro grupos de ratones CB6f1 , 14 días después de la última inmunización con PRAME, como se describe anteriormente. El crecimiento tumoral individual se midió dos veces por semana. El producto de los 2 diámetros principales de cada tumor se registró a través del tiempo, y los datos se muestran como la superficie tumoral promedio (mm2) en cada grupo de animales. Análisis de muestras: Respuesta humoral Antes de la adición de los sueros, la inmunoplaca se recubrió con el antígeno PRAME durante la noche a 4°C. Después de la reacción con los sueros durante 90 minutos a 37°C, se agregó un anticuerpo entero de conejo biotinilado contra las inmunoglobulinas de ratón durante 90 minutos a 37°C. El complejo de antígeno-anticuerpo se reveló mediante incubación con un complejo de estreptavidina-peroxidasa biotinilada durante 30 minutos a 37°C. Este complejo se reveló entonces mediante la adición de tetrametil-bencidina (TMB) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y la reacción se interrumpió con H2S04 0.2 M. Las densidades ópticas se registraron a 450 nanómetros.

Método de análisis de muestras: Respuesta celular (Producción de IFNv/TNFa) La producción de IFNY y TNFa por parte de las células-T CD4 y CD8 se midió mediante citometría de flujo (LSR2 de Becton Dickinson) utilizando teñido con citoquina intracelular (ICS) en las células del bazo de los ratones inmunizados (4 grupos de 3 ratones por grupo) después de 2 horas de estimulación con una reserva de péptidos 15mer traslapados que cubrían la secuencia entera de la proteína PRAME.

Estimulación de las células-T: Las células del bazo de los animales inmunizados se volvieron a estimular con una reserva de 123 péptidos 15mer traslapados por 11 aminoácidos, que cubrían la secuencia entera de PRAME. Los péptidos (1 microgramo/mililitro/péptido) se mezclaron con células-T 10e6 (las células del bazo) durante 2 horas a 37°C en una placa de 96 pozos (U) en un volumen final de 200 microlitros de RPMI con suero fetal de becerro (FCS) al 5 por ciento que contenía 2 microgramos/mililitro de anti-CD49d y anti-CD28 a 2 microgramos/ mililitro después de la incubación, se agregaron 50 microlitros de brefeldina (1/1000) en RPMI con suero fetal de becerro (FCS) al 5 por ciento.

Teñido intracelular: • Teñido de CD4/CD8: Las células se transfirieron a una placa de 96 pozos (pozos cónicos) Centrifugación a 1,000 revoluciones por minuto durante 5 minutos a 4°C.

Lavado con 250 microlitros de regulador FACS (suero regulado con fosfato (PBS) y suero fetal de becerro (FCS) al 1 por ciento).

Los aglomerados de células se incubaron con 50 microlitros de 2.4G2 1/50 en regulador FACS durante 10 minutos a 4°C.

Se agregaron 50 microlitros de la Mezcla Maestra CD4-PE (dilución de Mab: 1/200), y CD8PerCP (dilución de Mab: 1/200) en regulador FACS durante 30 minutos a 4°C.

Lavado en regulador FACS (1 ,200 revoluciones por minuto durante 10 minutos).

• Permeabilización de las células: Los aglomerados se incubaron con 200 microlitros de solución cytoFix-cytoPerm durante 20 minutos a 4°C.

Se lavaron con permWASH 1x (1 ,200 revoluciones por minuto durante 10 minutos) - la solución permWASH está concentrada a 10x; dilución en agua estéril.

• Teñido intracelular de IFNY y TNFa: - Los aglomerados se incubaron durante 2 horas a 4°C con 50 microlitros de la Mezcla de IFNy APC (dilución de Mab: 1/50), y TNFa FITC (dilución de Mab: 1/50) en la solución permWASH 1x.

Se lavaron con permWASH 1X (1 ,200 revoluciones por minuto durante 10 minutos).

- Los aglomerados se volvieron a suspender en regulador FACS.

Análisis FACS.

Brefeldina (Gologi Plug): BD cat.555029 Cytofix / cytoperm: Pharmingen (BD) Cat n° 554722 Regulador Perm/wash: Pharmingen(BD) Cat n° 554723 NA LE purificado CD49d de Rata Anti-Ratón: BD Cat n° 553154 NA LE purificado CD28 de Rata Anti-Ratón: BD Cat n° 553295 CD8a perCp de Rata Anti-Ratón: BD Cat n° 553036 CD4 PE de Rata Anti-Ratón: BD Cat n° 556616 IFNy APC de Rata Anti-Ratón: BD Cat n° 554413 TNFa FITC de Rata Anti-Ratón: BD Cat n° 554418 CD16/CD32 Anti-Ratón (2.4G2) Becton Dickinson cat n° 553142 (0.5 miligramos/mililitro)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno, en donde la concentración de cloruro de sodio o la concentración iónica de esta composición es menor de 100 mM.

2. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el antígeno o la preparación antigénica es cualquier antígeno que se precipite, se coagule, o se aglomere después de disolverse en una solución que comprende una concentración de cloruro de sodio o con una concentración iónica mayor de 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó 100 mM.

3. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1 ó 2, en donde la concentración de cloruro de sodio es menor de 100 mM, y en donde el antígeno es PRAME o un fragmento o un derivado del mismo.

4. Una composición inmunogénica, de la reivindicación 1 ó 2, en donde la concentración de cloruro de sodio es menor de 100 mM, y en donde el antígeno es NY-ESO-1 o un fragmento o un derivado del mismo.

5. Una composición inmunogénica como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la concentración de cloruro de sodio o la concentración iónica es menor de aproximadamente 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, o 15 mM.

6. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 5, en donde la concentración de cloruro de sodio o la concentración iónica es menor de 10 mM,

7. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 6, en donde la concentración de cloruro de sodio o la concentración iónica es menor de 5 mM.

8. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 7, la cual esencialmente no contiene cloruro de sodio.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual además comprende un agente de isotonicidad no iónico.

10. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el agente de isotonicidad no iónico es un poliol.

11. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el poliol es sorbitol.

12. La composición inmunogénica de la reivindicación 11, en donde la concentración de sorbitol es de entre aproximadamente el 3 por ciento y aproximadamente el 15 por ciento (peso/volumen).

13. La composición inmunogénica de la reivindicación 12, en donde la concentración de sorbitol es de entre aproximadamente el 4 por ciento y aproximadamente el 10 por ciento (peso/volumen).

14. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende cloruro de sodio a aproximadamente 5 mM, y entre el 5 por ciento y el 6 por ciento en peso/volumen de sorbitol.

15. Una composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, la cual comprende uno o más inmunoesti mulantes.

16. La composición inmunogénica de la reivindicación 15, en donde el inmunoestimulante es una saponina y/o un agonista de TLR-4.

17. La composición inmunogénica de la reivindicación 16, en donde el (los) inmunoestimulante(s) está(n) en la forma de liposomas.

18. La composición inmunogénica de la reivindicación 16 ó 17, en donde la saponina es QuilA o un derivado de la misma.

19. La composición inmunogénica de la reivindicación 18, en donde el derivado de QuilA es QS21.

20. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde el agonista de TLR-4 es 3D-MPL.

21. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, la cual además comprende un oligonucleótido de CpG.

22. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para utilizarse en medicina.

23. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para utilizarse en el tratamiento de cáncer.

24. El uso de una composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

25. Un proceso para la elaboración de una composición inmunogénica como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, el cual comprende los pasos de: a. liofilizar un antígeno, opcionalmente con un oligonucleótido ¡nmunoestimulante; y b. reconstituir la composición liofilizada del paso a) con una composición adyuvante acuosa, en donde la concentración de NaCI o la concentración iónica es menor de 100 mM 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 15 mM ó 10 mM.

26. Un kit, el cual comprende: a. un antígeno liofilizado, opcionalmente co-liofilizado con CpG; y b. una composición adyuvante acuosa, en donde la concentración de NaCI o la concentración iónica es menor de 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 15 mM ó 10 mM.

27. El proceso de la reivindicación 26, o un kit de acuerdo con la reivindicación 27, en donde la composición adyuvante acuosa comprende un agonista de TLR-4, y una saponina en una formulación liposomal, y un agente de isotonicidad no iónico.

28. El proceso o el kit de la reivindicación 27, en donde el agente de isotonicidad no iónico es sorbitol.

29. El proceso o el kit de la reivindicación 28, en donde la concentración de sorbitol es de entre aproximadamente el 3 por ciento y el 15 por ciento (peso/volumen), de entre el 4 por ciento y el 10 por ciento (peso/volumen), o de entre aproximadamente el 5 por ciento y el 6 por ciento (peso/volumen).

30. El proceso o el kit de las reivindicaciones 27 o 28, en donde la saponina es QS21.

31. El proceso o el kit de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde el agonista de TLR-4 es 3D-MPL.

32. Un proceso o un kit de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, en donde la concentración de NaCI en la composición adyuvante acuosa es de aproximadamente 5 mM.

33. El proceso o el kit de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el antígeno se precipita, se coagula, o se aglomera después de disolverse en una solución que comprende una concentración de cloruro de sodio, o en donde la concentración iónica de la solución es mayor de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ó 100 mM.

34. El proceso o el kit de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, en donde el antígeno se selecciona a partir de PRAME o NY-ESO-1.