CN101951950A

CN101951950A - 疫苗

Info

Publication number: CN101951950A
Application number: CN2008801274463A
Authority: CN
Inventors: D·I·勒穆瓦纳; S·V·A·蓬萨尔
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2011-01-19
Also published as: CO6290701A2; JP2015007067A; US20140193481A1; DOP2010000188A; BRPI0821555A2; CR11575A; JP2011506565A; CA2708718A1; EA201000829A1; WO2009080719A1; US20100285051A1; KR20100109555A; AU2008339984A1; MA32018B1; IL206307A0; EP2247307A1; ZA201004303B

Abstract

一种HIV疫苗的组分，其包含：a)免疫原性融合蛋白，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag这二者均存在时，在它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段，和b)稳定剂，其选自：一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物。本发明还扩展至包含所述组分的HIV疫苗以及治疗/预防HIV的用途。

Description

疫苗

发明领域

本发明涉及包含HIV融合蛋白(具体地说为本文称为F4的HIV融合蛋白)和稳定剂的新组合物；制备所述组合物的方法以及治疗和/或预防HIV-1感染和/或获得性免疫缺陷综合征AIDS的用途。

HIV-1是AIDS的病因，而AIDS是世界上主要的健康问题之一。需要预防和/或治疗HIV感染的疫苗。

发明背景

HIV-1是逆转录病毒科的RNA病毒。HIV基因组编码至少9种蛋白，它们被分为3类：主要结构蛋白Gag、Pol和Env，调节蛋白Tat和Rev，以及附属蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因组表现出所有逆转录病毒的5′LTR-gag-pol-env-LTR3′组织。

HIV包膜糖蛋白gp120是用于附着宿主细胞的病毒蛋白。该附着由结合至辅助T细胞和巨噬细胞的两个表面分子介导，这两个表面分子称为CD4和两个趋化因子受体CCR-5或CXCR-4之一。gp120蛋白最初表达为较大的前体分子(gp160)，然后其被翻译后切割，产生gp120和gp41。gp120蛋白通过连接gp41分子保留在病毒体表面上，gp41分子插入到病毒膜中。

gp120蛋白是中和抗体的主要靶，但遗憾的是，gp120蛋白的主要免疫原性区(V3环)也是蛋白的最易变部分。因此，认为使用gp120(或其前体gp160)作为激发中和抗体的疫苗抗原对于广泛保护性疫苗的作用是有限的。gp120蛋白的确也含有被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位。这些效应细胞能够消除病毒感染的细胞，并因此构成第二种主要抗病毒免疫机制。与中和抗体的目标区相反，某些CTL表位似乎在不同HIV株中相对保守。为此，gp120和gp160可能是疫苗中的有用抗原性组分，所述疫苗例如包含抗原/组分的混合物，其目的在于引发细胞介导的免疫反应(特别是CTL)。

HIV-1的非包膜蛋白包括例如内部结构蛋白，如Gag和pol基因的产物，和其它非结构蛋白，如Rev、Nef、Vif和Tat(Green等人，New England J.Med，324，5，308及以下等(1991)和Bryant等人(Ed.Pizzo)，Pediatr.Infect.Dis.J.，11，5，390及以下等(1992)。

HIV Nef在感染早期且没有结构蛋白的情况下表达。

Nef基因编码早期辅助HIV蛋白，其已经显示出具有若干活性。例如，已知Nef蛋白引起CD4、HIV受体和细胞表面的MHC I类分子的下调，但是关于这些功能的生物学重要性还没有确定。此外，Nef与T细胞信号途径相互作用，并诱导活性状态，这又可促进更有效的基因表达。某些HIV分离株在该区具有突变，这使它们不编码功能性蛋白，且严重危害它们在体内的复制和致病性。

Gag基因被翻译为前体多聚蛋白，其被蛋白酶裂解，产生产物，所述产物包括基质蛋白(p17)、衣壳(p24)、核衣壳(p9)、p6和两个间隔肽p2和p1。

Gag基因产生55千道尔顿(kD)的Gag前体蛋白，也称作p55，其由未剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中，p55的N末端被肉豆蔻酰化，引发它与细胞膜的胞质面相结合。膜结合的Gag糖蛋白募集病毒基因组RNA的两个拷贝连同引发病毒颗粒从感染细胞表面出芽的其它病毒蛋白和细胞蛋白。出芽后，在病毒成熟为4种被称作MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6的较小蛋白的过程中，p55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)裂解。

除了3种主要的Gag蛋白以外，所有Gag前体还含有若干其它区，它们被裂解出来，并作为各种大小的肽保留在病毒体中。这些蛋白具有不同的作用，例如，p2蛋白具有调节蛋白酶活性的预期作用，并有助于蛋白水解加工的正确定时。

p17(MA)多肽来源于p55的N末端的肉豆蔻酰化末端。大多数MA分子保持附着于病毒体脂质双层的内表面，使颗粒稳定。一部分MA被募集到病毒体深层内，它在那里变成复合体的一部分，所述复合体运送病毒DNA到细胞核。这些MA分子利于病毒基因组的核转运，因为MA上的亲核信号可被细胞核输入机器识别。该现象使HIV感染未分裂细胞，这是逆转录病毒与众不同的性质。

p24(CA)蛋白形成病毒颗粒的圆锥形核心。亲环蛋白A已被证实与p55的p24区相互作用，导致其掺入到HIV颗粒中。Gag与亲环蛋白A之间的相互作用是必需的，因为环孢菌素A所致该相互作用的破坏抑制病毒复制。

Gag的NC区负责特异性识别所谓的HIV包装信号。该包装信号由位于病毒RNA 5′末端附近的4个茎环结构组成，且足以介导异源RNA掺入到HIV-1病毒体中。NC通过由两个锌指基序介导的相互作用与包装信号结合。NC也促进逆转录。

p6多肽区介导p55Gag与辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr掺入到组装中的病毒体中。p6区还含有所谓的晚期结构域，其是从感染细胞有效释放出芽病毒体所需要的。

Pol基因编码含有早期感染中病毒所需的两种活性的两种蛋白，即RT和病毒DNA整合到细胞DNA中所需的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒体蛋白酶裂解，产生氨基末端RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA依赖性DNA聚合酶活性以及RNA酶H功能)，并产生羧基末端整合酶蛋白。HIV RT是全长RT(p66)和缺少羧基末端RNA酶H结构域的裂解产物(p51)的异二聚体。

RT是由逆转录基因组编码的保守性最高的蛋白之一。RT的两种主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可互换地利用RNA和DNA作为模板，且与所有已知的DNA聚合酶一样，不能启动DNA从头合成，而是需要预先存在的分子作为引物(RNA)。

随着DNA合成进行，所有RT蛋白固有的RNA酶H活性在除去RNA基因组的复制早期起重要作用。其选择性降解所有RNA-DNA杂种分子的RNA。在结构上，聚合酶和核糖核酸H占据分开的、不重叠的结构域，其中Pol覆盖Pol三分之二的氨基。

p66催化亚单位折叠成5个不同的亚结构域。它们的氨基末端23具有带RT活性的部分。这些的羧基末端是RNA酶H结构域。

WO 2006/013106描述了包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物的融合蛋白，其中当p17和p24Gag均存在时，它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段。在一个实施方案中，所述融合蛋白称为F4。

该类型的蛋白，尤其是F4，对沉淀、聚集、pH、光、搅拌、吸附和/或氧化敏感。这可能是正确的，即便在抗原被冻干储存以便随后在临用前用例如液体佐剂复溶时。这些现象，尤其是沉淀、聚集和/或氧化，可能导致丧失有利的生物特性，例如免疫原性和/或抗原性，或者可能导致所述制剂产生其它不需要的特性。而且，人用药物必须被充分表征，是稳定且安全的。

硫柳汞已被用作防腐剂，以避免在某些制剂中的微生物生长，亚硫酸钠已被用于稳定某些抗原。然而，这些试剂存在一些相关的缺点，具体地说，某些配方设计师不愿意使用硫柳汞，因为他们希望在疫苗中不包含汞化合物。亚硫酸钠被认为具有引起某些个体变态反应的可能性。因此，如果制剂中含有亚硫酸钠，则需要在标签上警示，因为所述制剂可能不适用于所有个体。

本发明人研究了向制剂加入诸如柠檬酸三钠盐、苹果酸钠盐、葡萄糖和L-甲硫氨酸的试剂，但这些试剂不具有所期望的作用。尽管如此，本发明人现在已发现，在没有使用亚硫酸钠的情况下，所述蛋白，尤其是F4，可以是稳定的。

发明概述

因此，本发明提供HIV疫苗的原液制剂或组分，其包含：

a)免疫原性融合蛋白，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag均存在时，它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段，和

b)为含有硫醇官能团的抗氧化剂的稳定剂，其例如选自谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物。

附图简述

图1显示了在F4的还原条件下的SDS-PAGE分析。

图2显示了F4的溶解度测定。

图3显示了密码子优化的F4的考马斯染色凝胶和蛋白质印迹。

图4显示了密码子优化的p51RT的考马斯染色凝胶和蛋白质印迹。

图5显示了RT/p55和RT/p66的溶解度测定。

图6显示了在还原条件下多种F4蛋白的SDS-PAGE分析。

图7显示了F4co和羧酰胺化F4co纯化之后的SDS-PAGE研究。以4-12％SDS凝胶分离在F4co或F4coca纯化过程中收集的5μg的每种级分。凝胶以考马斯蓝染色。1：匀浆；2：CM hyperZ洗脱液；3：Q琼脂糖洗脱液；4：纯化的原液。

图8，依据纯化方法I或方法II纯化的F4、F4co和F4coca的SDS-PAGE分析。5μg的每种蛋白在4-12％SDS凝胶上以还原条件(左侧)或非还原条件(右侧)分离。凝胶以考马斯蓝染色。1：方法II-F4co；2：方法II-F4coca；3：方法I-F4coca；4：方法I-F4；5：方法I-羧酰胺化的F4。

图9，在非还原条件下通过SDS PAGE筛选螯合剂。

图10，非还原条件下的SDS-PAGE：含谷胱甘肽和一硫代甘油的制剂的T15天、4℃最终原液稳定性。

图11，非还原条件下的SDS-PAGE：含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的制剂的T15天、4℃最终原液稳定性。

图12，非还原条件下的SDS-PAGE：包含谷胱甘肽和一硫代甘油的冻干抗原(饼块)的复溶液。

图13，非还原条件下的SDS-PAGE：包含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的饼块的复溶液。

图14，还原条件下的SDS-PAGE分析：以包含MPL和QS21的脂质体佐剂复溶包含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的饼块，于25℃4小时后(离心前和离心后)。

发明详述

有利的是，依据本发明使用以上b)部分列出的至少稳定剂一硫代甘油或N-乙酰半胱氨酸被认为提供了与亚硫酸钠相等或比亚硫酸钠更好的稳定性。也就是说，当使用亚硫酸钠稳定所述蛋白/抗原分子内氧化时，观察到似乎被终止但有些聚集，被认为是由于分子间氧化(即通过在分子间形成二硫键)。相比之下，当以合适的水平使用一硫代甘油、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种时，则没有观察到聚集，由此提供比亚硫酸钠更好的稳定性。而且，抗原的溶解度得以保持/保留。

尽管不希望被理论束缚，但一般认为抗氧化剂中的硫醇官能团连接蛋白中的硫醇基团，和/或优先氧化，由此预防蛋白中的氧化。

而且，在本发明的制剂中可以保持所需的蛋白特性，例如免疫原性和/或抗原性等。

一方面，所述稳定剂为一硫代甘油。

一方面，所述稳定剂为半胱氨酸。

一方面，所述稳定剂为N-乙酰半胱氨酸。

一方面，所述稳定剂为谷胱甘肽。

在至少一个方面，最终原液或液体制剂基本上没有碱金属亚硫酸盐，例如亚硫酸钠。

另一方面，最终原液或液体制剂基本没有硫柳汞。

所述稳定剂可以以0.001％-2.5％重量/体积的量存在，例如0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％重量/体积，尤其是0.5％重量/体积。

可以如下制备抗氧化剂溶液：

-粉末或液体称重

-溶解于注射用水中，例如约80ml

-将水加至预定限，例如至100ml

-用1M NaOH调节pH，例如至约pH 7.5

在本发明使用的构建体和如本文所述的本发明组合物中，Nef可以为全长Nef。

在一个实施方案中，Nef为非肉豆蔻酰化的。

在本发明使用的构建体中，p17Gag和p24Gag例如分别为全长p17和p24。

在一个实施方案中，所用的多肽包含p17和p24Gag这二者或其免疫原性片段。在这样的构建体中，p24Gag组分和p17Gag组分由至少一种另外的HIV抗原或免疫原性片段分隔，例如Nef和/或RT或其免疫原性片段或衍生物。

或者，p17或p24Gag可以分别提供。

在另一个实施方案中，用于本发明的多肽构建体进一步包含Pol或Pol衍生物，例如RT或其免疫原性片段或衍生物。适用于本发明的RT的特定片段是这样的片段：其中RT在C末端被截短，例如使得它们没有羧基末端RNA酶H结构域。一种这样的没有羧基末端RNA酶H结构域的片段是本文所述的p51片段。

本文所述的融合蛋白中的RT或免疫原性片段例如可以为p66RT或p51RT。

用于本发明的融合蛋白或组合物的RT组分任选地包含在592位的突变，或者在非HXB2菌株中的等同突变，使得甲硫氨酸通过突变为另一种残基如赖氨酸而被除去。该突变的目的是除去在原核表达系统中用作内部起始位点的位点。

RT组分还可以或者备选地可以包含突变，以除去酶活性(逆转录酶)。因此，可以存在K231来代替W。

在用于本发明的包含p24和RT的融合蛋白中，其可以合理地使用其中p24在RT之前的构建体，因为当所述抗原在大肠杆菌中单独表达时，观察到p24的表达比RT好。

本发明的具体构建体包括以下：

1.p24-RT-Nef-p17(在本文也称为F4)

2.p24-RT*-Nef-p17

3.p24-p51RT-Nef-p17

4.p24-p51RT*-Nef-p17

*代表RT甲硫氨酸₅₉₂突变为赖氨酸

一方面，所述融合蛋白为F4。

在本发明的又一方面，所用的F4或其它融合蛋白可被化学处理，以帮助纯化和/或保留所需的生物学特性。

合适的化学处理包括羧甲基化、羧酰胺化、乙酰化或用醛(例如甲醛或戊二醛)处理。

一方面，所述融合蛋白为F4co，其中编码所述蛋白或其部分的多核苷酸已被密码子优化。

免疫反应可通过适宜的免疫学测定检测，例如ELISA(用于抗体反应)或使用适用于细胞标记和细胞因子的染色的流式细胞术(用于细胞反应)。

用于本发明的HIV抗原的多肽构建体能够在体外系统中表达，包括原核生物系统，例如大肠杆菌。有利的是，它们可通过常规纯化方法纯化。

本文所述的融合蛋白当在选定的表达系统中表达时，可以是可溶性的，即它们以显著的量存在于表达系统的粗提物的上清液中。粗提物中融合蛋白的存在情况可以通过常规方法检测，例如在SDS凝胶上电泳、考马斯染色和通过密度检测检查适宜的条带。依据本文实施例中所述的技术检测，本发明的融合蛋白例如为至少50％可溶的，例如至少70％可溶的，尤其是90％或以上可溶的。改善重组表达的蛋白的溶解度的技术是已知的，例如在原核表达系统中，溶解度通过降低诱导基因表达时的温度进行改善。

如本文所述的免疫原性片段将包含至少一种抗原表位，并展示出HIV抗原性，且能够在以适宜的构建体提呈时(例如当融合至其它HIV抗原或在载体上提呈时)产生针对天然抗原的免疫应答。通常，免疫原性片段包含来自HIV抗原的至少20个，例如50个、例如100个连续氨基酸。

所述组分可以作为液体组分提供，例如以1剂或2剂或作为冷冻干燥的(冻干的)饼块。

组分制剂

一方面，提供液体制剂，其包括：

a)如本文所述的融合蛋白，

b)任选的液体载体，例如注射用水，和

c)稳定剂，其选自谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物。

以上内容中的液体制剂可以指原液或一剂或两剂的组分。

液体制剂例如可以包含糖，例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇或果糖，尤其是蔗糖。糖的量以最终制剂的重量计例如可以为1％-10％，例如4％-5％(重量/重量)，例如4％(重量/重量)。

液体制剂例如可以包含精氨酸。每剂的精氨酸的合适量在200-400mM的范围内，例如300-375mM，具体地说是在每个最终剂量中提供300mM。

液体制剂还可以包含螯合剂，例如柠檬酸三钠盐、苹果酸钠盐、葡萄糖、L-甲硫氨酸或EDTA二钠(乙二胺四乙酸)，例如每剂在0.5-2mM的范围内，例如1-1.25mM，尤其是提供每个最终剂量1mM。

所述液体制剂还可以包含非离子表面活性剂，例如吐温，如吐温80。最终剂量中的适宜量在0.005％重量/体积至约0.05％重量/体积的范围内，例如0.012％-0.015％重量/体积，尤其是0.012％重量/体积。

吐温用作溶解剂。然而，人们认为吐温可能包含残余的过氧化物，其催化抗原的聚集和/或降解。有利的是，本发明的抗氧化剂的用途被认为猝灭该反应。

所述液体制剂还可以包含磷酸盐(PO₄)，例如磷酸钠，例如在最终剂量中1-50mM，例如10mM，如4mM或5mM，如4mM。

本发明的液体制剂还可以包含痕量的其它组分，例如其可以为生产过程的残余物，例如tris HCL。

因此，一方面，提供HIV疫苗的最终原液或组分，其包含：

a)免疫原性融合蛋白，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag均存在时，在它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段，

b)稳定剂，其为包含硫醇官能团的抗氧化剂，例如选自谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物，

c)1％重量/体积或以下的非离子表面活性剂，

d)200-450mM精氨酸，

e)0.5-2.0mM螯合剂，和

f)1-50mM缓冲液。

一方面，本发明的组分或最终制剂还含有防腐剂，例如硫柳汞。当一起提供两剂或更多剂(例如10剂)时可能有需要。

在本发明上下文中的硫醇官能团意指相关分子中的至少一个-SH基。

在本说明书上下文中的最终原液涉及纯化的抗原、载体和其它赋形剂，但一般不包括佐剂组分/赋形剂。原液是指给定容器中存在两剂以上。因此，最终原液是包含抗原和所有赋形剂但没有佐剂且在分装为单剂之前的制剂。

纯化原液意指抗原，最少的赋形剂，例如悬浮在磷酸盐缓冲液中的纯化抗原。

本文的HIV疫苗的组分是指一剂或两剂抗原和除佐剂赋形剂之外的所有赋形剂组分。

在本发明的一方面，纯化原液在以下缓冲液中产生：Tris 10mM、精氨酸400mM(100mM、200mM或300mM)、亚硫酸钠10mM、EDTA 1mM、残余的吐温80，pH为8.5。

本发明还扩展至含亚硫酸盐的液体制剂，但其还包含带有至少一个硫醇基团的抗氧化剂，如本发明所使用的。亚硫酸盐例如可以1％或以下的水平存在，例如0.5％或以下，具体地说是0.1％或以下，尤其是0.05％或以下(重量/重量或重量/体积)。

在一个实施方案中，除去原液纯化抗原(其是原液中的组分)中的任何残余的亚硫酸盐稳定剂，以提供没有任何残余亚硫酸盐的最终原液。在该方面，最终原液将具有低于0.05％的亚硫酸盐含量，例如低于0.01％，尤其是0。

该原液可被冷冻干燥(冻干)得到冻干饼，其用佐剂复溶。

在一个实施方案中，用625μl佐剂复溶的500μl人用剂量饼块包含：

F4 10-30-90μg

蔗糖 4％

精氨酸 300mM

N-乙酰半胱氨酸 0.5％重量/体积

EDTA二钠 1mM

吐温80 0.012％重量/体积

PO₄ 4mM

Tris-HCl 残余

6.1±0.2(当用佐剂复溶时，但如果

pH 用注射用水复溶，则pH为约7.5)

在加入液体佐剂制剂之前最终液体制剂的pH可以为pH 6.50-pH8.5，例如约pH 7.5，例如7.5±0.1。

在另一个实施方案中，将最终原液分为含有一剂或两剂液体制剂的单独小瓶。该液体制剂可以用如上所述的佐剂重构，或者可以冻干，以便以后用例如佐剂或注射用水复溶。

因此，所述液体制剂可以包含所述抗原、稳定剂和液体载体，例如注射用水，但一般将包含除佐剂赋形剂/组分之外的所有赋形剂，例如就最终原液而言。

在加入液体佐剂制剂之前本发明的重构制剂的pH可以为例如pH6.00至pH 7.00，例如约pH 6.1。

在一个实施方案中，提供最终的液体抗原制剂。在本说明书上下文中的最终液体抗原制剂意指少于10剂抗原，例如1剂或2剂抗原，并具有除佐剂组分之外的所有赋形剂。

因此，HIV疫苗的最终液体抗原制剂和组分在本文可交互使用。

在本说明书上下文中的疫苗(或最终疫苗制剂)是适于注射入人类患者的制剂，且例如可以为最终液体制剂加佐剂组分，或适宜时用佐剂重构的冻干抗原。

在一个实施方案中，提供本发明的最终疫苗制剂。本文的最终制剂是指包含所有必需的疫苗组分(包括佐剂组分)的制剂。

可能有利的是提供为单独组分的疫苗制剂，例如在单独小瓶中的两种液体制剂(液体抗原制剂和液体佐剂组分)，因为与其中疫苗制剂以存在的所有组分(包括佐剂组分)提供的形式相比，抗原以该形式可具有更长的保存期。

包含例如液体佐剂制剂的液体组分可能需要储存于约4℃。

在一个实施方案中，冻干本发明的抗原和稳定剂。适当的冻干可能需要存在糖或其它赋形剂，例如本文所列的，如蔗糖。在该实施方案中，本文所述的一种或多种最终原液制剂可以与本发明使用的稳定剂一起冻干，所述稳定剂例如N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、一硫代甘油或其混合物，例如N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸或一硫代甘油。

如果是冻干制品，则其可具有提供长期非常稳定的组分的优势，例如与最终液体制剂相比。本文所述的冻干制品比没有稳定剂的相应冻干制品更稳定，尤其是在抗原以“高”浓度/剂量存在时，例如超过50μg的剂量，例如60μg、70μg、80μg、90μg或100μg以上。

在冻干过程中，可以减少制剂中的组分的有效量，其在制备制品时必须被考虑到。因此，当本文使用术语最终剂量时，其是指适于或准备用于给予患者的包含重构剂量的疫苗制剂，因此考虑由于冻干造成的任何损失。

本发明还扩展至包含最终液体制剂或以下组分的预充注射器：

a)包含本发明的抗原和稳定剂的液体组分，或

b)液体佐剂制剂。

当注射器含有包含抗原和稳定剂的液体组分时，则可将佐剂吸入注射器中，以提供最终制剂给予患者。

包含抗原的预充注射器和包含佐剂的小瓶可以作为药盒提供。

或者，在佐剂预充入注射器中时，则液体抗原可被吸入到注射器中，以提供最终制剂给予患者。

包含佐剂的预充注射器和包含液体抗原或冻干抗原的小瓶可以作为药盒提供。在后一种情况下(即当抗原被冻干时)，注射器中的佐剂可用于重构小瓶中的抗原，然后该疫苗制剂可根据需要被吸回到注射器中，并给予患者。

或者，药盒可以以预充佐剂的小瓶和本发明的冻干抗原或液体抗原的独立小瓶提供。

本发明还扩展至冻干本发明的组分或组合物的方法或工艺。

本发明还涉及通过混合以下组分形成疫苗的工艺：

a)本发明的液体抗原组分和液体佐剂制剂，以提供最终疫苗(例如1个最终剂量的疫苗或2个最终剂量的疫苗)；或

b)本发明的冻干抗原制剂和液体佐剂制剂，以提供最终疫苗。

在一个实施方案中，使用未硅化的玻璃小瓶储存最终原液。

在一个实施方案中，使用3mL硅化的玻璃小瓶装本发明的抗原组分或最终疫苗制剂。

在本发明的一方面，用于储存本发明的组分制剂或本发明的疫苗制剂的小瓶是琥珀色的，以避光保护所述制剂。

表达

多核苷酸可用于在选定的表达系统中表达编码多肽。至少一种HIV抗原，例如RT，可由多核苷酸中的密码子优化序列编码，也就是说，为了在选定的重组表达系统如大肠杆菌中表达而对所述序列进行了优化。

可以使用p51RT多肽或其衍生物或编码其的多核苷酸，其任选地被密码子优化，以便在适宜的表达系统中表达，尤其是原核系统，例如大肠杆菌。

p51RT多肽或多核苷酸可以单独使用，或者与多肽或多核苷酸构建体组合使用。

工艺

本文所述的多肽例如可以通过包括以下步骤的工艺纯化：

i)提供包含未纯化的多肽的组合物；

ii)对组合物实施至少两个层析步骤；

iii)任选地羧酰胺化多肽；

iv)进行缓冲交换步骤，以提供在适于药物制剂的缓冲液中的蛋白。

羧酰胺化可在两个层析步骤之间进行。羧酰胺化步骤可以使用碘乙酰亚胺进行。

在一种工艺中，使用不超过两个层析步骤。

一方面，本发明提供制备最终原液或疫苗组分的方法，如以下的流程图所示。

组合物/处理方法

本发明的稳定的融合蛋白可以与以下物质共给予和/或共配制：

●一种或多种其它的HIV多肽和/或HIV融合蛋白，

●编码用于本发明的融合蛋白的多核苷酸，和/或

●病毒载体，例如编码一种或多种HIV抗原(尤其是如本文所述的HIV抗原)的腺病毒载体。

所述多核苷酸可存在于本领域普通技术人员已知的众多递送系统的任一种内，包括核酸表达系统，如质粒DNA、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术都是本领域熟知的，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15：143-198，1998和其中引用的参考文献所描述的那些。适宜的核酸表达系统含有在患者中表达必需的DNA序列(如适宜的启动子和终止信号)。

当表达系统是重组活微生物(如病毒或细菌)时，目标基因可被插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。使用该活载体接种和体内感染将导致抗原的体内表达和免疫反应的诱导。用于该目的的病毒和细菌是例如：痘病毒(例如牛痘、禽痘、金丝雀痘、修饰的痘病毒，例如修饰的病毒Ankara(MVA))、甲病毒(新培斯病毒、Semliki Forest病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)、黄病毒(黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒)、腺病毒、腺相关病毒、小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)、麻疹病毒(例如麻疹，如Schwartz株或由其获得的株)、李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、奈瑟氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是有毒的，或以各种方式减毒，以获得活疫苗。

用作活载体的腺病毒包括例如Ad5或Ad35或非人来源的腺病毒，如非人灵长类动物腺病毒，如猿腺病毒。一般而言，所述载体是复制缺陷的。通常，这些病毒含有E1缺失，且可在用E1基因转化的细胞系上生长。适宜的猿腺病毒是分离自黑猩猩的病毒。具体而言，C68(也称作Pan 9)(见美国专利号6083716)和Pan 5、6和Pan 7(WO03/046124)对于本发明的用途是优选的。可操作这些载体，以插入异源多核苷酸，使得所述多肽可在体内表达。这类重组腺病毒载体的应用、配制和制造详述于WO 03/046142。

本发明的组合物还可以包括在混合物中的其它HIV抗原，例如gp120多肽、NefTat融合蛋白，例如WO 99/16884所述。NefTat融合蛋白以及gp120多肽/蛋白的制备描述于WO 01/54719。

在一个实施方案中，gp120多肽/蛋白混合在本发明的制剂中。

使用本发明组分的疫苗可用于对抗/针对HIV和/或AIDS(尤其是HIV)的预防性和/或治疗性免疫。

本发明进一步提供如本文所述的在制备用于对抗/针对HIV和/或AIDS(尤其是HIV)的预防性和/或治疗性免疫的疫苗中的任何方面的用途。

疫苗制备通常描述于New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。在脂质体内的包囊化例如由Fullerton，美国专利4,235,877描述。蛋白与大分子的缀合例如由Likhite，美国专利4,372,945和Armor等人，美国专利4,474,757公开。

疫苗剂量中的蛋白量可以选择这样的量：其在一般疫苗接种者中诱导适宜的免疫应答或免疫保护反应，而没有显著的不利副作用。这样的量将根据所用的具体免疫原和所选择的接种方案而有所变化。通常，预期各剂含有1-1000μg每种蛋白，例如2-200μg每种蛋白，如3-100μg每种蛋白，具体地说是10、20、30、40、50、60、70、80或90μg多肽融合体，尤其是10、30或90μg多肽融合体(在本文也称为融合蛋白)。

如果在制剂混合物中使用gp120，则每剂的量例如将少于100μg，例如50μg或以下，具体地说为25μg、20μg、10μg、5μg。

具体疫苗的最佳量可通过标准研究确定，包括受试者的抗体效价和其它免疫反应的观察。

在初始接种后，受试者可于约4、5、6、7、8、9、10、11、12、16或24周接受加强，随后再于4、5、6、7、8、9、10、11或12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或50周接受第二次加强。

或者，受试者可于约4、5、6、7、8、9、10、11、12、16或24周接受加强，随后再于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周接受第二次加强。

适于给予的融合蛋白的最终疫苗制剂将包含佐剂。

佐剂一般描述于Vaccine Design-the Subunit and AdjuvantApproach，Powell和Newman编辑，Plenum Press，New York，1995。

适宜的佐剂包括铝盐，如氢氧化铝或磷酸铝，但还可以是钙、铁或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的多糖、或聚磷腈的不溶性混悬液。

在本发明的制剂中，适合的佐剂组合物是诱导优先的Th1反应的组合物。

哺乳动物免疫应答具有两个关键部分：体液应答和细胞介导的应答。

体液应答包括产生循环抗体，其将结合它们特异性针对的抗原，由此中和抗原，并有利于其随后通过涉及为细胞毒性或吞噬细胞的其它细胞的方法清除。B细胞负责产生抗体(胞浆B细胞)，以及保持免疫体液记忆(记忆B细胞)，即例如通过接种首次接触抗原后数年识别抗原的能力。

细胞介导的应答包括无数不同类型的细胞的相互影响，T细胞是其中之一。T细胞被分为众多不同的亚型，主要是CD4+和CD8+T细胞。

诸如巨噬细胞和树突细胞的抗原提呈细胞(APC)用作免疫系统的警卫，为机体屏蔽外源抗原。当APC检测到胞外的外源抗原时，这些抗原被吞噬(吞没)在APC内部，在那里它们被加工为较小的肽。这些肽随后被提呈至APC表面的主要组织相容性复合物II类(MHC II)分子上，在那里它们被表达CD4表面分子的抗原特异性T淋巴细胞(CD4+T细胞)识别。

T辅助CD4+T细胞为活化B细胞提供帮助，以产生和释放抗体。T辅助CD4+T细胞还可以参与活化抗原特异性CD8+T细胞。

在适宜的共刺激信号存在下，当CD8+T细胞特异性肽被主要组织相容性I类(MHC I)分子提呈至宿主细胞表面时，CD8+T细胞识别这些肽。为了被提呈至MHC I分子上，外源抗原需要直接进入细胞内部(细胞溶质或核)，例如当病毒或胞内细菌直接穿透宿主细胞时或DNA接种后就是这种情况。在细胞内部，抗原被加工为小肽，其被加载至MHC I分子上，MHC I分子被再引导至细胞表面。在活化时，CD8+T细胞分泌一系列细胞因子，例如干扰素γ，其活化巨噬细胞和其它细胞。具体地说，这些CD8+T细胞中的一部分在活化时分泌溶细胞分子和细胞毒性分子(例如颗粒酶、穿孔蛋白)。这样的CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞。

最近，已描述了替代的抗原提呈途径，其包括将胞外抗原或其片段加载至MHC I复合物上，被称为“交叉提呈”。

在CD4+T细胞中，T辅助1(Th1)亚型和T辅助2(Th2)亚型可以由它们在抗原识别后产生的应答类型限定。在识别肽-MHC II复合物时，Th1CD4+T细胞分泌白介素和细胞因子，例如干扰素γ、IL-2和TNF-α。相反，Th2CD4+T细胞一般分泌白介素，例如IL-4、IL-5或IL-13。

已知某些疫苗佐剂尤其适于刺激Th1或Th2型细胞因子应答。传统上，接种或感染后免疫应答的Th1：Th2平衡的最佳指示包括直接测量用抗原再刺激后由T淋巴细胞在体外产生的Th1或Th2细胞因子，和/或检测抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。

因此，Th1型佐剂是这样一种佐剂：其在用抗原体外再刺激时刺激分离的T细胞群产生高水平的Th1型细胞因子，并诱导与Th1型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答。

可被配制以生产适用于本发明的佐剂的优选Th1-型免疫刺激剂包括但不限于以下佐剂。

单磷酰脂A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)，是用于本发明的优选Th1型免疫刺激剂。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的众所周知的佐剂。化学上，常常以带有4、5或6条酰化链的3-脱-O-酰化单磷酰脂A的混合物提供。它可通过GB 2122204B中教导的方法纯化并制备，该文献还公开了二磷酰脂A及其3-O-脱酰化变体的制备。已描述了其它纯化的和合成的脂多糖(US 6,005,099和EP 0 729 473B 1；Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)：392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)：141-6；和EP 0 549 074B1)。优选形式的3D-MPL为具有直径小于0.2μm的小粒度的颗粒剂形式，其生产方法公开于EP 0 689 454。

皂苷也是符合本发明的优选Th1免疫刺激剂。皂苷是众所周知的佐剂，讲述于：Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.A review ofthebiological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine，第2卷，363-386页)。例如，Quil A(来自南美Quillaja Saponaria Molina树的树皮)及其分离级分描述于US 5,057,540和“Saponins as vaccineadjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；以及EP 0 362 279 B1。溶血皂苷QS21和QS17(HPLC纯化的Quil A分离级分)已被描述为有效的系统性佐剂，其生产方法公开于美国专利第5,057,540号和EP 0 362 279 B1。在这些参考文献中还描述了用作系统性疫苗的有效佐剂的QS7(Quil A的非溶血性级分)的用途。QS21的用途进一步描述于Kensil等(1991.J.Immunology 146卷，431-437)。QS21与聚山梨醇酯或环糊精的组合也为人所知(WO99/10008)。包含Quil A的分离级分如QS21和QS7的颗粒佐剂系统描述于WO 96/33739和WO 96/11711。一种这样的系统被称为ISCOM，并可以包含一种或多种皂苷。

另一种适宜的免疫刺激剂是含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的缩写。本领域已知CpG在通过系统和粘膜途径给予时是一种佐剂(WO 96/02555、EP 468520，Davis等，J.Immunol，1998，160(2)：870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)：4463-6)。历史上观察到BCG的DNA级分能够发挥抗肿瘤作用。在进一步的研究中，来自BCG基因序列的合成寡核苷酸表现出能够诱导免疫刺激作用(体内和体外都如此)。这些研究的作者得出结论：包含中心CG基序的某些回文序列具备此活性。之后在Krieg，Nature 374，546页，1995的出版物中阐释了CG基序在免疫刺激中的核心作用。详细的分析已表明，CG基序必须处于一定的序列背景中，并且这些序列在细菌DNA中常见，但很少处于脊椎动物DNA中。免疫刺激性序列常常是：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序未被甲基化，但已知其它未甲基化的CpG序列是免疫刺激性的，并且可用于本发明。

在某些情况下存在6个核苷酸的回文序列组合。可在同一寡核苷酸中存在数个这样的基序，其或者为一种基序的重复或者为不同基序的组合。一种或多种这样的含免疫刺激性序列的寡核苷酸的存在可以激活多种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素γ并具有溶细胞活性)和巨噬细胞(Wooldrige等，89卷(第8章)，1977)。其它含未甲基化CpG但不具有这一共有序列的序列现在也已被证实具有免疫调节性。

本发明人还推定，实际上这些含“CpG”的序列也对氧化敏感，加入本发明使用的含硫醇的还原性基团具有降低或消除这种不需要的氧化的进一步的好处。

在配制成疫苗时，CpG通常以游离溶液与游离抗原一起施用(WO96/02555；McCluskie和Davis，出处同上)，或共价缀合至抗原(WO98/16247)，或与诸如氢氧化铝之类的载体配制在一起((肝炎表面抗原)Davis等，出处同上；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。

上述这些免疫刺激剂可以与载体一起配制，所述载体例如为脂质体、水包油乳剂和/或金属盐，包括铝盐(如氢氧化铝)。例如，3D-MPL可与氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳剂(WO 95/17210)一起配制；QS21可有利地与含有胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳剂(WO 95/17210)或铝佐剂(alum)(WO 98/15287)一起配制；CpG可以与铝佐剂(Davis等，出处同上；Brazolot-Millan，出处同上)或其它阳离子载体一起配制。

还优选免疫刺激剂的组合，具体地说是单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合(WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)，更具体地说是如WO 94/00153所公开的QS21和3D-MPL的组合。或者，CpG加皂苷(如QS21)的组合也构成了一种用于本发明的有效佐剂。或者，皂苷可以配制在脂质体或ISCOM中，并与免疫刺激性寡核苷酸组合。

增强的系统包括单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合，特别是WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或WO 96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中QS21在含胆固醇的脂质体(DQ)中被猝灭。该组合还可以含有免疫刺激性寡核苷酸。

水包油乳液形式的、含QS21、3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂描述于WO 95/17210，是用于本发明的另一合适制剂。

用于本发明制剂的特别适合的佐剂组合如下：

i)3D-MPL+QS21，在脂质体制剂中

ii)3D-MPL+QS21，在水包油乳剂中

iii)3D-MPL+QS21+CpG，在脂质体制剂中，和

iv)3D-MPL+QS21+CpG，在水包油乳剂中

在本发明的又一方面，提供一种制备本文所述的疫苗制剂的方法，其中所述方法包括将本发明的多肽与适宜的佐剂混合。

药物组合物的给予可采用一个或一个以上的单独剂量形式，例如含有相同多肽的组合物的重复给药，或异质性“初免-加强”接种方案。异质性初免-加强方案在初免和加强时使用不同形式的疫苗给予，其各自本身可包括两次或更多次给予。初免组合物和加强组合物将共有至少一种抗原，虽然无需相同形式的抗原，但它可以是不同形式的相同抗原。

本发明的初免加强免疫可使用蛋白和基于DNA的制剂或病毒载体制剂的组合进行。这种策略被认为有效诱导广泛的免疫反应。含佐剂的蛋白疫苗主要诱导抗体和T辅助免疫反应，而DNA作为质粒或活载体的递送诱导强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。因此，蛋白和DNA或病毒载体接种的组合将提供广泛的免疫反应。这在HIV背景下特别有意义，因为中和抗体、CD4+T细胞和/或CTL被认为对抵抗HIV的免疫防御很重要。

根据本发明，接种方案可包括顺序(“初免-加强”)给予本发明的多肽抗原和编码所述多肽的DNA。所述DNA可以裸DNA如质粒DNA或重组活载体(如痘病毒载体、腺病毒载体)或任何其它适宜活载体的形式递送。蛋白抗原可注射一次或若干次，接着是一次或多次DNA或病毒载体给药，或者可首先使用DNA或病毒载体进行一次或多次给药，接着进行一次或多次蛋白免疫。

本发明的初免-加强免疫的具体例子包括用DNA、重组活载体(如修饰的痘病毒载体，例如修饰的病毒Ankara(MVA)载体，或甲病毒载体，例如委内瑞拉马脑炎病毒载体或腺病毒载体)初免，接着用蛋白(例如佐剂化蛋白)加强。

初免组合物和加强组合物均可以超过一剂递送。此外，可在初始的初免和加强给药之后，可交替地进一步给药，得到例如DNA质粒或病毒载体初免/蛋白加强/进一步的DNA质粒或病毒载体给药/进一步的蛋白给药。替代的初免加强方案例如可以包括用一剂或两剂蛋白初免，随后用DNA或病毒载体进行一次或两次加强。

所述密码子优化是指多核苷酸序列被优化，从而类似目标表达系统(例如原核生物系统，如大肠杆菌)中基因的密码子选择。具体而言，序列中的密码子选择被优化，从而类似高表达的大肠杆菌基因的密码子选择。

为在本发明重组系统中表达而优化密码子的目的有两重：提高重组产物的表达水平并使表达产物更均匀(获得更均匀的表达模式)。均匀性提高意味着无关的表达产物如截短物更少。适于大肠杆菌表达的密码子选择还可消除推断的“移码”序列以及过早终止和/或内部起始位点。

DNA代码有4个字母(A、T、C和G)，且使用这些拼成三个字母的“密码子”，其代表生物基因中编码的蛋白的氨基酸。沿着DNA分子的密码子线性序列被翻译成由那些基因编码的蛋白中的氨基酸线性序列。代码是高度简并的，61个密码子编码20种天然氨基酸，3个密码子代表“终止”信号。因此，大部分氨基酸由一个以上的密码子编码-事实上，数个氨基酸由4个或更多不同的密码子编码。

当一个以上的密码子可用于编码已知氨基酸时，观察到生物的密码子选择模式是高度非随机的。不同物种显示它们密码子选择的不同偏好，而且，密码子的利用在单一物种的以高水平和低水平表达的基因之间可能显著不同。这种偏好在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中是不同的，且某些物种较之其它物种显示出远离随机密码子选择的更强偏好。例如，人和其它哺乳动物与某些细菌或病毒相比，偏好不太强。由于这些原因，存在显著可能性的是：在大肠杆菌中表达的哺乳动物病毒的病毒基因，或在哺乳动物细胞中表达的外源或重组基因，对于有效表达具有不适当的密码子分布。据信存在密码子簇的异源DNA序列或在将要表达的宿主中很少观察到的密码子冗余，预示着在该宿主中的异源表达水平较低。

在本发明的多核苷酸中，密码子选择模式因此可由人免疫缺陷病毒的典型模式发生改变，从而更接近代表靶生物(例如大肠杆菌)的密码子偏好。

用于密码子优化的可公开得到的程序有很多，例如，“CalcGene”(Hale and Thompson，Protein Expression and Purification12：185-189(1998)。

本发明还扩展至谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸或其混合物(具体地说是一硫代甘油、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸)稳定HIV疫苗组分的作用，所述HIV疫苗组分例如包含免疫原性融合蛋白，所述免疫原性融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag均存在时，则在它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段，所述融合蛋白具体地说为F4。

在替代的方面或其它的方面，本发明提供本文描述的蛋白，例如在惰性环境中的F4蛋白，例如在其中已除去氧和/或蛋白避光保护的容器中。这似乎还能够最小化或消除蛋白的聚集和/或降解。所述蛋白例如可以在氮气下储存和/或在琥珀色小瓶中储存。

在本说明书的上下文中的包含是指包含性的，也就是说，所述实施方案包括相关元素，但不排除其它元素。

本发明还扩展至由本文描述的元素组成或基本由其组成的单独的实施方案，正如包含所述元素的方面/实施方案，反之亦然。

在本文件的背景部分中的描述是为了将本发明置于上下文中。不应被视为承认所述信息是已知的或是通常的一般知识。

显示以下实施例是为了阐述可用于制备本发明的颗粒的方法。

实施例

实施例1：HIV-1p24-RT-Nef-p17融合体F4和密码子优化的F4(co)的构建和表达

1.未密码子优化的F4

HIV-1gag p24(衣壳蛋白)和p17(基质蛋白)、逆转录酶和Nef蛋白在嗜菌体T7启动子(pET表达系统)的控制下，在大肠杆菌B834株(B834(DE3)是BL21(DE3)的甲硫氨酸营养缺陷型亲代)中表达。

它们表达为含有4种蛋白的完整序列的单一融合蛋白。成熟的p24编码序列来自HIV-1BH10分子克隆，成熟的p17序列和RT基因来自HXB2，且Nef基因来自BRU分离株。

诱导后，重组细胞表达显著水平的p24-RT-Nef-p17融合蛋白，其占总蛋白的10％。

当细胞在22℃下生长并诱导时，p24-RT-Nef-p17融合蛋白主要限于细菌裂解物的可溶性级分(甚至冻/融之后)。当在30℃下生长时，约30％的重组蛋白与不溶性级分关联。

融合蛋白p24-RT-Nef-p17由1136个氨基酸组成，分子量约为129kDa。全长蛋白在SDS凝胶上迁移至约130kDa。该蛋白基于其氨基酸序列具有7.96的理论等电点(pI)，这通过2D-凝胶电泳加以证实。

重组质粒的详述：

名称：pRIT15436(或实验室名称pET28b/p24-RT-Nef-p17)

宿主载体：pET28b

复制子：colE1

选择：卡那霉素

启动子：T7

插入序列：p24-RT-Nef-p17融合基因

重组蛋白的详述：

p24-RT-Nef-p17融合蛋白：1136个氨基酸

N-末端-p24：232个氨基酸-铰链区：2个氨基酸-RT：562个氨基酸-铰链区：2个氨基酸-Nef：206个氨基酸-P17：132个氨基酸-C-末端

核苷酸和氨基酸序列：

核苷酸序列

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aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaatta

ctaa [SEQ ID NO：1]

p24序列以粗体表示

Nef序列加下划线

方框：通过基因构建引入的核苷酸

氨基酸序列

MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP 50

QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREP 100

RGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS 150

ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK 200

TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL

GPISPIETVSVKLKPG 250

MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300

KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350

FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400

KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450

TPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLN 500

WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550

GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV 600

KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE 650

FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700

VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750

ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV

MGGK 800

WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850

CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900

RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950

EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000

NC

MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050

NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100

TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 1136

[SEQ ID NO：2]

P24序列：氨基酸1-232(粗体)

RT序列：氨基酸235-795

Nef序列：氨基酸798-1002

P17序列：氨基酸1005-1136

方框：通过基因构建引入的氨基酸

K(赖氨酸)：代替色氨酸(W)。引入突变除去酶活性。

重组蛋白的表达：

在pET质粒中，靶基因(p24-RT-Nef-p17)受到强嗜菌体T7启动子的控制。该启动子不能由大肠杆菌RNA聚合酶识别，且依赖于宿主细胞中的T7RNA聚合酶源。B834(DE3)宿主细胞含有在lacUV5控制之下的T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝，且表达通过向细菌培养物加入IPTG来诱导。

使预培养物于37℃在摇瓶中生长至对数中期(A620:0.6)，然后在4℃下过夜贮存(以避免静止期培养物)。使培养物在补加1％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的LBT培养基中生长。在生长培养基中加入葡萄糖的好处是减少基础重组蛋白表达(避免cAMP介导的lacUV5启动子的去抑制)。

使用于4℃过夜贮存的10ml培养物接种200ml含卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在30℃和22℃下生长，且当O.D.₆₂₀达到0.6时，加入IPTG(1mM终浓度)。使培养物再培养3、5和18小时(过夜)。在3、5和18小时诱导之前和之后采集样品。

如下进行提取物制备：

将细胞沉淀混悬于破碎缓冲液*(理论O.D.为10)中，并通过在弗氏破碎仪(20.000psi或1250bar)中流通4次而破碎。以20.000g离心粗提物(T)30分钟，以分离可溶性级分(S)和不溶性(P)级分。

*破碎缓冲液：50mM Tris-HCL pH 8.0，1mM EDTA，1mM DTT+蛋白酶抑制剂混合物(Complete/Boerhinger)

SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：

与不溶性沉淀(P)、上清液(S)和粗提物(T)相应的级分在10％还原SDS-PAGE上电泳。p24-RT-Nef-p17重组体通过考马斯蓝染色和蛋白质印迹(WB)检测。

考马斯染色：p24-RT-Nef-p17蛋白显现为：

一条带在±130kDa(使用理论分子量拟合)

理论分子量：128.970道尔顿

表观分子量：130kDa

蛋白质印迹分析：

试剂＝-针对RT的单克隆抗体(p66/p51)

购自ABI(Advanced Biotechnologies)

稀释度：1/5000

-碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体

稀释度：1/7500

表达水平-22℃诱导20小时后非常强的p24-RT-Nef-p17

特异性带，占总蛋白的最多10％(参见图1)

重组蛋白“溶解度”：

“新鲜的”细胞提取物(T、S、P级分)：于22℃/20小时生长/诱导下，在细胞提取物的可溶性级分中回收到几乎所有的p24-RT-Nef-p17融合蛋白(图1)。于30℃/20小时生长/诱导下，约30％的p24-RT-Nef-p17蛋白与不溶性级分关联(图1)

“冻/融”(S2、P2级分)：

于-20℃保存可溶性(S1)级分(22℃诱导20小时)。融化并以20.000g/30分钟离心：S2和P2(以1/10体积重悬浮)

含DTT的破碎缓冲液：几乎所有的p24-RT-Nef-p17融合蛋白仍然可溶(仅1-5％沉淀)(见图2)

不含DTT的破碎缓冲液：85-90％的p24-RT-Nef-p17仍然可溶(图2)

图：

图1-用于p24-RT-Nef-p17(F4)的考马斯染色和蛋白质印迹(10％SDS-PAGE-还原性)

图2-通过考马斯染色和蛋白质印迹检测的p24-RT-Nef-p17溶解度测定(还原性凝胶-10％SDS-PAGE)

除非指定了其它条件(例如温度、破碎缓冲液组成)，否则以下实施例的细胞生长和诱导条件及细胞提取物制备如实施例1所述一样。

2.密码子优化的F4

以下的多核苷酸序列被密码子优化，使得密码子选择类似在大肠杆菌中高表达的基因的密码子选择。氨基酸序列与针对以上未密码子优化的F4所给出的序列相同。

F4co的核苷酸序列：

atggtcattgttcagaacatacagggccaaatggtccaccaggcaattagtccgcgaact

cttaatgcatgggtgaaggtcgtggaggaaaaggcattctccccggaggtcattccgatg

ttttctgcgctatctgagggcgcaacgccgcaagaccttaataccatgcttaacacggta

ggcgggcaccaagccgctatgcaaatgctaaaagagactataaacgaagaggccgccgaa

tgggatcgagtgcacccggtgcacgccggcccaattgcaccaggccagatgcgcgagccg

cgcgggtctgatattgcaggaactacgtctacccttcaggagcagattgggtggatgact

aacaatccaccaatcccggtcggagagatctataagaggtggatcatactgggactaaac

aagatagtccgcatgtattctccgacttctatactggatatacgccaaggcccaaaggag

ccgttcagggactatgtcgaccgattctataagacccttcgcgcagagcaggcatcccag

gaggtcaaaaattggatgacagaaactcttttggtgcagaatgcgaatccggattgtaaa

acaattttaaaggctctaggaccggccgcaacgctagaagagatgatgacggcttgtcag

ggagtcggtggaccggggcataaagcccgcgtctta

ggcccgatatctccgat

agaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatggatggtccaaaggtcaagcagtggcc

gctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagagatttgtactgaaatggagaaggaagg

caagataagcaagatcgggccagagaacccgtacaatacaccggtatttgcaataaagaa

aaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagattttagggaactaaacaagcgaaccca

agacttttgggaagtccaactagggatcccacatccagccggtctaaagaagaagaaatc

ggtcacagtcctggatgtaggagacgcatattttagtgtaccgcttgatgaggacttccg

aaagtatactgcgtttactataccgagcataaacaatgaaacgccaggcattcgctatca

gtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtctccggcgatatttcagagctgtatgac

aaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccggatattgtaatttaccaatacatgga

cgatctctatgtgggctcggatctagaaattgggcagcatcgcactaagattgaggaact

gaggcaacatctgcttcgatggggcctcactactcccgacaagaagcaccagaaggagcc

gccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccggacaagtggacagtacagccgatagt

gctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgatattcagaaactagtcggcaagcttaa

ctgggcctctcagatttacccaggcattaaggtccgacagctttgcaagctactgagggg

aactaaggctctaacagaggtcatcccattaacggaggaagcagagcttgagctggcaga

gaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggggtatactacgacccctccaaggacct

tatagccgagatccagaagcaggggcagggccaatggacgtaccagatatatcaagaacc

gtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgcatgcgaggggctcatactaatgatgt

aaagcaacttacggaagcagtacaaaagattactactgagtctattgtgatatggggcaa

gaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaaacatgggaaacatggtggactgaata

ttggcaagctacctggattccagaatgggaatttgtcaacacgccgccacttgttaagct

ttggtaccagcttgaaaaggagccgatagtaggggcagagaccttctatgtcgatggcgc

cgcgaatcgcgaaacgaagctaggcaaggcgggatacgtgactaataggggccgccaaaa

ggtcgtaacccttacggataccaccaatcagaagactgaactacaagcgatttaccttgc

acttcaggatagtggcctagaggtcaacatagtcacggactctcaatatgcgcttggcat

tattcaagcgcagccagatcaaagcgaaagcgagcttgtaaaccaaataatagaacagct

tataaagaaagagaaggtatatctggcctgggtccccgctcacaagggaattggcggcaa

tgagcaagtggacaagctagtcagcgctgggattcgcaaggttctt

gggggta

agtggtctaagtctagcgtagtcggctggccgacagtccgcgagcgcatgcgacgcgccg

aaccagccgcagatggcgtgggggcagcgtctagggatctggagaagcacggggctataa

cttccagtaacacggcggcgacgaacgccgcatgcgcatggttagaagcccaagaagagg

aagaagtagggtttccggtaactccccaggtgccgttaaggccgatgacc

tataaggcagcggtggatctttctcacttccttaaggagaaaggggggctggagggctta

attcacagccagaggcgacaggatattcttgatctgtggatttaccatacccaggggtac

tttccggactggcagaattacaccccggggccaggcgtgcgctatcccctgactttcggg

tggtgctacaaactagtcccagtggaacccgacaaggtcgaagaggctaataagggcgag

aacacttctcttcttcacccggtaagcctgcacgggatggatgacccagaacgagaggtt

ctagaatggaggttcgactctcgacttgcgttccatcacgtagcacgcgagctgcatcca

gaatatttcaagaactgc

atgggcgccagggccagtgtacttagtggcggaga

actagatcgatgggaaaagatacgcctacgcccggggggcaagaagaagtacaagcttaa

gcacattgtgtgggcctctcgcgaacttgagcgattcgcagtgaatccaggcctgcttga

gacgagtgaaggctgtaggcaaattctggggcagctacagccgagcctacagactggcag

cgaggagcttcgtagtctttataataccgtcgcgactctctactgcgttcatcaacgaat

tgaaataaaggatactaaagaggcccttgataaaattgaggaggaacagaataagtcgaa

aaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccgggcacagcaaccaggtgtcccaaaacta

ctaa

[SEQ ID NO：3]

p24序列以粗体表示

Nef序列加下划线

方框：通过基因构建引入的核苷酸

将针对未密码子优化的F4所用的程序用于密码子优化的序列。

重组质粒的详述：

名称：pRIT15513(实验室名称：pET28b/p24-RT-Nef-p17)

宿主载体：pET28b

复制子：colE1

选择：卡那霉素

启动子：T7

插入序列：p24-RT-Nef-p17融合基因，密码子优化的

密码子优化的F4基因在大肠杆菌BLR(DE3)细胞-即B834(DE3)株的recA^-衍生物中表达。RecA突变防止λ嗜菌体的推断产生。

预培养物于37℃在摇瓶中生长至对数中期(A₆₂₀:0.6)，然后4℃过夜贮存(以避免静止期培养物)。

培养物在补加1％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的LBT培养基中生长。将葡萄糖加入到生长培养基中具有减少基础重组蛋白表达的优点(避免cAMP介导的lacUV5启动子的去抑制)。

使用4℃过夜贮存的10ml培养物接种200ml含卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在37℃下生长，且当O.D.₆₂₀达到0.6时，加入IPTG(1mM终浓度)。使培养物于22℃再培养19小时(过夜)。在19小时诱导之前和诱导时采集样品。

提取物制备如下：

将细胞沉淀重悬浮于样品缓冲液(理论O.D.为10)中，煮沸并直接加样在SDS-PAGE上。

SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：

粗提物样品在10％还原SDS-PAGE上电泳。

p24-RT-Nef-p17重组蛋白通过考马斯蓝染色(图2)和蛋白质印迹检测。

考马斯染色：p24-RT-Nef-p17蛋白显现为：

一条带在±130kDa(使用理论分子量拟合)

理论分子量：128.967道尔顿

表观分子量：130kDa

蛋白质印迹分析：

试剂＝-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)

稀释度：1/10.000

-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)

稀释度：1/10.000

-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体

稀释度：1/7500

于22℃诱导19小时后，重组BLR(DE3)细胞以非常高的水平表达F4融合蛋白，占总蛋白的10-15％。

与来自天然基因的F4相比，来自于密码子优化基因的F4重组产物谱稍稍简化。60kDa处的主F4-相关带以及下面的次要带没有显现(见图3)。与表达F4的B834(DE3)重组株相比，产生F4co的BLR(DE3)株具有下列优点：F4全长蛋白的产量越高，重组产物的条带谱的复杂性越低。

图3显示了密码子优化的F4的考马斯染色凝胶和蛋白质印迹，其中

实施例2：P51RT(截短的、密码子-优化的RT)的构建和表达

氨基酸428-448之间的RT/p66区对大肠杆菌蛋白酶敏感。P51构建体终止于Leu 427，导致RNA酶H结构域的去除。

在RT天然基因序列中鉴定的推断大肠杆菌“移码”序列也被去除(通过p51基因的密码子优化)。

p51合成基因的设计/构建：

根据大肠杆菌密码子选择设计合成p51基因的序列。因此，它被密码子优化，使得密码子选择类似大肠杆菌中高表达基因的密码子选择。合成基因如下构建：以一步PCR组装32个寡核苷酸。在第二个PCR中，使用末端引物扩增全长组装体，且即所得PCR产物克隆到pGEM-T中间质粒中。校正在基因合成过程中引入的点误差后，将p51合成基因克隆到pET29a表达质粒中。该重组质粒用于转化B834(DE3)细胞。

重组蛋白特征：

P51RT核苷酸序列

atg

ggtccgatctctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatg 60

gatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagag 120

atttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtac 180

aatacaccggtatttgcaataaagaagaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagat 240

tttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactaggtatcccacat 300

ccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatatttt 360

agtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaac 420

aatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtct 480

ccggcgatatttcagagctctatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccg 540

gatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattggg 600

cagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactact 660

cccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccg 720

gacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgat 780

attcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtc 840

cgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacg 900

gaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggg 960

gtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaa 1020

tggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgc 1080

atgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattact 1140

actgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaa 1200

acatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaattt 1260

gtcaacacgccgccgctggtaaaactg

taa 1302

[SEQ ID NO：4]

方框：通过基因构建引入的氨基酸

1.1氨基酸序列：

M

GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPY 60

NTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYF 120

SVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNP 180

DIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLKMGYELHP 240

DKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLT 300

EEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR 360

MRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEF 420

VNT PPLVKL 433

[SEQ ID NO：5]

方框：通过基因构建引入的氨基酸

K(赖氨酸)：代替色氨酸(W)。引入突变以除去酶活性。长度、分子量、等电点(IP)：

433个氨基酸，MW：50.3kDa，IP：9.08

1.2B834(DE3)细胞中的p51表达：

与RT/p66生产株平行评价P51表达水平和重组蛋白溶解度。

p51表达水平：

诱导条件：5小时内于37℃进行细胞生长/诱导(+1mM IPTG)。

破碎缓冲液：50mM Tris/HCl，pH：7.5，1mM EDTA，+/-1mMDTT。

蛋白质印迹分析：

试剂：-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释度：1/10,000)

-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释度：1/7500)

使与粗提物(T)、不溶性沉淀(P)和上清液(S)相应的细胞级分在10％还原SDS-PAGE上电泳。

正如考马斯染色凝胶和蛋白质印迹(图4)所说明的，观察到非常高的P51表达(占总蛋白的15-20％)，高于对P66所观察到的。

对于p51和p66蛋白(37℃诱导5小时后)，在细胞提取物的可溶性级分(S1)中回收到80％重组产物(见图4)。当在30℃表达时，99％重组蛋白与可溶级分关联(没有给出数据)。

p51蛋白质印迹谱为多带，但较之对P66所观察到的复杂程度低。溶解度测定

溶解度测定：在还原(含DTT的破碎缓冲液)和非还原条件下制备的可溶性(S 1)级分的冻/融(5小时诱导，37℃)。在融化后，以20.000g/30分钟离心S1样品，产生S2和P2(p2以1/10体积重悬浮)。

在还原以及非还原条件下制备的可溶性级分(S1)于冻/融后，在可溶性(S2)级分中仍然回收到99％的p51和p66。在沉淀(P2)中仅发现1％。这在图5中示出。

图5显示了RT/p51和RT/p66溶解性测定，其中S1是可溶性级分(于30℃诱导3小时，保存于-20℃，在融化后，S1样品以20.000g/30分钟离心，产生S2和P2(p2以1/10体积重悬浮)。

实施例3：Nef-p17的构建和表达

构建双融合蛋白

Nef-P17

重组质粒构建：

●pET29a/Nef-p17表达载体：

通过PCR从F4重组质粒扩增Nef-p17融合基因。将PCR产物克隆到中间pGEM-T克隆载体中，并随后克隆到pET29a表达载体中。

重组蛋白特征：

●长度、分子量、等电点(IP)：

Nef-p17(称为NP)：340个氨基酸，MW：38.5kDa，IP：7.48

●氨基酸序列和多核苷酸序列：

Nef-p17核苷酸序列

Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg 60

Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat 120

Ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca 180

Caagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact 240

Tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta 300

Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac 360

Ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga 420

Tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag 480

Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg 540

Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg 600

Gagtacttcaagaactgcaggcctatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaa 660

Ttagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaa 720

Catatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaa 780

Acatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatca 840

Gaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata 900

Gagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaag 960

Aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattac 1020

Taa 1023

[SEQ ID NO：6]

Nef-p17(NP)

MGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA 60

QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY 120

FPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREV 180

LEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNCMGARASVLSGGELDRWEKI RLRPGGKKKYKLK 240

HIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRI 300

EIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 340

[SEQ ID NO：7]

方框：通过遗传构建导入的氨基酸

Nef序列为粗体。

P17-Nef核苷酸序列：

Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg 60

Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag 120

Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata 180

Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat 240

Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct 300

Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct 360

Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctatgggtggcaag 420

Tggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgag 480

Ccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcaca 540

Agtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggag 600

Gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagct 660

Gtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa 720

Cgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattgg 780

Cagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaag 840

Ctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttg 900

Ttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggagg 960

Tttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaag 1020

Aactgctaa 1029

[SEQ ID NO：8]

实施例4：p24-RT＊-Nef-p17(F4＊)的构建和表达

F4*是F4(p24-RT/p66-Nef-p17)融合蛋白的突变形式，其中592位的甲硫氨酸被赖氨酸取代。该甲硫氨酸是推断的内部转录“起始”位点，这由对F4纯化实验的Q琼脂糖洗脱样品进行的N-末端测序支持。实际上，Q洗脱样品中存在的62kDa的主F4-相关小带在592位的甲硫氨酸处开始。

甲硫氨酸被赖氨酸取代：RMR→RKR。RKR基序天然存在于分化枝A RT序列中。

评价该突变对CD4-CD8表位的影响：

-一个HLA-A3CTL表位(A*3002)丢失，但另外9个HLA-A3表位存在于RT序列中。

-在该区中没有鉴定到辅助表位。

重组蛋白特征：

N-末端-

-C-末端

●长度、分子量、等电点(IP)：

1136个氨基酸，129kDa，IP：8.07

●核苷酸序列

atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact

ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg

ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg

gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa

tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca

aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca

aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat

aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa

ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag

gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag

actattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcag

ggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg

ggccccattagccctat

tgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggcc

attgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagg

gaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaa

aaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactca

agacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatc

agtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcag

gaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatca

gtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgac

aaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatgga

tgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagct

gagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacc

tccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagt

gctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaa

ttgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagagg

aaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcaga

aaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt

aatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagcc

atttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcacgtaaacgcggtgcccacactaatgatgt

aaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaa

gactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagta

ttggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaatt

atggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggc

agctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaa

agttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagc

tttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaat

cattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagtt

aataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaa

tgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta

ggtggca

agtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctg

agccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatca

caagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggagg

aggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact

tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta

attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac

ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga

tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag

aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg

ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg

gagtacttcaagaactgc

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaga

attagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaa

acatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttaga

aacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatc

agaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggat

agagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaa

gaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaatta

ctaa

[SEQ ID NO：9]

p24序列为粗体

Nef序列加下划线

方框：通过基因构建引入的核苷酸

●氨基酸序列

MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP 50

QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREP 100

RGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS 150

ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK 200

TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL

GPI SPIETVSVKLKPG 250

MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300

KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350

FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400

KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450

TPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLN 500

WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550

GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARKRGAHTNDV 600

KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE 650

FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700

VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750

ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV

MGGK 800

WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850

CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900

RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950

EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000

NCMGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050

NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100

TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 1136

[SEQ ID NO：10]

P24序列：氨基酸1-232(粗体)

RT序列：氨基酸235-795

Nef序列：氨基酸798-1002

P17序列：氨基酸1005-1136

方框：通过基因构建引入的氨基酸

K(赖氨酸)：代替甲硫氨酸(内部“起始”密码子)

K(赖氨酸)K：代替色氨酸(W)。引入突变以除去酶活性。

B834(DE3)细胞中的F4＊表达

与F4未突变构建体平行，在18小时内于22℃诱导F4*重组株。制备粗提物，并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。

如图6所示，F4*高水平表达(10％总蛋白)，稍高于F4，且小62kDa带消失。

图6显示了还原条件(10％SDS-PAGE还原性凝胶；诱导：19小时，22℃)下多种F4蛋白的SDS-PAGE分析，其中1为F4，2为F4*，3为F4(Q琼脂糖洗脱样品)，2.5μg，而4为F4(Q琼脂糖洗脱样品)250ng。

蛋白质印迹分析：

试剂：-合并3种单克隆抗p24(JC13.1，JC16.1，IG8.1.1)(稀释度1/5000)

-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释度：1/10000)

-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)(稀释度：1/10000)

-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释度：1/7500)

-碱性磷酸酶缀合的抗-小鼠抗体(稀释度：1/7500)

诱导条件：3小时内，37℃下细胞生长/30℃诱导(+1mM IPTG)。

破碎缓冲液：F4：50mM Tris/HCl，pH：8.0，50mM NaCl，1mMEDTA，+/-1mM DTT

蛋白质印迹分析：

试剂：-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释度：1/10,000)

-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)(稀释度：1/10000)

-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释度：1/7500)

实施例5：F4(p51)和F4(p51)＊的构建和表达

RT/p51用于F4融合构建体(代替RT/p66)。

F4(p51)＝p24-p51-Nef-p17

F4(p51)＊＝p24-p51＊-Nef-p17-突变的F4(p51)：推断的内部甲硫氨酸起始位点(存在于RT部分中)被赖氨酸取代，从而进一步简化了抗原谱。

重组质粒的构建：

F4(p51)：通过PCR从pET29a/p51表达质粒扩增编码p51的序列。将限制位点掺入到PCR引物中(NdeI和StuI位于编码序列的5′末端，AvrII位于编码序列的3′末端)。将PCR产物克隆到pGem-T中间质粒中并测序。pGem-T/p51中间质粒被NdeI和AvrII限制，且p51片段连接到由NdeI和NheI限制的pET28b/p24-RT/p66-Nef-p17表达质粒中(导致RT/p66序列的切除)。连接在T4DNA连接酶存在下于适宜的浓度通过组合消化反应进行。连接产物用于转化DH5α大肠杆菌细胞。通过DNA测序证实p51插入到正确的翻译读框中(代替f4融合蛋白中的RT/p66)。所得融合构建体p24-RT/p51-Nef-p17称作F4(p51)。

F4(p51)＊：推断的内部甲硫氨酸起始位点(存在于RT/p51中)的突变用“GeneTailor定点诱变系统”(Invitrogen)实现，产生F4(p51)*构建体。

F4(p51)和F4(p51)*表达质粒用于转化B834(DE3)细胞。

重组蛋白特征：

N-末端

-C-末端

●长度、分子量、等电点(IP)：

1005个氨基酸，114.5kDa，IP：8.47

●核苷酸序列(F4(p51)＊)

Atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact 60

Ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg 120

Ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg 180

Gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa 240

Tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca 300

Aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca 360

Aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat 420

Aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa 480

Ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag 540

Gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag 600

Actattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcag 660

Ggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg

GGTCCGATCTCT 720

CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG 780

TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG 840

GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA 900

AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA 960

ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG 1020

AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC 1080

TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC 1140

TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT 1200

ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC 1260

ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1320

GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1380

GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG 1440

ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAAACTAGTCGGCAAG 1500

CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1560

AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG 1620

GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1680

GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA 1740

GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT 1800

GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG 1860

GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1920

GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1980

AAACTG

ATGggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctact 2040

Gtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcga 2100

Gacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgt 2160

Gcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct 2220

Ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg 2280

Ggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctac 2340

Cacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatat 2400

Ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag 2460

Gccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgac 2520

Cctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc 2580

Cgagagctgcatccggagtacttcaagaactgc

ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTA 2640

TTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAA 2700

AAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAAT 2760

CCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCC 2820

CTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGT 2880

GTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG 2940

CAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAG 3000

GTCAGCCAAAATTACtaa 3018

[SEQ ID NO：11]

P24：以粗体表示的序列

P51：以大写字母表示的序列

Nef：以小写字母表示的序列

P17：加下划线的序列

方框：通过基因构建引入的核苷酸

●氨基酸序列(F4(p51)＊)

MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV 60

GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMT 120

NNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQ 180

EVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL

GPIS 240

PIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAI 300

KKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDED 360

FRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY 420

MDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKWTVQP 480

IVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELEL 540

AENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARKRGAHTN 600

DVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLV 660

KL

MGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAAC 720

AWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY 780

HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDD 840

PEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNCMGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKK 900

KYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYC 960

VHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 1005

[SEQ ID NO：12]

P24：氨基酸1-232

P51：氨基酸237-662

Nef：氨基酸666-871

P17：氨基酸874-1005

K(赖氨酸)：代替甲硫氨酸(内部“起始”密码子)

K(赖氨酸)K：代替色氨酸(W)。引入突变以除去酶活性。

B834(DE3)细胞中的F4(p51)表达：

与F4表达株平行评价F4(p51)表达水平和重组蛋白溶解度。

诱导条件：19小时内，细胞于37℃生长/22℃诱导(+1mMIPTG)。

破碎缓冲液：50mMTris/HCl pH：7.5，1mM EDTA，1mM DTT

蛋白质印迹分析：

试剂-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释度：1/10000)

-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)(稀释度：1/10000)

-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释度：1/7500)

在10％还原SDS-PAGE上分析与粗提物(T)、不溶性沉淀(P)和上清液(S)相对应的细胞级分。

F4(p51)以高水平(10％总蛋白)表达，类似于F4。在细胞提取物的可溶性级分(S)中回收到几乎所有的F4(p51)。用抗-Nef-tat试剂检测后，F4(p51)WB谱显示被简化(+/-60kDa以下的截短产物减少)。

B834(DE3)细胞中的F4(p51)＊表达：

与F4(p51)未突变构建体F4和F4*平行，于22℃诱导F4(p51)*重组株18小时。制备粗细胞提取物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。观察到F4(p51)和F4(p51)*融合蛋白的高表达，占总蛋白的至少10％。WB谱：低于+/-60kDa的截短产物减少。此外，就F4(p51)*构建体而言，47kDa带(由于内部起始位点)已消失。

实施例6：F4、F4(p51)＊和F4＊的纯化-纯化方法I

将含4种HIV抗原p24-RT-Nef-p17的融合蛋白F4按照纯化方法I从大肠杆菌细胞匀浆纯化，该方法包括下列主要步骤：

■F4的硫酸铵沉淀

■SO₃Fractogel阳离子-交换色谱(正电模式)

■辛基琼脂糖疏水作用色谱(正电模式)

■Q琼脂糖FF阴离子-交换色谱(正电模式)

■在SDS存在下的Superdex 200凝胶过滤色谱

■透析和浓缩

此外，用同一纯化方法I纯化F4(p51)*融合蛋白(RT被携带另外的突变Met592Lys的密码子优化的p51取代)和F4*蛋白(携带另外的Met592Lys突变的F4)。

蛋白定量

■使用Lowry测定法测定总蛋白。检测蛋白浓度之前，针对PBS，0.1％SDS过夜透析所有样品，以除去干扰物质(尿素，DTT)。BSA(Pierce)用作标准品。

SDS-PAGE和蛋白质印迹

■在还原或非还原SDS-PAGE样品缓冲液(+/-β-巯基乙醇)中制备样品，并于95℃加热5分钟。

■于200V在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上使用1mm厚的预制Novex Tris-甘氨酸凝胶或Criterion凝胶(Bio-Rad)分离蛋白75分钟。

■使用考马斯蓝R250目测观察蛋白。

■对于蛋白质印迹(WB)，于4℃以100V在1.5小时内或以30V过夜将蛋白从SDS-凝胶转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。

■使用针对不同抗原的单克隆抗体抗-p24、抗-Nef-Tat、抗-RT检测F4(有时，抗-p24和抗Nef-Tat的混合物用于检测最大数目的蛋白带)。

■碱性-磷酸酶缀合的抗-小鼠或抗-兔抗体与第一抗体结合，并使用BCIP和NBT作为底物目测蛋白带。

抗-大肠杆菌蛋白质印迹

■通过SDS-PAGE分离5μg蛋白(Lowry)，并转移到上述硝酸纤维素膜上。

■使用多克隆抗-大肠杆菌抗体检测残余的宿主细胞蛋白。使用如上的碱性-磷酸酶反应目测蛋白带。

纯化方法I

方法I包括硫酸铵沉淀和4个色谱步骤：

■在存在10mM DTT、1mM PMSF、1mM EDTA的50mM Tris缓冲液pH 8.0中以OD50(约360ml)匀浆大肠杆菌细胞。以1000bar进行2次Rannie流通。

■以14400×g离心20分钟除去细胞碎片和不溶性物质。

■将硫酸铵(AS)从3.8M原液加入到澄清过的上清液中，至1.2M终浓度。使蛋白于室温(RT)沉淀约2小时，然后通过离心(10min，14400×g)沉淀。将沉淀重混悬于8M尿素、10mMDTT的10mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中。

■在存在8M尿素和10mM DTT的pH 7.0磷酸盐缓冲液中，在SO₃Fractogel柱(Merck)上捕获抗原。洗涤柱子，从而洗脱下未结合的蛋白，接续用170mM NaCl的预洗脱步骤，以除去结合的宿主细胞蛋白(HCP)。然后用460mM NaCl、8M尿素、10mM DTT的磷酸盐缓冲液pH 7.0洗脱F4。

■使用pH 7的10mM磷酸盐缓冲液2倍稀释SO₃洗脱液，并在存在4M尿素、1mM DTT、230mM NaCl的pH 7.0磷酸盐缓冲液中，上样到辛基琼脂糖柱(AmershamBiosciences)。洗涤步骤(平衡缓冲液)之后，用pH 8.0的8M尿素、1mM DTT的25mM Tris缓冲液洗脱结合的F4。

■稀释辛基洗脱液，并调节至pH 9.0，然后在pH 9.0的8M尿素(25mM Tris)存在下，F4与Q琼脂糖柱(AmershamBioscience)结合。洗掉(8M尿素、25mM Tris，pH 9.0)未结合的蛋白，并通过预洗脱步骤(90mM NaCl，溶于8M尿素、25mM Tris中，pH 9.0)除去HCP和F4-降解产物。使用200mM NaCl、8M尿素的Tris缓冲液pH 9.0将F4从柱子上解吸。

■将1％SDS加入Q洗脱液的等分试样，并针对含0.1％SDS和1mM DTT的PBS缓冲液透析，从而在将样品注射到凝胶过滤柱(制备级Superdex 200，连续的两个16×60cm柱)上之前除去尿素。过程中的SDS-PAGE分析之后合并相关级分。

■在室温下，在透析膜(12-14kDa截留分子量)中，针对1升0.5M精氨酸、10mM Tris、5mM谷胱甘肽，pH 8.5过夜透析样品两次。

连续纯化步骤以下面的流程图表示。

纯化流程图360ml匀浆OD50(Rannie)

50mM Tris pH 8.0，1mM PMSF，10mM DTT，2mM EDTA

↓

澄清

14400×g离心20分钟

↓

硫酸铵沉淀

1.2M AS，2h，RT，14400×g离心，10min

↓

将沉淀重混悬于8M尿素、10mM PO₄、10mM DTT，pH 7.0中

↓

(+)S03Fractogel EMD 650(M)色谱

pH 7.0，8M尿素，10mM DTT，170mM NaCl预洗脱，460mM NaCl洗

脱

↓

2×稀释至pH 7.0，4M尿素，5mM DTT，230mM NaCl

↓

(+)辛基琼脂糖色谱

pH 7.0，4M尿素，230mM NaCl，8M尿素，20mM Tris pH 8.0洗脱

↓

约2×稀释，调节至pH 9.0(NaOH)

↓

(+)Q琼脂糖FF色谱

Tris pH 9.0，8M尿素，90mM NaCl预洗脱，200mM NaCl洗脱

↓

加入1％SDS

↓

透析→TBS，0.1％SDS，pH 8.5

↓

Superdex 200凝胶过滤色谱16×120cm

2.TBS，0.1％SDS，pH 8.5

↓

IPA SDS-PAGE

↓

合并/浓缩/透析

→配制相容的缓冲液

IPA-过程中分析

如果没有特别说明，所有缓冲液均含有1mM DTT。

实施例7：F4和F4co(密码子优化的)的纯化-纯化方法II

纯化方法II

还开发了与方法I相比更简化的纯化程序-方法II。方法II仅由2个色谱步骤和用于缓冲液交换的最终透析/渗滤组成。特别地，引入CM hyperZ色谱柱(BioSepra)替代方法I的澄清步骤、硫酸铵沉淀和SO₃色谱(参见实施例6)。方法II用于纯化F4和完全密码子优化的F4(“F4co”)。对于F4co而言，进行了两种不同形式的方法II，其中一种包括羧酰胺化，另一种不包括。羧酰胺化步骤的目的是防止蛋白的氧化聚集。该羧酰胺化在第一次色谱步骤(CM hyperZ)之后进行。

■在存在10mM DTT的pH 8.050mM Tris缓冲液中，以OD90对大肠杆菌细胞(表达F4或F4co)进行匀浆。1000巴下进行2次Rannie流通。

■在用于CM hyperZ树脂(BioSepra)之前，将8M尿素加入到匀浆中，所述树脂使用8M尿素的磷酸盐缓冲液pH 7平衡。抗原捕获以分批模式进行。然后将树脂填装到柱中，使用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白，通过用120mM NaCl的预洗脱步骤除去结合的宿主细胞蛋白(HCP)。然后用360mM NaCl，8M尿素，10mM DTT的磷酸盐缓冲液pH 7.0洗脱F4co。

■为了控制融合蛋白的氧化聚集，F4co的半胱氨酸基团可以用碘乙酰胺羧酰胺化。因此，任选地，将50mM碘乙酰胺加入到CM hyperZ洗脱液中，并于室温在黑暗中进行30分钟的羧酰胺化。

■然后充分稀释(约5-8倍)CM hyperZ洗脱液，并调节至pH9.0。然后在8M尿素存在下于pH 9.0的Tris缓冲液中，F4co或F4coca(密码子优化的羧酰胺化)与Q琼脂糖柱(AmershamBioscience)结合。使用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白，并用含90mM NaCl(仅含未羧酰胺化的蛋白)的相同缓冲液的预洗脱步骤除去结合的HCP。用含200mM NaCl，8M尿素的pH 9.0的Tris缓冲液使F4co从柱子上解吸。

■于室温在透析膜(12-14kDa，截留分子量)中，针对1升0.5M精氨酸、10mM Tris缓冲液、10mM谷胱甘肽(仅加入到未羧酰胺化的蛋白中)，pH 8.5过夜透析样品两次。或者，缓冲液交换通过使用具有30kDa或50kDa截留分子量的切向流膜，针对10个样品体积的相同缓冲液渗滤而完成。

■最后，通过0.22μm膜除菌过滤透析产品。

连续纯化步骤在下面的流程图中表示。

纯化流程图

匀浆OD90(Rannie)

50mM Tris pH 8.0，10mM DTT

↓

加入8M尿素，调节至pH 7.0

↓

(+)CM hyperZ色谱

pH 7.0，8M尿素，10mM DTT，120mM NaCl预洗脱，360mM NaCl

洗脱

↓

任选的羧酰胺化：加入50mM碘乙酰胺，30分钟，RT

↓

稀释并调节至pH 9.0，8M尿素

↓

(+)Q琼脂糖FF色谱

Tris pH 9.0，8M尿素，预洗脱，使用NaCl*洗脱

↓

透析/渗滤

→磷酸盐缓冲液，0.5M精氨酸，pH 8.5(10mM谷胱甘肽)

↓

除菌过滤

如果F4co没有被羧酰胺化，则所有缓冲液均含DTT，并在纯化的原液中包含谷胱甘肽。一旦蛋白被羧酰胺化，则省略还原剂。*NaCl-就F4co而言，是200mM NaCl，对于F4coca，洗脱是通过NaCl梯度进行的。对于F4coca，该步骤可通过用60mM NaCl预洗脱并使用100mM NaCl洗脱以进一步优化；而对于F4co，该步骤可通过用100mM NaCl洗脱进一步优化(无需预洗脱步骤)。

结果：F4co的纯化

图7显示了在F4co纯化和羧酰胺化的F4co(“F4coca”)纯化过程中收集的含F4级分的SDS凝胶。

在8M尿素存在下，CM hyperZ树脂完全捕获粗匀浆中的F4co(第1道)，并用360mM NaCl实现定量洗脱。第2道中所示的CMhyperZ洗脱液富含大量F4co。将样品适当稀释并调节至pH 9后，F4co或F4coca与Q琼脂糖柱结合。然后如第3道所示，用200mM NaCl特异性洗脱F4co或F4coca。该色谱不仅除去剩余的宿主细胞蛋白，而且还除去DNA和内毒素。为了使纯化物质进入制剂相容性缓冲液中，针对10mM Tris缓冲液、0.5M精氨酸、10mM谷胱甘肽，pH 8.5，在具有12-14kDa截留分子量的透析膜中透析Q琼脂糖洗脱液。对于羧酰胺化蛋白省略谷胱甘肽。

F4co和F4coca的纯化均产生约500mg纯化物质/L培养物OD130。其与之前用未密码子优化的F4所观察到的处于相似的范围内。

如上所述，已经开发了两种不同的纯化方法(I和II)来纯化不同的F4构建体。图8比较所得的不同的纯化原液。

F4呈现出几种强的低分子量(LMW)带，密码子优化的F4co仅可见到较弱的带。方法I和方法II产生非常相似的F4co谱。抗大肠杆菌蛋白质印迹分析证实了纯化蛋白的纯度，表明所有制剂中的宿主细胞蛋白污染低于1％。

实施例8

测试两种可以避免氧化的抗氧化剂机制：

螯合剂：

在某些制剂中，螯合剂能够螯合制剂中存在的可催化氧化反应的离子。对于含本发明所用的蛋白的制剂可以测试这一项。

含-SH的化合物：

这些抗氧化剂的-SH官能团可以在蛋白与F4co的-SH官能团反应后稳定蛋白，或者可以被氧化，以代替蛋白的-SH官能团。

测试了4种螯合剂，即：柠檬酸三钠盐、苹果酸钠盐、葡萄糖、L-甲硫氨酸，并测试了4种抗氧化剂，即谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和一硫代甘油。

选定试剂的效力根据其避免F4co的分子间和/或分子内氧化的能力来评价。将对测试的抗氧化剂获得的结果与用亚硫酸钠(还原剂)+EDTA(螯合剂)获得的结果相比较，在后一种情况下，仅避免了分子内氧化。

图9显示了通过非还原条件的SDS PAGE在非还原条件下分析的螯合剂柠檬酸、L-甲硫氨酸、苹果酸和葡萄糖的筛选，其中：

1柠檬酸三钠盐 0.5％重量/体积

2柠檬酸三钠盐 1.0％重量/体积

3柠檬酸三钠盐1.5％重量/体积

4柠檬酸三钠盐2.0％重量/体积

5L-甲硫氨酸0.001％重量/体积

6L-甲硫氨酸0.01％重量/体积

7L-甲硫氨酸0.1％重量/体积

8L-甲硫氨酸0.5％重量/体积

9苹果酸钠盐0.001％重量/体积

10苹果酸钠盐0.01％重量/体积

11苹果酸钠盐0.1％重量/体积

12苹果酸钠盐0.5％重量/体积

13葡萄糖0.001％重量/体积

14葡萄糖0.01％重量/体积

15葡萄糖0.1％重量/体积

16葡萄糖1.0％重量/体积

抗氧化剂的筛选以2个步骤实施。首先，以8种试剂对30μg剂量的最终原液进行预筛选。然后，根据结果，有效的抗氧化剂经受了对最终原液和90μg剂量的成品(Final Container)的筛选。

a.对30μg剂量的预筛选(最终原液)

对30μg剂量的预筛选测试以非还原条件的SDS-PAGE对4℃储存1天的最终原液进行分析。

b.对90μg剂量的筛选

以90μg制剂进一步分析所筛选的潜在抗氧化剂，以分析经由不同的配制步骤的效力，所述配制步骤包括最终原液的储存、分装、冻干和复溶。

抗原溶解度

-目测观察

以比色皿在自然光前观察制剂(500μl)。制剂被描述为‘澄清的’(透明溶液)或‘浑浊的’。

-离心(14300g，15分钟)，之后是还原条件的SDS-PAGE

对于半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油或谷胱甘肽，未观察到对F4co溶解度的负面作用。

抗原氧化

非还原条件的SDS-PAGE

将配制的蛋白与纯化原液、阴性对照(用EDTA和亚硫酸钠配制的F4co)和阳性对照(未加入亚硫酸钠和EDTA配制的F4co)比较。

稳定性测试和加速稳定性测试

最终原液：

于4℃储存后T1(第1天)、T8(第8天)和T15(第15天)非还原条件的SDS-PAGE。

复溶的成品：

在冻干后(T0)或37℃*储存7天后或在AOT**下以水复溶饼块后非还原条件的SDS PAGE。

于25℃以脂质体佐剂复溶后24小时非还原条件的SDS PAGE。

于25℃储存4小时后以脂质体佐剂复溶的成品的还原条件SDS-PAGE。

*7天，37℃

使冻干饼块经受37℃的温度7天，以便加速稳定性。之后，以注射用水复溶饼块，以便通过非还原条件的SDS-PAGE分析。

**加速氧化测试(AOT)

使冻干饼块经受765w/m²光照15小时，以迫使产品曝光。之后，以注射用水复溶饼块，以便通过非还原条件的SDS-PAGE分析。

a)配制流程图

按照以下流程图制备多种制剂，但亚硫酸钠已被相关的抗氧化剂替代。

H₂O

+

蔗糖30％(商品124959)

+

NaH₂PO₄.2H₂O/K₂HPO₄100mM pH 6.8(商品121518&进行中

(ongoing))

+

NaH₂PO₄.2H₂O 10mM/精氨酸0.8M pH 6.8(商品121518&127636)

+

吐温80.3％重量/体积(商品129042)

+

EDTA二钠10mM pH 6.8，10X稀释时(商品416234)

+

抗氧化剂

+

F4co(Tris 10mM/精氨酸0.4M/Na₂SO₃10mM/EDTA 1mM；pH 8.5)

检查和/或调节至pH 7.5+/-0.1

于+4℃不搅拌储存

分装+冻干

结果

含-SH化合物的筛选

分析包含-SH官能团的制剂：谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸。

●对30μg剂量的预筛选(最终原液)

含-SH的化合物在最终原液步骤于4℃1天后表现出有前景的结果：在所测试的最高浓度(0.625％)既没有观察到分子内氧化，也没有观察到分子间氧化。

●对90μg剂量的筛选

最终原液稳定性

包含谷胱甘肽或一硫代甘油的90μg剂量制剂的非还原条件SDSPAGE示于图10，采用半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸的该SDS PAGE示于图11。

图10显示了非还原条件的SDS-PAGE：含谷胱甘肽和一硫代甘油的制剂于4℃T15天的最终原液稳定性。图10的SDS-PAGE说明：

1PB

2CTRL+

3CTRL-

4GSH 0.00625％

5GSH 0.0625％

6GSH 0.625％

7MTG 0.00625％

8MTG 0.0625％

9MTG 0.625％

10在其缓冲液中的PB

图11显示了非还原条件的SDS-PAGE：含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的制剂于4℃T15天的最终原液稳定性。图11的SDS-PAGE说明：

1PB

2CTRL+

3CTRL-

4Cyst 0.00625％

5Cyst 0.0625％

6Cyst 0.625％

7Acyst 0.00625％

8Acyst 0.0625％

9Acyst 0.625％

10在其缓冲液中的PB

证实了谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸在最终原液于4℃储存15天过程中的效力。

就最终原液于4℃的稳定性而言，谷胱甘肽0.625％、一硫代甘油0.625％、半胱氨酸0.625％和乙酰半胱氨酸0.625％与亚硫酸钠至少等效。

总之，含0.5％重量/体积浓度的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油的F4制剂于4℃储存1、8或15天时没有显示出任何分子间氧化或分子内氧化的迹象。

含0.5％重量/体积的谷胱甘肽的F4制剂于4℃储存1、8或15天时没有显示出分子间氧化或分子内氧化的迹象。

使用0.13％重量/体积的亚硫酸钠的相应制剂于4℃储存1、8或15天时显示出一些分子间氧化。

所测试的4种螯合剂的制剂于4℃储存24小时时全部显示出分子间氧化和分子内氧化。

成品稳定性和加速稳定性

于T0(时间0)在注射用水复溶后通过非还原条件SDS PAGE分析饼块，并与经受加速稳定性(7天37℃和/或AOT[加速氧化测试)的饼块比较。

当以0.5％重量/体积使用N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油时，于37℃储存7天的饼块没有显示出分子间氧化或分子内氧化的迹象。当以0.5％重量/体积使用半胱氨酸或谷胱甘肽或以0.13％重量/体积使用亚硫酸钠时，观察到一些分子间氧化。

图12显示了含谷胱甘肽和一硫代甘油的复溶冻干抗原(饼块)的非还原条件的SDS-PAGE，其中

1CTRL+

2CTRL-

3GSH 0.625％

4MTG 0.00625％

5MTG 0.0625％

6MTG 0.625％

对饼块进行加速测试

含-SH官能团的4种化合物即便在所述饼块接受加速稳定性(7天37℃，AOT，或二者的组合)之后，也至少与亚硫酸钠等效。一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸的最高测试浓度(0.5％)比10mM亚硫酸钠更有效避免F4co氧化。

由这些数据结果可以得出关于效力的结论：

●0.5％谷胱甘肽提供与10mM亚硫酸钠等效的稳定性。

●而0.5％一硫代甘油、0.5％半胱氨酸、0.5％乙酰半胱氨酸提供优于10mM亚硫酸钠的稳定性。

F4co溶解度

在以AS01B复溶饼块4小时后，研究选定的赋形剂对F4co溶解度的影响。图13显示了针对半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸获得的结果，其中

1CTRL+

2CTRL-

3Cyst 0.625％

4Acyst 0.00625％

5Acyst 0.0625％

6Acyst 0.625％

图14：还原条件的SDS-PAGE：以含MPL和QS21的脂质体佐剂复溶含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的饼块，于25℃4小时后(离心之前和之后)，其中：

1CTRL+

2CTRL-

3Cyst 0.5％

4Acyst 0.5％

且其中：

NC 未离心的

SN 上清液

P 沉淀

总之，含0.5％重量/体积浓度的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油的F4制剂在与含MPL和QS21的脂质体佐剂一起于25℃储存24小时时没有显示出任何分子间氧化或分子内氧化的迹象。含0.5％重量/体积的谷胱甘肽的F4制剂在与含MPL和QS21的脂质体佐剂一起于25℃储存24小时时显示出一些分子间氧化。使用0.13％重量/体积的亚硫酸钠的相应制剂在等同条件下储存时显示出一些分子间氧化。

具有较低量的抗氧化剂的制剂显示出不同程度的氧化。

Claims

1.一种用于HIV疫苗或液体原液的组分，所述组分包含：

a)免疫原性融合蛋白，所述融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，以及p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag均存在时，在它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段，和

b)稳定剂，所述稳定剂为含硫醇官能团的抗氧化剂，例如选自：谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物。

2.权利要求1的组分或液体原液，其中所述稳定剂为谷胱甘肽。

3.权利要求1的组分或液体原液，其中所述稳定剂为一硫代甘油。

4.权利要求1的组分或液体原液，其中所述稳定剂为半胱氨酸。

5.权利要求1的组分，其中所述稳定剂为N-乙酰半胱氨酸。

6.权利要求1-5中任一项的组分或液体原液，其中所述稳定剂的浓度使得最终制剂中的浓度为约0.5％重量/体积。

7.权利要求1-6中任一项的组分或原液，所述组分或原液进一步包含蔗糖、葡萄糖、甘露醇或果糖。

8.权利要求7的组分或原液，其中所述蔗糖、葡萄糖、甘露醇或果糖的浓度使得最终制剂的浓度为1-10％(重量)。

9.权利要求1-8中任一项的组分或原液，所述组分或原液进一步包含精氨酸。

10.权利要求9的组分或液体原液，其中所述精氨酸的浓度为200-400mM。

11.权利要求1-10中任一项的组分或液体原液，所述组分或液体原液进一步包含螯合剂。

12.权利要求11的组分或液体原液，其中所述螯合剂选自柠檬酸三钠盐、苹果酸钠盐、葡萄糖、L-甲硫氨酸或EDTA二钠。

13.权利要求12的组分或液体原液，其中所述螯合剂为EDTA。

14.权利要求12或权利要求13的组分或原液，其中所述螯合剂的浓度为每剂0.5mM-2mM。

15.权利要求14的组分或液体原液，其中所述螯合剂的浓度使得最终制剂的浓度为1mM-1.25mM。

16.权利要求1-15中任一项的组分或原液，所述组分或原液进一步包含非离子表面活性剂。

17.权利要求16的组分或原液，其中所述非离子表面活性剂为吐温80。

18.权利要求16或权利要求17的组分或原液，其中所述非离子表面活性剂的浓度使得最终制剂的浓度为0.005％重量/体积至约0.05％重量/体积。

19.权利要求1-18中任一项的组分或原液，所述组分或原液进一步包含缓冲剂。

20.权利要求19的组分或原液，其中所述缓冲剂为磷酸盐(PO₄)缓冲剂，例如磷酸钠。

21.权利要求19或权利要求20的组分或原液，其中所述缓冲剂的浓度使得最终制剂的浓度为1mM-50mM。

22.权利要求1-22中任一项的组分或原液，所述组分或原液进一步包含防腐剂。

23.权利要求22的组分或原液，其中所述防腐剂为硫柳汞。

24.用于HIV疫苗的原液或组分，所述原液或组分包含：

a)免疫原性融合蛋白，所述免疫原性融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，以及p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag均存在时，在它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段，

b)稳定剂，所述稳定剂为包含硫醇官能团的抗氧化剂，所述稳定剂例如选自谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物，

c)1％重量/体积或以下的非离子表面活性剂，

d)200mM-450mM精氨酸，

e)0.5mM-2.0mM螯合剂，

f)1mM-50mM缓冲剂。

25.一种冻干组分或液体原液，其如权利要求1-24中的任一项所定义。

26.一种药物组合物或疫苗，所述药物组合物或疫苗包含如权利要求1-24中的任一项所定义的组分。

27.权利要求26的药物组合物或包含权利要求25的冻干抗原的疫苗，所述药物组合物或疫苗进一步包含佐剂。

28.权利要求27的药物组合物或疫苗，其中所述佐剂包含TLR 4激动剂。

29.权利要求28的药物组合物或疫苗，其中所述TRL 4激动剂为MPL。

30.权利要求27-29中任一项的药物组合物或疫苗，其中所述佐剂进一步包含皂苷。

31.权利要求30的药物组合物或疫苗，其中所述皂苷为QS21。

32.权利要求27-31中任一项的药物组合物或疫苗，其中所述佐剂以脂质体制剂提供。

33.权利要求1-24中的任一项所定义的组分或原液或权利要求26-31中的任一项所定义的药物组合物或疫苗，它们用于治疗和/或预防HIV或AIDS。

34.权利要求1-24中的任一项所定义的组分或最终原液或权利要求26-31中的任一项所定义的药物组合物在制备用于治疗或预防HIV或AIDS的药物中的用途。

35.一种用于治疗或预防HIV或AIDS的治疗方法，所述方法包括给予治疗有效量的如在权利要求26-32中的任一项所定义的药物组合物或疫苗。

36.具有至少一个硫醇官能团的抗氧化剂用于稳定免疫原性融合蛋白的制剂的用途，所述免疫原性融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，以及p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24Gag均存在时，则在它们之间存在至少一种HIV抗原或免疫原性片段。

37.权利要求36的用途，其中所述抗氧化剂选自一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。

38.权利要求36或37的用途，其中所述蛋白为F4。

39.一种药盒，所述药盒包括权利要求25中所定义的冻干组分和单独的装有佐剂的容器。

40.一种复溶如权利要求25所定义的冻干组分的方法，所述方法包括将液体佐剂加入所述组分中的步骤。