CN105861679A

CN105861679A - Pcsk9在食管鳞癌诊治中的用途

Info

Publication number: CN105861679A
Application number: CN201610282186.3A
Authority: CN
Inventors: 肖枫; 王欣月; 杨承刚
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: CN105861679B

Abstract

本发明公开了PCSK9在食管鳞癌诊治中的用途。食管鳞癌是常见的消化道恶性肿瘤，实验证明，PCSK9基因在食管鳞癌组织中表达上调，PCSK9基因的过表达能促进食管鳞癌细胞的生长，抑制PCSK9基因的过表达可以抑制食管鳞癌细胞的过度增殖。本发明提供了一种食管鳞癌的诊断方法，同时提供了一种治疗食管鳞癌的潜在药物靶点。

Description

PCSK9在食管鳞癌诊治中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及PCSK9在食管鳞癌诊治中的用途。

背景技术

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其具有发病率高、预后差的特点，全世界每年新增的食管癌患者超过30万，每年死于食管癌的患者约20万人。中国是食管癌发病率和死亡率均较高的国家，食管癌在中国的恶性肿瘤死亡率高居前五位，而在美国，食管癌在恶性肿瘤中的死亡率仅1-2％，排名十位以后。食管癌根据临床病理类型分为食管鳞癌和食管腺癌，而在中国，约有90％以上的患者是食管鳞癌，而且食管癌的发病也具有非常明显的地区性，高发区和低发区之间的发病率可以相差60倍之多，河南省林县及太行山脉地区就属于典型的食管癌高发区。

食管鳞癌的治疗目前主要以手术治疗为主，再辅以放、化疗、生物治疗等辅助治疗。尽管在随着科学技术的进步，食管鳞癌在诊断和治疗技术水平上都得到了提高，食管鳞癌的综合治疗模式也已经形成，但是治疗的效果并不十分令人满意，食管鳞癌术后五年的生存率仅为20～30％。而且由于食管解剖结构的独特性，在粘膜固有层和粘膜肌层存在着丰富的淋巴管道，这是其他消化道所没有的，因此，即使是T分期较早的食管癌也会发生淋巴结的转移。而且有资料提出，对于已完全切除的食管癌，仍然约有27％的患者在手术后的2～3年内出现淋巴结转移性复发。

食管鳞癌已经成为目前世界上严重威胁人类生命健康的疾病之一。与其他的恶性肿瘤一样，食管鳞癌的演进是一个复杂的病理过程，它不仅包括了正常细胞的恶变，还包括了肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。但是，到目前为止，食管鳞癌的发病机制尚不十分清楚，而对于食管鳞癌的治疗目前并没有较为有效的方法。因此，探讨食管鳞癌的发生、发展、浸润和转移的确切机制，对于更有效的预防和治疗食管鳞癌都具有非常重要的意义。

PCSK9也称作神经细胞凋亡调节转换酶1，是一种蛋白酶K样亚麻酶。人PCSK9是一种分泌蛋白，主要在肾、肝和肠中表达。其具有三个结构域：抑制性前结构域、催化结构域以及长度为210个残基的富含半胱氨酸残基的C末端结构域。PCSK9作为酶原被合成，在内质网中经历在结构域与催化结构域之间的自身催化裂解。PCSK9与血浆中低密度脂蛋白胆固醇的水平有关，其在肝细胞和神经元细胞的分化中起作用，在胚胎肝中高表达，且明显参与胆固醇的稳态。但是目前并没有报道表明PCSK9与食管鳞癌的发生发展相关，通过研究PCSK9与食管鳞癌的关系，以期寻找食管鳞癌有效的分子标记物，对于食管鳞癌的研究具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供PCSK9基因在食管鳞癌诊治中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种基因及其表达产物在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用，其中，所述基因为PCSK9。

进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PCSK9基因及其表达产物的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。

其中，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增PCSK9基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增PCSK9基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与PCSK9蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与PCSK9基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PCSK9蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PCSK9基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述用实时定量PCR诊断管鳞癌的产品至少包括的一对特异扩增PCSK9基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述基因芯片可用于检测包括PCSK9基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PCSK9蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过同时检测多个食管鳞癌的标志物，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。

本发明提供了一种诊断食管鳞癌的产品，所述产品能够通过检测食管组织中PCSK9基因的表达水平来诊断食管鳞癌。

进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PCSK9基因转录水平的针对PCSK9基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PCSK9蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PCSK9基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PCSK9蛋白的特异性抗体。

本发明所述的基因检测试剂盒可用于检测包括PCSK9基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括PCSK9蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。

进一步，所述试剂包括针对PCSK9基因的引物和/或探针。

本发明中针对PCSK9基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明提供了PCSK9基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括PCSK9基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制PCSK9基因表达的物质、抑制PCSK9基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制PCSK9基因表达产物活性的物质。

进一步，所述抑制剂是针对PCSK9基因的siRNA。优选的，所述针对PCSK9基因的siRNA的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了一种治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物包含PCSK9基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制PCSK9基因表达的物质、抑制PCSK9基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制PCSK9基因表达产物活性的物质。

进一步，上述的药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。

稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本发明药物的单位剂型可以使多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如丸剂、粉剂、片剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如悬浮液、溶液、乳状液、酏剂、糖浆等。本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、肺内给药、直肠内给药、鼻内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、肌内给药、静脉内给药。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

本发明中所述PCSK9蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PCSK9蛋白的特异性抗体包括但不限于全长或完整的抗体、抗原结合片段、任何上述物质的衍生物、嵌合分子、任何上述物质与另一种多肽的融合物、或为了选择性结合PCSK9功能的目的而掺入任何上述物质的任何可选结构或组成，“完整”抗体或“全长”抗体指包含两条重链和两条轻链的蛋白。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

在本发明的上下文中，“PCSK9基因”包括人PCSK9基因以及人PCSK9基因的任何功能等同物的多核苷酸。PCSK9基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PCSK9基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，PCSK9基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述PCSK9基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，PCSK9基因表达产物包括人PCSK9蛋白以及人PCSK9蛋白的部分肽。所述PCSK9蛋白的部分肽含有与食管鳞癌相关的功能域。

“PCSK9蛋白”包括PCSK9蛋白以及PCSK9蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PCSK9蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、在高或低的严紧条件下能与人PCSK9的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，PCSK9蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述PCSK9蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。通过添加一个或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PCSK9蛋白的融合蛋白。对于与PCSK9蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PCSK9蛋白的生物学活性即可。

本发明的PCSK9蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PCSK9蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“治疗食管鳞癌”根据疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈；根据药物发挥的作用不同，可以包括抑制细胞生长、促进细胞凋亡。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与食管鳞癌发生发展相关的分子标志物—PCSK9，通过检测受试者食管组织中PCSK9的表达，可以判断受试者是否患有食管鳞癌，同时本发明提供了治疗食管鳞癌的分子靶点，通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性，同时本发明对食管鳞癌的病理研究提供了一定的理论基础。

附图说明

图1显示利用QPCR检测PCSK9基因在食管鳞癌组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测siRNA对PCSK9基因表达的影响；

图3显示软琼脂克隆形成实验检测siRNA对细胞增殖的影响；

图4显示MTT法检测PCSK9基因对人食管鳞癌胞增殖的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与食管鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例食管鳞癌癌旁组织和食管鳞癌组织样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用E.Z.N.A.kit进行操作)

上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)RNA的分离：

A.组织匀浆或细胞中加入RNA-Reagent II 1ml；

B.室温放置3min，加入0.2ml氯仿后剧烈摇动15s；

C.置于冰上防止10min；

D.12000g，4℃离心15min；

E.转移80％的水相进入新的2ml EP管中，加入1/2量的无水乙醇，振摇；

F.将小于700μl的上述液体转移至RNA Mini column，振摇后10000g室温离心60s。

2)RNA纯化：

A.向RNA Mini column加入500μl RWC Wash Buffer，10000g离心30s；

B.加入500μl RWB Wash Buffer，10000g离心30s，重复两次后采取最大离心完全干燥RNA Mini column；

C.向柱子加入15μl预热至70℃的DEPC水，室温放置2min后全速离心。

3、高通量转录组测序

1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，PCSK9基因在食管鳞癌组织中的表达量显著高于食管癌癌旁组织中的表达量。

实施例2QPCR测序验证PCSK9基因的差异表达

1、对PCSK9基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常食管组织和食管鳞癌组织各50例。

2、RNA提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录：

1)反应体系：

试剂	体积
		MgCl₂	2μl
10×RT Buffer	1μl
		无Rnase水	3.75μl
dNTP混合液	1μl
		Rnase抑制剂	0.25μl
AMV反转录酶	0.5μl
		寡聚dT适配子引物	0.5μl
实验样品	1μl

2)逆转录反应条件

按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。

42℃～55℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶链反应

1)引物设计

根据Genebank中PCSK9基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

PCSK9基因：

正向引物为5’-TTCCTGGTGAAGATGAGT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GTCCTCCTCGATGTAGTC-3’(SEQ ID NO.4)。

β-actin基因：

正向引物为5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

2)按照表1配制PCR反应体系：

表1PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	0.5μl
反向引物	0.5μl
		Takara Ex Taq HS	12.5μl
模板	10μl
		去离子水	补足25μl

3)PCR反应条件：94℃5min，(94℃30s，58℃40s，72℃40s)×35个循环，72℃5min。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与食管癌癌旁组织相比，PCSK9基因在食管鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3PCSK9基因的过表达

1、细胞培养

人食管鳞癌细胞株KYSE 150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对PCSK9基因的siRNA序列：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA1-PCSK9：

正义链为5’-UCAUUGAUGACAUCUUUGGCA-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链为5’-CCAAAGAUGUCAUCAAUGAGG-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA2-PCSK9：

正义链为5’-UGUUUGAAUGGUGAAAUGCCC-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-GCAUUUCACCAUUCAAACAGG-3’(SEQ ID NO.12)；

将细胞按5×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(KYSE 150)阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-PCSK9、siRNA2-PCSK9、)，其中阴性对照组siRNA与PCSK9基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测PCSK9基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取KYSE 150细胞的总RNA。

1)取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次。

2)加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀。

3)以1ml/管分装至1.5ml EP管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。

4)4℃、12000rpm离心15min。

5)将上层水相移至干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min。

6)4℃、7500rpm离心10min。

7)弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm离心5min。

8)室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。

9)质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰PCSK9基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比KYSE 150、转染空载siRNA-NC、siRNA2-PCSK9组，siRNA1-PCSK9组能够显著降低PCSK9基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化转染后处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO₂温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图3所示，与其他组相比，siRNA1-PCSK9组单细胞克隆集落形成数显著降低。

实施例5PCSK9基因对人食管鳞癌胞增殖的影响

采用MTT实验检测PCSK9基因对食管鳞癌细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3。

2、步骤：

(1)将对数增殖期的KYSE 150细胞接种于96孔板中，每孔约4×10³个。

(2)设三个PCSK9siRNA组，分别是siRNA1-PCSK9组、siRNA1-NC和KYSE 150对照组，每组细胞设三个复孔，其中siRNA1-PCSK9组、siRNA1-NC组进行瞬时转染。

(3)分别在转染后24h，48h，72h，在各组细胞中加入20μl MTT溶液(5mg/L)，室温下静置4h后，停止培养，吸弃培养基。

(4)往各孔中加入150μl DMSO，轻轻晃动96孔板，充分溶解残留的甲瓒结晶。

(5)在570nm处记录吸光值，注意设置含培养基和MTT但不含细胞的调零孔。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图4所示的结果显示：siRNA1-PCSK9组的细胞生长速度明显低于转染siRNA-NC组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明PCSK9表达有利于食管鳞癌细胞的生长，通过抑制PCSK9基因的表达可以抑制食管鳞癌细胞的增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种基因及其表达产物在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述基因为PCSK9。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PCSK9基因及其表达产物的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。

3.一种诊断食管鳞癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测食管组织中PCSK9基因的表达水平来诊断食管鳞癌。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TMIGD2基因转录水平的针对PCSK9基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PCSK9蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PCSK9基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PCSK9蛋白的特异性抗体。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括针对PCSK9基因的引物和/或探针。

6.PCSK9基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括PCSK9基因和/或其表达产物的抑制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制PCSK9基因表达的物质、抑制PCSK9基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制PCSK9基因表达产物活性的物质。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对PCSK9的siRNA。

10.一种治疗食管鳞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7-9任一项所述的抑制剂。