CN105861637A - 用于快速检测食用向日葵杂交种sh338真实性的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述试剂盒包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，所述引物液部分含有如下引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114中的至少一种。所述试剂盒可以在短时间内对大量待测向日葵检测，且检测结果准确，稳定可靠。
Description
技术领域
本发明属于鉴定农作物种子真实性和品种纯度领域，具体涉及一种基于SSR分子标记技术建立的可快速检测向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒。
背景技术
向日葵(Helianthus annuus L.)为菊科(Composicae)向日葵属的双子叶植物。向日葵分为油用型、食用型和兼用型向日葵，染色体基数均为17，有二倍、四倍、六倍不同倍数水平，其中栽培种为二倍体，属虫媒异花授粉作物，野生种在二倍、四倍、六倍等不同倍数水平均有发现。自上世纪60年代以来，向日葵在世界各地得到迅速发展，其油脂产量仅次于大豆。向日葵属喜光性短日植物，全生育期有效积温≥1800-2600℃；耐旱耐盐碱，耐瘠薄，对土壤有极广的适应性，最适宜的土壤为壤土和沙壤土。因此，在我国北方干旱、降雨少、土壤盐碱化严重的地区，向日葵成为当地农民脱贫致富、增产增收的经济作物。然而优良杂交种的推广应用需要大量优质种子，杂交种的真实性和纯度的高低直接影响着杂交向日葵的产量和农民种植的积极性。为保护新品种和农民的利益，降低因假种子和纯度低而导致的损失，迫切需要进行向日葵杂交种真实性和纯度的检验工作，并建立一种准确、简单、快捷的杂交种真实性和纯度鉴定方法。
传统的向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定采用形态学鉴定法。形态学鉴定法是依靠种子或植株的表型性状来鉴别不同的个体，该方法比较直观、简便，但由于可直接观测的农艺性状十分有限，有些性状要在特定的生育期才能检测，有些性状易受环境条件的影响，从而受到很大限制，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制。关键是如果混杂的材料在表型上与被鉴定杂交种的性状完全一致，采用这种方法就无法鉴定出伪杂种。
随着分子生物学技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实性与品种纯度鉴定。分子标记鉴定技术是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳定遗传，可以反映生物的个体和群体特征。由于分子标记可以直接反映DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，用于鉴定种子纯度的分子标记主要的方法有RAPD、SSR和SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)标记技术具有数量丰富、多态性高、共显性遗传、扩增稳定、易于检测等方面的优点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、标记和定位基因以及分子标记辅助方面的应用。SSR标记通常具有共显性的特点，F1杂交种具有双亲等位基因的互补带型。鉴于不育系和其同型保持系遗传背景基本一致，只在不育基因、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择DNA分子标记进行分析，从而实现有效地区别和鉴定。SSR标记已成为现阶段用于鉴定种子纯度的常用方法,已广泛应用于玉米、水稻、大豆的新品种纯度鉴定。但是目前在食用向日葵杂交种使用SSR分子标记技术鉴定其真实性和纯度的报道鲜有，建立一套适于食用向日葵杂交种真实性和纯度鉴定的SSR分子标记技术具有重要意义，可以克服传统的田间小区种植鉴定所带来的不足。
SH338是北京三瑞农业科技有限公司2014年选育的食用向日葵中熟杂交种，其亲本组合为A03-6×06R-2，生育期105天左右，长势旺，植株整齐度好；幼苗绿色，幼茎绿带紫色；叶片呈心脏形，叶脉明显，叶片较大，植株呈塔形，舌状花和管状花为黄色，花药为紫色；株高223厘米，花盘直径20.3厘米，籽粒排列紧密度中等，群体生长整齐度中等，平均不育株率0％，平均分枝株率0.3％；百粒重17.5克，籽仁率51.1％，结实率73.5％，单盘粒重106.9克，籽粒长度2.27厘米，宽0.84厘米，籽粒长卵形，颜色为褐底白边稍有白纹，籽粒排列紧密中等，花盘倾斜度4-5级，盘面形状平；盘腐型菌核病、褐斑病、黑斑病0-2级，根茎腐型菌核病、锈病、霜霉病0-1级，黄萎病0-3级，茎腐病株率0.2％，平均倒伏(含倒折)率3.4％，平均折茎率1.6％。抗性强，耐盐碱，产量高而稳定，较大面积生产的同类品种增产9.1％—13.3％，商品性好。为保证该优质品种的最大经济效益及其产业化的发展，需要一种权威的、高效准确的检测方法来鉴定所述食用向日葵杂交种SH338的真实性和品种纯度，加快杂交种的质量检测进程。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述试剂盒使用方便、快捷，能够在短时间内对大量的待测食用向日葵杂交种SH338样品进行快速鉴定，测定结果准确稳定可靠。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述试剂盒包括各自独立包装的引物液、PCR反应液和DNA聚合酶部分，其中，所述引物液部分含有如下SR-123、SR-889和SR-1114引物中的至少一种：
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
SR-889-F:5’-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3’；
SR-889-R:5’-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3’；
SR-1114-F:5’-AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3’；
SR-1114-R:5’-GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3’。
所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述引物液部分中的引物为引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114中的任意两种。
所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs以及ddH2O。
所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
本发明提供了一种利用所述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤，
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH338、以及标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA；
(2)取步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
(3)分别将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行凝胶电泳处理，获得所述待测食用向日葵杂交种SH338以及其亲本标准向日葵A03-6和06R-2的电泳图谱；
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所述杂交种SH338同时具有其亲本标准种子A03-6和06R-2的特征谱带，则判定所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实；反之，为假。
所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL。
所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃或-20℃保存，备用。
本发明提供了一种所述的试剂盒在鉴定优质食用向日葵杂交种SH338真实性领域中的用途。
本发明提供了一种所述的快速检测优质食用向日葵杂交种SH338的方法在鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性领域中的用途。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，通过大量引物筛选研究，筛选出了引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114，使用上述引物中的至少一种对待测食用向日葵杂交种SH338进行品种的鉴定，电泳图谱清晰，在短时间内进行大量的食用向日葵杂交种SH338的品种鉴定，鉴定结果稳定、准确可靠；
(2)本发明所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，操作步骤简单、易操作，可以高效的对食用向日葵杂交种SH338的品种鉴定，检测结果准确。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1的食用向日葵杂交种SH338的电泳图谱；
图2是本发明实施例2的食用向日葵杂交种SH338的电泳图谱；
图3是本发明实施例3的食用向日葵杂交种SH338的电泳图谱。
具体实施方式
本发明所使用的主要试剂如下：
RNase A生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为GE101；
GelSafe核酸染料生产厂家为北京原平皓生物技术有限公司，型号为EP106-01；
所使用的SSR引物生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司；
EasyTap Buffer for PAGE生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为AP112-02；
dNTPs生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为AP112-02；
EasyTap DNA Polymerase for PAGE生产厂家为北京全式金生物技术有限公司、型号为AP112-02；
TEMED生产厂家为SIGMA，型号为T8133；
本发明所使用的主要设备如下：
高速冷冻离心机生产厂家为SIGMA、型号为3K15；
电泳仪生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYY-8C；
水平电泳槽生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYCP-31E；
凝胶成像系统生产厂家为北京赛智创业科技有限公司，型号为ChampGe15000。
实施例1
本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
所述引物液部分中的引物为引物SR-123，所述SR-123引物为：
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
利用上述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤：
(1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清600μL至离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)取步骤(1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL，利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增：
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)分别将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis＝19:1：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，如图1所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH338的亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2，F1为食用向日葵杂交种SH338，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
实施例2
本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
所述引物液部分中的引物为引物SR-889，所述SR-889引物：
SR-889-F:5’-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3’；
SR-889-R:5’-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
利用上述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤：
(1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨株珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清750μL至离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清400μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)取步骤(1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL，利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增：
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物-20℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O，1L；
A)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis＝19:1：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，如图2所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH338的亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2，F1为食用向日葵杂交种SH338，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
实施例3
本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
所述引物液部分中的引物为引物SR-1114，所述SR-1114引物：
SR-1114-F:5’-AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3’；
SR-1114-R:5’-GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤：
(1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清800μL至离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清600μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清350μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)取步骤(1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL，利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增，
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis＝19:1：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，如图3所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH338的亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2，F1为食用向日葵杂交种SH338，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
实施例4
本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
所述引物液部分中的引物为引物SR-889和引物SR-1114，所述SR-889引物：
SR-889-F:5’-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3’；
SR-889-R:5’-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3’；
所述SR-1114引物：
SR-1114-F:5’-AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3’；
SR-1114-R:5’-GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤：
(1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清600μL至离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)取步骤(1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL，利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增，
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物-20℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis＝19:1：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
实施例5
本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
所述引物液部分中的引物为引物SR-123和SR-889，所述SR-123引物：
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
所述SR-889引物包括：
SR-889-F:5’-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3’；
SR-889-R:5’-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤：
(1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清650μL并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清400μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)取步骤(1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL，利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增，
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis＝19:1：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
实施例6
本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
所述引物液部分中的引物为引物SR-123、SR-889和SR-1114，所述SR-123引物：
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
所述SR-889引物：
SR-889-F:5’-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3’；
SR-889-R:5’-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3’；
所述SR-114引物：
SR-1114-F:5’-AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3’；
SR-1114-R:5’-GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3’。
每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
本实施例利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步骤：
(1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清800μL并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清600μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)取步骤(1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL，利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增，
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶电泳包括如下步骤：
所述凝胶电泳体系包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis＝19:1：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其特征在于，包括各自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有如下SR-123、SR-889和SR-1114引物中的至少一种；
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
SR-889-F:5’-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3’；
SR-889-R:5’-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3’；
SR-1114-F:5’-AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3’；
SR-1114-R:5’-GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3’。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其特征在于，所述引物液部分中的引物为SR-123、SR-889和SR-1114引物中的任意两种。
3.根据权利要求1或2所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs以及ddH2O。
4.根据权利要求1或2所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶部分含有Taq DNA聚合酶。
5.根据权利要求1-4任一所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒的配方为：
引物液,0.2μM,1μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
10×含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
ddH2O，17μL。
6.一种快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，其特征在于，包括如下步骤，
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH338、以及标准向日葵种子A03-6和06R-2种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA；
(2)取步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
(3)分别将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行凝胶电泳处理，获得所述待测食用向日葵杂交种SH338以及其亲本标准向日葵A03-6和06R-2的电泳图谱；
(4)对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所述杂交种SH338同时具有其亲本标准种子A03-6和06R-2的特征谱带，则判定所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实；反之，为假。
7.根据权利要求6所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，其特征在于，所述DNA模板的加入量为30ng配制1μL。
8.根据权利要求6或7所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃或-20℃保存，备用。
9.一种权利要求1-5任一所述的试剂盒在快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性领域中的用途。
10.一种权利要求6-8任一所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338的方法在鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性领域中的用途。
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Non-Patent Citations (3)
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