CN105793712A - 肾衰竭的早期诊断标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明鉴定能够从尿或血液中采集、且比肾小球滤过量和血清中肌酸酐浓度更早地发生变动的肾衰竭生物标志物，由此开发诊断初期肾衰竭的技术。本发明的被怀疑肾衰竭的受试者的血液、血浆、血清或尿的分析方法包括算出受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D?丝氨酸]和[L?丝氨酸]等组成的组的至少1种氨基酸对的D?型异构体的浓度相对于L?型异构体的浓度的比、或者D?型异构体的浓度相对于D?型异构体和L?型异构体的浓度之和的百分率作为前述受试者的病态指标值的步骤。

Description

肾衰竭的早期诊断标志物
技术领域
本发明涉及被怀疑肾衰竭的受试者的血液或尿的分析方法、和被怀疑肾衰竭的受试者的血液或尿的样品分析系统，具体而言，涉及：受试者的血液、血浆、血清或尿的分析方法，包括测定该受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]等组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤；以及用于实施前述分析方法的血液、血浆、血清或尿的样品分析系统，是该受试者的血液、血浆、血清或尿的样品分析系统，包含存储部、分析测定部、数据处理部和病态信息输出部。
背景技术
慢性肾衰竭(CKD)是相当于日本成人人口的约13％即1,330万人罹患的疾病，发展成终末期肾衰竭(ESKD)的风险高，威胁国民的健康。慢性肾衰竭包括具有由肾小球滤过量表示的肾功能下降、或者提示肾脏损伤的表现慢性地(3个月以上)持续的所有疾病。对慢性肾衰竭没有有效的治疗法，如果慢性肾衰竭发展、肾功能持续下降，则有尿毒症的危险，需要人工透析、肾移植，在医疗经济上成为大负担(非专利文献1)。慢性肾衰竭无自觉症状。因此，为了慢性肾衰竭的早期发现和发展抑制，利用肾衰竭的早期标志物的诊断是必要的。然而，作为比由肾小球滤过量表示的肾功能发生变化更早地正确反映肾功能损伤的发展的生物标志物，尚不存在令人满意的标志物。
急性肾衰竭(AKI)的实验动物模型能够再现肾功能损伤的初期。急性肾衰竭是肾功能在数周或数日内急剧下降的疾病。作为该疾病的模型，已知通过外科方法或药剂给予诱发的急性肾衰竭实验模型。急性肾衰竭诊断的金标准是尿生成量和血清中肌酸酐浓度。血清中肌酸酐浓度在与有无排尿无关、不进行活检而能够评价这点上是优异的。然而，需要肾小球滤过量为稳定状态。对肾小球滤过量的小变动不敏感。在急性肾衰竭的实验动物模型中，在较后期变化变得明显。而且，血清中肌酸酐浓度随着年龄、性别、肌肉量和服用的药品等条件而变动，因此不能说是特异性的标志物(非专利文献2)。作为急性肾衰竭的标志物，已经报告了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、白介素-18(IL-18)、肾损伤分子(KIM-1)、肝型脂肪酸结合蛋白(FABPs)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C等蛋白质，和高香草酸硫酸盐、三甲胺N-氧化物等低分子代谢化合物。然而，这些标志物均不能在肾衰竭的早期被检测出。
D-丝氨酸和D-丙氨酸的肾衰竭患者的血清中浓度高于健康正常者的血清中浓度，D-型异构体的浓度、和D-型异构体浓度/(D-型异构体浓度+L-型异构体浓度)的比两者与肌酸酐相关，由此启示了成为近端肾小管功能损伤的标志物的候选(非专利文献3)。已经公开了在肾炎患者的血浆中显示D-氨基酸(Ala、Pro、Ser)高的倾向，与肌酸酐量具有相关性(非专利文献9)。此外，在肾衰竭患者的血清中确认了D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-谷氨酸和D-天冬氨酸，由此启示了血清D-氨基酸浓度的测定对肾衰竭的诊断等有用(非专利文献5)。对于各年龄的健康正常人调查了D-丝氨酸和D-丙氨酸的尿中浓度以及D-型异构体相对于D-型异构体和L-型异构体的合计的比，启示了肾脏中的D-丝氨酸的处理不同(非专利文献6)。已经公开了选自D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-天冬酰胺、D-别苏氨酸、D-谷氨酰胺、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的1种或2种以上的氨基酸能够作为肾病的病态指标值(专利文献1)，但是在该文献中，虽然记载着使用血液、血浆、尿等体液作为样本，但是在实施例中用于求出肾病中的病态指标值的样本只有血清，关于能否使用尿中的这些氨基酸作为肾病的病态指标值没有公开。此外，已知在肾衰竭患者中，尿中的丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的D-型异构体比显著增加，另一方面对于甲硫氨酸、丝氨酸没有有显著性差异(非专利文献7)。然而，在该文献中，虽然对于没有显示病态判定基准的肾衰竭患者(renal failure)算出了各氨基酸的D-型异构体浓度/(D-型异构体浓度+L-型异构体浓度)的比，但是只不过不分病期地、杂乱无章地(模糊地)显示了该比的增加，没有任何记载或启示该比的变动与肾衰竭的病态、其他生物标志物相关。在本申请优先日后，从尿中的D/L-丝氨酸比由于缺血再灌注损伤而经时减少，启示了能够成为可以实现初期的缺血性肾损伤的检测、病态分类的生物标志物(非专利文献8)。已知近端肾小管中表达与D-氨基酸的分解相关的D-氨基酸氧化酶，在缺血再灌注大鼠中D-氨基酸氧化酶活性下降(非专利文献4)。另一方面，在生理的条件下，L-丝氨酸被重吸收，与此相对，D-丝氨酸几乎不被重吸收。然而，以D-丝氨酸为代表的D-氨基酸在肾衰竭的初期如何变动是不明的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2013/140785
非专利文献
非专利文献1：KDIGO 2012Clinical Practice Guideline for theEvaluation and Management of Chronic Kidney Disease,KidneyInternational Supplements 1(2013)
非专利文献2：Slocum,J.L.等，Transl Res.159：277(2012)
非专利文献3：Fukushima,T.等，Biol.Pharm.Bull.18：1130(1995)
非专利文献4：Zhang,H.等，Amino Acids 42：337(2012)
非专利文献5：Ishida等，北里医学23：51～62(1993)
非专利文献6：Yong Huang等，Biol.Pharm.Bull.21：(2)156-162(1998)
非专利文献7：Magdalena C.Waldhier等，J.Chromatography B(2010)1103-1112
非专利文献8：Jumpeji Sasabe等，PLOS ONE,vol.9,Issue 1,e86504
非专利文献9：Nagata.Y Viva Origino Vol.18(No.2)(1990)第15次学术讲演会讲演要旨集
发明内容
发明所要解决的课题
有必要鉴定能够从尿或血液中采集、且从比肾小球滤过量和血清中肌酸酐浓度更早地发生变动的肾衰竭的生物标志物，由此开发诊断初期肾衰竭的技术。
用于解决课题的方法
本发明提供被怀疑肾衰竭的受试者的血液或尿的分析方法。本发明的分析方法包括测定受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及从前述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤。其中，在从至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值显示具有显著性差异的D-型异构体的构成比例减少的情况下，能够将受试体与肾损伤的病态相关联。例如，能够将至少1种氨基酸对的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、或者D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的比或百分率作为前述受试者的病态指标值而算出。在非专利文献7中，虽然分析了未显示病态判定基准的肾衰竭患者的尿中的氨基酸，但是对于丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸和天冬氨酸显示了D-氨基酸比显著增加。因此，在肾衰竭患者的尿中，D-氨基酸的构成比例减少是令人惊讶的发现。
在其他方式中，在本发明的分析方法中，上述氨基酸组中还可以包含[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]。因此，本发明的分析方法还可以包括测定受试者的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及从前述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤。其中，在从至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值显示具有显著性差异的D-型异构体的构成比例减少的情况下，能够将受试体与肾损伤的病态相关联。例如，能够将至少1种氨基酸对的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、或者D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的比或百分率作为前述受试者的病态指标值而算出。
在本发明的其他方式中，可以涉及肾衰竭的检查方法，该检查方法包括测定非样本的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及从前述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度，算出将D-型异构体的构成比例减少与受试体的肾衰竭相关联的病态指标值的步骤。其中，所谓检查方法，可以通过非医师的医疗辅助者等来进行，也可以涉及由分析机构等进行的方法。
可以从上述的氨基酸组中任意选择氨基酸，但是进一步优选由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]组成。在其他方式中，各氨基酸的组合可以从上述的氨基酸组中除去。例如，可以除去[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]，可以除去[D-组氨酸]和[L-组氨酸]，可以除去[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]，可以除去[D-精氨酸]和[L-精氨酸]，可以除去[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]，可以除去[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]，可以除去[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]，可以除去[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]，可以除去[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]，可以除去[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]，可以除去[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]，可以除去[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]，可以除去[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]，可以除去[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]，可以除去[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]，以及可以除去[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]。
这些病态指标值与尿中肌酸酐浓度同样，在肾缺血再灌注后显示出下降。尿中肌酸酐浓度的下降显示肾功能的下降，因此能够作为肾衰竭的标志物使用，本申请的病态指标值也能够与尿中肌酸酐浓度同样地作为肾衰竭的标志物使用。另外，作为尿中的肾衰竭的标志物的KIM-1、NGAL，随着肾功能的下降，尿中的浓度增加。在缺血再灌注模型实验体系中，尿中肌酸酐浓度在缺血再灌注后8小时有显著性差异地降低，尿中KIM-1在缺血再灌注后20小时有显著性差异地增加，而且尿中NGAL在缺血再灌注后8小时有显著性差异地增加(图2-D、F和G)，另一方面，使用选自由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的1对或多对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，在肾缺血再灌注后4小时后有P<0.05的显著性差异地减少，因此，能够对于肾衰竭能够具有更高的灵敏度。因此，从对早期肾损伤具有更高的灵敏度的观点出发，优选使用该病态指标值。进一步优选地，使用选自由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的1对或多对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，其在肾缺血再灌注后4小时后有P<0.01的显著性差异地减少，因此能够将该病态指标值作为灵敏度更高的标志物使用。进一步更优选地，从选自由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]中的1对或多对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，在肾缺血再灌注后4小时后有P<0.001的显著性差异地减少，因此能够将该病态指标值作为灵敏度极高的标志物使用。因此，本发明的病态指标值，能够与现有的作为肾衰竭标志物的血清肌酸酐等同等、或者比其灵敏度高地用于早期肾衰竭的诊断。作为早期的肾衰竭，可举出例如，作为急性肾衰竭(AKI)的RIFLE、AKIN、KDIGO等各分类的初期病期基准的血清肌酸酐上升到1.5～2.0倍的状态，在慢性肾衰竭(CKD)中由GFR表示的肾功能开始下降的状态，或者有肾损伤但血清肌酸酐、GFR发生变化以前的非常早期的状态。此外，能够将在肾缺血再灌注后4小时后无显著性差异、但在肾缺血再灌注后8小时以后有显著性差异的使用选自由[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]组成的组中的1对或多对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，作为与现有的肌酸酐等有同等灵敏度的标志物使用。
可以使用从1对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，也可以组合使用从其他氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值。例如，可以将从选自由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的1对以上的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的灵敏度极高的病态指标值，与从选自同组的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的其他灵敏度极高的病态指标值组合。另外，在其他方式中，可以将上述灵敏度极高的病态指标值与灵敏度较低的病态指标值，例如从选自由[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]组成的组中的1对D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值组合使用，由此，在血清肌酸酐显示上升到1.5～2.0倍的出现肾功能下降的状态或者在此之前，与尿肌酸酐、尿中KIM-1、尿中NGAL相比，能够更敏锐地检测出肾损伤。
本发明的分析方法有时进一步包含下述步骤：将前述受试者的病态指标值与健康正常者的病态指标基准值、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者的病态指标基准值进行比较，判定前述受试者的病态指标值与前述健康正常者的病态指标基准值类似，或者前述受试者的病态指标值与前述急性肾衰竭患者或慢性肾衰竭患者的病态指标基准值类似，或者前述受试者的病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间。
进而在其他方式中，本发明通过从健康正常者组和/或肾衰竭患者组的病态指标值预先设定阈值，将受试者的病态指标值与阈值进行比较，从而能够判定受试者是否为肾衰竭。只要是本领域技术人员，就能够从健康正常者组、肾衰竭患者组的病态指标值适当设定阈值。作为阈值，能够使用例如，健康正常者组或肾衰竭患者组的平均值、中央值、X百分数值，但不限于这些。其中，X可以选择任意的数值，可以适当使用3、5、10、15、20、30、40、60、70、80、85、90、95、97。阈值可以是1个，也可以根据肾衰竭的种类(急性、慢性)、原因(例如，药剂性肾病、糖尿病性肾病、IgA肾病、膜性肾病、肾硬化症等)、状态(早期、中期、后期)以及使用的氨基酸或其组合而设定多个。通过将预先设定的阈值与受试者的病态指标值进行比较，能够判定、确定或诊断受试者的肾衰竭的病态。
本发明的分析方法有时进一步包含下述步骤：判定前述受试者的第一病态指标值是否在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间，并且判定前述受试者的病态指标值是否在前述健康正常者的第二病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间，前述受试者的第一病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的，前述受试者的病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、以及[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
在本发明中，作为第一病态指标值，可以使用从由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的前述受试者的病态指标值，作为第二病态指标值，可以使用从由[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的前述受试者的病态指标值。
在前述氨基酸组中进一步包含[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]的情况下，第一病态指标值可以使用从由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的前述受试者的病态指标值。此外，第二病态指标值也可以是从选自由[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]以及[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值。
本发明提供被怀疑肾衰竭的受试者的血液或尿的样品分析系统。本发明的样品分析系统包含存储部、分析测定部、数据处理部和病态信息输出部。前述存储部存储健康正常者的血液、血浆、血清或尿的病态指标基准值、以及急性肾衰竭患者和/或慢性肾衰竭患者的血液、血浆、血清或尿的病态指标基准值。前述分析测定部对前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的氨基酸中选自由D-丝氨酸和L-丝氨酸、D-组氨酸和L-组氨酸、D-天冬酰胺和L-天冬酰胺、D-精氨酸和L-精氨酸、D-别苏氨酸和L-苏氨酸、D-谷氨酸和L-谷氨酸、D-丙氨酸和L-丙氨酸、D-脯氨酸和L-脯氨酸、D-缬氨酸和L-缬氨酸、D-别异亮氨酸和L-异亮氨酸、D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸、D-赖氨酸和L-赖氨酸组成的组中的至少1对氨基酸立体异构体进行分离、定量。前述数据处理部包括从前述受试者的选自由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤。其中，在从至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值显示D-型异构体的构成比例减少的情况下，能够将受试体与肾衰竭相关联。
在其他方式中，除了上述氨基酸对以外，还可以包含D-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺、D-苏氨酸和L-苏氨酸、D-别苏氨酸和L-别苏氨酸、以及D-亮氨酸和L-亮氨酸。因此，在其他方式中，前述分析测定部对前述受试者的尿中的氨基酸中选自由D-丝氨酸和L-丝氨酸、D-组氨酸和L-组氨酸、D-天冬酰胺和L-天冬酰胺、D-精氨酸和L-精氨酸、D-别苏氨酸和L-苏氨酸、D-谷氨酸和L-谷氨酸、D-丙氨酸和L-丙氨酸、D-脯氨酸和L-脯氨酸、D-缬氨酸和L-缬氨酸、D-别异亮氨酸和L-异亮氨酸、D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸、D-赖氨酸和L-赖氨酸、D-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺、D-苏氨酸和L-苏氨酸、D-别苏氨酸和L-别苏氨酸、以及D-亮氨酸和L-亮氨酸组成的组中的至少1对氨基酸立体异构体进行分离、定量。前述数据处理部包括从前述受试者的选自由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤。其中，在从至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值显示D-型异构体的构成比例减少的情况下，能够将受试体与肾衰竭相关联。
所谓病态指标值，是指能够从某种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出，在显示D-型异构体的构成比例减少的情况下，能够将受试体与肾衰竭相关联的值。进而，本发明的样品分析系统中，作为病态指标值，例如，将D-型异构体和L-型异构体对的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的比或百分率定义为受试者的病态指标值。将该受试者的病态指标值与健康正常者的病态指标基准值、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者的病态指标基准值进行比较，当前述受试者的病态指标值与前述健康正常者的病态指标基准值类似时，将前述受试者肾衰竭的嫌疑小定义为前述受试者的病态信息。当前述受试者的病态指标值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值类似时，将前述受试者有肾衰竭的嫌疑定义为前述受试者的病态信息。当前述受试者的病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，将前述受试者有早期肾衰竭的嫌疑定义为前述受试者的病态信息。前述病态信息输出部输出前述受试者的病态信息。
在本发明的样品分析系统中，当前述受试者的第一病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间，而且前述受试者的第二病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，将前述受试者有非常早期的肾衰竭的嫌疑定义为前述受试者的病态信息，前述受试者的第一病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的，前述受试者的第二病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、以及[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
本发明提供肾衰竭的诊断方法。本发明的诊断方法包括测定被怀疑肾衰竭的受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及从前述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤。
在其他方式中，在本发明的诊断方法中，上述氨基酸组中还可以包含[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]。因此，本发明的诊断方法包括测定受试体的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及从前述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤。
其中，在从至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值显示D-型异构体的构成比例减少的情况下，能够将受试体与肾衰竭相关联。关于前述病态指标值，能够使用至少1种氨基酸对的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、或者D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的比或百分率作为前述受试者的病态指标值。
本发明的诊断方法有时进一步包括下述步骤：将前述受试者的病态指标值与健康正常者的病态指标基准值、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者的病态指标基准值进行比较，当前述受试者的病态指标值与前述健康正常者的病态指标基准值类似时，诊断为前述受试者是健康正常者的可能性高或者前述受试者肾衰竭的嫌疑小，当前述受试者的病态指标值与前述急性肾衰竭患者或慢性肾衰竭患者的病态指标基准值类似时，诊断为前述受试者是肾衰竭的嫌疑大，当前述受试者的病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，诊断为前述受试者有早期肾衰竭的嫌疑。
本发明的诊断方法包括下述步骤：当前述受试者的第一病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间，而且前述受试者的第二病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，诊断为前述受试者有非常早期的肾衰竭的嫌疑，前述受试者的第一病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的，前述受试者的第二病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、以及[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
本发明提供肾衰竭的治疗方法。本发明的诊断方法包括下述步骤：测定被怀疑肾衰竭的受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤；从前述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出病态指标值的步骤；将前述受试者的病态指标值与健康正常者的病态指标基准值、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者的病态指标基准值进行比较，当前述受试者的病态指标值与前述健康正常者的病态指标基准值类似时，诊断为前述受试者是健康正常者的可能性高或者前述受试者肾衰竭的嫌疑小，当前述受试者的病态指标值与前述急性肾衰竭患者或慢性肾衰竭患者的病态指标基准值类似时，诊断为前述受试者肾衰竭的嫌疑大，当前述受试者的病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，诊断为前述受试者有早期肾衰竭的嫌疑的步骤；以及当前述受试者被诊断为肾衰竭的嫌疑大时，通过给予抑制或改善肾衰竭进展的治疗药来治疗前述受试者的步骤，该治疗药包括：包含血管紧张素转化酶转换酶、血管紧张素II受体拮抗剂等但不限于此的高血压治疗药、包含α葡糖苷酶抑制剂、胰岛素制剂等但不限于此的糖尿病治疗药、包含HMG-CoA还原酶抑制剂、小肠胆固醇转运体抑制剂等但不限于此的脂质异常症治疗药、包含基因重组人促红细胞生成素制剂但不限于此的贫血治疗药、骨·矿物质代谢异常的治疗药、高尿酸血症的治疗药、包含球形吸附炭内服药但不限于此的尿毒症治疗药。
本发明的治疗方法包括下述步骤：当前述受试者的第一病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间，而且前述受试者的第二病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，诊断为前述受试者有非常早期的肾衰竭的嫌疑的步骤，前述受试者的第一病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的，前述受试者的第二病态指标值是从前述受试者的血液、血浆、血清或尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]以及[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的；通过给予急性肾衰竭的治疗药来治疗前述受试者的步骤，前述急性肾衰竭的治疗药包括：包含聚苯乙烯磺酸钠但不限于此的高钾血症的治疗药、包含碳酸钙或乙酸钙但不限于此的高磷酸血症的治疗药。
本发明中的血液、血浆、血清和尿中的D-氨基酸浓度的测定，可以使用本领域技术人员周知的任何方法来进行。例如，预先用邻苯二甲醛(OPA)、N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸(Boc-L-Cys)、其他修饰试剂立体异构特异性地将D-和L-氨基酸衍生化，然后，使用ODS-80TsQA这样的分析柱梯度洗脱100mM的乙酸盐缓冲液(pH6.0)与乙腈的混合溶液进行分离的方法，能够用于天冬氨酸、丝氨酸和丙氨酸的D-型异构体和L-型异构体的同时测定。此外，预先用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)这样的荧光试剂将D-和L-氨基酸衍生化，然后，使用ODS-80TsQA、Mightysil RP-18GP等这样的分析柱立体异构非特异性地将各氨基酸分离，然后使用Pirkle型手性固定相柱(例如，Sumichiral OA-2500S或R)进行光学拆分、立体异构特异性地进行分离的方法，能够用于脯氨酸、亮氨酸和其他氨基酸的微量测定(滨濑健司和财津洁，分析化学，53卷，677-690(2004))。本说明书中的光学拆分柱体系，是指至少使用光学拆分柱的分离分析体系，有时包含利用光学拆分柱以外的分析柱的分离分析。更具体而言，通过使用光学异构体的分析方法，能够测定试样中的D-/L-氨基酸浓度，前述光学异构体的分析方法的特征在于，包括：使包含具有光学异构体的成分的试样，与作为流动相的第一液体一起通过作为固定相的第一柱填充剂，将前述试样的前述成分进行分离的步骤；使前述试样的各个前述成分在多回路单元中单独保持的步骤；使前述在多回路单元中单独保持的前述试样的各个前述成分，与作为流动相的第二液体一起，通过流路提供给作为固定相的具有光学活性中心的第二柱填充剂，将前述试样的各个成分中包含的前述光学异构体进行拆分的步骤；以及检测前述试样的各个成分中包含的前述光学异构体的步骤(日本特许第4291628号)。可替代地，通过使用识别氨基酸的光学异构体的单克隆抗体，例如特异性结合D-亮氨酸、D-天冬氨酸等的单克隆抗体的免疫学方法，能够定量D-氨基酸(日本特愿2008-27650说明书)。
在本说明书中，对于某氨基酸用方括号([])括起来的标记(例如，[D-丝氨酸])表示该氨基酸的浓度。本发明中作为基于氨基酸的浓度的参数(病态指标值)，利用例如，D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、和D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的百分率。这些参数由于将某物质的浓度用另外的物质的浓度做除法，因此血液、血清、血浆或尿这样的体液的体积被约分。因此，与浓度的情况不同，这些参数有不需要利用体液量校正的优点。
在本发明中，通过将血液过滤和重吸收而仅特异性除去血液中的成分的一部分而生成尿的肾脏的功能发挥大的作用。因此，本发明的氨基酸浓度有时在血液与尿中差异较大，在血液、血清和血浆之间没有太大的差异。这是因为，还未知氨基酸被血液细胞、血液凝固物等特异性地浓缩。因此，在本发明的实施例中测定血清中浓度，将基于血清中浓度的参数用作受试者的病态指标值、健康正常者或肾衰竭患者的病态指标基准值，而测定血液中浓度或血浆中浓度来代替血清中浓度，基于血液中浓度或血浆中浓度的参数也可以用作受试者的病态指标值、健康正常者或肾衰竭患者的病态指标基准值。
在本说明书中，所谓“病态指标值”，是指基于多个生物标志物的浓度、而非个别生物标志物分子的浓度而能够计算的数值。在本说明书中使用的病态指标值，是指从某氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度能够算出，在D-型异构体的构成比例显示减少的情况下，能够将受试体与肾衰竭相关联的值。作为病态指标值，包含某氨基酸与其对映异构体的浓度比，例如，某氨基酸的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的百分率，但不限于此。
在本说明书中，所谓“病态指标基准值”，是指对于通过已有的诊断技术所诊断的健康正常者、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者获得的、生物标志物分子的病态指标值的平均值或中央值。病态指标值是特定受试者的某特定时刻的数值，但病态指标基准值是从多个健康正常者、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者通过统计处理获得的数值。因此，所谓某病态指标值与某病态指标基准值类似，是指该病态指标值与前述病态指标基准值在统计上无显著性差异。能够利用例如，学生t双侧检验、单因素方差分析、Tukey’s多重比较检验等统计学方法。此外，当这些检验中的显著性的阈值P值小于0.05时，设为有显著性。
本发明中的受试者的血液、血浆、血清或尿的分析系统包含存储部、分析测定部、数据处理部和病态信息输出部。其中，存储部包含存储病态指标基准值的存储器，前述病态指标基准值是从基于对于通过已有的诊断技术诊断的健康正常者、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者获得的血液、血浆、血清或尿中的氨基酸的对映异构体浓度数据的参数获得的。前述存储部有时包含前述健康正常者和患者的人数和从每个人的数据通过统计处理获得的显著性的阈值P的数据。前述分析测定部包含能够通过机器人控制自动运转测定本说明书中说明的氨基酸对映异构体浓度的二维HPLC系统的任一自动分析装置、和用于控制该自动分析装置的中央控制装置。前述数据处理部从由前述分析测定部获得的氨基酸对映异构体浓度计算本说明书中说明的参数。将从该参数获得的受试者的病态指标值与从前述存储部调取的健康正常者和患者的病态指标基准值进行比较。当前述受试者的病态指标值与前述健康正常者的病态指标基准值类似时，将前述受试者肾衰竭的嫌疑小定义为前述受试者的病态信息。当前述受试者的病态指标值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值类似时，将前述受试者有肾衰竭的嫌疑定义为前述受试者的病态信息。当前述受试者的病态指标值在前述健康正常者的病态指标基准值与前述慢性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，将前述受试者有早期肾衰竭的嫌疑定义为前述受试者的病态信息。此时，有时前述显著性的阈值P从前述存储部调取，用于判定前述受试者的病态指标值与前述健康正常者或患者的病态指标基准值类似的程度。数据处理部包括现有技术的计算机、和存储于该计算机的病态信息处理软件。前述病态信息输出部有时将前述受试者的病态信息显示在液晶或其他显示器图像、印刷输出到打印机、或者介由网络或LAN等将受试者的病态信息作为数据传输。
在本发明中，所分析或检查的肾衰竭，是肾功能比正常时下降的状态，包含在通常意义上使用的全部肾脏损伤。虽然不限定，但肾衰竭一般是指肾功能低于正常时的30％的状态，大致分为急性肾衰竭和慢性肾衰竭。作为肾功能下降的原因，可举出免疫系统异常、对药物的变态反应、高血压、糖尿病、出血、急剧的血压下降、感染症、伴随烧伤的脱水等多种因子。关于急性肾衰竭(AKI)，倡导RIFLE分类、AKIN分类、KDIGO分类等病期分类，将急性肾衰竭分为Risk(风险)(阶段1)、Injury(损伤)(阶段2)、Failure(衰竭)(阶段3)，进一步根据持续时间分为Loss(丧失)和End stagekidney disease(终末期肾病)。这些分类均以血清肌酸酐的量和尿量为指标，例如，在Risk(阶段1)，将血清肌酸酐从基线上升到1.5～2.0倍或小于0.5ml/kg/时的尿量为6小时以上作为判断基准，在Injury(阶段2)，将血清肌酸酐从基线上升到2.0～3.0倍或小于0.5ml/kg/时的尿量为12小时以上作为判断基准，在Failure(阶段3)，将血清肌酸酐从基线上升到3.0倍以上或小于0.3ml/kg/时的尿量为24小时以上作为判断基准。另一方面，这些分类通过并用其他指标，例如GFR的变化量，能够更正确地进行急性肾衰竭的分类。关于慢性肾衰竭(CKD)，在日本肾脏学会的指导原则(2009)中显示了病期阶段1(有肾损伤但肾功能正常，eGFR≥90)～阶段5(肾衰竭，eGFR<15)的诊断基准。其中，成为指标的估算肾小球滤过量(eGFR)是由血清肌酸酐值和年龄、性别算出的，显示肾脏将代谢物排到尿中的能力。在本发明的分析·检查方法中，能够以比迄今为止的肾功能标志物高的灵敏度检测肾功能的下降。因此，能够分类根据现有的标志物没有分为肾衰竭的风险组，例如，即使在有上述原因那样的AKI、CKD危险因子，但血清肌酸酐、GFR没有观察到明确的变动的高风险组中，也能够检测肾功能的下降。
在本发明中，受试者不限定于人，可以包含实验动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。因此，受试者也可以表示为受试体。
本发明的分析方法能够用于收集用于慢性和/或急性肾衰竭的诊断方法的预备数据。使用这样的预备数据，医师能够进行慢性和/或急性肾衰竭诊断，但是该分析方法可以通过非医师的医疗辅助者等来进行，也能够由分析机构等进行。因此，本发明的分析方法也可以说是诊断的预备方法。
本说明书中提到的所有文献其整体通过引用而纳入本说明书中。
附图说明
图1-A是通过二维HPLC法获得的进行了假手术或缺血再灌注处置的C57BL/6J野生型小鼠血清中的D-/L-丝氨酸的典型色谱图。
图1-B是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠血清中的D-丝氨酸浓度的变化的图。
图1-C是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠血清中的L-丝氨酸浓度的变化的图。
图1-D是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠血清中的D-丝氨酸浓度相对于L-丝氨酸浓度的比的变化的图。
图1-E是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠血清中的肌酸酐浓度的变化的图。
图1-F是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度的变化的图。
图2-A是通过二维HPLC法获得的进行了假手术或缺血再灌注处置的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-/L-丝氨酸的典型色谱图。
图2-B是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丝氨酸浓度的变化的图。
图2-C是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的L-丝氨酸浓度的变化的图。
图2-D是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的肌酸酐浓度的变化的图。
图2-E是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丝氨酸浓度相对于L-丝氨酸浓度的比的变化的图。
图2-F是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的KIM-1浓度的变化的图。
图2-G是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的NGAL浓度的变化的图。
图3-A是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-组氨酸浓度相对于L-组氨酸浓度的比的变化的图。
图3-B是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-天冬酰胺浓度相对于L-天冬酰胺浓度的比的变化的图。
图3-C是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丝氨酸浓度相对于L-丝氨酸浓度的比的变化的图。
图3-D是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-精氨酸浓度相对于L-精氨酸浓度的比的变化的图。
图3-E是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别苏氨酸(D-allo-Thr)浓度相对于L-苏氨酸浓度的比的变化的图。
图3-F是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-谷氨酸浓度相对于L-谷氨酸浓度的比的变化的图。
图3-G是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丙氨酸浓度相对于L-丙氨酸浓度的比的变化的图。
图3-H是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-脯氨酸浓度相对于L-脯氨酸浓度的比的变化的图。
图3-I是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-缬氨酸浓度相对于L-缬氨酸浓度的比的变化的图。
图3-J是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)浓度相对于L-异亮氨酸浓度的比的变化的图。
图3-K是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-苯丙氨酸浓度相对于L-苯丙氨酸浓度的比的变化的图。
图3-L是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-赖氨酸浓度相对于L-赖氨酸浓度的比的变化的图。
图4-A是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-组氨酸浓度相对于L-组氨酸浓度和D-组氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-B是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-天冬酰胺浓度相对于L-天冬酰胺浓度和D-天冬酰胺浓度之和的百分率的变化的图。
图4-C是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丝氨酸浓度相对于L-丝氨酸浓度和D-丝氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-D是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-精氨酸浓度相对于L-组氨酸浓度和D-精氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-E是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别苏氨酸(D-allo-Thr)浓度相对于L-苏氨酸浓度和D-别苏氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-F是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-谷氨酸浓度相对于L-谷氨酸浓度和D-谷氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-G是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丙氨酸浓度相对于L-丙氨酸浓度和D-丙氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-H是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-脯氨酸浓度相对于L-脯氨酸浓度和D-脯氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-I是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-缬氨酸浓度相对于L-缬氨酸浓度和D-缬氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-J是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)浓度相对于L-异亮氨酸浓度和D-别异亮氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-K是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-苯丙氨酸浓度相对于L-苯丙氨酸浓度和D-苯丙氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图4-L是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-赖氨酸浓度相对于L-赖氨酸浓度和D-赖氨酸浓度之和的百分率的变化的图。
图5-A是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-组氨酸浓度相对于L-组氨酸浓度的比的变化的图。
图5-B是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-天冬酰胺浓度相对于L-天冬酰胺浓度的比的变化的图。
图5-C是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丝氨酸浓度相对于L-丝氨酸浓度的比的变化的图。
图5-D是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-精氨酸浓度相对于L-精氨酸浓度的比的变化的图。
图5-E是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别苏氨酸(D-allo-Thr)浓度相对于L-苏氨酸浓度的比的变化的图。
图5-F是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-谷氨酸浓度相对于L-谷氨酸浓度的比的变化的图。
图5-G是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-丙氨酸浓度相对于L-丙氨酸浓度的比的变化的图。
图5-H是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-脯氨酸浓度相对于L-脯氨酸浓度的比的变化的图。
图5-I是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-缬氨酸浓度相对于L-缬氨酸浓度的比的变化的图。
图5-J是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)浓度相对于L-异亮氨酸浓度的比的变化的图。
图5-K是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-苯丙氨酸浓度相对于L-苯丙氨酸浓度的比的变化的图。
图5-L是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-赖氨酸浓度相对于L-赖氨酸浓度的比的变化的图。
图5-M是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-谷氨酰胺浓度相对于L-谷氨酰胺浓度的比的变化的图。
图5-N是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-苏氨酸浓度相对于L-苏氨酸浓度的比的变化的图。
图5-O是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-甲硫氨酸浓度相对于L-甲硫氨酸浓度的比的变化的图。
图5-P是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-天冬氨酸浓度相对于L-天冬氨酸浓度的比的变化的图。
图5-Q是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-别苏氨酸(D-allo-Thr)浓度相对于L-别苏氨酸(L-allo-Thr)浓度的比的变化的图。
图5-R是显示进行了肾缺血再灌注处理的C57BL/6J野生型小鼠尿中的D-亮氨酸浓度相对于L-亮氨酸浓度的比的变化的图。
具体实施方式
以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的，并不限定本发明的技术的范围。本发明的技术的范围仅受权利要求书的记载限定。以不偏离本发明的宗旨为条件，可以进行本发明的变更，例如，本发明的构成要素的添加、删除和替换。
实施例1
1.材料和方法
(1)研究伦理
所有的实验是按照设施的指导原则进行的，是获得该设施的动物实验委员会的认可而进行的。
(2)材料
氨基酸的对映异构体和HPLC级的乙腈从ナカライテスク(京都)买入。HPLC级的甲醇、三氟乙酸、硼酸等从和光纯药(大阪)买入。水使用Mill-Q梯度A10系统纯化。
(3)动物
动物是在SPF环境、每12小时明暗交替的条件下，以能够自由摄取水和饲料的方式饲养的。C57BL/6J小鼠从日本クレア(东京)买入。本实施例中使用的D-氨基酸氧化酶的点突变小鼠是181位的甘氨酸被替换为精氨酸的突变体，对C57BL/6J系统回交ddY系统(Sasabe,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109：627(2012))。丝氨酸消旋酶基因敲除小鼠是由Miyoshi,Y.等(Amino Acids 43：1919(2012))制作的。
(4)肾缺血再灌注处理
将12-16周龄的雄性小鼠进行肾缺血再灌注(以下也称为“IRI”。)处理。在进行IRI处理之前，在戊巴比妥麻醉下除去右侧肾。12天后，随机选择小鼠，进行假手术(Sham)或者IRI处置。在戊巴比妥麻醉下，将左侧肾拉至体外，用夹子(Schwartz Micro Serrefines，Fine Science Tools Inc.，加拿大，温哥华)夹闭动脉和静脉。45分钟后，恢复血流循环，除去夹子。用肉眼确认肾表面的颜色复原，将肾送饭体内。在假手术中，左侧的肾被拉至体外，但没有利用夹子夹闭血流。在再灌注的4、8、20和40小时后，用乙醚麻醉小鼠，从大静脉采血，从膀胱采尿。肾摘出后，根据需要进行灌注固定。血清通过在ベクトン·ディッキンソン(BD)マイクロテーナー(微量采血管)中进行1500×g、10分钟离心而被分离。血清或尿中的肌酸酐和血中尿素氮(BUN)水平使用FujiDRI-CHEM4000系统(富士フィルム，东京)测定。
血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和尿中的KIM-1和NGAL使用R&Dシステムズ社制的小鼠ELISA试剂盒来定量。
(5)氨基酸立体异构体全分析
将前述样品进行利用财津等开发的D、L-氨基酸同步高灵敏度分析系统(日本特许第4291628号)的氨基酸立体异构体全分析。各氨基酸的分析条件的细节在MiyoshiY.等，J.Chromatogr.B,879：3184(2011)和Sasabe,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、109：627(2012)中说明。简洁而言，将血清和尿中的氨基酸用NBD-F(4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑，东京化成工业株式会社)衍生化，提供给HPLC系统(参照NANOSPACE SI-2，株式会社资生堂的补充信息。)。简洁而言，反相分离用分析柱使用了本公司制的单块ODS柱(内径1.5mm×250mm，装入石英玻璃毛细管)。荧光检测以激发波长470nm、检测波长530nm进行。反相分离后，移至对映选择性柱。对映异构体分离使用了利用(S)-萘基甘氨酸作为手性拆分试剂的スミキラルOA-2500S柱(250mm×1.5mm，自己填充，材料是株式会社住化分析中心制)。体液中的D-氨基酸的浓度在生理学上保持在微摩尔的级别。本实施例中说明的二维HPLC系统，例如，能够将丝氨酸的立体异构体区分、在1fmol～100pmol的范围内定量测定。这是对于识别健康正常者和肾衰竭患者的丝氨酸的D-型异构体和L-型异构体的浓度变化而言充分的灵敏度(未图示。)。
(6)统计处理
本说明书和附图记载的全部数值是由平均值±样本均值的标准误差(标准误，SEM)表示的。实验的统计学分析利用了学生t双侧检验、单因素方差分析(one way ANOVA)、Tukey’s多重比较检验(Tukey’s multiplecomparison test)等统计学方法。此外，当这些检验中的P值小于0.05时，评价为有显著性。所有的解析利用Prism5(GraphPad Software，加利福尼亚州，拉霍亚)。
2.结果
(1)血清中D-丝氨酸和L-丝氨酸浓度
图1-A是通过二维HPLC法获得的进行了假手术或缺血再灌注处置的C57BL/6J野生型小鼠血清中的D-/L-丝氨酸的典型色谱图。在以下的实验中，对于假手术的8只、再灌注后4小时的5只、8小时的9只、20小时的6只和40小时的7只测定标志物。图1-A～1-F的柱状图表示平均值，误差柱表示样本均值的标准误差(SEM)。对于本实施例的数据，在进行单因素方差分析后，利用Tukey’s多重比较检验进行统计分析。在图1-A～1-F中，*表示P小于0.05，**表示P小于0.01，***表示P小于0.001。NS表示没有显著性差异。图的Sham表示假手术处置小鼠的浓度，IRI4、IRI8、IRI20和IRI40分别表示再灌注后4、8、20和40小时后的小鼠的浓度。在C57BL/6J小鼠中，血清中的D-丝氨酸浓度在再灌注后4小时和8小时未观察到显著的变动，但是在20小时上升，在40小时进一步上升(图1-B)。另外，图1-B所示的D-丝氨酸浓度的数值，Sham为3.7±0.3μM，IRI4为3.4±0.3μM，IRI8为4.3±0.4μM，IRI20为5.5±0.5μM，IRI40为10.6±0.4μM。血清中的L-丝氨酸浓度在再灌注后4小时骤减，之后一直保持低的值(图1-C)。图1-C所示的D-丝氨酸浓度的数值，Sham为106.1±5.0μM，IRI4为46.9±0.9μM，IRI8为61.5±5.6μM，IRI20为70.6±7.5μM，IRI40为64.7±2.2μM。因此，[D-丝氨酸]/[L-丝氨酸]随着L-丝氨酸浓度的下降而上升，在40小时进一步上升(图1-D)。图1-D所示的[D-丝氨酸]/[L-丝氨酸]的数值，Sham为0.036±0.004，IRI4为0.074±0.005，IRI8为0.073±0.009，IRI20为0.082±0.009，IRI40为0.164±0.008。血清中肌酸酐浓度从再灌注后4小时开始上升，在40小时进一步上升(图1-E)。图1-E所示的肌酸酐浓度的数值，Sham为0.59±0.05mg/dl，IRI4为1.108±0.04mg/dl，IRI8为1.89±0.09mg/dl，IRI20为1.14±0.22mg/dl，IRI40为3.73±0.09mg/dl。然而，血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度在再灌注后4小时上升，然后渐渐下降直到40小时为止(图1-F)。图1-F所示的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度的数值，Sham为0.84±0.01μg/mL，IRI4为1.63±0.08μg/mL，IRI8为1.39±0.09μg/mL，IRI20为1.19±0.05μg/mL，IRI40为1.06±0.10μg/mL。这些实验表明，[D-丝氨酸]/[L-丝氨酸]的比在再灌注后4小时开始上升，单调递增至40小时，因此，作为肾衰竭的标志物是有用的。其中，如果是单调性变化的标志物，则显示某一数值的仅仅是再灌注后的一个时期，但是在有峰或谷的变动的情况下，显示某一数值的不仅是一个时期，还存在1次或2次以上。因此，不能根据标志物的数值唯一地推定肾衰竭的进展阶段。
(2)尿中D-丝氨酸和L-丝氨酸
在以下的实验中，对于假手术的7只、再灌注后4小时的5只、8小的5只时、20小时的5只和40小时的5只小鼠，测定标志物。图2-A～2-J的柱状图表示平均值，误差柱表示样本均值的标准误差(SEM)。针对本实施例的数据，在进行单因素方差分析后，利用Tukey’s多重比较检验进行统计分析。在图2-A～2-G中，*表示P小于0.05，**表示P小于0.01，***表示P小于0.001。NS表示没有显著性差异。在血清中，随着缺血再灌注后的时间推移，D-丝氨酸浓度上升，而L-丝氨酸浓度下降。然而，在尿中相反，随着缺血再灌注后的时间推移，D-丝氨酸浓度下降(图2-B)，L-丝氨酸浓度上升(图2-C)。图2-B所示的D-丝氨酸浓度的数值，Sham为52.0±7.6μM，IRI4为24.5±5.7μM，IRI8为9.9±1.1μM，IRI20为36.9±3.3μM，IRI40为22.4±3.8μM。图2-C所示的L-丝氨酸浓度的数值，Sham为19.0±3.0μM，IRI4为23.6±2.7μM，IRI8为62.6±9.9μM，IRI20为136.1±14.9μM，IRI40为93.8±12.1μM。另外，尿中的肌酸酐在再灌注后8小时以后骤减(图2-D)。这是因为，由于肾功能下降，肌酸酐向尿中的排出受到阻碍。而且，肌酸酐在再灌注后4小时与假手术小鼠相比基本没有变化，因此肾功能下降在再灌注后4小时还不显著，但是尿中的[D-丝氨酸]/[L-丝氨酸]的比即使在4小时也下降到假手术小鼠的近三分之一(图2-E)。因此，尿中的[D-丝氨酸]/[L-丝氨酸]的比，在肾功能下降之前发生变动，而且单调递减，因此显示作为肾衰竭的早期标志物是有用的。图2-E所示的[D-丝氨酸]/[L-丝氨酸]的比的数值，Sham为2.82±0.18，IRI4为1.10±0.26，IRI8为0.16±0.01，IRI20为0.28±0.02，IRI40为0.25±0.04。尿中的KIM-1浓度，在再灌注后20小时上升，在40小时减少(图2-F)。尿中NGAL浓度，在再灌注后4小时与假手术小鼠相比无显著性差异，在8小时上升，之后几乎没有变化(图2-G)。因此，基于尿中丝氨酸浓度的参数比现有的任一标志物都早地显示伴随肾衰竭而变动，而且，其变化是单调性变化，因此，对于判断受试者处于肾衰竭进展的哪个阶段是有用的。
(3)尿中的各种氨基酸对映异构体的浓度比的变化
对于测定了尿中的标志物的图2-A～2-J的实验中使用的小鼠中的2只的尿，测定了各种氨基酸的对映异构体对的浓度。在图3-A～图3-L中，对于假手术小鼠和缺血再灌注处理后4、8、20和40小时的小鼠，以柱状图显示小鼠个体的D-型异构体的浓度的平均值相对于L-型异构体的浓度的平均值的比。其结果是，对于尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸](图3-F)、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸](图3-J)、以及[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸](图3-K)，D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比即使在再灌注4小时后也不变动，8小时以后下降非常多。与此相对，对于[D-组氨酸]和[L-组氨酸](图3-A)、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺](图3-B)、[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸](图3-C)、[D-精氨酸]和[L-精氨酸](图3-D)、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸](图3-E)、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸](图3-G)、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸](图3-H)、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸](图3-I)、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸](图3-L)的组合，D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比在再灌注后4小时大幅变动，显示了假手术小鼠与再灌注8小时以后的中间的数值。因此，对于某一个体，如果[D-组氨酸]/[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]/[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]/[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]/[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]/[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]/[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]/[L-缬氨酸]、以及[D-赖氨酸]/[L-赖氨酸]的至少任1数值比健康正常者的数值低，则即使[D-谷氨酸]/[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]/[L-异亮氨酸]、以及[D-苯丙氨酸]/[L-苯丙氨酸]中的至少任1数值与健康正常者相比无变化，也能够检测肾功能开始下降之前的非常早期的状态。此外，对于某一个体，当[D-组氨酸]/[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]/[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]/[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]/[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]/[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]/[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]/[L-缬氨酸]、以及[D-赖氨酸]/[L-赖氨酸]中的至少任1数值比健康正常者的数值低，而且[D-谷氨酸]/[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]/[L-异亮氨酸]、以及[D-苯丙氨酸]/[L-苯丙氨酸]中的至少任1数值也比健康正常者的数值低时，可检测肾功能开始下降的时期的状态。如此通过基于不同组的氨基酸的D-型异构体和L-型异构体的尿中浓度的参数，不仅能够区分受试者是否处于肾衰竭的早期，还能够区分是肾功能开始下降之前的非常早期的状态还是肾功能开始下降的时期的状态。
(4)尿中各种氨基酸的D-型异构体浓度相对于对映异构体总浓度的百分率的变化
在图4-A～图4-L中，对于假手术小鼠和缺血再灌注处理后4、8、20和40小时的小鼠，以柱状图显示小鼠个体的D-型异构体的浓度的平均值相对于L-型异构体的浓度的平均值与D-型异构体的浓度的平均值之和的百分率。其结果是，对于尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸](图4-F)、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸](图4-J)、以及[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸](图4-K)，D-型异构体的浓度的平均值相对于L-型异构体的浓度的平均值与D-型异构体的浓度的平均值之和的百分率即使在再灌注4小时后也不变动，8小时以后下降非常多。与此相对，对于[D-组氨酸]和[L-组氨酸](图4-A)、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺](图4-B)、[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸](图4-C)、[D-精氨酸]和[L-精氨酸](图4-D)、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸](图4-E)、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸](图4-G)、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸](图4-H)、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸](图4-I)、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸](图4-L)的组合，D-型异构体的浓度的平均值相对于L-型异构体的浓度的平均值与D-型异构体的浓度的平均值之和的百分率在再灌注后4小时大幅变动，显示了假手术小鼠与再灌注8小时以后的中间的数值。因此，对于某一个体，如果[D-组氨酸]相对于[总组氨酸]的百分率、[D-天冬酰胺]相对于[总天冬酰胺]的百分率、[D-精氨酸]相对于[总精氨酸]的百分率、[D-别苏氨酸]相对于[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]之和的百分率、[D-丙氨酸]相对于[总丙氨酸]的百分率、[D-脯氨酸]相对于[总脯氨酸]的百分率、[D-缬氨酸]相对于[总缬氨酸]的百分率、以及[D-赖氨酸]相对于[总赖氨酸]的百分率的至少任1数值比健康正常者的数值低，则即使[D-谷氨酸]相对于[总谷氨酸]的百分率、[D-别异亮氨酸]相对于[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]之和的百分率、以及[D-苯丙氨酸]相对于[总苯丙氨酸]的百分率中的至少任1数值与健康正常者相比无变化，也能够检测肾功能开始下降之前的非常早期的状态。
此外，对于某一个体，当[D-组氨酸]相对于[总组氨酸]的百分率、[D-天冬酰胺]相对于[总天冬酰胺]的百分率、[D-精氨酸]相对于[总精氨酸]的百分率、[D-别苏氨酸]相对于[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]之和的百分率、[总丙氨酸]相对于[L-丙氨酸]的百分率、[D-脯氨酸]相对于[总脯氨酸]的百分率、[D-缬氨酸]相对于[总缬氨酸]的百分率、以及[D-赖氨酸]相对于[总赖氨酸]的百分率中的至少任选1数值比健康正常者的数值低，而且[D-谷氨酸]相对于[总谷氨酸]的百分率、[D-别异亮氨酸]相对于[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]之和的百分率、以及[D-苯丙氨酸]相对于[总苯丙氨酸]的百分率中的至少任选1数值也比健康正常者的数值低时，可检测肾功能开始下降的时期的状态。如此通过基于不同组的氨基酸的D-型异构体和L-型异构体的尿中浓度的参数，不仅能够区分受试者是否处于肾衰竭的早期，还能够区分是肾功能开始下降之前的非常早期的状态还是肾功能开始下降的时期的状态。
(5)尿中的各种氨基酸对映异构体的浓度比的变化
对于3～7只小鼠进行缺血再灌注处理，对于取得的尿测定了各种氨基酸的对映异构体对的浓度。在图5-A～图5-R中，对于假手术小鼠和缺血再灌注处理后4、8、20和40小时的小鼠，以柱状图显示小鼠个体的D-型异构体的浓度的平均值相对于L-型异构体的浓度的平均值的比，调查了有无统计学上的显著性差异。其结果是，对于尿中的[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸](图5-J)、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸](图5-K)、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸](图5-R)，D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比即使在再灌注4小时后也不变动(无统计学上的显著性差异)，8小时以后下降非常多(有显著性差异)。对于[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸](图5-F)、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸](图5-I)、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺](图5-M)、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸](图5-N)、以及[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸](图5-Q)，在再灌注4小时后虽然变动，但没有统计学上的显著性差异，8小时以后下降非常多(有显著性差异)。对于[D-甲硫氨酸]和[L-甲硫氨酸](图5-O)、以及[D-天冬氨酸]和[L-天冬氨酸](图5-P)，没有变动的倾向。与此相对，对于[D-组氨酸]和[L-组氨酸](图5-A)、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺](图5-B)、[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸](图5-C)、[D-精氨酸]和[L-精氨酸](图5-D)、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸](图5-E)、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸](图5-G)、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸](图5-H)以及、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸](图5-L)的组合，D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比在再灌注后4小时大幅变动(有统计学上的显著性差异)，显示了假手术小鼠与再灌注8小时以后的中间的数值。现有作为肾衰竭的诊断标志物使用的尿中肌酸酐，在小鼠缺血再灌注模型中，在缺血后4小时不能检测出肾衰竭，在8小时以后能够检测出(图2-D)，因此本申请的[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸](图5-N)、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸](图5-Q)、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸](图5-H)以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸](图5-L)，均能够作为灵敏度与尿中肌酸酐同等或在其之上的肾衰竭标志物使用。尤其是如果使用能够在再灌注后4小时具有显著性差异地检测的选自由[D-组氨酸]/[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]/[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]/[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]/[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]/[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]/[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]/[L-赖氨酸]组成的组中的1个或多个病态指标值，则能够以高于尿中肌酸酐的灵敏度诊断肾衰竭。其中，尤其是在再灌注后4小时后与假手术组相比显示p<0.01的显著性差异的选自由[D-组氨酸]/[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]/[L-天冬酰胺]、[D-脯氨酸]/[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]/[L-赖氨酸]组成的组中的1个或多个病态指标值，能够以更高的灵敏度诊断肾衰竭，进而在再灌注后4小时后与假手术组相比显示p<0.001的显著性差异的选自由[D-组氨酸]/[L-组氨酸]、[D-脯氨酸]/[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]/[L-赖氨酸]组成的组中的1个或多个病态指标值，能够以进一步高的灵敏度诊断肾衰竭。病态指标值可以单独使用，也能够通过组合多个病态指标值获得可靠性更高的诊断。
此外，本发明的病态指标值中，使用[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]中的任一组的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，能够作为灵敏度与尿中肌酸酐同等或在其之上的肾衰竭标志物使用。因此，在受试体的病态指标值相对于健康正常者组的病态指标基准值有统计学上的显著性差异，且相对于肾衰竭患者组的病态指标基准值有统计学上的显著性差异的情况下，如果在健康正常者组的病态指标基准值与肾衰竭患者组的病态指标基准值之间，则能够诊断受试体有早期的肾衰竭的嫌疑。在病态指标值中，尤其是通过使用在再灌注后4小时后与假手术组相比显示p<0.01的显著性差异的使用选自由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的1对或多对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，能够诊断更早期的肾衰竭。进而，通过在再灌注后4小时后与假手术组相比显示p<0.001的显著性差异的从选自由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的组中的1对或多对氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的病态指标值，能够诊断更早阶段的肾衰竭。

Claims (13)

1.被怀疑肾衰竭的受试体的尿的分析方法，该分析方法包括：
测定该受试体的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及
从所述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度，算出将D-型异构体的构成比例具有显著性差异的减少与受试体的肾衰竭相关联的病态指标值的步骤。
2.根据权利要求1所述的分析方法，所述病态指标值是所述至少1种氨基酸对的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、或者D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的比。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法，还包括下述步骤：将所述受试体的病态指标值与健康正常者组的病态指标基准值、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值进行比较，判定所述受试体的病态指标值与所述健康正常者组的病态指标基准值有无统计学上的显著性差异，并判定所述受试体的病态指标值与所述急性肾衰竭患者和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值有无统计学上的显著性差异，或者在相对于所述健康正常者组以及所述急性肾衰竭患者和/或慢性肾衰竭患者组在统计学上有显著性差异的情况下，判定所述受试体的病态指标值是否在所述健康正常者组的病态指标基准值与急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值之间。
4.根据权利要求3所述的分析方法，还包括下述步骤：在所述受试体的第一病态指标值与所述健康正常者组的病态指标基准值以及所述急性肾衰竭患者和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值在统计学上有显著性差异的情况下，判定所述受试体的第一病态指标值是否在所述健康正常者组的病态指标基准值与所述慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值之间，所述受试体的第一病态指标值是从所述受试体的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
5.根据权利要求4所述的分析方法，包括进一步判定所述受试体的第二病态指标值是否在所述健康正常者的病态指标基准值与所述慢性肾衰竭和/或急性肾衰竭患者的病态指标基准值之间的步骤，所述受试体的第二病态指标值是从所述受试体的尿中的选自由[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
6.肾衰竭的检查方法，该检查方法包括：
测定非样本的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度的步骤，以及
从所述至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度，算出将D-型异构体的构成比例减少与受试体的肾衰竭相关联的病态指标值的步骤。
7.根据权利要求6所述的检查方法，所述氨基酸组由[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]组成。
8.受试体的尿的分析系统，是被怀疑肾衰竭的受试体的尿的样品分析系统，包含存储部、分析测定部、数据处理部和病态信息输出部，
所述存储部存储健康正常者组的尿的病态指标基准值、以及急性肾衰竭患者和/或慢性肾衰竭患者组的尿的病态指标基准值，
所述分析测定部对所述受试体的尿中的氨基酸中选自由D-丝氨酸和L-丝氨酸、D-组氨酸和L-组氨酸、D-天冬酰胺和L-天冬酰胺、D-精氨酸和L-精氨酸、D-别苏氨酸和L-苏氨酸、D-谷氨酸和L-谷氨酸、D-丙氨酸和L-丙氨酸、D-脯氨酸和L-脯氨酸、D-缬氨酸和L-缬氨酸、D-别异亮氨酸和L-异亮氨酸、D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸、以及D-赖氨酸和L-赖氨酸组成的氨基酸组中的至少1对氨基酸立体异构体进行分离、定量，
所述数据处理部从所述受试体的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度，算出将D-型异构体的构成比例减少与受试体的肾衰竭相关联的病态指标值，将该受试体的病态指标值与健康正常者的病态指标基准值、以及急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭的患者的病态指标基准值进行比较，当所述受试体的病态指标值与所述健康正常者组的病态指标基准值在统计学上无显著性差异时，将所述受试体肾衰竭的嫌疑小定义为所述受试体的病态信息，当所述受试体的病态指标值与所述急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值在统计学上无显著性差异时，将所述受试体有肾衰竭的嫌疑定义为所述受试体的病态信息，在所述受试体的病态指标值与所述健康正常者组的病态指标基准值以及所述急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值在统计学上有显著性差异的情况下，当所述受试体的病态指标值在所述健康正常者组的病态指标基准值与所述急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值之间时，将所述受试体有早期肾衰竭的嫌疑定义为所述受试体的病态信息，
所述病态信息输出部输出所述受试体的病态信息。
9.根据权利要求8所述的分析系统，所述病态指标值是所述至少1种氨基酸对的D-型异构体的浓度相对于L-型异构体的浓度的比、或者D-型异构体的浓度相对于D-型异构体和L-型异构体的浓度之和的百分率。
10.根据权利要求8或9所述的分析系统，当所述受试体的第一病态指标值在所述健康正常者组的病态指标基准值与所述急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值之间时，将有非常早期的肾衰竭的嫌疑定义为所述受试体的病态信息，所述受试体的第一病态指标值是从所述受试体的尿中的由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、以及[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的分析系统，所述氨基酸组中进一步包含[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]，
当所述受试体的第一病态指标值在所述健康正常者组的病态指标基准值与所述急性肾衰竭和/或慢性肾衰竭患者组的病态指标基准值之间时，将有非常早期的肾衰竭的嫌疑定义为所述受试体的病态信息，所述受试体的第一病态指标值是从由[D-丝氨酸]和[L-丝氨酸]、[D-组氨酸]和[L-组氨酸]、[D-天冬酰胺]和[L-天冬酰胺]、[D-精氨酸]和[L-精氨酸]、[D-丙氨酸]和[L-丙氨酸]、[D-脯氨酸]和[L-脯氨酸]、[D-赖氨酸]和[L-赖氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]组成的氨基酸组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
12.根据权利要求10所述的分析系统，当所述受试体的第二病态指标值在所述健康正常者的病态指标基准值与所述慢性肾衰竭和/或急性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，将所述受试体有处于肾功能开始下降时期的状态的嫌疑定义为所述受试体的病态信息，所述受试体的第二病态指标值是从所述受试体的尿中的[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、以及[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
13.根据权利要求11所述的分析系统，所述氨基酸组中进一步包含[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-别苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]，
当所述受试体的第二病态指标值在所述健康正常者的病态指标基准值与所述慢性肾衰竭和/或急性肾衰竭患者的病态指标基准值之间时，将所述受试体有处于肾功能开始下降时期的状态的嫌疑定义为所述受试体的病态信息，所述受试体的第二病态指标值是从选自由[D-谷氨酸]和[L-谷氨酸]、[D-缬氨酸]和[L-缬氨酸]、[D-别异亮氨酸]和[L-异亮氨酸]、[D-苯丙氨酸]和[L-苯丙氨酸]、[D-谷氨酰胺]和[L-谷氨酰胺]、[D-苏氨酸]和[L-苏氨酸]、[D-别苏氨酸]和[L-苏氨酸]、以及[D-亮氨酸]和[L-亮氨酸]组成的组中的至少1种氨基酸的D-型异构体和L-型异构体对的浓度算出的。
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