WO2015087985A1 - 腎不全の早期診断マーカー - Google Patents

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WO2015087985A1
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renal failure
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健司 浜瀬
百合香 三次
真史 三田
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株式会社資生堂
国立大学法人九州大学
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    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing blood or urine of a subject suspected of having renal failure, and a blood or urine sample analysis system of a subject suspected of having renal failure, and more specifically, A subject comprising a step of measuring the concentration of a D-form and L-form pair of at least one amino acid of the group consisting of [D-serine] and [L-serine] etc. in blood, plasma, serum or urine Blood, plasma, serum or urine analysis method and blood, plasma, serum or urine sample analysis system of the subject, storage unit, analysis measurement unit, data processing unit, pathological information output A blood, plasma, serum or urine sample analysis system for carrying out the analysis method.
  • Chronic renal failure is a disease that affects 13.3 million people, equivalent to about 13% of Japan's adult population, and has a high risk of end-stage renal failure (ESKD), threatening the health of the people.
  • Chronic renal failure includes all those with decreased renal function, expressed as glomerular filtration rate, or with persistent (3 months or longer) evidence suggesting kidney damage.
  • There is no effective treatment for chronic renal failure and if chronic renal failure progresses and kidney function declines, there is a risk of uremia, necessitating artificial dialysis and kidney transplantation, which imposes a heavy burden on the medical economy (non-patented) Reference 1).
  • Chronic renal failure has no subjective symptoms.
  • Acute renal failure is a disease in which renal function rapidly decreases in weeks or days.
  • an acute renal failure experimental model induced by a surgical technique or drug administration is known.
  • the gold standard for diagnosis of acute renal failure is urine production and serum creatinine concentration. Serum creatinine concentration is excellent in that it can be evaluated without biopsy regardless of urination.
  • the glomerular filtration rate needs to be in a steady state. Insensitive to small fluctuations in glomerular filtration rate.
  • changes become apparent at a relatively late stage.
  • Non-patent Document 2 The serum creatinine concentration varies depending on conditions such as age, sex, muscle mass, and medicines to be taken, so it cannot be said to be a specific marker (Non-patent Document 2). Markers of acute renal failure include neutrophil gelatinase-related lipocalin (NGAL), interleukin-18 (IL-18), nephropathy molecule (KIM-1), liver fatty acid binding proteins (FABPs), cystatin C and other proteins.
  • NGAL neutrophil gelatinase-related lipocalin
  • IL-18 interleukin-18
  • KIM-1 nephropathy molecule
  • FABPs liver fatty acid binding proteins
  • cystatin C cystatin C
  • metabolic low molecular weight compounds such as homovanillic acid sulfate and trimethylamine-N-oxide have been reported. However, none of these markers are detected early in renal failure.
  • D-serine and D-alanine have higher serum concentrations in patients with renal insufficiency than those in healthy subjects, and the ratio of D-isomer and D-isomer / (D-isomer + L-isomer) Both of these are correlated with creatinine, suggesting that they are candidates for markers of renal proximal tubule dysfunction (Non-patent Document 3). It has been disclosed that D-amino acids (Ala, Pro, Ser) tend to be high in the plasma of nephritis patients and have a correlation with the amount of creatinine (Non-patent Document 9).
  • Non-Patent Document 5 The concentration of D-serine and D-alanine in urine and the ratio of D-form to the sum of D-form and L-form have been investigated for healthy individuals in each age, and the handling of D-serine in the kidneys is different (Non-Patent Document 6).
  • One or more amino acids selected from the group consisting of D-serine, D-threonine, D-alanine, D-asparagine, D-allose threonine, D-glutamine, D-proline and D-phenylalanine
  • a body fluid such as blood, plasma, urine, etc.
  • the serum is the only sample used for determining the disease state index value in kidney disease, and it is not disclosed whether these amino acids can be used as the disease state index value in kidney disease.
  • Non-patent Document 8 D-amino acid oxidase enzyme involved in the degradation of D-amino acid is expressed in the renal proximal tubule, and the D-amino acid oxidase enzyme activity decreases in ischemia-reperfused rats (Non-patent Document 4). ).
  • L-serine is reabsorbed, whereas D-serine is hardly reabsorbed.
  • D-amino acids including D-serine fluctuate early in renal failure.
  • the present invention provides a method for analyzing blood or urine of a subject suspected of having renal failure.
  • the analysis method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], and [D-asparagine] in the blood, plasma, serum or urine of a subject.
  • the pathological index value calculated from the concentration of the D-form and L-form pair of at least one amino acid shows a significant decrease in the D-form composition ratio
  • the ratio of the concentration of the D-form to the concentration of the L-form of at least one amino acid pair, or the ratio or percentage of the concentration of the D-form to the sum of the concentrations of the D-form and the L-form It can be calculated as a disease state index value.
  • Non-Patent Document 7 amino acids in urine of patients with renal failure whose disease condition criteria are not shown are analyzed, but D-amino acid ratio is significantly higher for alanine, valine, proline, threonine, and aspartic acid. It has been shown that it has increased. Therefore, it is a surprising discovery that the percentage of D-amino acids is reduced in the urine of patients with renal failure.
  • the analysis method of the present invention includes the above-mentioned amino acid group, [D-glutamine] and [L-glutamine], [D-threonine] and [L-threonine], and [D-allo-threonine]. ] And [L-allo-threonine], and [D-leucine] and [L-leucine] may be included. Therefore, the analysis method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [L-serine] in the urine of the subject.
  • the pathological index value calculated from the concentration of the D-form and L-form pair of at least one amino acid shows a significant decrease in the D-form composition ratio
  • the ratio of the concentration of the D-form to the concentration of the L-form of at least one amino acid pair, or the ratio or percentage of the concentration of the D-form to the sum of the concentrations of the D-form and the L-form It can be calculated as a disease state index value.
  • a method for examining renal failure wherein [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], and [D -Asparagine] and [L-Asparagine], [D-Arginine] and [L-Arginine], [D-Allo-threonine] and [L-Threonine], [D-Glutamic acid] and [L-Glutamic acid] [D-alanine] and [L-alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], [D-allo-isoleucine] and [ L-isoleucine], [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine], [D-lysine] and [L-lysine], [D-glutamine] and [L-glutamine], and [D-threonine] as well as[ -Threon
  • the inspection method may be performed by a medical assistant who is not a doctor, or relates to a method performed by an analysis organization or the like.
  • amino acid may be arbitrarily selected from the above amino acid group, but [D-histidine] and [L-histidine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-glutamic acid] and [ L-glutamic acid], [D-valine] and [L-valine], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], [D-lysine], [L-lysine] and [D-glutamine] And [L-glutamine], [D-leucine] and [L-leucine], and [D-allo-threonine] and [L-allo-threonine] are more preferable.
  • each amino acid combination may be excluded from the amino acid group described above.
  • [D-serine] and [L-serine] may be excluded, [D-histidine] and [L-histidine] may be excluded, [D-asparagine] and [L-asparagine]. ], [D-arginine] and [L-arginine] may be removed, [D-allo-threonine] and [L-threonine] may be removed, [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid] may be excluded, [D-alanine] and [L-alanine] may be excluded, and [D-proline] and [L-proline] may be excluded.
  • [D-valine] and [L-valine] may be excluded, [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine] may be excluded, or [D-phenylalanine].
  • [L-phenylalanine] [D-lysine] and [L-lysine] may be excluded, [D-glutamine] and [L-glutamine] may be excluded, and [D-threonine] and [ [L-threonine] may be removed, [D-allo-threonine] and [L-allo-threonine] may be removed, and [D-leucine] and [L-leucine] may be removed. May be.
  • pathologic index values were shown to decrease after renal ischemia / reperfusion as well as the urinary creatinine concentration. Since a decrease in urinary creatinine concentration indicates a decrease in renal function, it can be used as a marker for renal failure, and the pathologic index value of the present application should also be used as a marker for renal failure in the same manner as the urinary creatinine concentration. Can do. Note that KIM-1 and NGAL, which are markers of renal failure in urine, increase in urine concentration due to decreased renal function.
  • [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [L-asparagine], [D-proline] and [L-proline], [D-lysine] and [ L-lysine] is a pathological index value calculated using the concentration of a pair of D-form and L-form of one or more amino acids selected from the group consisting of Since it decreases with a significant difference of ⁇ 0.01, the disease state index value can be used as a more sensitive marker.
  • the pathological index value calculated from the concentration of the D-form and L-form pairs of a plurality of amino acids decreases with a significant difference of P ⁇ 0.001 4 hours after renal ischemia reperfusion.
  • the disease state index value can be used as a very sensitive marker. Therefore, the disease state index value of the present invention is equivalent to serum creatinine or the like, which is a conventional renal failure marker, or higher in sensitivity, and can be used for diagnosis of early stage renal failure.
  • chronic kidney Insufficiency includes a state in which a decrease in renal function indicated by GFR starts, or a very early state that has renal impairment but before changes in serum creatinine and GFR appear.
  • [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-phenylalanine] and [D] have no significant difference after 4 hours after renal ischemia / reperfusion, but have significant differences after 8 hours after renal ischemia / reperfusion.
  • L-phenylalanine [D-valine] and [L-valine], [D-glutamine] and [L-glutamine], [D-threonine] and [L-threonine], [D-leucine] and D-form of one or more amino acids selected from the group consisting of [L-leucine], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], [D-allo-threonine] and [L-threonine]
  • the pathological index value calculated using the concentration of the L-form pair can be used as a marker having sensitivity equivalent to that of conventional creatinine or the like.
  • a disease state index value calculated from the concentration of a pair of D-form and L-form of one amino acid may be used, or a condition state index calculated from the concentration of a pair of D-form and L-form of another amino acid Can also be used in combination with a value.
  • a condition state index calculated from the concentration of a pair of D-form and L-form of another amino acid Can also be used in combination with a value.
  • [D-histidine] and [L-histidine] [D-proline] and [L-proline]
  • [D-lysine] and [L-lysine] [L-lysine].
  • An extremely sensitive pathological index value calculated from the concentration of the body and L-pair, and another extremely sensitive pathological index calculated from the concentration of the D- and L-pairs selected from the same group May be combined with a value.
  • the above highly sensitive pathological condition index values are less sensitive pathological condition index values such as [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine].
  • [D-valine] and [L-valine] [D-glutamine] and [L-glutamine], [D-threonine] and [L-threonine], [D-leucine] and [L-leucine]
  • the analysis method of the present invention compares the pathological index value of the subject with the pathological index reference value of a healthy person and the pathological index reference value of a patient with acute renal failure and / or chronic renal failure. Whether the patient's pathological index value is similar to the normal pathological index value of the healthy person, or whether the pathological index value of the subject is similar to the pathological index reference value of the acute renal failure patient or chronic renal failure patient, or the subject
  • the method may further include a step of determining whether the pathological index value of the person is between the pathological index reference value of the healthy person and the pathological index reference value of the chronic renal failure patient.
  • the present invention provides a method in which a threshold is set in advance from a pathological index value of a group of healthy subjects and / or a group of patients with renal failure, thereby comparing the pathological index value of the subject with the threshold and Can be determined. If it is an expert, a threshold value can be suitably set from the pathological condition index value of a healthy subject group or a renal failure patient group. As the threshold value, for example, an average value, a median value, and an X percentile value of a healthy person group or a renal failure patient group can be used, but the threshold value is not limited thereto.
  • the threshold may be one, type of renal failure (acute, chronic) and cause (for example, drug nephropathy, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, membranous nephropathy, nephrosclerosis, etc.), A plurality can be set according to the state (early, middle, late) and the amino acids used or combinations thereof. By comparing the preset threshold value with the pathological condition index value of the subject, it becomes possible to determine, determine or diagnose the pathological condition of the subject's renal failure.
  • the analysis method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], and [D-asparagine in the blood, plasma, serum or urine of the subject. ] And [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-alanine] and [L-alanine], D of at least one amino acid in the amino acid group consisting of [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], and [D-lysine] and [L-lysine]
  • the first pathological index value of the subject calculated from the concentration of the body and L-body pair is between the pathological index reference value of the healthy subject and the pathological index reference value of the chronic renal failure patient; And the subject's blood, plasma, serum or Of [D-glutamic acid] and [L-gluta
  • the first disease state index value [D-serine] and [L-serine]
  • [D-histidine] and [L-histidine] [D-asparagine] and [L-asparagine]
  • [D-arginine] and [L-arginine] [D-alanine] and [L-alanine]
  • [D-proline] and [L-proline] [D-lysine] and [L-lysine]
  • the pathological condition index value of the subject calculated from the concentrations of the D-form and L-form pairs of at least one amino acid in the group consisting of: [D-glutamic acid] ] And [L-glutamic acid], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine], [D-valine] and [L-valine]
  • the amino acid group further includes [D-glutamine] and [L-glutamine], [D-threonine] and [L-threonine], [D-allo-threonine] and [L-allo-threonine], [ When D-leucine] and [L-leucine] are included, the first disease state index values are [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-alanine] and [L-alanine], [D-proline] and [L-proline] And [D-lysine] and [L-lysine], and [D-allo-threonine] and [L-allo-threonine] at least one amino acid in the D-form and L-form pair Calculated from the concentration It can be used a condition index of the subject.
  • the second disease state index values are [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine], In addition to [D-valine] and [L-valine], [D-glutamine] and [L-glutamine], [D-threonine] and [L-threonine], [D-leucine] and [L-valine] It may be a disease state index value calculated from the concentration of a pair of D-form and L-form of at least one amino acid selected from the group consisting of [leucine].
  • the present invention provides a sample analysis system for blood or urine of a subject suspected of having renal failure.
  • the sample analysis system of the present invention includes a storage unit, an analysis measurement unit, a data processing unit, and a pathological condition information output unit.
  • the storage unit stores a pathological index reference value in blood, plasma, serum or urine of a healthy person and a pathological index reference value in blood, plasma, serum or urine of a patient with acute renal failure and / or chronic renal failure.
  • the analytical measurement unit comprises D-serine and L-serine, D-histidine and L-histidine, D-asparagine and L-asparagine among amino acids in blood, plasma, serum or urine of the subject.
  • D-arginine and L-arginine D-allo-threonine and L-threonine, D-glutamic acid and L-glutamic acid, D-alanine and L-alanine, D-proline and L-proline, D- At least one pair of amino acid stereoisomers selected from the group consisting of valine and L-valine, D-allo-isoleucine and L-isoleucine, D-phenylalanine and L-phenylalanine, and D-lysine and L-lysine Is separated and quantified.
  • the data processing unit includes [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [L-asparagine] of the subject, [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-alanine] and [L- Alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], and [D-phenylalanine].
  • the pathological index value calculated from the concentration of the D-form and L-form pair of at least one amino acid indicates that the subject is associated with renal failure when it indicates a decrease in the proportion of the D-form. it can.
  • the analytical measurement unit comprises D-serine and L-serine, D-histidine and L-histidine, D-asparagine and L-asparagine among the urine amino acids of the subject.
  • the data processing unit includes [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [L-asparagine] of the subject, [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-alanine] and [L- Alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], and [D-phenylalanine].
  • the pathological index value Calculating at least one amino acid of the group consisting of D-form and L-form pairs, the pathological index value Calculating.
  • the pathological index value calculated from the concentration of the D-form and L-form pair of at least one amino acid indicates that the subject is associated with renal failure when it indicates a decrease in the proportion of the D-form. it can.
  • the disease state index value can be calculated from the concentration of a D-form and L-form pair of a certain amino acid, and is a value that can correlate a subject with renal failure when it indicates a decrease in the proportion of the D-form.
  • the sample analysis system of the present invention further includes, for example, the ratio of the concentration of D-isomer to the concentration of L-isomer in the D-isomer and L-isomer pair, the concentration of D-isomer and L-isomer, as pathological index values.
  • the ratio or percentage of the concentration of D-form relative to the sum is defined as the disease state index value of the subject.
  • the pathological index value of the subject is compared with the pathological index reference value of a healthy person and the pathological index reference value of a patient with acute renal failure and / or chronic renal failure.
  • the subject is similar to a normal condition index value of a healthy subject, the subject is less likely to have renal failure and is defined as the subject's disease state information.
  • the condition index value of the subject is similar to the condition index reference value of the chronic renal failure patient, it is defined as the condition information of the subject that the subject is suspected of having renal failure.
  • the subject is suspected of premature renal failure when the condition index value of the subject is between the condition index reference value of the healthy subject and the condition index reference value of the chronic kidney failure patient It is defined as the condition information of the subject.
  • the pathological condition information output unit outputs pathological condition information of the subject.
  • [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine] in the blood, plasma, serum or urine of the subject [D- Asparagine] and [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-alanine] and [L-alanine] [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], and [D-lysine] and [L-lysine].
  • the first pathological index value of the subject calculated from the concentration of the body and L-body pair is between the pathological index reference value of the healthy subject and the pathological index reference value of the chronic renal failure patient; And the blood of the subject At least one of [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], and [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine] in plasma, serum or urine
  • the second disease state index value of the subject calculated from the concentration of a pair of D-form and L-form of one kind of amino acid is the disease condition index reference value of the healthy person and the disease condition index reference value of the chronic renal failure patient
  • the subject is suspected of having very early renal failure as the condition information of the subject.
  • the present invention provides a method for diagnosing renal failure.
  • the diagnostic method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine] in blood, plasma, serum or urine of a subject suspected of having renal failure, [D-asparagine] and [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-glutamic acid] and [L- Glutamic acid], [D-alanine] and [L-alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], and [D-allo-isoleucine].
  • the diagnostic method of the present invention comprises [D-glutamine] and [L-glutamine], [D-threonine] and [L-threonine], [D-leucine] and [L-leucine] may be included. Therefore, the diagnostic method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [L-asparagine] in urine of a subject.
  • the pathological index value calculated from the concentration of the D-form and L-form pair of at least one amino acid correlates the subject with renal failure when it indicates a decrease in the proportion of the D-form.
  • the disease state index value is the ratio of the concentration of D-form to the concentration of L-form of at least one amino acid pair, or the ratio or percentage of the concentration of D-form to the sum of the concentrations of D-form and L-form. Can be used as the disease state index value of the subject.
  • the diagnostic method of the present invention comprises comparing the pathological index value of the subject with the pathological index reference value of a healthy person and the pathological index reference value of a patient with acute renal failure and / or chronic renal failure.
  • the patient's disease state index value is similar to the healthy person's disease state index reference value, the subject is diagnosed as having a high possibility of being a healthy person or having a low suspicion of renal failure.
  • the subject's disease state index value is similar to the disease state index reference value of the acute renal failure patient or chronic kidney failure patient, the subject is diagnosed with a high suspicion of renal failure, and the subject's When the disease condition index value is between the disease condition index reference value of the healthy subject and the disease condition index reference value of the chronic renal failure patient, the subject further includes a step of diagnosing that the subject is suspected of having early renal failure. There is.
  • the diagnostic method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], and [D-asparagine in the blood, plasma, serum or urine of the subject. ] And [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-alanine] and [L-alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], and [D-lysine] and [L-lysine].
  • the first condition index value of the subject calculated from the concentration of the body and L-body pair is between the condition index reference value of the healthy subject and the condition index reference value of the chronic renal failure patient, and , Blood, plasma, serum or urine of the subject At least one amino acid selected from [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], and [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine].
  • the second condition index value of the subject calculated from the concentration of the D-form and L-form pairs is between the condition index reference value of the healthy subject and the condition index reference value of the chronic renal failure patient Sometimes, the subject is diagnosed as suspected of having very early renal failure.
  • the present invention provides a method for treating renal failure.
  • the diagnostic method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine] in blood, plasma, serum or urine of a subject suspected of having renal failure, [D-asparagine] and [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-glutamic acid] and [L- Glutamic acid], [D-alanine] and [L-alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], and [D-allo-isoleucine].
  • the subject When it is between the index reference value, the subject is diagnosed with suspected early renal failure. And when the subject is diagnosed as suspected of having renal failure, an antihypertensive drug including, but not limited to, angiotensin converting enzyme, an angiotensin II receptor antagonist, and the like, an ⁇ -glucosidase inhibitor, insulin
  • an antihypertensive drug including, but not limited to, angiotensin converting enzyme, an angiotensin II receptor antagonist, and the like, an ⁇ -glucosidase inhibitor, insulin
  • a therapeutic agent for diabetes including but not limited to a pharmaceutical preparation, a therapeutic agent for dyslipidemia including but not limited to an HMG-CoA reductase inhibitor, a small intestinal cholesterol transporter inhibitor, and the like, and a recombinant human erythropoietin preparation Including, but not limited to, anemia treatment, bone / mineral metabolism disorder treatment, hyperuricemia treatment, and uremic treatment including but not limited to spherical
  • the treatment method of the present invention comprises [D-serine] and [L-serine], [D-histidine] and [L-histidine], and [D-asparagine in the blood, plasma, serum or urine of the subject. ] And [L-asparagine], [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine], [D-alanine] and [L-alanine], [D-proline] and [L-proline], [D-valine] and [L-valine], and [D-lysine] and [L-lysine].
  • the first condition index value of the subject calculated from the concentration of the body and L-body pair is between the condition index reference value of the healthy subject and the condition index reference value of the chronic renal failure patient, and , Blood, plasma, serum or urine of the subject At least one amino acid selected from [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid], [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine], and [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine].
  • the second condition index value of the subject calculated from the concentration of the D-form and L-form pairs is between the condition index reference value of the healthy subject and the condition index reference value of the chronic renal failure patient
  • a step of diagnosing that the subject is suspected of having very early renal failure a therapeutic agent for hyperkalemia, including but not limited to sodium polystyrene sulfonate, and calcium carbonate or calcium acetate. Treating said subject by administering a therapeutic agent for acute renal failure, including but not limited to a therapeutic agent for hyperphosphatemia.
  • the measurement of the D-amino acid concentration in blood, plasma, serum and urine in the present invention may be carried out using any method known to those skilled in the art.
  • o-phthalaldehyde OPA
  • Boc-L-Cys N-tert-butyloxycarbonyl-L-cysteine
  • other modifying reagents are derivatized stereospecifically with D- and L-amino acids, and then A method of separating a mixture of 100 mM acetate buffer (pH 6.0) and acetonitrile using an analytical column such as ODS-80TsQA with gradient elution is a D-form and L-form of aspartic acid, serine and alanine.
  • D- and L-amino acids are derivatized with a fluorescent reagent such as 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F) in advance, and then ODS-80TsQA, Mightysil RP.
  • a fluorescent reagent such as 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F) in advance, and then ODS-80TsQA, Mightysil RP.
  • NBD-F 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole
  • ODS-80TsQA Mightysil RP.
  • -Each amino acid is separated non-stereoisomerically using an analytical column such as -18GP, and then optically resolved using a Pilkle type chiral stationary phase column (for example, Sumichiral OA-2500S or R).
  • a Pilkle type chiral stationary phase column for example, Sumichiral OA-2500S or R.
  • the optical resolution column system in the present specification refers to a separation analysis system using at least an optical resolution column, and may include a separation analysis using an analysis column other than the optical resolution column. More specifically, passing a sample containing components having optical isomers along with a first liquid as a mobile phase through a first column filler as a stationary phase to separate the components of the sample; Individually holding each of the components of the sample in a multi-loop unit, each of the components of the sample individually held in the multi-loop unit as a stationary phase together with a second liquid as a mobile phase Supplying the second column packing material having an optically active center through a flow path to split the optical isomers contained in each of the sample components, and the optical isomerism contained in each of the sample components
  • the D- / L-amino acid concentration in the sample can be measured by using an optical isomer analysis method characterized by including a step of detecting a body ( Patent No.
  • D-amino acids can be quantified by immunological techniques using monoclonal antibodies that identify optical isomers of amino acids, such as monoclonal antibodies that specifically bind to D-leucine, D-aspartic acid, etc. (Japanese Patent Application No. 2008-27650).
  • the notation (for example, [D-serine]) enclosed in square brackets ([]) for a certain amino acid means the concentration of the amino acid.
  • a parameter (pathologic index value) based on the amino acid concentration for example, the ratio of the concentration of D-form to the concentration of L-form and the concentration of D-form relative to the sum of the concentrations of D-form and L-form Percentage is used. Since these parameters divide the concentration of one substance by the concentration of another substance, the volume of body fluids such as blood, serum, plasma or urine is reduced. Therefore, unlike the case of concentration, these parameters have the advantage that correction by the amount of body fluid is unnecessary.
  • the function of the kidney to generate urine by specifically removing only a part of the blood components by filtering and reabsorbing blood plays a major role. Therefore, the amino acid concentration of the present invention may differ greatly between blood and urine, but there is not much difference between blood, serum and plasma. This is because it is not known that amino acids are specifically concentrated in blood cells, blood clots and the like. Therefore, in the examples of the present invention, the serum concentration is measured, and the parameters based on the serum concentration are used as the pathological index value of the subject and the pathological index reference value of a healthy person or a patient with renal failure. Instead of medium concentration, blood concentration or plasma concentration is measured, and parameters based on blood concentration or plasma concentration are used as the pathological index value of the subject or the pathological index reference value of healthy subjects or patients with renal failure. It doesn't matter.
  • the “pathological condition index value” refers to a numerical value that can be calculated based on the concentration of a plurality of biomarkers, not the concentration of individual biomarker molecules.
  • the disease state index value used in the present specification can be calculated from the concentration of a pair of D-form and L-form of a certain amino acid. A value that can be associated.
  • the concentration ratio between a certain amino acid and its enantiomer for example, the ratio of the concentration of the D-form to the concentration of the L-form of a certain amino acid, and the D-form relative to the sum of the concentrations of the D-form and the L-form But not limited to these percentages.
  • the “pathological index reference value” is a pathological index value of a biomarker molecule obtained for a healthy person diagnosed by an existing diagnostic technique and a patient with acute renal failure and / or chronic renal failure. Mean or median.
  • the disease state index value is a numerical value at a specific time of a specific subject
  • the disease state index reference value is obtained by statistical processing from a plurality of healthy subjects and patients with acute renal failure and / or chronic renal failure. Number. Therefore, being similar to a certain disease state index reference value means that the disease state index value is not statistically significantly different from the disease state index reference value. For example, statistical methods such as Student's t-tailed test, one-way analysis of variance, Tukey's multiple comparison test, and the like can be used.
  • the significance threshold value P in these tests is less than 0.05, it is considered significant.
  • the subject's blood, plasma, serum, or urine analysis system in the present invention includes a storage unit, an analysis measurement unit, a data processing unit, and a pathological condition information output unit.
  • the memory is based on enantiomer concentration data of amino acids in blood, plasma, serum, or urine obtained for healthy subjects diagnosed by existing diagnostic techniques and patients with acute and / or chronic renal failure. It includes a memory for storing pathologic index reference values obtained from the parameters.
  • the storage unit may include data on the threshold value P of significance obtained by statistical processing from the number of healthy persons and patients and data for each individual.
  • the analytical measurement unit controls any automatic analyzer capable of automatically operating a two-dimensional HPLC system for measuring amino acid enantiomer concentrations described herein by robot control, and the automatic analyzer.
  • the data processing unit calculates parameters described herein from the amino acid enantiomer concentration obtained by the analytical measurement unit.
  • the subject's disease state index value obtained from the parameter is compared with the normal state and patient's disease state index reference values called from the storage unit.
  • the disease condition index value of the subject is similar to the disease condition index reference value of the healthy person, the subject is defined as having the suspicion of renal failure as the condition information of the subject.
  • the condition index value of the subject is similar to the condition index reference value of the chronic renal failure patient, it is defined as the condition information of the subject that the subject is suspected of having renal failure.
  • the subject is suspected of premature renal failure when the condition index value of the subject is between the condition index reference value of the healthy subject and the condition index reference value of the chronic kidney failure patient It is defined as the condition information of the subject.
  • the threshold value P of significance may be called from the storage unit and used to determine the degree to which the subject's pathological index value is similar to the normal or patient's pathological index reference value.
  • the data processing unit includes a conventional computer and pathological information processing software stored in the computer.
  • the pathological condition information output unit displays the pathological condition information of the subject on a liquid crystal or other display screen, prints it out on a printer, or uses the pathological condition information of the subject as data via the Internet or a LAN. Or send it.
  • the renal failure to be analyzed or examined is a state in which the renal function is lower than normal, and includes all kidney disorders that are used in a normal sense.
  • renal failure refers to a state in which renal function falls below 30% of normal, and is roughly classified into acute renal failure and chronic renal failure.
  • causes of decreased renal function include multiple factors such as immune system abnormalities, allergies to drugs, high blood pressure, diabetes, bleeding, rapid blood pressure decrease, infection, dehydration associated with burns.
  • Acute renal failure (AKI) has been proposed for stage classification such as RIFLE classification, AKIN classification, and KDIGO classification.
  • Acute renal failure is classified as Risk (stage 1), Injury (stage 2), Failure (stage 3), Furthermore, it classified into Loss and End stage kidney disease according to the duration. All of these classifications are based on the amount of serum creatinine and the amount of urine. For example, in Risk (stage 1), serum creatinine increases 1.5 to 2.0 times from the baseline or 0.5 ml. urine volume of less than 6 hours / kg / hour is 6 hours or more.
  • stage 2 serum creatinine increases 2.0 to 3.0 times from baseline or less than 0.5 ml / kg / hour Urine volume is 12 hours or more, and in Failure (Stage 3), serum creatinine increases 3.0 times or more from baseline, or urine volume of less than 0.3 ml / kg / hour is 24 hours or more. It is based on judgment. On the other hand, these classifications make it possible to classify acute renal failure more accurately by using other indicators, for example, the amount of change in GFR together.
  • Chronic renal failure is a diagnostic criterion for stage 1 (with renal impairment but normal renal function, eGFR ⁇ 90) to stage 5 (renal failure, eGFR ⁇ 15) according to the Japanese Society of Nephrology guidelines (2009) It is shown.
  • the estimated glomerular filtration rate (eGFR) which is an index here, is calculated from the serum creatinine level, age, and sex, and indicates the ability of the kidneys to discharge waste products into the urine.
  • eGFR which is an index here, is calculated from the serum creatinine level, age, and sex, and indicates the ability of the kidneys to discharge waste products into the urine.
  • it is possible to detect a decrease in renal function with higher sensitivity than conventional renal function markers. Therefore, it is possible to classify into a risk group that was not classified as renal failure with the previous marker. For example, it has risk factors of AKI and CKD as described above, but it is clear in serum creatinine and GFR. It is possible to detect a decrease in renal function even in
  • subjects are not limited to humans, and may include laboratory animals such as mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, and the like.
  • the subject may be represented as a subject.
  • the analysis method of the present invention can be used to collect preliminary data for a diagnostic method of chronic and / or acute renal failure.
  • a doctor can diagnose chronic and / or acute renal failure using such preliminary data, but such an analysis method may be performed by a medical assistant who is not a doctor, or by an analysis organization or the like. You can also Therefore, it can be said that the analysis method of the present invention is a preliminary method of diagnosis.
  • Typical chromatogram obtained by two-dimensional HPLC method of D- / L-serine in serum of C57BL / 6J wild type mice subjected to sham surgery or ischemia reperfusion treatment The graph which shows the change of the D-serine density
  • mouth which performed the renal ischemia reperfusion process The graph which shows the change of the creatinine density
  • Typical chromatogram obtained by two-dimensional HPLC method of D- / L-serine in urine of C57BL / 6J wild type mice subjected to sham surgery or ischemia reperfusion treatment The graph which shows the change of the D-serine density
  • mouth urine to which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine to which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine which performed the renal ischemia reperfusion process The graph which shows the change of the ratio of D-allo-threonine density
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine which performed the renal ischemia reperfusion process The graph which shows the change of the percentage of D-asparagine density
  • mouth urine which performed renal ischemia reperfusion processing The graph which shows the change of the percentage of D-arginine density
  • mouth urine which performed the renal ischemia reperfusion process The graph which shows the change of the percentage of D-glutamic acid concentration with respect to the sum of L-glutamic acid density
  • mouth urine which performed the renal ischemia reperfusion process The graph which shows the change of the percentage of the D-proline density
  • mouth which performed renal ischemia reperfusion processing The graph which shows the change of the percentage of D-allo-isoleucine density
  • mouth urine which performed renal ischemia reperfusion processing The graph which shows the change of the percentage of D-lysine density
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine which performed the renal ischemia reperfusion process The graph which shows the change of the ratio of D-allo-threonine density
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine in which the renal ischemia reperfusion process was performed.
  • mouth urine to which renal ischemia reperfusion processing was performed.
  • C57BL / 6J mice were purchased from CLEA Japan (Tokyo).
  • the D-amino acid oxidase point mutant mouse used in this example was a mutant in which glycine at position 181 was replaced with arginine, and the ddY strain was backcrossed to the C57BL / 6J strain (Sasabe, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 627 (2012)).
  • Serine racemase knockout mice are described in Miyoshi, Y. et al. (Amino Acids 43: 1919 (2012)).
  • Renal ischemia reperfusion treatment 12-16 week old male mice were subjected to renal ischemia reperfusion treatment (hereinafter also referred to as “IRI”). Before the IRI treatment, the right kidney was removed under pentobarbital anesthesia. After 12 days, mice were randomly selected and subjected to sham surgery (Sham) or IRI treatment. Under pentobarbital anesthesia, the left kidney was withdrawn from the body and the artery and vein were occluded with a clamp (Schwartz Micro Serrefines, Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada). Blood circulation resumed after 45 minutes and the clamp was removed. It was confirmed with the naked eye that the color of the kidney surface was restored, and the kidney was returned to the body.
  • IRI renal ischemia reperfusion treatment
  • mice were anesthetized with diethyl ether, bled from the vena cava, and collected from the bladder. The kidney was perfused and fixed as needed after removal. Serum was separated by centrifugation in a Becton Dickinson (BD) microtainer at 1500 ⁇ g for 10 minutes. Serum or urine creatinine and blood urea nitrogen (BUN) levels were measured using the FujiDRI-CHEM4000 system (Fuji Film, Tokyo).
  • BD Becton Dickinson
  • Cystatin C in serum and KIM-1 and NGAL in urine were quantified using a mouse ELISA kit manufactured by R & D Systems.
  • NBD-F 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole
  • HPLC system NANOSPACE
  • an in-house manufactured monolithic ODS column (inner diameter 1.5 mm ⁇ 250 mm, loaded in a quartz glass capillary) was used as the analytical column for reverse phase separation. Fluorescence detection was performed with an excitation wavelength of 470 nm and a detection wavelength of 530 nm. After reverse phase separation, it was transferred to an enantioselective column.
  • a Sumichiral OA-2500S column 250 mm ⁇ 1.5 mm, self-packing, material is manufactured by Sumika Chemical Analysis Co., Ltd.) using (S) -naphthylglycine as a chiral selector was used.
  • the concentration of D-amino acid in the body fluid is kept physiologically on the order of micromolar.
  • the two-dimensional HPLC system described in this example can quantitatively measure in the range of 1 fmol to 100 pmol, for example, by distinguishing the stereoisomer of serine. This was sensitive enough to discriminate changes in serine D- and L-concentrations in healthy and renal failure patients (not shown).
  • FIG. 1-A shows two-dimensional HPLC of D- / L-serine in serum of C57BL / 6J wild-type mice subjected to sham surgery or ischemia-reperfusion treatment It is a typical chromatogram obtained by the method.
  • markers were measured for 8 animals in sham surgery, 5 animals, 9 animals, 6 animals and 7 animals at 4 hours, 8 hours, 20 hours and 40 hours after reperfusion, respectively.
  • the bar graphs in FIGS. 1-A to 1-F represent the mean value, and the error bars represent the standard error (SEM) of the sample mean.
  • SEM standard error
  • NS means no significant difference.
  • Sham is the concentration of sham-operated mice
  • IRI4, IRI8, IRI20 and IRI40 are the concentrations of mice at 4, 8, 20 and 40 hours after reperfusion, respectively.
  • serum D-serine concentration did not change significantly at 4 and 8 hours after reperfusion, but increased at 20 hours and further increased at 40 hours (FIG. 1-B). ).
  • [D-serine] / [L-serine] increased as the L-serine concentration decreased, and further increased even after 40 hours (FIG. 1-D).
  • the numerical values of [D-serine] / [L-serine] shown in FIG. 1-D are 0.036 ⁇ 0.004 for Sham, 0.074 ⁇ 0.005 for IRI4, and 0.073 ⁇ 0 for IRI8. 0.009, IRI 20 was 0.082 ⁇ 0.009, and IRI 40 was 0.164 ⁇ 0.008.
  • Serum creatinine concentration increased from 4 hours after reperfusion and further increased at 40 hours (FIG. 1-E). The creatinine concentration values shown in FIG.
  • the IRI20 was 1.19 ⁇ 0.05 ⁇ g / mL and the IRI40 was 1.06 ⁇ 0.10 ⁇ g / mL. From these experiments, the ratio of [D-serine] / [L-serine] begins to increase at 4 hours after reperfusion and increases monotonically up to 40 hours, which makes it useful as a marker for renal failure. It was. Here, if the marker is monotonically changing, a certain value is shown only for one period after reperfusion, but in the case of a fluctuation with a peak or bottom, a certain value is displayed not only for one period but also once. Or it exists more than once. Therefore, the progression stage of renal failure cannot be uniquely estimated by the marker value.
  • FIGS. 4-A to 4-L Change in percentage of D-form concentration with respect to the total concentration of various amino acid enantiomers in urine
  • FIGS. 4-A to 4-L the average concentration of L-form and the D-form concentration of mouse individuals are shown.
  • the percentage of the mean value of D-body relative to the sum of the mean values is shown as a bar graph for sham-operated mice and mice at 4, 8, 20 and 40 hours after ischemia-reperfusion treatment.
  • [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid] FIG. 4-F
  • [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine] FIG.
  • At least one of the percentage, the percentage of [D-valine] with respect to [total valine], and the percentage of [D-lysine] with respect to [total lysine] is lower than that of healthy subjects, and [D-glutamic acid ] Of [Total glutamic acid] and [D-Allo-isoleucine] and [L-isoleucine] of [D-Allo-isoleucine]
  • the state at the time when renal function decline begins is detected. .
  • the urinary concentrations of D- and L-amino acids of different groups not only whether the subject is in early stage of renal failure, A distinction can be made between an early state and a state in which renal function decline begins.
  • [D-allo-threonine] and [L-allo-threonine] (FIG. 5-Q)
  • [D-histidine] and [L-histidine] [D-asparagine] and [L- Aspa Gin]
  • [D-serine] and [L-serine] [D-arginine] and [L-arginine]
  • [D-allo-threonine] and [L-threonine [D-alanine] and [L-alanine]
  • [D-proline] and [L-proline] (FIG. 5-H)
  • [D-lysine] and [L-lysine] (FIG. 5-L) are all in urine.
  • [D-histidine] / [L-histidine], [D-asparagine] / [L-asparagine], and [D-arginine] / [L-arginine] detectable with a significant difference at 4 hours after reperfusion [D-allo-threonine] / [L-threonine], [D-alanine] / [L-alanine], [D-proline] / [L-proline], [D-lysine] / [ L-lysine] makes it possible to diagnose renal failure with higher sensitivity than urinary creatinine using one or more disease state index values selected from the group consisting of L-lysine].
  • One or a plurality of disease state index values selected from the group consisting of [L-proline] and [D-lysine] / [L-lysine] can diagnose renal failure with higher sensitivity.
  • the pathological index value may be used alone, but by combining a plurality of pathological index values, a more reliable diagnosis is possible.
  • [D-allo-isoleucine] and [L-isoleucine] [D-phenylalanine] and [L-phenylalanine]
  • [D-leucine] and [L-leucine] [D-glutamic acid] and [L-glutamic acid]
  • [D-valine] and [L-valine] [D-glutamine] and [L-glutamine]
  • [D -Serine] and [L-serine] [D-arginine] and [L-arginine], [D-allo-threonine] and [L-threonine, [D-alanine] and [L-alanine]
  • the disease state index value in the subject has a statistically significant difference from the disease state index reference value of the healthy subject group and has a statistically significant difference from the disease state index reference value of the renal failure patient group.
  • the condition index reference value of the healthy subject group and the condition index reference value of the renal failure patient group are between, the subject can be diagnosed as suspected of having early renal failure.
  • the pathological index values [D-histidine] and [L-histidine], [D-asparagine] and [D] exhibiting a significant difference of p ⁇ 0.01 from the sham operation group, 4 hours after reperfusion.

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Abstract

　尿又は血液から採取でき、かつ、糸球体濾過量及び血清中クレアチニン濃度より早期から変動する腎不全のバイオマーカーを同定し、これにより、初期の腎不全を診断する技術を開発する。本発明の腎不全が疑われる被検者の血液、血漿、血清又は尿の分析方法は、被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］等からなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比か、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の百分率かを前記被検者の病態指標値として算出するステップとを含む。

Description

腎不全の早期診断マーカー
　本発明は、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿の分析方法と、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿のサンプル分析システムとに関し、具体的には、該被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］等からなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップを含む被検者の血液、血漿、血清又は尿の分析方法と、該被検者の血液、血漿、血清又は尿のサンプル分析システムであって、記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む、前記分析方法を実施するための血液、血漿、血清又は尿のサンプル分析システムとに関する。
　慢性腎不全（ＣＫＤ）はわが国の成人人口の約１３％に相当する１，３３０万人が罹患する疾患で、末期腎不全（ＥＳＫＤ）に至るリスクが高く、国民の健康を脅かしている。慢性腎不全は、糸球体濾過量で表される腎機能の低下があるか，もしくは腎臓の障害を示唆する所見が慢性的（３カ月以上）に持続するものすべてを包含する。慢性腎不全に有効な治療法はなく、慢性腎不全が進行して腎機能低下が進むと尿毒症の危険があり、人工透析や腎移植が必要となり、医療経済上大きな負担となる（非特許文献１）。慢性腎不全は自覚症状がない。そこで慢性腎不全の早期発見及び進行抑制のためには、腎不全の早期マーカーによる診断が必要である。しかし、糸球体濾過量で表される腎機能の変化が起こるより早い時期から腎機能障害の進行を正確に反映するバイオマーカーとして満足できるものは未だ存在しない。
　急性腎不全（ＡＫＩ）の実験動物モデルは腎機能障害の初期を再現することができる。急性腎不全は、腎機能が数週間又は数日間に急激に低下する疾患である。この疾患のモデルとしては、外科的手法又は薬剤投与により誘発される急性腎不全実験モデルが知られている。急性腎不全診断のゴールドスタンダードは、尿生成量及び血清中クレアチニン濃度である。血清中クレアチニン濃度は、排尿の有無に関わらず、バイオプシーを行うことなく評価可能な点では優れている。しかし、糸球体濾過量が定常状態であることを必要とする。糸球体濾過量の小さな変動には鈍感である。急性腎不全の実験動物モデルでは比較的後期になって変化が明らかになる。そして、血清中クレアチニン濃度は、年齢、性別、筋肉量及び服用する医薬等の条件により変動するので、特異的なマーカーとはいえない（非特許文献２）。急性腎不全のマーカーとして、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、腎障害分子（ＫＩＭ－１）、肝脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰｓ）、シスタチンＣ等のタンパク質と、ホモバニリン酸硫酸、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド等の代謝低分子化合物とが報告されている。しかし、これらのマーカーはいずれも腎不全の早期から検出されるものではない。
　Ｄ－セリン及びＤ－アラニンは、腎不全患者の血清中濃度が健常者の血清中濃度より高く、Ｄ－体の濃度、及びＤ－体濃度／（Ｄ－体濃度＋Ｌ－体濃度）の比の双方が、クレアチニンと相関することから、腎近位尿細管機能障害のマーカーの候補となることが示唆されている（非特許文献３）。腎炎患者の血漿においてＤ－アミノ酸（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ）が高い傾向を示し、クレアチニン量と相関性を有することが開示されている（非特許文献９）。また、腎不全患者では血清中にＤ－アラニン、Ｄ－セリン、Ｄ－グルタミン酸、及びＤ－アスパラギン酸が認められ、これにより、血清Ｄ－アミノ酸濃度の測定が、腎不全の診断等に有用であることが示唆された（非特許文献５）。Ｄ－セリン及びＤ－アラニンの尿中の濃度及びＤ－体及びＬ－体の合計に対するＤ－体の比が、各年代における健常人について調べられており、腎臓におけるＤ－セリンの取り扱いが異なることが示唆されている（非特許文献６）。Ｄ－セリン、Ｄ－スレオニン、Ｄ－アラニン、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－アロースレオニン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－プロリン及びＤ－フェニルアラニンからなるグループから選択される１種類又は２種類以上のアミノ酸が、腎臓病の病態指標値とすることができることが開示されているが（特許文献１）、この文献では、検体として、血液、血漿、尿などの体液を用いることを記載しているものの、実施例にて腎臓病における病態指標値を求めるために使用している検体は、血清のみであり、尿についてこれらのアミノ酸が腎臓病の病態指標値として使用できるか否かについては開示されていない。また、腎不全患者で、尿中のアラニン、バリン、プロリン、スレオニン、アスパラギン酸、及びアスパラギンのＤ－体比が有意に増加する一方で、メチオニンやセリンでは有意差がないことが知られている（非特許文献７）。しかしながら、この文献では、病態判定基準の示されていない腎不全患者（renal failure）で、各アミノ酸のＤ－体濃度／（Ｄ－体濃度＋Ｌ－体濃度）の比を算出しているものの、かかる比の増加を病期にかかわらず漫然と（漠然と）示しているに過ぎず、かかる比の変動が、腎不全の病態や他のバイオマーカーと関連することについては何ら記載も示唆もない。本願優先日後には、虚血再還流障害により、尿中のＤ／Ｌ－セリン比が経時的に減少することから、初期の虚血性腎障害の検出や病態分類が可能なバイオマーカーとなりうる点が示唆されている（非特許文献８）。腎近位尿細管にはＤ－アミノ酸の分解に関与するＤ－アミノ酸オキシダーゼ酵素が発現し、虚血再灌流ラットではＤ－アミノ酸オキシダーゼ酵素活性が低下することが知られている（非特許文献４）。一方生理的条件下では、Ｌ－セリンが再吸収されるのに対し、Ｄ－セリンはほとんど再吸収されない。しかし、Ｄ－セリンをはじめとするＤ－アミノ酸が腎不全の初期にどのように変動するかは不明であった。
ＷＯ２０１３／１４０７８５
ＫＤＩＧＯ　２０１２　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ　１　（２０１３） Ｓｌｏｃｕｍ，　Ｊ．　Ｌ．ら、Ｔｒａｎｓｌ　Ｒｅｓ．　１５９：２７７　（２０１２） Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　１８：　１１３０（１９９５） Ｚｈａｎｇ，　Ｈ．ら、Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　４２：　３３７（２０１２） Ｉｓｈｉｄａら、北里医学　２３：５１～６２　（１９９３） Ｙｏｎｇ　Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　２１：（２）１５６-１６２（１９９８） Ｍａｇｄａｌｅｎａ　Ｃ．　Ｗａｌｄｈｉｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｂ　（２０１０）１１０３－１１１２ Ｊｕｍｐｅｊｉ　Ｓａｓａｂｅら、ＰＬＯＳ　ＯＮＥ，　ｖｏｌ．９，　Ｉｓｓｕｅ　１，　ｅ８６５０４ Ｎａｇａｔａ．Ｙ　Ｖｉｖａ　Ｏｒｉｇｉｎｏ　Ｖｏｌ．１８（Ｎｏ．２）　（１９９０）第１５回学術講演会講演要旨集
　尿又は血液から採取でき、かつ、糸球体濾過量及び血清中クレアチニン濃度より早期から変動する腎不全のバイオマーカーを同定し、これにより、初期の腎不全を診断する技術を開発する必要がある。
　本発明は、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿の分析方法を提供する。本発明の分析方法は、被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値は、有意差をもってＤ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎障害の病態と関連づけることができる。例えば少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比、或いはＤ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の比や百分率を前記被検者の病態指標値として算出することができる。非特許文献７においては、病態判定基準の示されていない腎不全患者の尿中のアミノ酸が分析されているものの、アラニン、バリン、プロリン、スレオニン、及びアスパラギン酸について、Ｄ－アミノ酸比が有意に増加したことが示されている。したがって、腎不全患者の尿中で、Ｄ－アミノ酸の構成割合が減少することは、驚くべき発見である。
　別の態様では、本発明の分析方法は、上述のアミノ酸群に、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］が含まれてもよい。したがって、本発明の分析方法は、被検者の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ-スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含んでもよい。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値は、有意差をもってＤ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎障害の病態と関連づけることができる。例えば少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比、或いはＤ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の比や百分率を前記被検者の病態指標値として算出することができる。
　本発明の別の態様では、腎不全の検査方法であって、非検体の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、
　前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から、Ｄ－体の構成割合の減少と、被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出するステップと
　を含む、検査方法に関してもよい。ここで、検査方法とは、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行う方法に関する。
　上述のアミノ酸群から、アミノ酸は任意に選択してもよいが、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］からなることがさらに好ましい。別の態様では、各アミノ酸の組合せが、上述のアミノ酸群から除かれてもよい。例えば、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］が除かれてもよいし、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］が除かれてもよいし、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］が除かれてもよいし、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］が除かれてもよいし、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］が除かれてもよいし、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］が除かれてもよいし、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］が除かれてもよいし、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］が除かれてもよいし、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］が除かれてもよいし、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］が除かれてもよいし、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］が除かれてもよいし、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］が除かれてもよいし、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］が除かれてもよいし、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］が除かれてもよいし、［Ｄ-アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］が除かれてもよいし、及び［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］が除かれてもよい。
　これらの病態指標値は、尿中クレアチニン濃度と同様に、腎虚血再灌流後に低下することが示された。尿中クレアチニン濃度の低下は、腎機能の低下を示すことから、腎不全のマーカーとして使用することができ、本願の病態指標値も、尿中クレアチニン濃度と同様に腎不全のマーカーとして使用することができる。なお、尿中の腎不全のマーカーであるＫＩＭ－１やＮＧＡＬは、腎機能の低下により、尿中の濃度が増加する。虚血再灌流モデル実験系では尿中クレアチニン濃度が虚血再灌流後８時間で有意差をもって低減し、尿中ＫＩＭ－１が虚血再灌流後２０時間で有意差をもって増加し、そして尿中ＮＧＡＬが虚血再灌流後８時間で有意差をもって増加した一方で（図２－Ｄ、Ｆ及びＧ）、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を使用して算出された病態指標値は、腎虚血再灌流後４時間後においてＰ＜０．０５の有意差をもって減少していることから、腎不全に対してより高い感度を有するということができる。したがって、早期腎障害に対してより高い感度を有する観点から、かかる病態指標値を使用することが好ましい。さらに好ましくは、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を使用して算出された病態指標値は、腎虚血再灌流後４時間後においてＰ＜０．０１の有意差をもって減少していることから、当該病態指標値をより感度の高いマーカーとして用いることができる。さらにより好ましくは［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値は、腎虚血再灌流後４時間後においてＰ＜０．００１の有意差をもって減少していることから、当該病態指標値を極めて感度の高いマーカーとして用いることができる。したがって、本発明の病態指標値は、従来の腎不全マーカーである血清クレアチニン等と同等であるか、又はそれよりも感度が高く、早い段階の腎不全の診断に用いることができる。早い段階の腎不全として、例えば、急性腎不全（ＡＫＩ）のＲＩＦＬＥ、ＡＫＩＮ、ＫＤＩＧＯといった各分類の初期病期の基準である血清クレアチニンが１．５～２．０倍に上昇する状態、慢性腎不全（ＣＫＤ）ではＧＦＲで示される腎機能低下が始まる状態、または腎障害を有するが血清クレアチニンやＧＦＲに変化が現れる以前の非常に早期の状態が挙げられる。また、腎虚血再灌流後４時間後において有意差はないが、腎虚血再灌流後８時間以降において有意差を有する［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］からなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を使用して算出された病態指標値を、従来のクレアチニンなどと同等の感度のマーカーとして使用することができる。
　１のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値を用いてもよいし、他のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値と組み合わせて、使用することもできる。例えば、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］からなる群から選ばれる１以上のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された極めて感度の高い病態指標値を、同群から選ばれるＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された他の極めて感度の高い病態指標値と組み合わせてもよい。また別の態様では、上記の極めて感度の高い病態指標値を、より感度の低い病態指標値、例えば［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］とからなる群から選ばれる１のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値と組み合わせて使用することができ、それにより、血清クレアチニンが１．５～２．０倍に上昇を示す腎機能低下が現れる状態、もしくはそれ以前において、尿クレアチニン、尿中ＫＩＭ－１、尿中ＮＧＡＬと比較して鋭敏に腎障害を検出することが可能になる。
　本発明の分析方法は、前記被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似か、前記被検者の病態指標値が前記急性腎不全患者又は慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するか、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む場合がある。
　さらに別の態様では、本発明は、健常者群及び/又は腎不全患者群の病態指標値から予め閾値を設定することにより、被験者の病態指標値と閾値とを比較して、被験者が腎不全であるかを判定することができる。当業者であれば、健常者群や腎不全患者群の病態指標値から、閾値を適宜設定することができる。閾値としては、例えば健常者群又は腎不全患者群の平均値、中央値、Ｘパーセンタイル値を使用することができるがこれらに限定されるものではない。ここでＸは任意の数値を選択することができ、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７を適宜使用することができる。閾値は１つであってもよいし、腎不全の種類（急性、慢性）や原因（例えば、薬剤性腎症、糖尿病性腎症、IgA腎症、膜性腎症、腎硬化症など）、状態（早期、中期、後期）、並びに使用するアミノ酸若しくはその組合せに応じて複数設定することもできる。予め設定された閾値と、被験者の病態指標値とを比較することにより、被験者の腎不全の病態を判定、決定又は診断することが可能になる。
　本発明の分析方法は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値が前記健常者の第二病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む場合がある。
　本発明において、第一病態指標値として、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値を用いることができ、第二病態指標値として［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値を用いることができる。
　前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］が含まれる場合には、第一病態指標値は、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と、［Ｄ-アロ-スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］からなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値を用いることができる。また、第二病態指標値は、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］に加えて、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］からなる群から選ばれる、少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値であってもよい。
　本発明は、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿のサンプル分析システムを提供する。本発明のサンプル分析システムは、記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む。前記記憶部は、健常者の血液、血漿、血清又は尿における病態指標基準値と、急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者の血液、血漿、血清又は尿における病態指標基準値とを記憶する。前記分析測定部は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿中のアミノ酸のうち、Ｄ－セリン及びＬ－セリンと、Ｄ－ヒスチジン及びＬ－ヒスチジンと、Ｄ－アスパラギン及びＬ－アスパラギンと、Ｄ－アルギニン及びＬ－アルギニンと、Ｄ－アロ－スレオニン及びＬ－スレオニンと、Ｄ－グルタミン酸及びＬ－グルタミン酸と、Ｄ－アラニン及びＬ－アラニンと、Ｄ－プロリン及びＬ－プロリンと、Ｄ－バリン及びＬ－バリンと、Ｄ－アロ－イソロイシン及びＬ－イソロイシンと、Ｄ－フェニルアラニン及びＬ－フェニルアラニンと、Ｄ－リジン及びＬ－リジンとからなるグループから選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量する。前記データ処理部は、前記被検者の［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値は、Ｄ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる。
　別の態様では、上記のアミノ酸対に加えて、Ｄ－グルタミン及びＬ－グルタミンと、Ｄ-スレオニン及びＬ－スレオニンと、Ｄ-アロ－スレオニン及びＬ－アロ－スレオニンと、Ｄ－ロイシン及びＬ－ロイシンが含まれていてもよい。したがって、別の態様では、前記分析測定部は、前記被検者の尿中のアミノ酸のうち、Ｄ－セリン及びＬ－セリンと、Ｄ－ヒスチジン及びＬ－ヒスチジンと、Ｄ－アスパラギン及びＬ－アスパラギンと、Ｄ－アルギニン及びＬ－アルギニンと、Ｄ－アロ－スレオニン及びＬ－スレオニンと、Ｄ－グルタミン酸及びＬ－グルタミン酸と、Ｄ－アラニン及びＬ－アラニンと、Ｄ－プロリン及びＬ－プロリンと、Ｄ－バリン及びＬ－バリンと、Ｄ－アロ－イソロイシン及びＬ－イソロイシンと、Ｄ－フェニルアラニン及びＬ－フェニルアラニンと、Ｄ－リジン及びＬ－リジンと、Ｄ－グルタミン及びＬ－グルタミンと、Ｄ-スレオニン及びＬ－スレオニンと、Ｄ－アロ－スレオニン及びＬ－アロ－スレオニンと、Ｄ－ロイシン及びＬ－ロイシンとからなるグループから選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量する。前記データ処理部は、前記被検者の［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロスレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値は、Ｄ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる。
　病態指標値とは、あるアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出可能であり、Ｄ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる値をいう。本発明のサンプル分析システムは、さらに、病態指標値として、例えばＤ－体及びＬ－体の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の比や百分率を被検者の病態指標値と定義する。該被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いが薄いことを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるときは前記被検者は早期腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。前記病態情報出力部は前記被検者の病態情報を出力する。
　本発明のサンプル分析システムにおいて、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。
　本発明は、腎不全の診断方法を提供する。本発明の診断方法は、腎不全が疑われる被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。
　別の態様では、本発明の診断方法は、上述のアミノ酸群に、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］が含まれてもよい。したがって、本発明の診断方法は、被検体の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。
　ここで、少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値は、Ｄ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる。前記病態指標値は、少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比か、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の比又は百分率を前記被検者の病態指標値として使用することができる。
　本発明の診断方法は、前記被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は健常者の可能性が高いか、前記被検者が腎不全の疑いが薄いかであると診断し、前記被検者の病態指標値が前記急性腎不全患者又は慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は腎不全の疑いが濃いと診断し、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は早期腎不全の疑いがあると診断するステップをさらに含む場合がある。
　本発明の診断方法は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は非常に早期の腎不全である疑いがあると診断するステップを含む。
　本発明は、腎不全の治療方法を提供する。本発明の診断方法は、腎不全が疑われる被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から病態指標値を算出するステップと、前記被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は健常者の可能性が高いか、前記被検者が腎不全の疑いが薄いかであると診断し、前記被検者の病態指標値が前記急性腎不全患者又は慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は腎不全の疑いが濃いと診断し、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は早期腎不全の疑いがあると診断するステップと、前記被検者は腎不全の疑いが濃いと診断されたとき、アンジオテンシン変換酵素、アンジオテンシンII受容体拮抗薬等を含むがこれらに限定されない高血圧治療薬と、αグルコシダーゼ阻害薬、インシュリン製剤等を含むがこれらに限定されない糖尿病治療薬と、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬、小腸コレステロールトランスポーター阻害薬等を含むがこれらに限定されない脂質異常症治療薬と、遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤を含むがこれらに限定されない貧血治療薬と、骨・ミネラル代謝異常の治療薬と、高尿酸血症の治療薬と、球形吸着炭内服薬を含むがこれらに限定されない尿毒症治療薬とを含む、腎不全の進行を抑制又は改善する治療薬を投与することによって前記被検者を治療するステップとを含む。
　本発明の治療方法は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検者の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は非常に早期の腎不全である疑いがあると診断するステップと、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを含むがこれに限定されない高カリウム血症の治療薬と、炭酸カルシウム又は酢酸カルシウムを含むがこれらに限定されない高リン酸血症の治療薬とを含む急性腎不全の治療薬を投与することによって前記被検者を治療するステップとを含む。
　本発明における血液、血漿、血清及び尿中のＤ－アミノ酸濃度の測定は、当業者に周知ないかなる方法を用いて実施しても構わない。例えば、予めｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－システイン（Ｂｏｃ－Ｌ－Ｃｙｓ）その他の修飾試薬で立体異性特異的にＤ－及びＬ－アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ－８０ＴｓＱＡのような分析カラムを用いて１００ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）とアセトニトリルの混液をグラジエント溶離して分離する方法が、アスパラギン酸、セリン及びアラニンのＤ－体及びＬ－体の同時測定に用いることができる。また、予め４－フルオロ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ－Ｆ）のような蛍光試薬でＤ－及びＬ－アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ－８０ＴｓＱＡ、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ　ＲＰ－１８ＧＰ等のような分析カラムを用いて立体異性非特異的に各アミノ酸を分離した後、Ｐｉｒｋｌｅ型キラル固定相カラム（例えばＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ－２５００Ｓ又はＲ）を用いて光学分割して立体異性特異的に分離する方法が、プロリン、ロイシンその他のアミノ酸の微量測定に用いることができる（浜瀬健司及び財津潔、分析化学、５３巻、６７７－６９０（２００４））。本明細書における光学分割カラム系は、少なくとも光学分割カラムを用いる分離分析系をいい、光学分割カラム以外の分析カラムによる分離分析を含む場合がある。より具体的に、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々をマルチループユニットにおいて個別に保持するステップ、前記マルチループユニットにおいて個別に保持された前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に流路を通じて供給し、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むことを特徴とする光学異性体の分析方法を用いることにより、試料中のＤ-／Ｌ-アミノ酸濃度を測定することができる（特許第４２９１６２８号）。代替的には、アミノ酸の光学異性体を識別するモノクローナル抗体、例えばＤ－ロイシン、Ｄ－アスパラギン酸等に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によってＤ－アミノ酸を定量することができる（特願２００８－２７６５０明細書）。
　本明細書において、あるアミノ酸についてカギ括弧（［］）でくくる表記（例えば、［Ｄ－セリン］）は、当該アミノ酸の濃度を意味する。本発明ではアミノ酸の濃度に基づくパラメーター（病態指標値）として、例えばＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比と、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の百分率とが利用される。これらのパラメーターは、ある物質の濃度を別の物質の濃度で除算するため、血液、血清、血漿又は尿のような体液の体積が約分されてしまう。そのため、濃度の場合と異なり、これらのパラメーターでは体液量による補正が不要になるという利点がある。
　本発明では、血液を濾過及び再吸収することによって血液中の成分の一部だけを特異的に除去して尿を生成する腎臓の機能が大きい役割を果たす。そのため本発明のアミノ酸濃度は、血液と尿とでは大きく異なる場合があるが、血液、血清及び血漿の間ではあまり大きな違いはない。アミノ酸は、血液細胞、血液凝固物等に特異的に濃縮されることは知られていないからである。そこで、本発明の実施例では血清中濃度が測定され、血清中濃度にもとづくパラメーターが被検者の病態指標値や、健常者や腎不全患者の病態指標基準値に用いられているが、血清中濃度のかわりに血液中濃度又は血漿中濃度が測定され、血液中濃度又は血漿中濃度にもとづくパラメーターが、被検者の病態指標値や健常者や腎不全患者の病態指標基準値に用いられてもかまわない。
　本明細書において、「病態指標値」とは、個々のバイオマーカー分子の濃度ではなく、複数のバイオマーカーの濃度に基づいて計算可能な数値をいう。本明細書において用いられる病態指標値は、あるアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出可能であり、Ｄ－体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる値をいう。病態指標値として、あるアミノ酸とそのエナンチオマーとの濃度比、例えば、あるアミノ酸のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比と、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の百分率とを含むがこれらに限定されない。
　本明細書において、「病態指標基準値」とは、既存の診断技術によって診断された健常者と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者とについて得られる、バイオマーカー分子の病態指標値の平均値又は中央値をいう。病態指標値は特定の被検者のある特定の時点での数値であるが、病態指標基準値は、健常者と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者との複数から統計処理により得られた数値である。したがって、ある病態指標値がある病態指標基準値に類似するとは、当該病態指標値が前記病態指標基準値から統計的に有意差がないことをいう。例えば、ステューデントのｔ両側検定、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定等の統計学的手法が利用可能である。また、これらの検定における有意性の閾値Ｐ値が０．０５未満のとき、有意性があるとされる。
　本発明における被検者の血液、血漿、血清又は尿の分析システムは、記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む。ここで記憶部は、既存の診断技術によって診断された健常者と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者とについて得られた血液、血漿、血清又は尿中のアミノ酸のエナンチオマー濃度データにもとづくパラメーターから得られた病態指標基準値を記憶するメモリを含む。前記記憶部には、前記健常者及び患者の人数と個人ごとのデータから統計処理により得られた有意性の閾値Ｐのデータを含む場合がある。前記分析測定部は、本明細書に説明されるアミノ酸エナンチオマー濃度を測定する２次元ＨＰＬＣシステムをロボット制御によって自動的に運転することができるいずれかの自動分析装置と、該自動分析装置を制御するための中央制御装置とを含む。前記データ処理部は、前記分析測定部で得られたアミノ酸エナンチオマー濃度から本明細書で説明されるパラメーターを計算する。該パラメーターから得られた被検者の病態指標値を、前記記憶部から呼び出された健常者及び患者の病態指標基準値と比較する。前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いが薄いことを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるときは前記被検者は早期腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。このとき、前記有意性の閾値Ｐが前記記憶部から呼び出されて、前記被検者の病態指標値が前記健常者又は患者の病態指標基準値と類似する程度を判定するのに用いられる場合がある。データ処理部は従来技術のコンピュータと、該コンピュータに格納された病態情報処理ソフトウェアとを含む。前記病態情報出力部は、前記被検者の病態情報を液晶その他のディスプレイ画面に表示したり、プリンタに印刷出力したり、あるいは、インターネット又はＬＡＮ等を介して被検者の病態情報をデータとして送信したりする場合がある。
　本発明において、分析又は検査される腎不全とは、腎機能が正常時より低下した状態であり、通常の意味で用いられる腎臓の障害の全てを含むものとする。限定されるものではないが、一般的に腎不全とは、腎機能が正常時の３０％を下回った状態をいい、急性腎不全と慢性腎不全に大別される。腎機能が低下する原因としては、免疫系の異常や薬に対するアレルギー、高血圧、糖尿病や、出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水など複数の因子があげられる。急性腎不全（ＡＫＩ）は、ＲＩＦＬＥ分類、ＡＫＩＮ分類、ＫＤＩＧＯ分類といった病期の分類が提唱されており、急性腎不全を、Ｒｉｓｋ（ステージ１）、Ｉｎｊｕｒｙ（ステージ２）、Ｆａｉｌｕｒｅ（ステージ３）、さらには持続期間に応じてＬｏｓｓとＥｎｄ　ｓｔａｇｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｄｉｓｅａｓｅに分類した。これらの分類は、どれも血清クレアチニンの量と尿量とを指標としており、例えばＲｉｓｋ（ステージ１）では、血清クレアチニンがベースラインから１．５～２．０倍に上昇すること又は０．５ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が６時間以上であること、Ｉｎｊｕｒｙ（ステージ２）では、血清クレアチニンがベースラインから２．０～３．０倍に上昇すること又は０．５ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が１２時間以上であること、Ｆａｉｌｕｒｅ（ステージ３）では、血清クレアチニンがベースラインから３．０倍以上に上昇すること又は０．３ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が２４時間以上であることを判断基準としている。一方で、これらの分類は、他の指標、例えばＧＦＲの変化量を併用することでより正確に急性腎不全の分類を可能にする。慢性腎不全（ＣＫＤ）は、日本腎臓学会のガイドライン（２００９）で病期ステージ１（腎障害を有するが腎機能は正常、ｅＧＦＲ≧９０）～ステージ５（腎不全、ｅＧＦＲ＜１５）の診断基準が示されている。ここで指標となっている推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は血清クレアチニン値と年齢、性別より算出されるもので腎臓が老廃物を尿に排出する能力を示している。本発明の分析・検査方法では、これまでの腎機能マーカーよりも高感度で腎機能の低下を検出することが可能になる。したがって、従前のマーカーでは腎不全に分類されなかったようなリスク群に分類することも可能になり、例えば、上述の原因のようなＡＫＩ、ＣＫＤの危険因子を有するが、血清クレアチニンやＧＦＲにおいて明確な変動の見られないハイリスク群においても腎機能の低下を検出することが可能になる。
　本発明において、被験者は、ヒトに限定されず、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなどを包含しうる。したがって、被験者は、被検体として表されてもよい。
　本発明の分析方法は、慢性及び/又は急性腎不全の診断方法のための予備的なデーターを収集するために使用することができる。このような予備的データーを用いて医師が慢性及び/又は急性腎不全診断することができるが、かかる分析方法は、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行うこともできる。したがって、本発明の分析方法は、診断の予備的方法と言うこともできる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
偽手術又は虚血再灌灌流処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＤ－／Ｌ－セリンの２次元ＨＰＬＣ法により得られた典型的なクロマトグラム。 腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＤ－セリン濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＬ－セリン濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＬ－セリン濃度に対するＤ－セリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のクレアチニン濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のシスタチンＣ濃度の変化を示すグラフ。 偽手術又は虚血再灌流処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＤ－／Ｌ－セリンの２次元ＨＰＬＣ法により得られた典型的なクロマトグラム。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＤ－セリン濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－セリン濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のクレアチニン濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－セリン濃度に対するＤ－セリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＫＩＭ－１濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＮＧＡＬ濃度の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－ヒスチジン濃度に対するＤ－ヒスチジン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アスパラギン濃度に対するＤ－アスパラギン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－セリン濃度に対するＤ－セリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アルギニン濃度に対するＤ－アルギニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－スレオニン濃度に対するＤ－アロ－スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－グルタミン酸濃度に対するＤ－グルタミン酸濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アラニン濃度に対するＤ－アラニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－プロリン濃度に対するＤ－プロリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－バリン濃度に対するＤ－バリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－イソロイシン濃度に対するＤ－アロ－イソロイシン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－フェニルアラニン濃度に対するＤ－フェニルアラニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－リジン濃度に対するＤ－リジン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－ヒスチジン濃度及びＤ－ヒスチジン濃度の和に対するＤ－ヒスチジン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アスパラギン濃度及びＤ－アスパラギン濃度の和に対するＤ－アスパラギン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－セリン濃度及びＤ－セリン濃度の和に対するＤ－セリン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－ヒスチジン濃度及びＤ－アルギニン濃度の和に対するＤ－アルギニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－スレオニン濃度及びＤ－アロ－スレオニン濃度の和に対するＤ－アロ－スレオニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－グルタミン酸濃度及びＤ－グルタミン酸濃度の和に対するＤ－グルタミン酸濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アラニン濃度及びＤ－アラニン濃度の和に対するＤ－アラニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－プロリン濃度及びＤ－プロリン濃度の和に対するＤ－プロリン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－バリン濃度及びＤ－バリン濃度の和に対するＤ－バリン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－イソロイシン濃度及びＤ－アロ－イソロイシン濃度の和に対するＤ－アロ－イソロイシン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－フェニルアラニン濃度及びＤ－フェニルアラニン濃度の和に対するＤ－フェニルアラニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－リジン濃度及びＤ－リジン濃度の和に対するＤ－リジン濃度の百分率の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－ヒスチジン濃度に対するＤ－ヒスチジン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アスパラギン濃度に対するＤ－アスパラギン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－セリン濃度に対するＤ－セリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アルギニン濃度に対するＤ－アルギニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－スレオニン濃度に対するＤ－アロ－スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－グルタミン酸濃度に対するＤ－グルタミン酸濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アラニン濃度に対するＤ－アラニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－プロリン濃度に対するＤ－プロリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－バリン濃度に対するＤ－バリン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－イソロイシン濃度に対するＤ－アロ－イソロイシン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－フェニルアラニン濃度に対するＤ－フェニルアラニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－リジン濃度に対するＤ－リジン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－グルタミン濃度に対するＤ－グルタミン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－スレオニン濃度に対するＤ－スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－メチオニン濃度に対するＤ－メチオニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アスパラギン酸濃度に対するＤ－アスパラギン酸濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－アロ－スレオニン濃度に対するＤ－アロ－スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。 腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ－ロイシン濃度に対するＤ－ロイシン濃度の比の変化を示すグラフ。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　１．材料及び方法
　（１）研究倫理
　全ての実験は施設のガイドラインに従って実施され、該施設の動物実験委員会の承認を得て行われた。
　（２）材料
　アミノ酸のエナンチオマー及びＨＰＬＣ級のアセトニトリルはナカライテスク（京都）から購入された。ＨＰＬＣ級のメタノール、トリフルオロ酢酸、ホウ酸等は和光純薬（大阪）から購入された。水はＭｉｌｌ－ＱグラジエントＡ１０システムを用いて精製された。
　（３）動物
　動物はＳＰＦ環境、１２時間ずつの明暗サイクルの条件下で、自由に水及び飼料を摂取できるようにして飼育された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは日本クレア（東京）から購入された。本実施例で用いたＤ－アミノ酸オキシダーゼの点突然変異マウスは１８１位のグリシンがアルギニンに置換された突然変異体で、ｄｄＹ系統をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統に戻し交配された（Ｓａｓａｂｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９:６２７（２０１２））。セリンラセマーゼノックアウトマウスは、Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．ら（Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　４３：１９１９（２０１２））によって作成された。
　（４）腎虚血再灌流処理
　１２－１６週齢のオスマウスが腎虚血再灌流（以下、「ＩＲＩ」ともいう。）処理に供された。ＩＲＩ処理施術前にペントバルビタール麻酔下で右側腎は除去された。１２日後に、マウスはランダムに選ばれて、偽手術（Ｓｈａｍ）か、ＩＲＩ処置かに供された。ペントバルビタール麻酔下で、左側腎が体外に引き出され、クランプ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｍｉｃｒｏ　Ｓｅｒｒｅｆｉｎｅｓ、Ｆｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｔｏｏｌｓ　Ｉｎｃ．、カナダ、バンクーバー）で動脈及び静脈が閉塞された。４５分後に血流循環が再開され、クランプは除去された。腎表面の色がもとどおりになることは肉眼で確認され、腎は体内に戻された。偽手術では、左側の腎が体外に引き出されたが、クランプによる血流閉塞は行われなかった。再灌流の４、８、２０及び４０時間後に、マウスはジエチルエーテルで麻酔され、大静脈から採血され、膀胱から採尿された。腎は摘出後、必要に応じて灌流固定された。血清はベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）マイクロテーナー中で１５００×ｇ、１０分間遠心により分離された。血清又は尿中のクレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルはＦｕｊｉＤＲＩ－ＣＨＥＭ４０００システム（富士フィルム、東京）を用いて測定された。
　血清中のシスタチンＣ及び尿中のＫＩＭ－１及びＮＧＡＬはＲ＆Ｄシステムズ社製のマウスＥＬＩＳＡキットを用いて定量された。
　（５）アミノ酸立体異性体の全分析
　前記サンプルは、財津らが開発したＤ、Ｌ－アミノ酸一斉高感度分析システム（特許第４２９１６２８号）によるアミノ酸立体異性体の全分析に供された。各アミノ酸の分析条件の詳細は、ＭｉｙｏｓｈｉＹ．、ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，　８７９：３１８４（２０１１）及びＳａｓａｂｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０９：６２７（２０１２）に説明される。簡潔には、血清及び尿中のアミノ酸は、ＮＢＤ－Ｆ（４－フルオロ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール、東京化成工業株式会社）で誘導体化され、ＨＰＬＣシステム（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ　ＳＩ－２、株式会社資生堂、の補足情報を参照せよ。）に供された。簡潔には、逆相分離用分析カラムは、自社製のモノリシックＯＤＳカラム（内径１．５ｍｍ×２５０ｍｍ、石英ガラス毛管に装填）が用いられた。蛍光検出は、励起波長４７０ｎｍ、検出波長５３０ｎｍで実行された。逆相分離の後、エナンチオ選択性カラムに移された。エナンチオマー分離には、キラルセレクターとして（Ｓ）－ナフチルグリシンを用いるスミキラルＯＡ－２５００Ｓカラム（２５０ｍｍ×１．５ｍｍ、自家充填、材料は株式会社住化分析センター製）が使用された。体液中のＤ－アミノ酸の濃度は生理学的にマイクロモルのオーダーに保たれている。本実施例で説明された２次元ＨＰＬＣシステムは、例えばセリンの立体異性体を区別して１ｆｍｏｌから１００ｐｍｏｌの範囲で定量的に測定できる。これは、健常者と腎不全患者とにおけるセリンのＤ－体及びＬ－体の濃度変化を識別するのに十分な感度であった（図示されない。）。
　（６）統計処理
　本明細書及び図面に記載の全ての数値は、平均±標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表示される。実験の統計学的解析には、ステューデントのｔ両側検定、一元配置分散分析（ｏｎｅ　ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）、テューキーの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔｅｓｔ）等の統計学的手法が利用された。また、これらの検定におけるＰ値が０．０５未満のとき、有意性があると評価された。全ての解析はＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州、ラホヤ）が用いられた。
　２．結果
　（１）血清中Ｄ－セリン及びＬ－セリン濃度
　図１－Ａは偽手術又は虚血再灌流処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＤ－／Ｌ－セリンの２次元ＨＰＬＣ法により得られた典型的なクロマトグラムである。以下の実験では、偽手術に８匹、再灌流後４時間、８時間、２０時間及び４０時間にそれぞれ、５匹、９匹、６匹及び７匹についてマーカーが測定された。図１－Ａないし１－Ｆの棒グラフは平均値を表し、誤差棒は標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。本実施例のデータについては一元配置分散分析の後、テューキーの多重比較検定による統計解析が行われた。図１－Ａないし１－Ｆにおいて、＊はＰが０．０５未満を意味し、＊＊はＰが０．０１未満を意味し、＊＊＊はＰが０．００１未満を意味する。ＮＳは有意差がないことを意味する。図のＳｈａｍは偽手術処置マウスの濃度、ＩＲＩ４、ＩＲＩ８、ＩＲＩ２０及びＩＲＩ４０は、それぞれ再灌流後４、８、２０及び４０時間後のマウスの濃度を表す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、血清中のＤ－セリン濃度は再灌流後４時間及び８時間では有意な変動がみられなかったが、２０時間で上昇し、４０時間ではさらに上昇した（図１－Ｂ）。なお、図１－Ｂに示されたＤ－セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで３．７±０．３μＭ、ＩＲＩ４で３．４±０．３μＭ、ＩＲＩ８で４．３±０．４μＭ、ＩＲＩ２０で５．５±０．５μＭ、ＩＲＩ４０で１０．６±０．４μＭであった。血清中のＬ－セリン濃度は再灌流後４時間で激減し、その後はずっと低い値のままであった（図１－Ｃ）。図１－Ｃに示されたＤ－セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで１０６．１±５．０μＭ、ＩＲＩ４で４６．９±０．９μＭ、ＩＲＩ８で６１．５±５．６μＭ、ＩＲＩ２０で７０．６±７．５μＭ、ＩＲＩ４０で６４．７±２．２μＭであった。そのため、［Ｄ－セリン］／［Ｌ－セリン］はＬ－セリン濃度の低下に伴って上昇し、４０時間でもさらに上昇した（図１－Ｄ）。図１－Ｄに示された［Ｄ－セリン］／［Ｌ－セリン］の数値は、Ｓｈａｍで０．０３６±０．００４、ＩＲＩ４で０．０７４±０．００５、ＩＲＩ８で０．０７３±０．００９、ＩＲＩ２０で０．０８２±０．００９、ＩＲＩ４０で０．１６４±０．００８であった。血清中クレアチニン濃度は、再灌流後４時間から上昇し、４０時間ではさらに上昇した（図１－Ｅ）。図１－Ｅに示されたクレアチニン濃度の数値は、Ｓｈａｍで０．５９±０．０５ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ４で１．１０８±０．０４ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ８で１．８９±０．０９ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ２０で１．１４±０．２２ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ４０で３．７３±０．０９ｍｇ／ｄｌであった。しかし血清中シスタチンＣ濃度は再灌流後４時間で上昇後、４０時間まで徐々に低下した（図１－Ｆ）。図１－Ｆに示されたシスタチンＣ濃度の数値は、Ｓｈａｍで０．８４±０．０１μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ４で１．６３±０．０８μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ８で１．３９±０．０９μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ２０で１．１９±０．０５μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ４０で１．０６±０．１０μｇ／ｍＬであった。これらの実験から、［Ｄ－セリン］／［Ｌ－セリン］の比は再灌流後４時間で上昇し初め、４０時間まで単調増加するため、腎不全のマーカーとして有用であることが明かになった。ここで単調変化するマーカーであれば、ある数値を示すのは再灌流後の一時期だけであるが、ピーク又はボトムがある変動の場合では、ある数値を示すのは一時期だけでなく、もう１回又は２回以上存在する。そのため、マーカーの数値によって腎不全の進行段階を一義的に推定することができない。
　（２）尿中Ｄ－セリン及びＬ－セリン
　以下の実験では、偽手術に７匹、再灌流後４時間、８時間、２０時間及び４０時間にそれぞれ、５匹、５匹、５匹及び５匹についてマーカーが測定された。図２－Ａないし２－Ｊの棒グラフは平均値を表し、誤差棒は標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。本実施例のデータについては一元配置分散分析の後、テューキーの多重比較検定による統計解析が行われた。図２－Ａないし２－Ｇにおいて、＊はＰが０．０５未満を意味し、＊＊はＰが０．０１未満を意味し、＊＊＊はＰが０．００１未満を意味する。ＮＳは有意差がないことを意味する。血清中では虚血再灌流後の時間経過とともにＤ－セリン濃度は上昇したが、Ｌ－セリン濃度は低下した。しかし、尿中では逆に、虚血再灌流後の時間経過とともにＤ－セリン濃度が低下し（図２－Ｂ）、Ｌ－セリン濃度が上昇した（図２－Ｃ）。図２－Ｂに示されたＤ－セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで５２．０±７．６μＭ、ＩＲＩ４で２４．５±５．７μＭ、ＩＲＩ８で９．９±１．１μＭ、ＩＲＩ２０で３６．９±３．３μＭ、ＩＲＩ４０で２２．４±３．８μＭであった。図２－Ｃに示されたＬ－セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで１９．０±３．０μＭ、ＩＲＩ４で２３．６±２．７μＭ、ＩＲＩ８で６２．６±９．９μＭ、ＩＲＩ２０で１３６．１±１４．９μＭ、ＩＲＩ４０で９３．８±１２．１μＭであった。なお、尿中のクレアチニンは再灌流後８時間以降激減している（図２－Ｄ）。これは、クレアチニンの尿への流出が腎機能低下のために阻害されたためである。そして、クレアチニンは再灌流後４時間では偽手術マウスとあまり変わらないことから、腎機能低下は再灌流後４時間ではまだ顕著ではないが、尿中の［Ｄ－セリン］／［Ｌ－セリン］の比は４時間でも偽手術マウスの３分の１近くまで低下していた（図２－Ｅ）。そこで、尿中の［Ｄ－セリン］／［Ｌ－セリン］の比は、腎機能低下に先立って変動し、単調減少するため、腎不全の早期マーカーとして有用であることが示された。図２－Ｅに示される［Ｄ－セリン］／［Ｌ－セリン］の比の数値は、Ｓｈａｍで２．８２±０．１８、ＩＲＩ４で１．１０±０．２６、ＩＲＩ８で０．１６±０．０１、ＩＲＩ２０で０．２８±０．０２、ＩＲＩ４０で０．２５±０．０４であった。尿中のＫＩＭ－１濃度は、再灌流後２０時間で上昇したが、４０時間では減少した（図２－Ｆ）。尿中ＮＧＡＬ濃度は、再灌流後４時間では偽手術マウスと有意差がなく、８時間では上昇し、その後ほぼ変化はなかった（図２－Ｇ）。したがって、尿中セリン濃度にもとづくパラメーターは既存のいずれのマーカーよりも早い時期から腎不全に伴う変動をしめし、かつ、その変化が単調変化であるため、被検者が腎不全の進行のどの段階にあるのかの判断に有用である。
　（３）尿中でのさまざまなアミノ酸エナンチオマーの濃度比の変化
　尿中のマーカーが測定された図２－Ａないし２－Ｊの実験に用いられたマウスのうち２匹の尿について、さまざまなアミノ酸のエナンチオマーの対の濃度が測定された。図３－Ａないし図３－Ｌでは、マウス個体のＬ－体の濃度の平均値に対するＤ－体の濃度の平均値比が、偽手術マウスと、虚血再灌流処理後４、８、２０及び４０時間のマウスとについて棒グラフで示される。その結果、尿中の［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］（図３－Ｆ）と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］（図３－Ｊ）と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］（図３－Ｋ）とでは、Ｌ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比は、再灌流４時間後でも変動せず、８時間後以降は非常に低下していた。これに対し、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］（図３－Ａ）と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］（図３－Ｂ）と、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］（図３－Ｃ）と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］（図３－Ｄ）と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン（図３－Ｅ）と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］（図３－Ｇ）と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］（図３－Ｈ）と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］（図３－Ｉ）と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］（図３－Ｌ）との組合せでは、Ｌ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比は再灌流後４時間で大きく変動し、偽手術マウスと、再灌流８時間以降との中間の数値を示した。そこで、ある個体について［Ｄ－ヒスチジン］／［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］／［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］／［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］／［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］／［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］／［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］／［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－リジン］／［Ｌ－リジン］とのいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低ければ、［Ｄ－グルタミン酸］／［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］／［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］／［Ｌ－フェニルアラニン］とのうちいずれか少なくとも１つでは健常者と変わらない数値であっても、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態が検出できることになる。また、ある個体について、［Ｄ－ヒスチジン］／［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］／［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］／［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］／［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］／［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］／［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］／［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－リジン］／［Ｌ－リジン］とのうちいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低く、かつ、［Ｄ－グルタミン酸］／［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］／［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］／［Ｌ－フェニルアラニン］とのうちいずれか少なくとも１つも健常者の数値より低いときは、腎機能低下が始まる時期の状態が検出されることになる。このようにして異なるグループのアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の尿中濃度にもとづくパラメーターによって、被検者が腎不全の早期にあるかどうかだけでなく、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態か、それとも、腎機能低下が始まる時期の状態かまで区別することができる。
　（４）尿中でのさまざまなアミノ酸エナンチオマーの全濃度に対するＤ－体濃度の百分率の変化
　図４－Ａないし図４－Ｌでは、マウス個体のＬ－体の濃度の平均値とＤ－体の濃度の平均値の和に対するＤ－体の濃度の平均値の百分率が、偽手術マウスと、虚血再灌流処理後４、８、２０及び４０時間のマウスとについて棒グラフで示される。その結果、尿中の［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］（図４－Ｆ）と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］（図４－Ｊ）と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］（図４－Ｋ）とでは、Ｌ－体の濃度の平均値とＤ－体の濃度の平均値の和に対するＤ－体の濃度の平均値の百分率は、再灌流４時間後でも変動せず、８時間後以降は非常に低下していた。これに対し、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］（図４－Ａ）と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］（図４－Ｂ）と、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］（図４－Ｃ）と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］（図４－Ｄ）と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン（図４－Ｅ）と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］（図４－Ｇ）と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］（図４－Ｈ）と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］（図４－Ｉ）と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］（図４－Ｌ）との組合せでは、Ｌ－体の濃度の平均値とＤ－体の濃度の平均値の和に対するＤ－体の濃度の平均値の百分率は再灌流後４時間で大きく変動し、偽手術マウスと、再灌流８時間以降との中間の数値を示した。そこで、ある個体について［Ｄ－ヒスチジン］の［全ヒスチジン］に対する百分率と、［Ｄ－アスパラギン］の［全アスパラギン］に対する百分率と、［Ｄ－アルギニン］の［全アルギニン］に対する百分率と、［Ｄ－アロ－スレオニン］の［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］の和に対する百分率と、［Ｄ－アラニン］の［全アラニン］に対する百分率と、［Ｄ－プロリン］の［全プロリン］に対する百分率と、［Ｄ－バリン］の［全バリン］に対する百分率と、［Ｄ－リジン］の［全リジン］に対する百分率とのいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低ければ、［Ｄ－グルタミン酸］の［全グルタミン酸］に対する百分率と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］の［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］の和に対する百分率と、［Ｄ－フェニルアラニン］の［全フェニルアラニン］に対する百分率とのうちいずれか少なくとも１つでは健常者と変わらない数値であっても、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態が検出できることになる。
また、ある個体について、［Ｄ－ヒスチジン］の［全ヒスチジン］に対する百分率と、［Ｄ－アスパラギン］の［全アスパラギン］に対する百分率と、［Ｄ－アルギニン］の［全アルギニン］に対する百分率と、［Ｄ－アロ－スレオニン］の［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］の和に対する百分率と、［全アラニン］の［Ｌ－アラニン］に対する百分率と、［Ｄ－プロリン］の［全プロリン］に対する百分率と、［Ｄ－バリン］の［全バリン］に対する百分率と、［Ｄ－リジン］の［全リジン］に対する百分率とのうちいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低く、かつ、［Ｄ－グルタミン酸］の［全グルタミン酸］に対する百分率と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］の［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］の和に対する百分率と、［Ｄ－フェニルアラニン］の［全フェニルアラニン］に対する百分率とのうちいずれか少なくとも１つも健常者の数値より低いときは、腎機能低下が始まる時期の状態が検出されることになる。このようにして異なるグループのアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の尿中濃度にもとづくパラメーターによって、被検者が腎不全の早期にあるかどうかだけでなく、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態か、それとも、腎機能低下が始まる時期の状態かまで区別することができる。
　（５）尿中でのさまざまなアミノ酸エナンチオマーの濃度比の変化
　３～７匹のマウスについて、虚血再灌流処理を行い、取得した尿について、さまざまなアミノ酸のエナンチオマーの対の濃度を測定した。図５－Ａ～図５－Ｒでは、マウス個体のＬ－体の濃度の平均値に対するＤ－体の濃度の平均値比が、偽手術マウスと、虚血再灌流処理後４、８、２０及び４０時間のマウスとについて棒グラフで示し、統計的有意差の有無を調べた。その結果、尿中の［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］（図５－Ｊ）と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］（図５－Ｋ）と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］（図５－Ｒ）では、Ｌ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比は、再灌流４時間後でも変動せず（統計的有意差無し）、８時間後以降は非常に低下していた（有意差有り）。［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］（図５－Ｆ）と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］（図５－Ｉ）と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］（図５－Ｍ）、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］（図５－Ｎ）、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］（図５－Ｑ）とでは、再灌流４時間後でも変動したものの、統計的有意差が無く、８時間後以降は非常に低下していた（有意差有り）。［Ｄ－メチオニン］及び［Ｌ－メチオニン］（図５－Ｏ）と、［Ｄ－アスパラギン酸］及び［Ｌ－アスパラギン酸］（図５－Ｐ）とでは、変動の傾向が得られなかった。これに対し、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］（図５－Ａ）と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］（図５－Ｂ）と、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］（図５－Ｃ）と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］（図５－Ｄ）と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン（図５－Ｅ）と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］（図５－Ｇ）と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］（図５－Ｈ）と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］（図５－Ｌ）、との組合せでは、Ｌ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比は再灌流後４時間で大きく変動し（統計的有意差有り）、偽手術マウスと、再灌流８時間以降との中間の数値を示した。従来の腎不全の診断マーカーとして使用される尿中クレアチニンでは、マウス虚血再灌流モデルにおいて、虚血後４時間では、腎不全を検知できず、８時間以降で検知できていた（図２－Ｄ）ため、本願の［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］（図５－Ｎ）と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］（図５－Ｑ）と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニンと、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］（図５－Ｈ）と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］（図５－Ｌ）とはいずれも、尿中クレアチニンと同等又はそれ以上の感度の腎不全マーカーとして使用することができる。特に再還流後４時間において有意差をもって検知可能な［Ｄ－ヒスチジン］／［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］／［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］／［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］／［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アラニン］／［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］／［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］／［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数の病態指標値を用いれば、尿中クレアチニンよりも高い感度で腎不全を診断することを可能にする。その中でも特に、再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．０１の有意差を示す、［Ｄ－ヒスチジン］／［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］／［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－プロリン］／［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］／［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数の病態指標値は、より高い感度で腎不全を診断することができ、さらに再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．００１の有意差を示す、［Ｄ－ヒスチジン］／［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－プロリン］／［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］／［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数の病態指標値は、さらに高い感度で腎不全を診断することができる。病態指標値は、単独で用いられてもよいが、複数を組み合わせることにより、より信頼性の高い診断を可能にする。
　また、本発明の病態指標値の中で、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニンと、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］のうちの何れかのＤ－体及びＬ－体の対の濃度を用いて算出された病態指標値は、尿中クレアチニンと同等又はそれ以上の感度の腎不全マーカーとして使用することができる。したがって、被検体における病態指標値が、健常者群の病態指標基準値に対し、統計的有意差を有し、かつ腎不全患者群の病態指標基準値に対し、統計的有意差を有する場合であって、健常者群の病態指標基準値と腎不全患者群の病態指標基準値との間にある場合、被検体は、は早期の腎不全の疑いがあると診断することができる。病態指標値の中でも特に、再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．０１の有意差を示す、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を使用して算出された病態指標値を用いることで、より早期の腎不全を診断することができる。さらに再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．００１の有意差を示す、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された病態指標値により、さらに早い段階の腎不全を診断することができる。

Claims (13)

  1. 　腎不全が疑われる被検体の尿の分析方法であって、
    　該被検体の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、
    　前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合の有意差をもった減少と、被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出するステップとを含む、分析方法。
  2. 　前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比又は、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の比である、請求項１に記載の分析方法。
  3. 　前記被検体の病態指標値を、健常者群の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者群の病態指標基準値と比較して、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値からの統計的有意差の有無を判定し、前記被検体の病態指標値が前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値と統計的有意差の有無を判定し、又は前記健常者群と前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群とに対し統計的に有意差が有る場合に、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と急性腎不全及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
  4. 　前記被検体の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が、前記健常者群の病態指標基準値並びに前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値に統計的に有意差が有る場合に、前記健常者群の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む、請求項３に記載の分析方法。
  5. 　前記被検体の尿における［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］からなるアミノ酸群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを、さらに判定するステップを含む、請求項４に記載の分析方法。
  6. 　腎不全の検査方法であって、非検体の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ-アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度を測定するステップと、
    　前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合の減少と、被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出するステップとを含む、検査方法。
  7. 　前記アミノ酸群が、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］からなる、請求項６に記載の検査方法。
  8. 　記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む、腎不全が疑われる被検体の尿のサンプル分析システムであって、
    　前記記憶部は、健常者群の尿における病態指標基準値と、急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の尿における病態指標基準値とを記憶し、
    　前記分析測定部は、前記被検体の尿中のアミノ酸のうち、Ｄ－セリン及びＬ－セリンと、Ｄ－ヒスチジン及びＬ－ヒスチジンと、Ｄ－アスパラギン及びＬ－アスパラギンと、Ｄ－アルギニン及びＬ－アルギニンと、Ｄ－アロ－スレオニン及びＬ－スレオニンと、Ｄ－グルタミン酸及びＬ－グルタミン酸と、Ｄ－アラニン及びＬ－アラニンと、Ｄ－プロリン及びＬ－プロリンと、Ｄ－バリン及びＬ－バリンと、Ｄ－アロ－イソロイシン及びＬ－イソロイシンと、Ｄ－フェニルアラニン及びＬ－フェニルアラニンと、Ｄ－リジン及びＬ－リジンとからなるアミノ酸群から選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量し、
    　前記データ処理部は、前記被検体の［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合の減少と被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出し、該被検体の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と統計的に有意差が無いときは前記被検体は腎不全の疑いが薄いことを前記被検体の病態情報と定義し、前記被検体の病態指標値が前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値と統計的に有意差が無いときは前記被検体は腎不全の疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義し、前記健常者群の病態指標基準値並びに前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値に統計的に有意差が有る場合に、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは前記被検体は早期腎不全の疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義し、
    　前記病態情報出力部は前記被検体の病態情報を出力する、被検体の尿の分析システム。
  9. 　前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ－体の濃度に対するＤ－体の濃度の比又は、Ｄ－体及びＬ－体の濃度の和に対するＤ－体の濃度の百分率である、請求項８に記載の分析システム。
  10. 　前記被検体の尿における［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは、非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項８又は９に記載の分析システム。
  11. 　前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ-アロ-スレオニン］及び［Ｌ－アロ-スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］が含まれ、
    ［Ｄ－セリン］及び［Ｌ－セリン］と、［Ｄ－ヒスチジン］及び［Ｌ－ヒスチジン］と、［Ｄ－アスパラギン］及び［Ｌ－アスパラギン］と、［Ｄ－アルギニン］及び［Ｌ－アルギニン］と、［Ｄ－アラニン］及び［Ｌ－アラニン］と、［Ｄ－プロリン］及び［Ｌ－プロリン］と、［Ｄ－リジン］及び［Ｌ－リジン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ－スレオニン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは、非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の分析システム。
  12. 　前記被検体の尿における［Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、[Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］のうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検体が、腎機能低下が始まる時期の状態である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項１０に記載の分析システム。
  13. 　前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ-アロ－スレオニン］及び［Ｌ－アロ-スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］が含まれ、
    [Ｄ－グルタミン酸］及び［Ｌ－グルタミン酸］と、［Ｄ－バリン］及び［Ｌ－バリン］と、［Ｄ－アロ－イソロイシン］及び［Ｌ－イソロイシン］と、［Ｄ－フェニルアラニン］及び［Ｌ－フェニルアラニン］、［Ｄ－グルタミン］及び［Ｌ－グルタミン］と、［Ｄ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－アロ－スレオニン］及び［Ｌ－スレオニン］と、［Ｄ－ロイシン］及び［Ｌ－ロイシン］からなる群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸のＤ－体及びＬ－体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検体が、腎機能低下が始まる時期の状態である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項１１に記載の分析システム。
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