TW202107085A - 用以判定關鍵期之腎損傷之標記 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種標記，其係用以根據基於血液中D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值而判定關鍵期之腎損傷；以及分析方法，其係用以使用該標記確定手術、加護中之關鍵期之腎損傷；及分析系統，其係用以判定手術、加護中之關鍵期之腎損傷。

Description

用以判定關鍵期之腎損傷之標記

本發明係關於一種用以判定手術、加護中之關鍵期之腎損傷之標記、用以確定手術、加護中之關鍵期之腎損傷之分析方法、及用以判定手術、加護中之關鍵期之腎損傷之分析系統。

手術或加護醫療之目的在於對構成人體之各器官系統之重症功能衰竭運用高度之醫療技術使該等恢復或穩定化，而謀求維持生命。另一方面，腎臟於生物體內之作用在於藉由體內廢物之排出、血壓之調節、體液量/離子調整功能而維持體內之恆常性，手術或加護中之腎疾病之併發會引起/增加其他器官衰竭。將於呈現出手術或加護之關鍵期之不穩定之循環動態之嚴重之多器官衰竭或敗血症中腎功能急遽地降低之狀態稱為急性腎損傷(AKI)，有報告稱，若併發AKI，則死亡率會大幅上升。隨著醫療之進步，對於至今為止為高風險且不適合侵入性治療之超高齡者等病例，提供手術或加護亦成為關鍵期之AKI增加之一個原因。加護病房(ICU)定群(cohort)中，驗證了40～60%之病例產生了AKI。AKI係腎臟所產生之病態，但亦具有如下特徵：於多器官衰竭或敗血症等全身性疾病中之作用備受關注，除腎臟專科醫生以外之醫生進行診療之情況較多。

認為AKI需要藉由於更早期進行診斷並介入治療來改善預後，提倡RIFLE(Risk, Injury, Failure, Loss, and End-stage kidney disease，風險期、損傷期、衰竭期、喪失期、終末期腎病)分類或AKIN(Acute Kidney Injury Network，急性腎損傷照護網)診斷基準、KDIGO(Kidney Disease Improving Global Outcomes，改善全球腎臟病預後組織)診斷基準。已知於該等分類或基準中所採用之血清肌酸酐於早期AKI中之上升感度較低。又，血清肌酸酐由於強烈受到肌肉量之影響，故而於超高齡者中較多之消瘦或長期臥床之患者中特別不穩定，難言為特異性之診斷標記(非專利文獻1)，因而期待藉由感度、特異度不同之複數種生物標記進行早期診斷，使NGAL(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，嗜中性白血球明膠酶相關運載蛋白)或L-FABP(Liver fatty acid binding protein，肝臟型脂肪酸結合蛋白)實用化。

已明確，先前以來被認為於哺乳類之生物體內不存在之D-胺基酸存在於各種組織中承擔生理功能。又，指出：人類血液中之D-胺基酸中，D-絲胺酸、D-丙胺酸、D-脯胺酸、D-麩胺酸、D-天冬胺酸之量與血清肌酸酐之量相關，且可成為腎臟病之診斷標記(非專利文獻3、非專利文獻4、非專利文獻5)。進而揭示有：選自由D-絲胺酸、D-蘇胺酸、D-丙胺酸、D-天冬醯胺、D-別蘇胺酸、D-麩胺酸、D-脯胺酸及D-苯丙胺酸所組成之群組中之1種或2種以上之胺基酸作為腎臟病之病態指標值(專利文獻1)。再者，指出了小鼠血液中之D-絲胺酸因缺血再灌注處理而上升之情況、及小鼠尿中之D-絲胺酸因缺血再灌注處理而減少之情況(專利文獻2、非專利文獻6)。該等文獻雖作為以小鼠為對象之急性腎損傷模型進行了缺血再灌注處理，但藉由該處理，受到腎損傷之小鼠均未恢復腎功能且死亡，因此並非人類中具有腎功能之可逆性之準確地反映AKI之病態的模型。又，針對慢性腎臟病之預後預測，進行了識別血液中胺基酸之光學異構物之分析(非專利文獻7)，但尚不存在針對人類之AKI對血液中之胺基酸光學異構物進行分析並發現了生物標記之例。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2013/140785號 [專利文獻2]國際公開第2015/087985號 [非專利文獻]

[非專利文獻1] Slocum, J. L.等，Transl Res. 159: 277 (2012) [非專利文獻2] KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease, Kidney International Supplements 1 (2013) [非專利文獻3] Fukushima, T.等，Biol. Pharm. Bull. 18: 1130(1995) [非專利文獻4] Nagata. Y Viva Origino Vol. 18(No.2) (1990)第15屆學術演講會演講主旨集 [非專利文獻5] Ishida等，北裏醫學 23: 51～62 (1993) [非專利文獻6] Sasabe J.等，PLOS ONE (2014) vol. 9, Issue 1, e86504 [非專利文獻7] Kimura T.等，Scientific Reports 6: 26137 DOI: 10. 1038/srep26137

[發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種代替或補充血清肌酸酐等既有之急性腎損傷之診斷標記之關鍵期之腎損傷之診斷標記。 [解決問題之技術手段]

本發明者等人針對在加護病房治療中之患者之可利用於關鍵期之腎損傷之診斷的生物標記進行了探索，結果令人驚奇的是，發現根據血液中之D-絲胺酸量或血液中之D-絲胺酸及L-絲胺酸量所求出之指標與血清肌酸酐表現出極高之相關。藉此，發現根據血液中之D-絲胺酸量或血液中之D-絲胺酸及L-絲胺酸量所求出之指標成為關鍵期之腎損傷之診斷標記，從而完成本發明。因此，本發明係關於以下發明：

[1]一種標記，其係用以根據基於血液中D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值而判定關鍵期之腎損傷。 [2]如項目1中記載之標記，其中基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值為比或百分率。 [3]如項目1或2中記載之標記，其係於接受手術、加護之患者中判定關鍵期之腎損傷。 [4]如項目1中記載之標記，其中接受手術、加護之患者處於選自由脫水症、腎病症候群、絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、血壓降低所組成之群之狀態。 [5]一種血液分析方法，其係針對接受手術、加護之患者之血液分析方法，且包括如下步驟： 測定血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量；及 將基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值與關鍵期之腎損傷建立關聯。 [6]如項目5中記載之血液分析方法，其中基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值為比或百分率。 [7]如項目5或6中記載之血液分析方法，其中接受手術、加護之患者處於選自由脫水症、腎病症候群、絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、血壓降低所組成之群之狀態。 [8]如項目5至7中任一項中記載之血液分析方法，其係用以進而藉由與腎功能標記之組合而特定出關鍵期之病期或病態。 [9]如項目8中記載之血液分析方法，其中上述腎功能標記為選自由尿中NGAL、血液中NGAL、尿中IL-18、尿中KIM-1、尿中L-FABP、血液中肌酸酐、尿中肌酸酐、血液中胱抑素C、尿蛋白、尿中白蛋白、尿中β2-MG、尿中α1-MG、尿中NAG、eGFR(肌酸酐、胱抑素C)、血液中脲氮所組成之群中之至少1種標記。 [10]一種診斷接受手術、加護之患者之關鍵期之腎損傷並且進行治療之方法，其包括如下步驟：測定血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量； 根據基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值判斷關鍵期之腎損傷；及對患有關鍵期之腎損傷之患者進行介入治療。 [11]如項目10中記載之方法，其中上述介入治療為選自由生活習慣改善、飲食指導、有效循環血液量或血壓之維持、腎功能替代療法、血壓管理、血糖值管理、免疫管理及脂質管理所組成之群中之至少1種。 [12]如項目10或11中記載之方法，其包含對上述對象投予選自由利尿劑、髄質液、等張性晶質液、輸液、升壓藥、鈣拮抗劑、血管收縮素轉化酶抑制劑、血管收縮素受體拮抗劑、交感神經阻斷劑、SGLT2抑制劑、磺醯脲劑、噻唑啶劑、雙胍藥、α-葡萄糖苷酶抑制劑、格列奈藥、胰島素製劑、NRF2活化劑、免疫抑制劑、斯達汀系藥劑、貝特系藥劑、貧血治療藥、紅血球生成素製劑、HIF-1抑制劑、鐵劑、電解質調整藥、鈣受體促效劑、磷吸附劑、尿毒素吸附劑、DPP4抑制劑、EPA製劑、菸鹼酸衍生物、膽固醇轉運體抑制劑、及PCSK9抑制劑所組成之群中之至少1種藥劑作為上述介入治療。 [13]一種血液分析系統，其係包含記憶部、分析測定部、資料處理部、及病態資訊輸出部之用以確定接受手術、加護之患者之關鍵期之腎損傷者，且 上述記憶部記憶用以判定關鍵期之腎損傷之閾值， 上述分析測定部將上述血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量分離而進行定量， 上述資料處理部將上述住院患者之基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值與記憶部所記憶之上述閾值進行比較，判定關鍵期之腎損傷， 上述病態資訊輸出部將關於關鍵期之腎損傷之資訊輸出。 [14]如項目13中記載之血液分析系統，其中基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值為比或百分率。 [15]如項目13或14中記載之血液分析系統，其中接受手術、加護之患者處於選自由脫水症、腎病症候群、絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、血壓降低所組成之群之狀態。 [16]一種程式，其係使包含輸入部、輸出部、資料處理部、及記憶部之資訊處理裝置確定關鍵期之腎損傷者，且包含用以使上述資訊處理裝置執行以下內容之指令： 使記憶部記憶自輸入部所輸入之指標值之算出式、及指標值之閾值； 使記憶部記憶自輸入部所輸入之D-絲胺酸、或D-絲胺酸及L-絲胺酸於血液中之量； 使資料處理部讀出所記憶之D,L-絲胺酸之血液中量及指標值之算出式，算出指標值並使記憶部記憶；及 使資料處理部讀出所記憶之指標值、及指標值之閾值，並將指標值與閾值進行比較，使輸出部輸出關鍵期之腎損傷之有無。 [發明之效果]

根據本發明，能夠判定關鍵期之腎損傷。

本發明係關於一種用以根據基於血液中D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值而判定關鍵期之腎損傷之標記，又，本發明係關於一種住院患者或手術、加護時之血液分析方法、輸出關於關鍵期之腎損傷之資訊之血液分析系統、及其作動程式。

所謂關鍵期之腎損傷，係指對急遽之腎功能降低能夠藉由利用腎功能替代療法或血壓管理、藥劑之介入而控制尿毒症等症狀來改善生命預後的狀態。關鍵期之腎損傷亦可稱為手術或加護中之腎損傷，又，亦可稱為多器官衰竭或敗血症所併發之腎損傷。

於加護病房(ICU)住院之患者若伴隨心臟疾病(心衰竭、心律不整、瓣膜病、冠狀動脈疾病、主動脈疾病等)、消化系統疾病(食道癌、胰臟癌、肝癌等)、腦部疾病(腦梗塞、腦內出血、蛛膜下出血、痙攣、癲癇、腦腫瘤、腦動脈瘤等)、頸椎病、腎移植、肺炎、敗血症等、急遽之脫水或血壓降低之同時產生腎損傷，則會引起及/或增加其他器官衰竭。因此，加護中之急性腎損傷(AKI)即便作為單一之器官損傷發病，亦可能併發多器官衰竭，又，亦可能作為多器官衰竭之一個分症而發生。

大多數關鍵期之腎損傷係根據KDIGO準則，藉由尿量之降低及血清肌酸酐之上升來診斷。具體而言，按照下述表進行急性腎臟病(AKI)之分類。 [表1]

表1.AKI之重症度分類
病期	血清肌酸酐	尿量
1	較基礎值增加1.5～1.9倍、或0.3 mg/dL以上	於6～12小時以上未達0.5 mL/kg/小時之降低
2	基礎值之2.0～2.9倍	於12小時以上未達0.5 mL/kg/小時之降低
3	基礎值之3倍、或4 mg/dL以上之增加、或開始腎替代療法或未達18歲eGFR＜35 mL/min/1.73 m2 之降低	於24小時以上未達0.3 mL/kg/小時之降低、或於12小時以上無尿

另一方面，已知血清肌酸酐係肌肉之磷酸肌酸之代謝產物，其量依賴於肌肉量。有人指出，血清肌酸酐於產生及排泄為不穩定狀態之急性腎損傷之發病時，不會敏銳地反映精確之腎功能變化，於損傷之早期不會增加。又，作為迄今為止各種介入治療試驗失敗之原因之一，推測係由基於血清肌酸酐基準之AKI診斷之精度不足而引起。

本發明之基於血液中D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值與接受加護之患者之血清肌酸酐具有較高之相關。此種情況顯示：該等指標值成為用以判定關鍵期之腎損傷之標記。通常，眾所周知：就健康者而言，血液中之D-絲胺酸量由基於絲胺酸消旋酶或D-胺基酸氧化酶等酶之代謝系統(合成、分解)嚴密地控制，另一方面，於腎臟之絲球體過濾或再吸收能力變化之情形時會產生變動，於和血清肌酸酐不同之機制中有可能成為更敏銳之標記。關於關鍵期之腎損傷，腎臟專科醫生進行處理之情況較少，於此種情況下，早期之適當之介入對生命預後產生較大之影響，因此有用的是藉由使用感度較高且變動機制不同之複數個標記之面板化的診斷。

急性腎損傷之原因大致分為腎前性、腎性、及腎後性之原因。所謂腎前性之原因，係指由因全身性之疾病使於腎臟之血流降低而引起之情況，可能由脫水、休克、燒傷、大出血、血壓降低、鬱血性心衰竭、肝硬化、腎動脈狹窄症等引起。腎性之原因係指腎臟本身存在原因之情況，可列舉腎臟中之血流障礙、絲球體疾病、腎小管間質疾病。作為引起腎臟中之血流障礙之疾病，可列舉兩側腎梗塞、腎動脈血栓、彌漫性血管內凝血症候群、血栓性血小板減少性紫瘢病、溶血性尿毒症症候群等。作為絲球體疾病，可列舉腎病症候群、急性絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、狼瘡性腎炎(全身性紅斑狼瘡)、ANCA關聯血管炎、結節性多發性動脈炎等。該等之原因之任一者均有可能成為引起關鍵期之腎損傷之因素，尤其是腎前性例如脫水症狀、血壓降低、出血、由心衰竭而引起之缺血、或腎性例如腎病症候群、急性絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、狼瘡性腎炎可能成為關鍵期之腎損傷之主要因素。

本發明中所使用之指標值可使用血液中D-絲胺酸量本身，或亦可使用基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值。關於基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值，作為一例，可使用D-絲胺酸量與L-絲胺酸量之比(D-Ser/L-Ser或L-Ser/D-Ser)、D-絲胺酸量之百分率(D-Ser/(D-Ser+L-Ser)×100等，只要能夠判定關鍵期之腎損傷，則可加上、減去、乘以、及/或除以任意之常數或年齡、體重、性別、BMI(body mass index，身體質量指數)、eGFR等任意之變數。於使用與胺基酸之光學異構物之量比作為指標值之情形時，具有不需要藉由試樣之量或體積進行修正之優勢。

可藉由將本發明之指標值與預先設定之閾值進行比較來判定關鍵期之腎損傷。亦可藉由進而使用數階段之閾值來確定病期。閾值只要進行大規模調査即可適當設定。又，關於血清肌酸酐或推算絲球體過濾量，亦可藉由使其與目前所使用之基準對應而進行設定。就感度更良好地判定關鍵期之腎損傷之觀點而言，較佳為針對基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值實施大規模調査。

根據本發明，判定關鍵期之腎損傷之對象為任意對象均可，就判定關鍵期之腎損傷之觀點而言，較佳為接受手術、加護之患者。作為接受加護之患者，可列舉於病房中表現出嚴重之症狀之患者、急救患者中需要持續性之狀態管理之患者、手術後需要高度之狀態管理之患者等。血液試樣可於手術前、術中、及術後之任意時點取得。亦可經時性地取得血液試樣。

本發明之另一態樣係關於一種血液分析方法，其係手術、加護中之血液分析方法，且包括如下步驟： 測定血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量；及 將基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值與關鍵期之腎損傷建立關聯。

本發明之分析方法能夠提供醫生用以進行診斷之預備資料，亦可稱為診斷之預備方法。使用此種預備資料，醫生能夠診斷急性腎損傷，該分析方法可由並非醫生之醫療輔助者等來進行，亦可由分析機構等進行。因此，本發明之分析方法亦可稱為診斷之預備方法。該分析方法可進而包括將指標值與關鍵期之腎損傷之病態建立關聯之步驟。此種分析方法可由分析公司或分析技術者進行，提供與腎損傷之病態相關聯之結果。更佳為於住院患者、尤其是接受手術、加護之患者中經時性地進行分析。

本發明之又一態樣中，可藉由將本發明之標記進一步與腎功能標記組合，而特定出關鍵期之病期或病態。組合所使用之腎功能標記可為既知或開發中之標記，作為一例，可使用選自由尿中NGAL、血液中NGAL、尿中IL-18、尿中KIM-1、尿中L-FABP、血液中肌酸酐、尿中肌酸酐、血液中胱抑素C、尿蛋白、尿中白蛋白、尿中β2-MG、尿中α1-MG、尿中NAG、eGFR(肌酸酐、胱抑素C)、血液中脲氮所組成之群中之至少1種標記。可藉由使用複數種標記而恰當地判定腎損傷開始期、腎損傷擴大期、腎損傷持續期、及腎損傷修復期。

關於將指標值與關鍵期之腎損傷建立關聯之步驟，將針對基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值之閾值與所算出之指標值進行比較，於超過閾值之情形時，可確定伴隨關鍵期之腎損傷。

於本發明中，血液中之胺基酸量係分別將光學異構物分離所測得之胺基酸之量，可指特定之血液量中之胺基酸量，亦可以濃度而表示。血液中之胺基酸量係作為於所採取之血液中進行了離心分離、沈澱分離、或用以進行分析之預處理之試樣中的量進行測定。因此，血液中之胺基酸量可作為源自所採取之全血、血清、血漿等血液之血液試樣中之量進行測定。作為一例，於使用HPLC之分析之情形時，特定量之血液中所包含之特定之光學異構物之胺基酸係以層析圖而表示，可藉由針對波峰之高度、面積、形狀而與標準品之比較或藉由校準之分析進行定量。又，酵素法中，可藉由使用標準品之校準曲線之定量分析而算出胺基酸濃度。

D-絲胺酸及L-絲胺酸量可藉由任意之方法進行測定，例如可藉由使用手性管柱層析法、或酵素法之測定，進而使用識別胺基酸之光學異構物之單株抗體之免疫學方法進行定量。本發明之試樣中之D-絲胺酸及L-絲胺酸量之測定可使用業者所周知之任何方法而實施。例如有層析法或酵素法(Y. Nagata et al., Clinical Science, 73 (1987), 105. Analytical Biochemistry, 150 (1985), 238., A. D'Aniello et al., Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 66 (1980), 319. Journal of Neurochemistry, 29 (1977), 1053., A. Berneman et al., Journal of Microbial & Biochemical Technology, 2 (2010), 139., W. G. Gutheil et al., Analytical Biochemistry, 287 (2000), 196., G. Molla et al., Methods in Molecular Biology, 794 (2012), 273., T. Ito et al., Analytical Biochemistry, 371 (2007), 167. 等)、抗體法(T. Ohgusu et al., Analytical Biochemistry, 357 (2006), 15.,等)、氣相層析法(GC)(H. Hasegawa et al., Journal of Mass Spectrometry, 46 (2011), 502., M. C. Waldhier et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 394 (2009), 695., A. Hashimoto, T. Nishikawa et al., FEBS Letters, 296 (1992), 33., H. Bruckner and A. Schieber, Biomedical Chromatography, 15 (2001), 166. , M. Junge et al., Chirality, 19 (2007), 228., M. C. Waldhier et al., Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 4537.等)、毛細管電泳法(CE)(H. Miao et al., Analytical Chemistry, 77 (2005), 7190., D. L. Kirschner et al., Analytical Chemistry, 79 (2007), 736., F. Kitagawa, K. Otsuka, Journal of Chromatography B, 879 (2011), 3078., G. Thorsen and J. Bergquist, Journal of Chromatography B, 745 (2000), 389.等)、高效液相層析法(HPLC)(N. Nimura and T. Kinoshita, Journal of Chromatography, 352 (1986), 169., A. Hashimoto et al., Journal of Chromatography, 582 (1992), 41., H. Bruckner et al., Journal of Chromatography A, 666 (1994), 259., N. Nimura et al., Analytical Biochemistry, 315 (2003), 262., C. Muller et al., Journal of Chromatography A, 1324 (2014), 109., S. Einarsson et al., Analytical Chemistry, 59 (1987), 1191., E. Okμma and H. Abe, Journal of Chromatography B, 660 (1994), 243., Y. Gogami et al., Journal of Chromatography B, 879 (2011), 3259., Y. Nagata et al., Journal of Chromatography, 575 (1992), 147., S. A. Fuchs et al., Clinical Chemistry, 54 (2008), 1443., D. Gordes et al., Amino Acids, 40 (2011), 553., D. Jin et al., Analytical Biochemistry, 269 (1999), 124., J. Z. Min et al., Journal of Chromatography B, 879 (2011), 3220., T. Sakamoto et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408 (2016), 517., W. F. Visser et al., Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 7130., Y. Xing et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408 (2016), 141., K. Imai et al., Biomedical Chromatography, 9 (1995), 106., T. Fukushima et al., Biomedical Chromatography, 9 (1995), 10., R. J. Reischl et al., Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 8379., R. J. Reischl and W. Lindner, Journal of Chromatography A, 1269 (2012), 262., S. Karakawa et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 115 (2015), 123.,等)。

本發明之光學異構物之分離分析系統可組合複數種分離分析。更具體而言，可藉由使用光學異構物之分析方法測定試樣中之D-/L-胺基酸量(日本專利第4291628號)，該分析方法之特徵在於包括如下步驟：使包含具有光學異構物之成分之試樣與作為流動相之第一液體一起通過作為固定相之第一管柱填充劑，將上述試樣之上述成分分離；使上述試樣之上述各成分於多環路單元中個別地保持；使於上述多環路單元中個別地保持之上述試樣之上述各成分與作為流動相之第二液體一起通過流路供給至作為固定相之具有光學活性中心之第二管柱填充劑，將上述試樣之成分之各者所包含之上述光學異構物進行分割；及檢測出上述試樣之各成分所包含之上述光學異構物。HPLC分析中，存在預先利用鄰苯二甲醛(OPA)或4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并㗁二唑(NBD-F)之類之螢光試劑使D-及L-胺基酸衍生物化、或使用N-第三丁氧羰基-L-半胱胺酸(Boc-L-Cys)等進行非鏡像異構物(diastereomer)化之情況(濱瀨健司及財津潔，分析化學，53卷，677-690(2004))。可藉由使用識別胺基酸之光學異構物之單株抗體、例如與D-絲胺酸、L-絲胺酸等特異性地結合之單株抗體之免疫學方法測定D-胺基酸進行代替。又，於以D體及L體之合計量為指標之情形時，無需將D體及L體分離而進行分析，亦可分析胺基酸而不區別D體及L體。此種情形亦可利用酵素法、抗體法、GC、CE、HPLC進行分離及定量。

圖2係本發明之試樣分析系統之構成圖。圖2所示之本發明之試樣分析系統10係以能夠實施本發明之分析方法及檢查方法之方式而構成。此種試樣分析系統10包含記憶部11、輸入部12、分析測定部13、資料處理部14、及輸出部15，能夠對血液試樣進行分析，並輸出關於關鍵期之腎損傷之資訊。更具體而言，本發明係關於一種血液分析系統，於本發明之試樣分析系統10中， 記憶部11記憶自輸入部12所輸入之用以判別關鍵期之腎損傷之指標值之閾值； 分析測定部13將血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量分離而進行定量； 資料處理部14基於血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量算出指標值； 資料處理部14藉由與記憶部11所記憶之閾值進行比較來判別關鍵期之腎損傷之資訊；且 輸出部15輸出關於關鍵期之腎損傷之資訊。

記憶部11具有RAM(Random Access Memory，隨機存取記憶體)、ROM(Read Only Memory，唯讀記憶體)、快閃記憶體等記憶體裝置、硬碟驅動器等固定碟片裝置、或軟碟、光碟等可搬用之記憶裝置等。記憶部對分析測定部所測得之資料、自輸入部所輸入之資料及指示、資料處理部所進行之演算處理結果等、以及資訊處理裝置之各種處理所使用之電腦程式、資料庫等進行記憶。電腦程式例如可經由CD-ROM(Compact Disc-Read Only Memory，唯讀光碟)、DVD-ROM(Digital Versatile Disc-Read Only Memory，唯讀數位多功能光碟)等電腦能夠讀取之記錄媒體、或網際網路進行安裝。電腦程式可使用公知之安裝程式等安裝於記憶部。

輸入部12為介面等，亦包含鍵盤、滑鼠等操作部。藉此，輸入部能夠輸入分析測定部13所測得之資料、資料處理部14進行之演算處理之指示等。又，輸入部12例如於分析測定部13處於外部之情形時，除操作部以外，還可包含能夠經由網路或記憶媒體輸入所測得之資料等之介面部。

分析測定部13進行血液試樣中之胺基酸之D體及L體之量之測定步驟。因此，分析測定部13具有能夠進行胺基酸之D體及L體之分離及測定之構成。胺基酸可逐個地進行分析，可針對一部分或全部種類之胺基酸匯總進行分析。分析測定部13並不意在限定於以下者，例如亦可為具備試樣導入部、光學拆分管柱、檢測部之高效液相層析法系統。分析測定部13可與試樣分析系統分開構成，亦可使用網路或記憶媒體，經由輸入部12輸入所測得之資料等。本發明之分析測定部13可進而具備樣品取得部，可自樣品取得部經時性地取得樣品，並將所取得之樣品供於分析測定部。

資料處理部14按照記憶部中所記憶之程式對分析測定部13所測得且被記憶部11記憶之資料執行各種運算處理。運算處理係藉由資料處理部所包含之處理器或CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)來進行。該處理器或CPU包含對分析測定部13、輸入部12、記憶部11、及輸出部15進行控制之功能模組，可進行各種控制。該等各部可由分別獨立之積體電路、微處理器、韌體等所構成。資料處理部14根據計算式算出基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值，並與記憶部中所記憶之指標值之閾值進行比較，判定關鍵期之腎損傷。

輸出部15以輸出作為由資料處理部進行運算處理所得之結果之有無關鍵期之腎損傷之方式而構成。輸出部15可為直接顯示運算處理之結果之液晶顯示器等顯示裝置、印表機等輸出構件，亦可為用以向外部記憶裝置輸出或經由網路輸出之介面部。

本發明之又一態樣係關於一種使上述血液分析系統或資訊處理裝置作動之程式。圖3係表示用以向程式輸出關鍵期之腎損傷之有無或程度之動作之例的流程圖。具體而言，本發明之程式係使包含輸入部、輸出部、資料處理部、及記憶部之資訊處理裝置確定絲球體過濾量之程式。本發明之程式包含用以使上述資訊處理裝置執行以下內容之指令： 使記憶部記憶自輸入部所輸入之指標值之算出式、及指標值之閾值； 使記憶部記憶自輸入部所輸入之D-絲胺酸、或D-絲胺酸及L-絲胺酸於血液中之量； 使資料處理部讀出所記憶之D,L-絲胺酸於血液中之量及指標值之算出式，算出指標值並使記憶部記憶；及 使資料處理部讀出所記憶之指標值、及指標值之閾值，並將指標值與閾值進行比較，使輸出部輸出關鍵期之腎損傷之有無或程度。 本發明之程式可儲存於記憶媒體中，亦可經由網際網路或LAN(Local Area Network，區域網路)等電信線路而提供。

於資訊處理裝置具備分析測定部之情形時，分析測定部亦可包含用以使資訊處理裝置執行自血液試樣測定有關值並使記憶部記憶之指令來代替自輸入部輸入D-絲胺酸量之值。

根據本發明，於已明確對象患有關鍵期之腎損傷之情形時，可藉由生物標記之監測而進行治療方針之確定或治療效果之判定。於判定了關鍵期之腎損傷之發病之情形時，進行介入治療，以維持有效循環血液量及血壓，但並不限定於以下者。又，於投予具有腎毒性之藥物之情形時，可停止藥物投予。為了維持有效循環血液量或血壓，可投予利尿劑、髓質液、等張性晶質液、輸液、升壓藥(去甲腎上腺素、星奈佛林(synephrine)、去氧腎上腺素、美速克新命、美芬丁胺等)。進而，作為介入治療，可為了生活習慣改善、飲食指導、血壓管理、貧血管理、電解質管理、尿毒素管理、血糖值管理、免疫管理、脂質管理進行指導或進行藉由投藥之治療。作為生活習慣改善，可推薦禁菸及BMI值減少至未達25等。作為飲食指導，可進行減鹽及蛋白質限制。作為血壓管理，以成為130/80 mmHg以下之方式進行管理，根據情況不同可投予高血壓治療藥。作為高血壓治療藥，可使用：利尿藥(噻𠯤系利尿藥，例如三氯甲噻𠯤、苯甲基氫氯噻𠯤、氫氯噻𠯤；噻𠯤系類似利尿藥，例如美替克侖、吲達帕胺、曲帕胺、美夫西特；亨氏環利尿藥，例如利尿磺胺；留鉀利尿藥/醛固酮拮抗劑，例如胺苯喋啶、螺內酯、依普利酮等)；鈣拮抗劑(二氫吡啶系，例如硝苯地平、胺氯地平、依福地平、西尼地平、尼卡地平、尼索地平、尼群地平、尼伐地平、巴尼地平、非洛地平、貝尼地平、馬尼地平、阿折地平、阿雷地平、苯并噻氮呯系、地爾硫卓等)；血管收縮素轉化酶抑制劑(卡托普利、依那普利、阿拉普利、地拉普利、西拉普利、賴諾普利、貝那普利、咪達普利、替莫普利、喹那普利、群多普利、培哚普利丁胺鹽等)；血管收縮素受體拮抗劑(血管收縮素II受體拮抗劑，例如洛沙坦、坎地沙坦、纈沙坦、替米沙坦、奧美沙坦、艾比沙坦、阿齊沙坦等)；交感神經阻斷劑(β阻斷劑，例如阿替洛爾、比索洛爾、倍他洛爾、美托洛爾、醋丁洛爾、塞利洛爾、普萘洛爾、納多洛爾、卡替洛爾、品多洛爾、尼普洛爾、氨磺洛爾、阿羅洛爾、卡維地洛、拉貝洛爾、貝凡洛爾、烏拉地爾、特拉唑辛、哌拉唑辛、多沙唑辛、布那唑辛等)等。作為貧血治療藥，可使用紅血球生成素製劑、鐵劑、HIF-1抑制劑等。作為電解質調整藥，可使用鈣受體促效劑(西那卡塞、依他卡西肽等)、磷吸附劑。作為尿毒素吸附劑，可使用活性碳等。血糖值可以成為未達Hba1c 6.9%之方式進行管理，可根據情況不同而投予降血糖藥。作為降血糖藥，可使用SGLT2抑制劑(伊格列淨、達格列淨、魯格列淨、托格列淨、卡格列淨、恩格列淨等)、DPP4抑制劑(磷酸西他列汀、維格列汀、沙格列汀、阿格列汀、利拉列汀、特力列汀、曲格列汀、阿格列汀、奧格列汀等)、磺醯脲劑(甲苯磺丁脲、乙醯苯磺醯環己脲、氯磺丙脲、格列吡脲、格列吡脲、格列齊特、格列美脲等)、噻唑啶劑(吡咯列酮等)、雙胍藥(二甲雙胍、丁雙胍等)、α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等)、格列奈藥(那格列奈、米格列奈、瑞格列奈等)胰島素製劑、NRF2活化劑(甲基巴多索隆等)等。作為免疫管理，可使用免疫抑制劑(類固醇類、他克莫司、抗CD20抗體、環己醯亞胺、麥考酚酸酯(MMF)等)。脂質管理係以成為LDL-C未達120 mg/dL之方式進行管理，根據情況不同，可使用脂質異常症治療藥，例如斯達汀系藥劑(瑞舒伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀等)、貝特系藥劑(氯貝特、苯紮貝特、非諾貝特、克利貝特等)、菸鹼酸衍生物(維生素E菸鹼酸酯、尼可莫耳、戊四醇菸鹼酸酯(Niceritrol)等)、膽固醇轉運體抑制劑(依折麥布等)、PCSK9抑制劑(依洛尤單抗等) EPA製劑等。任一藥劑之劑型可為單劑亦可為合劑。 於腎功能之降低顯著對生命預後產生危險之情形時，可實施腹膜透析、血液透析、持續血液過濾透析、血液血球分離(血漿交換、血漿吸附等)或腎移植之類之腎替代療法。

本說明書中所言及之所有文獻係藉由引用而將其整體引入本說明書中。

以下進行說明之本發明之實施例僅為了例示，並非對本發明之技術範圍進行限定。本發明之技術範圍僅受申請專利範圍之記載所限定。可於不偏離本發明之主旨之條件下進行本發明之變更，例如進行本發明之構成要件之追加、刪除及置換。 [實施例]

材料及方法 材料 胺基酸之標準品及HPLC級之乙腈係自Nacalai Tesque(京都)購入。HPLC級之甲醇、三氟乙酸、硼酸等係自和光純藥(大阪)購入。水係使用Mill-Q Gradient A10 System進行純化。

受驗者集合 於2013年至2017年在金澤大學醫院住院、患有急性腎臟病(AKI)並接受過加護之患者中，取得血液試樣。排除接受過利用免疫抑制劑及抗生物質之治療之患者。表2中，急性腎臟病患者之臨床資訊如下。針對所有患者，檢查基準線時及AKI時之血清肌酸酐、尿蛋白、尿潛血、糖尿病之有無。又，按照下述D-胺基酸之測定法，對血液中D-Ser濃度及D-Ser/L-Ser比進行測定。所有患者藉由AKI時之介入治療，生命預後良好。 [表2]

表2.關鍵期之患者之臨床特徵
患者編號	1	2	3	4	5	6	7	8
性別	M	M	M	M	M	M	M	M
年齡	28	58	78	25	57	21	42	56
KDIGO分類之AKI階段	1	1	1	2	2	3	3	3
基準線時之腎功能	Cr	0.70	1.12	4.95	0.69	1.05	0.65	1.07	1.18
eGFR	110.1	53.4	9.7	115.6	57.6	129.7	61.6	51.0
AKI時之腎功能	Cr	1.35	2.11	9.42	2.30	3.84	2.43	10.87	5.56
eGFR	53.7	26.7	4.8	31.0	14.0	30.7	4.9	9.4
AKI之原因	脫水症	急速進行性絲球體腎炎	急性絲球體腎炎	腎病症候群、血壓降低	脫水症、血壓降低	脫水症	腎病症候群、血壓降低	急速進行性絲球體腎炎
尿蛋白	±	3+	3+	4+	-	-	4+	2+
尿潛血	-	3+	3+	±	1+	-	2+	3+
糖尿病	-	-	+	-	+	-	-	-
D-Ser濃度	2.1	4.0	11.7	8.5	13.0	5.0	15.6	2.4
D/L ser比	0.019	0.032	0.133	0.071	0.119	0.030	0.174	0.019

血液中D-胺基酸之測定 樣品製備 如下述般利用人類血漿進行樣品製備： 將20倍體積之甲醇添加至血漿中，完全混合。離心後，將自甲醇勻漿所獲得之上清液之10 μL轉移至褐色管中進行減壓乾燥。向殘渣添加20 μL之200 mM硼酸鈉緩衝液(pH值8.0)及5 μL之螢光標識試劑(於無水MeCN中40 mM之4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并㗁二唑(NBD-F))，繼而，以60℃加熱2分鐘。加入75 μL之0.1% TFA水溶液(v/v)停止反應，而後將2 μL之反應混合液供於二維HPLC。

藉由二維HPLC之胺基酸光學異構物之定量 使用以下二維HPLC系統對胺基酸光學異構物進行定量。使用逆相管柱(KSAA RP，1.0 mm i.d.×400 mm；資生堂股份有限公司)使胺基酸之NBD衍生物於流動相(5～35% MeCN、0～20% THF、及0.05% TFA)中分離、溶出。管柱溫度設定為45℃，流動相之流速設定為25 μL/min。使用多環閥分取所分離之胺基酸之組分，連續利用手性管柱(KSAACSP-001S，1.5 mm i.d.×250 mm；資生堂)進行光學拆分。作為流動相，根據胺基酸之保持情況，使用包含檸檬酸(0～10 mM)或甲酸(0～4%)之MeOH-MeCN之混合用液。NBD-胺基酸係使用470 nm之激發光於530 nm進行螢光檢測。NBD-胺基酸之保持時間係藉由胺基酸光學異構物之標準品進行鑑定，藉由校準曲線進行定量。

將AKI時之血清肌酸酐、及D-絲胺酸/L-絲胺酸比繪製於散佈圖上，求出相關係數，結果為R=0.941(圖1A)。又，將根據AKI時之血清肌酸酐所求出之推算絲球體過濾量、及D-絲胺酸/L-絲胺酸比繪製於散佈圖上，求出相關係數，結果為R=0.924(圖1B)。又，將AKI時之血清肌酸酐、及D-絲胺酸量繪製於散佈圖上，求出相關係數，結果為R=0.87(圖2A)。將根據AKI時之血清肌酸酐所求出之推算絲球體過濾量、及D-絲胺酸量繪製於散佈圖上，求出相關係數，結果為R=0.872(圖2B)。根據該等結果，於關鍵期中，與作為腎損傷之標記之血清肌酸酐同樣地，可將血液中D-絲胺酸/L-絲胺酸比及D-絲胺酸量作為標記而使用。

圖1A係表示血液中D-絲胺酸/L-絲胺酸比與血清肌酸酐之相關之散佈圖，圖1B係表示血液中D-絲胺酸/L-絲胺酸比與根據血清肌酸酐所求出之推算絲球體過濾量(eGFR)之相關之散佈圖。 圖2A係表示血液中D-絲胺酸量與血清肌酸酐之相關之散佈圖，圖2B係表示血液中D-絲胺酸量與根據血清肌酸酐所求出之推算絲球體過濾量(eGFR)之相關之散佈圖。 圖3表示本發明之試樣分析系統之構成圖。 圖4係表示由本發明之程式而進行之用以確定絲球體過濾量之動作之例的流程圖。

Claims (13)

1. 一種標記，其係用以根據基於血液中D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值而判定關鍵期之腎損傷。
2. 如請求項1之標記，其中基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值為比或百分率。
3. 如請求項1或2之標記，其係於接受手術、加護之患者中判定關鍵期之腎損傷。
4. 如請求項1之標記，其中接受手術、加護之患者處於選自由脫水症、腎病症候群、絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、血壓降低所組成之群之狀態。
5. 一種血液分析方法，其係針對接受手術、加護之患者之血液分析方法，且包括如下步驟： 測定血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量；及 將基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值與關鍵期之腎損傷建立關聯。
6. 如請求項5之血液分析方法，其中基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值為比或百分率。
7. 如請求項5或6之血液分析方法，其中接受手術、加護之患者處於選自由脫水症、腎病症候群、絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、血壓降低所組成之群之狀態。
8. 如請求項5至7中任一項之血液分析方法，其係用以進而藉由與腎功能標記之組合而特定出關鍵期之病期或病態。
9. 如請求項8之血液分析方法，其中上述腎功能標記為選自由尿中NGAL、血液中NGAL、尿中IL-18、尿中KIM-1、尿中L-FABP、血液中肌酸酐、尿中肌酸酐、血液中胱抑素C、尿蛋白、尿中白蛋白、尿中β2-MG、尿中α1-MG、尿中NAG、eGFR(肌酸酐、胱抑素C)、血液中脲氮所組成之群中之至少1種標記。
10. 一種血液分析系統，其係包含記憶部、分析測定部、資料處理部、及病態資訊輸出部之用以判定接受手術、加護之患者之關鍵期之腎損傷者，且 上述記憶部記憶用以判定關鍵期之腎損傷之閾值， 上述分析測定部將上述血液中之D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量分離而進行定量， 上述資料處理部將上述患者之基於D-絲胺酸量、或D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值與記憶部所記憶之上述閾值進行比較，判定關鍵期之腎損傷， 上述病態資訊輸出部將關於關鍵期之腎損傷之資訊輸出。
11. 如請求項10之血液分析系統，其中基於D-絲胺酸量及L-絲胺酸量之指標值為比或百分率。
12. 如請求項10或11之血液分析系統，其中接受手術、加護之患者處於選自由脫水症、腎病症候群、絲球體腎炎、急速進行性絲球體腎炎、血壓降低所組成之群之狀態。
13. 一種程式，其係使包含輸入部、輸出部、資料處理部、及記憶部之資訊處理裝置確定關鍵期之腎損傷者，且包含用以使上述資訊處理裝置執行以下內容之指令： 使記憶部記憶自輸入部所輸入之指標值之算出式、及指標值之閾值； 使記憶部記憶自輸入部所輸入之D-絲胺酸、或D-絲胺酸及L-絲胺酸於血液中之量； 使資料處理部讀出所記憶之D,L-絲胺酸於血液中之量及指標值之算出式，算出指標值並使記憶部記憶；及 使資料處理部讀出所記憶之指標值、及指標值之閾值，並將指標值與閾值進行比較，使輸出部輸出關鍵期之腎損傷之有無。

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