CN105779653A

CN105779653A - 用于检测太子参病毒的双重rt-pcr试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN105779653A
Application number: CN201610245431.3A
Authority: CN
Inventors: 匡云波; 叶祖云; 叶炜; 薛俊轶; 刘盛荣; 吴明霞
Original assignee: Ningde Normal University
Current assignee: Ningde Normal University
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-04-20
Also published as: CN105779653B

Abstract

本发明提供一种用于检测太子参病毒的双重RT‑PCR试剂盒及检测方法。试剂盒包含了混装在一起的2对特异引物：TuMV‑F/R和BBWV‑F/R。所述病毒为侵染太子参的两种主要病毒TuMV和BBWV。采用本发明分子诊断试剂盒，通过双重RT‑PCR方法可同时检测这两种病毒，可为太子参病毒病诊断和脱毒检测提供一种更加快速、准确、灵敏的检测方法。

Description

用于检测太子参病毒的双重RT-PCR试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及用于检测太子参病毒的双重RT-PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

太子参（Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax），又名孩儿参、童参，为石竹科太子参属多年生草本药用植物，异叶假繁缕的块根为主要药用部分；收载于中华人民共和国药典中，具有益气健脾，生津润肺之功效。太子参在我国华东、华中、华北和西北等地都有分布，主产于福建、贵州、江苏、山东、安徽等地，尤以福建“柘荣太子参”最为闻名，栽培历史已过百年。

长期以来，太子参均以块根进行无性繁殖，体内侵染并积累了多种病毒，从而导致太子参种性退化，产量下降，品质变逆。太子参病毒病发生普遍、危害严重、防治困难，严重影响了太子参的种植效益和药材质量，已成为太子参产业发展的瓶颈。应用现代生物技术进行太子参的脱毒研究，进而建立脱毒种苗的快繁体系，可以快速获得大量优质脱毒种苗以满足现代工厂化育苗的需要。然而采用各种方法获得的脱毒苗均必须经过严格的检测确定脱毒后才能推广应用。因此，脱毒检测成为太子参无病毒种苗生产的关键环节。此外，本技术还能在植株发病初期对太子参病毒进行快速、准确的检测，可以在病毒侵染初期实施相应的补救措施，避免病害扩散蔓延。

早期学者通过指示植物法、酶联免疫吸附法（ELISA）和电镜技术发现侵染太子参的病毒主要有芜青花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)、蚕豆萎焉病毒(Broad beanwilt virus, BBWV)、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CWV）。目前，在太子参病毒的快速检测方面，仅限于ELISA 法。与传统的植物病毒检测方法相比，RT-PCR检测方法不需要制备抗体，无放射性危险，具有快速、稳定、特异性强、灵敏度高等特点，在植物病毒检测方面有极其广阔的应用前景，已成功应用于植物病毒的检测。多重RT-PCR（Multiplex RT-PCR）可同时检测多种植物病毒，在复合侵染诊断中，不仅可以大大提高检测效率，又可以显著降低试验成本，具有很高的实际应用价值。

截至目前，有关太子参病毒RT-PCR快速检测的研究尚未见报道。在前期工作中，我们分别采用4种病毒的单一RT-PCR方法对不同产地的栽培太子参样品进行了初步检测，结果发现各地太子参样品中主要存在TuMV和BBWV病毒。由于不同物种，不同病毒组合的多重RT-PCR检测体系存在均不同，为保证引物的特异性，灵敏性，最大限度降低假阳性率与漏检率，需要对太子参双重RT-PCR体系的引物设计、组合、模板cDNA、以及PCR体系进行一系列的设计与优化。

发明内容

根据上述领域存在的不足，本发明提供用于检测太子参病毒的双重RT-PCR试剂盒及检测方法,具体是用于同时检测侵染太子参的2种主要病毒，即TuMV和BBWV病毒的双重RT-PCR试剂盒及检测方法。本发明请求保护的技术方案如下。

用于检测太子参病毒的双重PCR试剂盒，包含混装在一起的等比例浓度混合的如下2对引物：

TuMV-F：AGGTGAAAYGCTTGATGCAGGTY；

TuMV-R：GTTHCCATCCARKCCGAACAAAT；

BBWV-F：TTGGGHTCWAGYYTGGGACGYTTRT；

BBWV-R：TTRTARAACTTCTTGCTCCCACGM。

所述病毒为太子参TuMV或BBWV病毒。

用于检测太子参TuMV病毒的PCR试剂盒，包含如下核苷酸序列的引物：

TuMV-F：AGGTGAAAYGCTTGATGCAGGTY；

TuMV-R：GTTHCCATCCARKCCGAACAAAT。

用于检测太子参BBWV病毒的PCR试剂盒，包含如下核苷酸序列的引物：

BBWV-F：TTGGGHTCWAGYYTGGGACGYTTRT。

BBWV-R：TTRTARAACTTCTTGCTCCCACGM。

用于检测太子参病毒的双重PCR方法包括如下步骤：

（1）待测样品总RNA提取，反转录为cDNA模板；

（2）采用以上所述引物，以待测样品cDNA为模板，进行双重PCR，获得扩增产物；

（3）1% 琼脂糖电泳检测2-5μL扩增产物，若出现775 bp大小的阳性条带，则表示样品中含TuMV；若出现1345 bp大小的阳性条带，则表示样品中含BBWV。

所述PCR 反应体系为：cDNA 模板1 μL；两对引物上、下游引物各1 μL（10 μmol/L）；10×Taq Plus Buffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）4 μL；Taq Plus（2.5 U/μL）0.25μL；加ddH₂O至总体积25 μL。

所述PCR 反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，51-57℃退火30 s，72℃延伸85 s；共30-35个循环（图1）；最后72℃延伸10 min。

所述的试剂盒在检测太子参病毒TuMV和BBWV中的应用。

本发明的优点在于：

本发明提供同时检测太子参TuMV和BBWV病毒的PCR试剂盒，将太子参TuMV和BBWV病毒特异性引物进行混装，可以最大限度减少PCR操作过程的交叉污染与误操作。PCR反应条件、模板cDNA浓度直接影响病毒检出效果。退火温度51-57℃（图2，3），30-35个循环，可检出太子参TuMV和BBWV的检测灵敏度相当于10^-5g 病叶组织量（50 ng 病叶RNA），两种病毒在样品浓度稀释 10⁴ 倍后仍能扩增出特异条带（图4）。

附图说明

图1 不同循环数下太子参TuMV病毒的单一RT-PCR扩增。M为DM2000；1、2 循环次数分别为35、30。

图2 不同退火温度下太子参病毒的单一RT-PCR扩增。A. TuMV的RT-PCR检测；B.TuMV的RT-PCR检测。M为DM2000；1～5 退火温度分别为51℃、54℃、57℃、60℃、63℃。

图3 不同退火温度下太子参病毒的双重RT-PCR扩增。M为DM2000；1～4 退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃。

图4 双重RT-PCR扩增的灵敏度检测。M为DM2000；1～5 的cDNA模版浓度分别为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4 _、10^-5倍，6为健康太子参样品的cDNA。

图5 太子参样品的病毒检测结果。1为健康太子参样品；2～4均为福建省病样，5～8分别为江苏省、湖南省、贵州省、山东省太子参病样，M为DM2000；9～11为种胚脱毒的太子参组培苗样品；12为茎尖脱毒的太子参组培苗样品。

具体实施方式

以下通过具体实验便对本发明进行解释，需要解释的是，下述实施例仅作为解释和说明，不构成对本发明的任何限制。

实施例1

植物材料

供试材料为来自福建省柘参西岸生物科技有限公司英山试验基地的福建太子参及江苏、湖南、贵州、山东太子参病样，观察到植株矮小，叶片呈现斑驳花叶，叶片皱缩等明显病毒病症状。以健康太子参样品的cDNA作为阴性对照。叶片经液氮速冻后于-80℃保存备用。

病叶总RNA的提取

采用Trizol试剂（Invitrogen）提取太子参病叶总RNA。采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，采用核酸测定仪测定RNA的浓度。

引物设计

根据所克隆太子参的TuMV、BBWV外壳蛋白基因（CP）的核苷酸序列的保守区域，采用Primer 5.0软件分别设计特异性引物。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成。引物序列和预期目的片段大小见表1。

表1 引物序列、预期目的片段大小

双重 PCR检测

取病叶总RNA 5 μg，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）进行cDNA 第一链的合成（10 μL体系）。以反转录产物为模板，进行PCR扩增，观察不同循环次数及不同退火温度（Ta）对扩增效果的影响。PCR 反应体系为：cDNA 模板1 μL；上、下游引物各1 μL（10 μmol/L）；10×Taq Plus Buffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）4 μL；TaqPlus（2.5 U/μL） 0.25 μL；加H₂O至总体积25 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，51～57℃退火30 s，72℃延伸1 kb/min；共35个循环；最后72℃ 延伸10 min。PCR扩增所采用的试剂为2×Taq Plus PCR Master Mix（TianGen）。取2～5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖（1%）电泳检测，在紫外灯下观察条带亮度以确定最佳退火温度。

以健康太子参样品的cDNA作为阴性对照，在7份不同产地栽培太子参样品中，5份样品扩增到了两条大小分别为1345 bp 和775 bp条带，1份扩增到了大小为775 bp的条带，1份扩增到大小为1345 bp的条带，而采用两种方法进行脱毒处理的4份太子参组培苗均未检测出病毒（图5），与单一RT-PCR的扩增结果一致。结果表明，不同产地栽培太子参中存在TuMV或BBWV单种病毒侵染，或这两种病毒复合侵染的情况；采用胚脱毒和茎尖脱毒这种两种方法可以对太子参进行脱毒处理效果良好。

采用DNA快速纯化回收试剂盒（Solarbio）回收目的片段，以pMD-18T（TaKaRa）连接载体，Escherichia coli （DH5α）感受态（TianGen）对回收片段进行连接、克隆和转化，阳性克隆子送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁德师范学院

<120> 用于检测太子参病毒的双重RT-PCR试剂盒及检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggtgaaayg cttgatgcag gty 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtthccatcc arkccgaaca aat 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttggghtcwa gyytgggacg yttrt 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttrtaraact tcttgctccc acgm 24

Claims

1.用于检测太子参病毒的双重RT-PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的等比例浓度混合如下2对引物：

TuMV-F：AGGTGAAAYGCTTGATGCAGGTY；

TuMV-R：GTTHCCATCCARKCCGAACAAAT；

BBWV-F：TTGGGHTCWAGYYTGGGACGYTTRT；

BBWV-R：TTRTARAACTTCTTGCTCCCACGM。

2.利用权利要求1所述的引物用于检测太子参病毒的双重PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）待测样品总RNA提取，反转录为cDNA模板；

（2）采用权利要求1所述引物，以待测样品cDNA为模板，进行双重PCR，获得扩增产物；

（3）1%琼脂糖电泳检测3-5μL扩增产物，若出现775bp大小的阳性条带，则表示样品中含TuMV病毒; 若出现1345 bp大小的阳性条带，则表示样品中含BBWV病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR 反应体系为：cDNA 模板1 μL；10μmol/L两对上、下游引物各1 μL；10×Taq Plus Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4μL；2.5 U/μL Taq Plus 0.25 μL；加ddH₂O至总体积25 μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR 反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s， 51-57℃退火30 s，72℃延伸85 s；共30-35个循环；最后72℃延伸10 min。

5.一种如权利要求1所述的试剂盒在检测太子参病毒TuMV和BBWV中的应用。