具体实施方式
太子参组织侵染病毒基因组快速鉴定,包括病毒起源vsRNA的快速组装、病毒全长评测、病毒快速克隆、病毒全长基因组真实信息确证等个关键技术体系。本研究以太子参病毒根组织内的病毒鉴定作为具体实施案例,步骤如下:
1. 以病毒侵染组织、发病组织、营养繁殖器官或常规太子参组织内的sRNA的数据作为病毒基因组溯源的基础数据。首选,为了捕获来源于太子参感染花叶病毒的基因组片段,分别利用Velvet(https://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/)、PFOR2(http://staff.ustc.edu.cn/~wuqf/2014plos.htmL)以及VirusDetect(http://virusdetect.feilab.net/)将不同样品sRNA reads组装成Contigs。同时,利用Trinity(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)软件对不同样品内转录本相关片段进行组装。将3个软件所产生的Contigs片段混合,利用CAP3软件(http://doua.prabi.fr/software/cap3)对混合片段进一步进行组装,形成更长片段(LargerContigs)。利用BlastN和BlastX将larger Contigs与NCBI病毒数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/)进行比对,综合BLASTX(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和BLASTN(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)片段结果,去除非病毒来源片段序列,保留比对片段作为候选基因组来源片段(Candiate viurs derived Contigs)。整合分析BLASTN和BLASTX比对结果时,BLASTN权重高于BLASTX,即:BLASTN和BLASTX在数据库比对结果矛盾时,以BLASTN为主。为了充分延伸候选病毒基因组的长度,尽量获取候选太子参病毒基因组完整信息,将所有Contigs片段反向匹配到候选病毒基因组起源片段上,将候选病毒基因组片段与匹配片段混合,利用CAP3进一步组装,获取延伸或非延伸的病毒候选基因组片段。如果片段没有延伸,将其去除作为最终获取的病毒基因组片段,如果片段得到了延伸,将延伸病毒基因组片段继续与所有Contigs片段进行匹配,重复上述步骤,直到片段不能得到延伸未知。将所有经过充分延伸片段混合收集,作为最终候选太子参病毒来源基因组片段集。利用BLASTN将片段集再次与NCBI病毒数据库比对,去除病毒集中假阳性片段信息,保留的序列进一步用CD-Hit(http://weizhongli-lab.org/cdhit _suite/cgi-bin/index.cgi)去除可能的冗余序列,将最终所获取非冗余序列确证为太子参病毒基因组片段。
2. 将上述所获取的病毒片段与NCBI的Nt数据库进行比对,比对E值设为1e-100,抽取出比对结果排列前100的序列。对所获取的序列以此手动检查,滤除可能的非病毒基因组和非全长的病毒基因组序列。利用MUSCL软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)对这100序列进行多重比对,根据比对结果,构建出相应病毒基因组末端保守序列区域,并进行截取。将所获取的候选病毒基因组片段与上述构建的末端保守区进行“Ping”接触式比较,判定所获取基因组片段是否为相应基因组的全长。如果所获取基因组片段能够代表相应基因组全长信息,将相应片段标记为太子参病毒基因组。
3. 采用分段克隆的方法对病毒基因组进行克隆。
根据所获的基因组序列,将序列分为两个片段,即P1和P2片段,对2段设计克隆引物:
P1段克隆引物:
F:agtccagttacgctggagtcAAAAAATATAAAAACTCAACACAACATACAC
R:TGTGTGACCTATTCGCAGAGCGTG
P2段克隆引物:
F:CTCTGCGAATAGGTCACACAGAGAAGG;R:atcattcaggacgagcctcaGTCCCTTGCATCCTATCAAATGTTA
以田间病害侵染高发期的太子参总RNA为模板,以P1和P2的反向重组引物分别用作反转录反应的特异引物进行特异片段的反转录反应。分别用上述P1段和P2段克隆引物对2部分进行克隆。选择较小的克隆载体pSMART来克隆全长候选病毒基因组序列。用特定引物(aaggaggatcaaggcAATGTAATCACCTGGCTCACCTTC和gccttgatcctccttTGGGCCCTCATCAGAGGTTT)将一个DpnI限制性酶切位点插入pSMART载体中。通过PCR反向扩增线性化修饰的pSMART载体。然后,用引物(TGAGGCTCGTCCTGAATGATATC和GACTCCAGCGTAACTGGACTGC)对pSMART载体线性化。其次,用DpnI消化PCR产物,使用同源重组试剂盒(Vayzme, C113-01/02)将P1、P2和线性化pSMART连接到一个完整的载体,用大肠杆菌扩繁后,进行Sanger测序,测序结果如SEQ ID NO.1所示。
3.在pSMART-克隆病毒的基础上,分段克隆所获病毒序列。
本发明为了阻滞非病毒核酸序列掺入病毒基因组,利用含有PolyA和RZ(Ribozyme)序列的Exp-P1.R引物:
gactcgtcagtgtactgatataagtacagacTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTGTCCCTTGCATCCTATCAAATGT引物;结合上述克隆引物CTCTGCGAATAGGTCACACAGAGAAGG扩增候选病毒克隆中P2的部分。
P1部分使用引物:
Exp-P1:GTTCATTTCATTTGGAGAGGAAAAAATATAAAAACTCAACACAACATACAC
和上述克隆引物TGTGTGACCTATTCGCAGAGCGTG。
产物用DpnI酶进行12h消化,以减弱反向扩增后环状质粒带来的假阳性影响。PCR反应混合液中增加dNTP用量,反应程序中延长彻底延伸时间,增加长引物扩增中的保真度。为了降低PhMV与表达载体连接后片段过大的问题,选择目前表达载体骨架相对较小的pCB301过表达载体为基本骨架,构建PhMV侵染克隆的表达载体。
使用下列引物对进行反向PCR克隆表达载体pCB301的核心部分,以实现表达载体的线性化。
pCB301-LinZ-F:tatcagtacactgacgagtccctaaaggacgaaacGGTACCCGGATGTGTTTTCCG
pCB301-LinZ-R:CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
使用同源重组将三种纯化的产物即线性化的pCB301, P1(ExpP1段)和P2(ExpP2段)连接形成一个完整的、含特定病毒的pCB301-太子参花叶病病毒表达载体。将上述片段按同源重组试剂盒说明书进行重组连接,采用DH10B大肠杆菌感受态进行转化。
4. pCB301-太子参花叶病病毒表达载体转入GV3101农杆菌,在100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的双重抗性条件筛选阳性菌落。具体步骤如下:(1)加入1 μl质粒于GV3101感受态中,冰上静置5 min、液氮冷冻5 min。(2)在37℃水浴锅中复苏5 min,再次在冰上静置5 min。(3) 在无菌条件下加入700 μl-800 μl无抗性LB到上述感受态细胞内,在28℃,180 rpm条件下孵育2-3 h。(4)在 5000 rmp条件下离心1 min,取100 μl于(卡那+利福平)上,在28℃条件下倒置培养48 h。(5) 挑取阳性单菌落在,5 mL(LB液体Kan+Rif)28℃、180 rmp条件下摇菌24 h。(6) 取1 mL菌液,在50mL液体LB(Kan+Rif)中放大培养,培养至浓度(OD600)达到1.0时,在4000 rpm条件下离心10 min,收集农杆菌的菌体。将上述农杆菌重悬于10 mM MES,pH 5.6、10 mM MgCl2和200 μM AS的侵染液内。用去掉针头的注射器,吸取浸染液,采用浸润法注射本氏烟的叶片。具体步骤如下:取容积为 1mL的注射器,移处注射器针头,用手固定住待侵染叶片,用注射器头轻轻摩擦叶片,然后,用力将侵染液体浸润、延展至整个叶片。观察侵染结果发现明显侵染特征。如图2所示,被太子参花叶病病毒克隆感染的本氏烟草的叶子在侵染后第3天开始出现典型的花叶病毒症状;第5天时,新叶中叶片出现卷曲;第12天时叶片边缘向背卷曲且叶脉褪绿;第22天时,植株叶片褪绿更为严重,叶片边缘有明显的扭曲且向背卷曲,而同时期的对照的叶片更光滑(图2)。如图3所示,进一步利用已经克隆的太子参花叶病的病毒基因组的外壳蛋白区域信息,设计一对特异检测引物(F:CACCTAATCCTATACACGCCAGAG; R:TCCATCCAAGCCGAACAAAT)。利用这对特异引物对4个被侵染烟草内叶片内的太子参花叶病进行分子检测,结果在4个侵染的本氏烟植株的叶片内均可以清晰的侵染检测出太子参花叶病基因组信息,表明从侵染后第3天开始,太子参花叶病已经成功侵染入了受体植物本氏烟,也侧面的证明了通过本发明所克隆的基因组信息的准确性和有效性(图3)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
福建天人药业股份有限公司
焦作市玖道种苗繁育有限公司
泰宁县古农堂生物科技有限公司
<120> 药用太子参病毒基因组全长快速鉴定、克隆技术
<130> 15
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9839
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaaaatata aaaactcaac acaacataca caaaacgatt aaagcaaaca caaatatttc 60
aaagcattca agcaatcaaa atattttctt ttaaatcttt cattgttacc aaagcaatca 120
ccaacaacga atcaaatggc aacagttaca ttcgcgtcag ctatcaccaa cgccaccacc 180
aacaaaccag cactcaccgg aatggtacaa tttgggagtt tcccaccagt gccattgcga 240
tccaccaccg ctattacagt tgccacttca gtggcgcaac ctaaactgta cacagtgcag 300
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tgctttctcg catatcgtag tgacaatcgt gaacacacat gctattcagg gctagacgtc 1320
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atcaacaaac taaacgcaat attgatcaag ggggccacag cgacaggaga ggaattctcg 1680
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acattaatgt gtgacaacca gctcgatagg aatggaaatt tcatatgggg tgagagaggg 1860
taccatgcaa aacgattctt tagcaactat tttgagataa tcgatccgaa gaaaggctac 1920
acccagtatg agacaagagc ggtgcctaat gggtcacgga aacttgcaat cggcaaacta 1980
atagtcccaa caaacttcga agttttaagg gaacaaatga aaggcgaacc agtagaaccg 2040
tacccagtaa cagtcgaatg tgtgagtaaa ttacagggtg acttcgtcca cgcatgttgt 2100
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cacctagtga ttggtaacag cggcgatcca aagtacatag atctccctga gatcgaggag 2220
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gctaatgtta atgggtcagg tgacgcagcc tcgcgcgcgt gtgacagatt catgggcatg 3000
cttttgcaca tggcagaacc aaactgggag cttgcggatg gtggatacac aattctgaga 3060
gatcatagca tctccatttt agaaaaaagt tatctacaaa tcttggacga agcatggaac 3120
gagttaagtt ggtcggagcg ctgtgctata agatactact cgtcaaagca agcaattttt 3180
acacagaaag atttgccaat gaaaagcgac gtcgatttag gcggcagata cagcgtgtca 3240
gtcatgtcat cttacgaatg gagtaagcga tgtatgaaaa gcgtatactc tagaataggc 3300
agtaaattac gtagtagtat gtcttggact agtagcaagg tatcgaatag tgtgtataag 3360
actataaatt atttagtacc agatgtgctc aagtttatta acgtgcttgt ttgtatcggc 3420
atactaatta cgatggctgc tgaggcgaat cgcatcgtca tcacgcaaag gaggctcaaa 3480
ctggatgtcg aagagacaga gcgcagaaaa gcagaatggg agcttgcatt ccaccacgcc 3540
attctgacac agagtgcagg tcaacaccca acgatagatg agttcagagc atacatcgct 3600
gacaaagcac cacatctaag taagcatatc gagcctgaag aaaaggtagt agttcatcaa 3660
gcgaagagac aatccgagca agagctcgag cgcataatag catttgttgc attggtgctc 3720
atgatgtttg atgcagaacg aagcgattgt gtcacaaaga tcctcaacaa gcttaaggga 3780
ctagttgcca ctgtggaacc tacagtctac catcagactc ttaatgatat agaagatgat 3840
ttgaatgaga ggaacctctt catcgatttt gaacttagca gcgacggcga catgctccaa 3900
cagcttccag ccgaaaagac atttgcctca tggtggaatc atcaactaag tagaggattc 3960
acaatcccac attacagaac agaagggaag ttcatgactt ttactagagc aactgccacg 4020
gaagtcgcag gtaaaatagc acacgagagt gacaaagata tattgctaat gggagcagta 4080
ggatcaggta agtcaactgg cttgccttat catctctcca gaaaagggaa tgtattgctc 4140
cttgagccga ctcggccact tgcagaaaac gtacacaagc agttgtcgca ggcgccattt 4200
catcagaaca caactcttag gatgcgcgga ctaacggcat ttggatcggc accaatttca 4260
gtgatgacta gtggttttgc actcaattac tttgcaaaca acagaatgcg aattaaagag 4320
tttgactttg tcatatttga tgaatgtcac gttcatgacg ccaacgcaat ggcgatgaga 4380
tgtttgctac atgaatgtga ttattctggc aaaattatca aagtttcagc cacaccacca 4440
ggtcgagaag ttgagttctc tactcaatac cctgtatcga taagcacaga agacacacta 4500
tcgtttcaga attttgtgaa cgcacagggt agtggaagca attgtgatgt aatttcaaaa 4560
ggagacaata tcctcgtgta tgtagcaagc tacaatgagg tagatgcgct ttcaaaactt 4620
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ccataccttg atacagacag cagaatgctt agcacaacaa agacaagcat caattatggg 4860
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gagcatttct ttggtgatgc ctacacaaag aaagggaaga gtaagggcag gacacgtggt 6060
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agggattact tcgctgagtt cacacccgag atgaaagaag aaatactgaa acaaagttgt 7680
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agagctcctt ggagcgttgg catgacaaag ttttattgtg gttgggatca cttgttggag 7920
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gtagacaaca cgctcatggt catactggca gtcaactatt cactcaagaa aagtggaatt 8220
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gttggtacaa cggtagagaa cacggagagg catacgaccg aggacgttaa tcggaacatg 9600
cataacttac ttggcgttaa ggggttatga agttgtatgc tggtagacta taagtattta 9660
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tagcgcatgt ggtgaggatt gtcctcgatt gccttaacat ttgataggat gcaagggac 9839
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