CN105777803A - 具有还原响应性两亲磷脂分子及其在药物缓释中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物载体设计领域，特别涉及一种具有还原响应性两亲磷脂分子及其在药物缓释中的应用。本发明以正构烷基硫醇为起始原料，首先将其通过2,2'‑二硫二吡啶活化，并进一步与巯基丙酸反应得到在Δ3位含有二硫键的脂肪酸；该羧酸在缩合剂存在下与1‑十六酰‑sn‑丙三醇‑磷酸胆碱发生酯化反应，得到甘油2‑羟基酯的在Δ3位含有二硫键的两亲磷脂分子。该类磷脂分子可以通过简单的有机单元反应制备得到，由其制备的磷脂囊泡也具有良好的药物包覆与控释能力。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体设计领域，特别涉及一种具有还原响应性两亲磷脂分子及其在药物缓释中的应用。
背景技术
刺激响应型磷脂分子是近年来新型药物载体设计的主要方向之一。在两亲性的磷脂分子结构中引入具有环境响应性的单元，可以使得磷脂囊泡在受到特定的物理、化学或生物刺激时发生结构上的相变、化学结构的异构或解离，进而导致载药的释放。通过在磷脂分子的结构中引入不同种类的刺激响应单元，以及调节响应单元在的磷脂中的位置，可以实现不同类型刺激相应囊泡的制备。
具有还原响应性刺激的囊泡在药物控释中具有重要的地位，近年来，多个课题组开发出了含有具有还原响应性单元的两亲分子，来作为药物包裹与控释的研究模型。人们通过在两亲分子中引入二硫键、醌和二茂铁等还原性官能团来实现囊泡的还原刺激性。目前报道的还原响应型囊泡的合成均十分繁琐，分离纯化十分困难。此外，受限于合成手段，许多课题组将还原性官能团修饰在两亲分子头基或亲水-疏水连接部分，客观上限制了不同种类还原剂的使用。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，为了简化该类分子的合成路线，拓宽还原剂的适用范围，我们发展了一类高效合成含有还原性二硫键的两亲磷脂分子的方法，通过简单的路线，将二硫键引入到磷脂分子的疏水链部分，在简化合成路线的同时实现了多种还原剂的刺激释放。
本发明的技术方案是：
一种具有还原响应性两亲磷脂分子，其具有如式(I)所示的两亲性结构，即
本发明的另一个目的在于公开上述具有还原响应性两亲磷脂分子的制备方法，以正构烷基硫醇为起始原料，首先将其通过2,2'-二硫二吡啶活化，并进一步与巯基丙酸反应得到在Δ3 位含有二硫键的脂肪酸；该羧酸在缩合剂存在下与1-十六酰-丙三醇-磷酸胆碱发生酯化反应，得到甘油2-羟基酯的在Δ3位含有二硫键的两亲磷脂分子。
具体的步骤如下：
步骤a：将十二烷基硫醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，冰浴搅拌加入2,2'-二硫二吡啶，反应液在0℃搅拌下1小时后自然升至室温，继续搅拌24小时，结晶，得到化合物2；
步骤b：化合物2和巯基丙酸溶于二氯甲烷中，室温搅拌下滴加三乙胺，反应于室温下搅拌12小时，滤除不溶物，得到化合物3；
步骤c：化合物3和1-十六酰-丙三醇-磷酸胆碱分散在二氯甲烷中，室温搅拌下加入二环己基碳二酰亚胺和N,N-二甲基-4-氨基吡啶，反应于室温下搅拌48小时；结晶，得到甘油2-羟基酯的在Δ3位含有二硫键的两亲磷脂分子。
本发明的第三个目的在于公开上述的两亲磷脂分子在药物缓释中的应用。
本发明的第四个目的在于公开一种载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将两亲性磷脂分子置于圆底烧瓶中，加入三氯甲烷和甲醇的混合溶剂，使磷脂分子完全溶解；缓慢旋除溶剂，使磷脂分子在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜；
步骤2：将附着有均匀磷脂膜的烧瓶在避光情况下抽真空16小时，向烧瓶中加入溶解有5(6)-羧基荧光素(CF)的磷酸钠缓冲液，在60℃水浴下轻轻振荡使得磷脂膜从烧瓶内壁上剥离；
步骤3：将该悬浊液转移:具塞离心管中，交替置于液氮和60℃水浴锅中，每次时间5分钟；该循环进行12次，得到具有包覆有荧光染料的囊泡溶液。
本发明的有益效果是：
1、本发明公开的磷脂分子制备的囊泡，在多种不同浓度水溶性还原剂的作用下表现出了不同的控释速率，具有重要的理论意义和临床价值。
2、该方案通过简单的硫醚化和酯化等标准的有机单元反应来高效制备含有二硫键的磷脂分子。
3、我们通过核磁和质谱对合成中间体及最终产物进行了结构和纯度的表征，并通过冷冻透射电镜证实了囊泡的形貌和尺寸，证实了囊泡的存在和结构细节；同时考察了不同类型的还原剂在不同浓度下对负载药物释放速率的影响。实验结果表明该类磷脂分子可以通过简单的有机单元反应制备得到，由其制备的磷脂囊泡也具有良好的药物包覆与控释能力。
附图说明
附图1为本发明具体实施例的化合物2的核磁共振氢谱；
附图2为本发明具体实施例的化合物2的质谱；
附图3为本发明具体实施例的化合物3的核磁共振图谱；
附图4为本发明具体实施例的化合物3的质谱；
附图5为本发明具体实施例的化合物4的核磁共振图谱；
附图6为本发明具体实施例的化合物4的质谱；
附图7为本发明具体实施例的还原响应型囊泡的性能冷冻透射电镜照片；
附图8为本发明囊泡在不同浓度的二硫苏糖醇存在下的释放曲线；
附图9为本发明囊泡在不同浓度的三羧乙基膦存在下的释放曲线；
附图10为本发明囊泡在不同浓度的谷胱甘肽存在下的释放曲线。
具体实施方式
本发明的具体实施方式如下：
合成路线：a.2,2'-二硫二吡啶，三乙胺，0℃；b.巯基丙酸，三乙胺，二氯甲烷，25℃；c.1-十六酰-丙三醇-磷酸胆碱，二环己基碳二酰亚胺，二氯甲烷，25℃。
步骤a：20克十二烷基硫醇和10克三乙胺溶于200毫升二氯甲烷中，冰浴搅拌加入88克2,2'-二硫二吡啶于100毫升于二氯甲烷中的溶液，反应液在0℃搅拌下1小时后自然升至室温，继续搅拌24小时。反应结束后，浓缩反应液至大量结晶出现，抽滤，滤饼加入200毫升正己烷洗涤，合并滤液后用50毫升冰乙醚结晶，得到25克化合物2(淡黄色固体)，收率 79％；
步骤b：15.5克化合物2和5.3克巯基丙酸溶于100毫升二氯甲烷中，室温搅拌下滴加10克三乙胺，反应于室温下搅拌12小时，滤除不溶物，滤液以饱和氯化铵溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。得到14.9克化合物3(黄色蜡状固体)，收率98％。
步骤c：3.0克化合物3和2.5克1-十六酰-丙三醇-磷酸胆碱分散在100毫升二氯甲烷中，室温搅拌下加如4.2克二环己基碳二酰亚胺和1.0克N,N-二甲基-4-氨基吡啶，反应于室温下搅拌48小时。反应液浓缩至20毫升，滤除不溶物，滤液加入6毫升甲醇和24毫升水，再次过滤除去不溶物。滤液经过旋转蒸发除掉，残余物溶于15毫升无水甲醇和5毫升无水乙醚中，重结晶得到淡黄色粉末状固体2.5克，收率64％。
所有有机分子的结构和纯度均由核磁共振氢谱和电喷雾解离质谱来确定。核磁型号为Bruker AMX 400 Spectrometer(500MHz)，质谱型号为Agilent 6510 Q-TOF。如图1-6。
化合物2的核磁共振氢谱。1H-NMR(CDCl3),400MHz:8.45-8.46(m,1H,ArH),7.66-7.74(s,mH,ArH),7.62-7.64(m,1H,ArH),7.06-7.09(m,1H,ArH),2.77-2.81(t,J＝8.0Hz,2H,CH2S),1.67-1.70(m,2H,CH2),1.36-1.39(m,2H,CH2),1.25-1.36(m,16H,CH2),0.86-0.90(m,3H,CH3)。
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化合物3的核磁共振氢谱。1H-NMR(CDCl3),400MHz:2.89-2.90(m,2H,CH2S),2.81-2.83(m,2H,CH2S),2.67-2.71(m,2H,CH2COOH),2.77-2.81(t,J＝8.0Hz,2H,CH2S),1.65-1.67(m,2H,CH2),1.26-1.37(m,18H,CH2),0.86-0.90(m,3H,CH3)。
化合物3的质谱。C15H30O2S2,calc 306.1087,dete 329.1641(M+Na+),289.1709(M-OH)
化合物4的核磁共振氢谱。1H-NMR(CDCl3),400MHz:4.11-4.64(m,5H,glycol-H),3.97-3.99(m,2H,CH2N),3.80-3.84(m,2H,CH2O),3.40(s,9H,CH3),2.87-2.89(m,2H,CH2S),2.79-2.81(m,2H,CH2S),2.68-2.71(m,2H,CH2COOH),2.77-2.81(t,J＝8.0Hz,2H,CH2S),2.28-2.29(m,2H,CH2CO),1.58-1.66(m,4H,CH2),1.26-1.37(m,42H,CH2),0.86-0.90(m,6H,CH3)。
化合物4的质谱。C39H78NO8PS2,calc 783.4906,dete 784.4850(M+H+),806.4648(M+Na+)
载药囊泡的制备以及不同类型还原剂的刺激释放：
将20mg磷脂分子置于50mL干净圆底烧瓶中，加入9mL三氯甲烷和1mL甲醇的混合溶剂，使磷脂分子完全溶解。将旋蒸水浴温度调节在35℃左右，缓慢旋除溶剂，使磷脂分子在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜。
将附着有均匀磷脂膜的烧瓶在避光情况下抽真空16小时，除去残留的有机溶剂。向烧瓶 中加入溶解有100mM 5(6)-羧基荧光素(CF)的10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.4)，在60℃水浴下轻轻振荡使得磷脂膜从烧瓶内壁上剥离。将该悬浊液转移至15mL具塞离心管中，交替置于液氮(-170℃)和60℃水浴锅中，每次时间5分钟。该循环进行12次，得到具有包覆有荧光染料的囊泡溶液。未被囊泡包覆的染料经由Sephadex G50柱分离除去。包裹了荧光分子的囊泡形貌如图7所示。
选择二硫苏糖醇(DTT)，三羧乙基膦(TCEP)和谷胱甘肽(GSH)等三种还原剂来调节囊泡对负载物的可控释放，还原剂的浓度梯度设置为2mM，5mM，和10mM。还原机理如下：
释放曲线见图8-10。
由图8-10中的释放曲线可以看出，还原刺激性磷脂分子制备的囊泡在多种还原剂的存在下均表现出了良好的控释能力。通过向体系中加入不同浓度含有巯基的还原剂二硫苏糖醇，我们观察到了囊泡中药物模型的不同释放速率。当选用不含巯基的三价膦还原剂三羧乙基膦时，药物模型的释放速率明显要高于二硫苏糖醇作为还原剂时的速率，这是由于三羧乙基膦不仅可以还原囊泡结构中的二硫键，还可以通过改变pH来降低囊泡结构的稳定性。含有巯基的谷胱甘肽分子的还原性相对较弱，这是由于其较大的体积和氨基酸分子间的构型影响了巯基的还原活性，但是在足够长的作用时间下，谷胱甘肽仍然可以刺激该类囊泡实现可控释放。由此，我们可以通过选择不同浓度和不同类型的还原剂，来实现对该类囊泡负载药物的可控释放。
Claims (5)
1.一种具有还原响应性两亲磷脂分子，其具有如式(I)所示的两亲性结构，即
2.一种权利要求1所述的具有还原响应性两亲磷脂分子的制备方法，其特征在于，以正构烷基硫醇为起始原料，首先将其通过2,2'-二硫二吡啶活化，并进一步与巯基丙酸反应得到在Δ3位含有二硫键的脂肪酸；该羧酸在缩合剂存在下与1-十六酰-丙三醇-磷酸胆碱发生酯化反应，得到甘油2-羟基酯的在Δ3位含有二硫键的两亲磷脂分子。
3.根据权利要求1所述的具有还原响应性两亲磷脂分子的制备方法，其特征在于，具体的步骤如下：
步骤a：将十二烷基硫醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，冰浴搅拌加入2,2'-二硫二吡啶，反应液在0℃搅拌下1小时后自然升至室温，继续搅拌24小时，结晶，得到化合物2；
步骤b：化合物2和巯基丙酸溶于二氯甲烷中，室温搅拌下滴加三乙胺，反应于室温下搅拌12小时，滤除不溶物，得到化合物3；
步骤c：化合物3和1-十六酰-sn-丙三醇-磷酸胆碱分散在二氯甲烷中，室温搅拌下加入二环己基碳二酰亚胺和N，N-二甲基-4-氨基吡啶，反应于室温下搅拌48小时；结晶，得到化合物4。
4.一种具有还原响应性两亲磷脂分子在药物缓释中的应用。
5.一种载药囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将两亲性磷脂分子置于圆底烧瓶中，加入三氯甲烷和甲醇的混合溶剂，使磷脂分子完全溶解；缓慢旋除溶剂，使磷脂分子在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜；
步骤2：将附着有均匀磷脂膜的烧瓶在避光情况下抽真空16小时，向烧瓶中加入溶解有5(6)-羧基荧光素(CF)的磷酸钠缓冲液，在60℃水浴下轻轻振荡使得磷脂膜从烧瓶内壁上剥离；
步骤3：将该悬浊液转移:具塞离心管中，交替置于液氮和60℃水浴锅中，每次时间5分钟；该循环进行12次，得到具有包覆有荧光染料的囊泡溶液。
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