CN103965420A

CN103965420A - 一种基于二硫键还原响应型可降解药物载体及其制备和应用

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Publication number: CN103965420A
Application number: CN201410144592.4A
Authority: CN
Inventors: 袁建超; 陈静静; 慕燕琼; 许卫兵; 赵杰
Original assignee: Northwest Normal University
Current assignee: Northwest Normal University
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2034-04-11
Also published as: CN103965420B

Abstract

本发明提供一种基于二硫键还原响应型的可降解药物载体，该药物载体是将聚己内酯和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺通过RAFT聚合而形成的嵌段共聚物，该嵌段聚合物在水中能自组装形成胶束，通过物理包埋作用将药物分子5-氟尿嘧啶载入载体纳米粒子的核层，可大幅提高药物溶解度，延长循环时间，血管渗透性增强效应（即EPR效应增强）被动靶向至肿瘤组织，二硫键在还原环境的细胞内断裂而降药物释放于靶点部位，减少副作用，改善药物生物利用度；同时该嵌段聚合物体现出良好的生物相性和可降解性，从而减少了对正常组织的伤害，是一种具有应用前景的纳米药物载体。

Description

一种基于二硫键还原响应型可降解药物载体及其制备和应用

技术领域

本发明属于高分子化学领域，涉及一种基于二硫键还原响应型的可降解药物载体；本发明同时还涉及该药物载体的制备方法；本发明还涉及该载体对抗癌药物5-氟尿嘧啶的缓释作用及5-氟尿嘧啶载药胶束的制备。

背景技术

药物控释载体可有效控制药物治疗剂量和药物在体内病灶部位的选择性释放，具有毒副作用低、给药剂量小、良好生物利用度、稳定性、更长的半衰期等特点。还原响应型药物载体以其高效快速释放药物、毒副作用小、可生物降解的优良特性，逐渐成为药物载体领域研究的热点，也是最具临床应用潜力的智能药物载体之一。

5-氟尿嘧啶（5-FU）抗癌谱较广，可用于治疗消化道肿瘤、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌及卵巢癌等。5-FU已应用于对铂类及紫杉醇类耐药的晚期复发卵巢癌的治疗中，多为联合其他抗肿瘤药物或制备成 5-FU 缓释剂局部给药。5-FU在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5F-dUMP ），而抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸（dUMP ）甲基化转变为脱氧胸苷酸（dTMP），从而影响 DNA 的合成。此外，5-FU 在体内可转化为 5-氟尿嘧啶核苷，以伪代谢产物形式掺入 RNA 中干扰蛋白质的合成，故对其他各期细胞也有作用。

二硫键具有如下特点：在人体的正常体温、pH 和氧化等环境下非常稳定，在一定量的谷胱甘肽（GSH）还原酶或二硫苏糖醇（DTT）等还原剂存在下被还原生成巯基。细胞内外恰好存在氧化还原电位，细胞内的谷胱甘肽浓度（0.5～10 毫摩尔每升）是细胞外谷胱甘肽浓度（2～20微摩尔每升）的200倍以上，细胞外的谷胱甘肽浓度不足以还原二硫键。另外，肿瘤组织细胞比正常组织细胞缺氧，更具有还原性环境。因此，含有二硫键的药物和载体通过细胞内吞作用进入靶细胞后被 GSH 还原，即二硫键断裂生成巯基，从而有效快速地释放药物，并扩散到细胞核等杀死癌细胞。

载体材料聚己内酯(PCL)可生物降解，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）具有良好的生物相容性，对细胞毒副作用小，输送药物至靶细胞后便可分解或经其他组织代谢排出体外，是理想的药物载体。

发明内容

本发明的目的是利用聚己内酯和二硫键的特点，提供一种基于二硫键还原响应型药物载体。

本发明的另一目的是提供一种基于二硫键还原响应型药物载体的制备方法。

本发明还有一个目的，就是提供一种5-氟尿嘧啶载药胶束的制备方法。

一、基于二硫键还原响应型可将降解的药物载体

本发明基于二硫键还原响应型可将降解的药物载体，是将聚己内酯和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺通过RAFT聚合而形成的一种嵌段共聚物。其结构式如下：

式中，m=46～56 mol%，n=44～54 mol%；数均分子量M_n= 12900～13700 g/mol，M_w/M_n=1.18～1.23。

本发明的嵌段共聚物，由两个功能部分组成：（1）聚HPMA亲水段为聚合物纳米粒子的壳层；（2）含有二硫键的聚己内酯作为疏水部分构成可还原降解的核层。这种嵌段聚合物在水中能自组装形成胶束，通过物理包埋作用将药物分子（如5-氟尿嘧啶）载入载体纳米粒子的核层，大幅提高药物溶解度，延长循环时间，血管渗透性增强效应（即EPR效应增强）被动靶向至肿瘤组织，二硫键在还原环境的细胞内断裂而降药物释放于靶点部位，减少副作用，改善药物生物利用度。而且高分子载体HPMA和聚己内酯PCL也降低了抗癌药物的毒性，同时体现出良好的生物相性和可降解性，从而减少了对正常组织的伤害，是一种具有应用前景的纳米药物载体。

本发明基于二硫键还原响应型药物载体的制备方法，包括以下工艺步骤：

（1）聚己内酯（PCL-SS-PCL）的制备：氮气保护下，以甲苯为溶剂，锌酸亚锡为催化剂，ε-己内酯与双（2 - 羟基乙基）二硫醚以54:1～ 60:1的摩尔比，于 100～ 110℃下聚合18～ 24小时；聚合反应完后用二氯甲烷稀释、甲醇沉淀，过滤，洗涤，干燥即得；其结构式为：

所述催化剂锌酸亚锡的用量是ε-己内酯质量的1～ 2%。

（2）聚己内酯大分子RAFT试剂（DMP-PCL-SS-PCL-DMP）的制备：以二氯甲烷为溶剂，使聚己内酯（PCL-SS-PCL）、2-(十二烷硫基硫羰基硫基)-2-甲基丙酸（DMP）、4-(二甲基氨基)吡啶（DMAP）和N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC），在室温下避光搅拌反应24～ 48小时；过滤除去副产物二环己基脲，滤液浓缩后用甲醇沉淀，过滤、真空干燥，即得产物。其结构式为：

所述PCL-SS-PCL、DMP、DMAP和DCC投料的摩尔比是1:4:1:4.8～ 1:6:2:8。

（3）目标嵌段共聚物（PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA）的制备：氮气气氛下，以THF为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂， DMP-PCL-SS-PCL-DMP与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺以1:40～ 1:60的摩尔比，于50～ 60℃下进行RAFT聚合反应16～ 24小时，反应结束后，用正己烷沉淀，过滤，再用无水甲醇溶解沉淀物，然后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心，除去小分子即得目标高分子共聚物。其结构式为：

引发剂偶氮二异丁腈的用量为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺摩尔量的0.5～ 1%。

本发明制备基于二硫键还原响应型药物载体的化学合成式如下：

图1为上述方法制备的基于二硫键还原响应型药物载体核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，RAFT聚合得到的高分子聚合物，化学位移在3.97 ppm和2.31 ppm处有PCL上的特征峰-CH₂-(与-COO-相连)和-CH₂-(与-OCO-相连)，化学位移在3.70 ppm和2.81 ppm左右会出现HPMA上的特征峰-CH-（和-OH相连）和-CH₂（和-NH-相连），同时化学位移在5-6 ppm之间没有出峰，说明用上述方法共聚得到的产物与前面设计的结构一致。

图2为本发明制备的基于二硫键还原响应型药物载体的DLS图。结果显示：本发明制得的5-FU纳米粒粒径分布较窄，且基本呈正态分布，平均粒径为95nm，多分散性指数为0.22。

图3为本发明制备的基于二硫键还原响应型药物载体的TEM图。从图中可以看出，5-FU 纳米胶束呈核-壳型结构，球形或椭圆形，粒度大小较一致。

二、5-氟尿嘧啶载药胶束的制备及缓释实验

5-氟尿嘧啶载药胶束的制备：将PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA和5-氟尿嘧啶以1:1～ 1:2的质量比充分溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在剧烈搅拌下缓慢滴加至磷酸缓冲液中，继续搅拌10～ 12小时（过夜），然后在磷酸缓冲液中透析24～ 48小时，得到载药胶束溶液。

体外模拟药物释放实验：用二硫苏糖醇（DTT）进行体外模拟5-氟尿嘧啶释放实验。分别量取1mL载药胶束溶液，置预先处理好的透析袋（分子量截留3500）中，分别在20mL磷酸缓冲液（pH 7. 4，50 mM）和20毫升10 mM DTT的磷酸缓冲液（pH 7. 4，50 mM）中透析，将其置于水浴振荡器中，温度37℃，振荡频率为每分钟100次。分别于1、2、3、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120小时取透析袋外液5mL在276 nm处测定紫外-可见吸光度，同时补入5mL同温度的新鲜释放介质。根据5-氟尿嘧啶的标准曲线方程，计算其浓度和累积释放量。5-氟尿嘧啶在各时间点的累积释放百分率（Q）计算公式为：

式中为各时间点测得释放介质中5-FU的浓度（mg·mL^-1），为投入的5-FU纳米粒的总重量（mg），V₀为释放介质的总体积，V为每次取样体积，X为测得5 - FU纳米粒的载药量（%）。

释放结果为：5-氟尿嘧啶在10 mM二硫苏糖醇（DTT）的释放介质中于1、2、3、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120小时的累积释放百分率分别为2.3、6.1、 9.8、 12.7、 18.4、 26.2、 45.4、56.3、64.7、71.5、78.9、83.8、89.5、93.6、95.2%；5-氟尿嘧啶在PBS缓冲液介质中于1、2、3、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120小时的累积释放百分率分别为0.15、0.42、 0.63、 0.96、 1.2、 1.7、 2.9、3.7、4.2、4.7、5.2、5.6、5.8、6.1、6.4%。

图4为5-氟尿嘧啶载药胶束的体外模拟释放曲线。由图4可知该载药胶束在PBS介质中释放较为缓慢，120小时累计释放量仅为6.4%，而在加有还原剂二硫苏糖醇（DTT）的释放介质中，释放速率明显加快，累计释放量达到95.2%。以上现象说明该载药胶束具有一定的缓释作用，并且对DTT（或GSH）有良好的还原敏感响应性，能有效刺激药物在肿瘤部位的释放。

综上所述，本发明的嵌段共聚物在水中能自组装形成胶束，通过物理包埋作用将药物分子（如5-氟尿嘧啶）载入载体纳米粒子的核层，大幅提高药物溶解度，延长循环时间，血管渗透性增强效应（即EPR效应增强）被动靶向至肿瘤组织，二硫键在还原环境的细胞内断裂而降药物释放于靶点部位，减少副作用，改善药物生物利用度。而且高分子载体HPMA和聚己内酯PCL也降低了抗癌药物的毒性，同时体现出良好的生物相性和可降解性，从而减少了对正常组织的伤害，是一种具有应用前景的纳米药物载体。

附图说明

图1为本发明制备的基于二硫键还原响应型嵌段共聚物的核磁共振氢谱。

图2为本发明制备的基于二硫键还原响应型药物载体的DLS粒径分布图。

图3为本发明制备的基于二硫键还原响应型药物载体的TEM图。

图4为发明制备的5-氟尿嘧啶载药胶束的体外模拟释放曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明基于二硫键还原响应型药物载体的合成及结构表征作进一步的说明。

实施例1

（1）聚己内酯（PCL-SS-PCL）的制备氮气保护下，将ε-己内酯（4.28克，37.50毫摩尔）、双（2-羟基乙基）二硫醚（106毫克，0.69毫摩尔）和锌酸亚锡（48毫克，0.12毫摩尔）溶解于10mL甲苯中， 110℃下聚合24小时。聚合反应完后加入15毫升二氯甲烷稀释，然后在剧烈搅拌下滴加到200毫升冷甲醇中沉淀，滤出固体，用150毫升冷甲醇洗涤数次，室温减压干燥，得PCL-SS-PCL 产物3.19克，产率74.5%。

M_n=5050g/mol，M_w/M_n=1.39。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm):1.38-1.67 (-OCH₂CH ₂CH ₂CH ₂CH₂COO-), 2.31 (-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH ₂COO-), 2.92 (-OCH₂CH ₂ -SS-), 3.65 (HOCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂COO-), 4.06(-OCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂COO-), 4.34 (-OCH ₂CH₂-SS-)。

（2）聚己内酯大分子RAFT试剂（DMP-PCL-SS-PCL-DMP）的制备：称取PCL-SS-PCL（0.505克，0.1毫摩尔）、DMP（0.146克，0.40毫摩尔）和DMAP（12毫克，0.10毫摩尔）溶解于10毫升二氯甲烷中并冷却至0℃。然后，将DCC（99毫克，0.48毫摩尔）溶解在5毫升二氯甲烷中，滴加至反应混合物中，室温下避光搅拌反应48小时。将副产物二环己基脲过滤除去，滤液浓缩，在剧烈搅拌下加入到冷的甲醇中沉淀，过滤、真空干燥。得产物DMP-PCL-SS-PCL-DMP 0.423克，产率83.8％。

M_n=5396g/mol，M_w/M_n=1.36。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm)：0.88(CH ₃C₁₁H₂₂S-(C=S)-S-),1.38(-OCH₂CH₂CH ₂CH₂CH₂COO-), 1.65(-OCH₂CH ₂CH₂CH ₂CH₂COO-), 2.31(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH ₂COO-), 2.92(-OCH₂CH ₂ -SS-), 3.65(-OCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂COO-), 4.06(-OCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂COO-), 4.34 (-OCH ₂CH₂-SS-)。

（3）目标化合物（PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA）的制备：称取DMP-PCL-SS-PCL-DMP大分子RAFT试剂（0.17克，1.49 mmol ε-己内酯，54 mol%），N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（0.18克，1.26毫摩尔，46 mol%）和AIBN（1.0毫克，6.2毫摩尔）加入到10 mL Shleck瓶中，抽真空充氮气循环3～ 5次，氮气气氛下加入2毫升四氢呋喃溶解，在60℃聚合反应24小时。聚合完后放入冰浴中5分钟终止反应，加入正己烷沉淀，过滤，用无水甲醇溶解沉淀物，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心，除去小分子即得目标高分子共聚物。得产物0.26克，产率63.8％。M_n=12900 g/mol, M_w/M_n=1.18. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, δ, ppm): 0.8??1.2(-C(CH ₃)( -C=O)CH_2, -CH(OH)CH ₃），1.38（-OCH₂CH₂CH ₂CH₂CH₂COO-），1.44-1.65(-OCH₂CH ₂CH₂CH ₂CH₂COO-, -C(CH₃)( -C=O)CH ₂ -), 2.31(-OCH₂CH₂CH₂CH ₂CH ₂COO-), 2.65-3.10 ( -NH-CH ₂-，(-OCH₂CH ₂ -SS-), 3.67（-CH(OH)CH₃），3.97(-OCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂COO-), 4.34 (-OCH ₂CH₂-SS-), 4.71 (-OH), 7.17 (-NH ₂)；

（4）5-氟尿嘧啶载药胶束的制备：将25 毫克PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA和 50 毫克 5-氟尿嘧啶溶于10 mL N,N-二甲酰胺中，搅拌2小时，然后在室温剧烈搅拌下将溶液缓慢滴加（1 滴/15秒）至40 mL的磷酸缓冲液（pH 7.4，50毫摩尔）中。滴完后将混合液继续搅拌过夜，然后在磷酸缓冲液（pH 7.4，50毫摩尔）中透析（分子量截留8000）24小时，得到载药胶束溶液。

实施例2

（1）聚己内酯（PCL-SS-PCL）的制备：同实施例1；

（2）聚己内酯大分子RAFT试剂（DMP-PCL-SS-PCL-DMP）的制备：同实施例1；

（3）目标化合物（PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA）的制备：称取DMP-PCL-SS-PCL-DMP大分子RAFT试剂（0.17克，1.49 mmol ε-己内酯，44 mol%），N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（0.27克，1.89毫摩尔，56 mol%）和AIBN（1.0毫克，6.2毫摩尔）加入到10 ml Shleck瓶中, 抽真空充氮气循环3～ 5次，氮气气氛下加入2毫升THF溶解，60℃聚合反应24h。聚合完后放入冰浴中5分钟终止反应，加入正己烷沉淀，过滤，用无水甲醇溶解沉淀物，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心，除去小分子即得目标高分子共聚物。得产物0.42克，产率64.1％。M_n=13700 g/mol，M_w/M_n=1.23. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, δ, ppm): 0.8??1.02 (H_i), 1.38 (H_e+H_l), 1.67 (H_d+H_g), 2.31(H_c), 2.90 (H_j+H_b), 3.67 (H_k), 3.97 (H_f), 4.34 (H_a), 4.71 (-OH), 7.17 (-NH ₂)；

（4）5-氟尿嘧啶载药胶束的制备：同实施例1。

实施例3

（1）聚己内酯（PCL-SS-PCL）的制备：同实施例1；

（3）目标化合物（PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA）的制备：同实施例1；

（4）5-氟尿嘧啶载药胶束的制备：将25 毫克PHPMA-PCL-SS-PCL-PHPMA和 25 毫克 5-氟尿嘧啶溶于10 ml N,N-二甲酰胺中，搅拌2小时，然后在室温剧烈搅拌下将溶液缓慢滴加（μ1 滴/15秒）至40 ml的磷酸缓冲液（pH 7.4，50毫摩尔）中。滴完后将混合液继续搅拌过夜，然后在磷酸缓冲液（pH 7.4，50毫摩尔）中透析（分子量截留8000）24小时，得到载药胶束溶液。

Claims

1.一种基于二硫键还原响应型药物载体，是将聚己内酯和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺通过RAFT聚合而形成的嵌段共聚物，其结构如下：

式中，m=46～56 mol%，n=44～54 mol%。

2.如权利要求1所述基于二硫键还原响应的药物载体的制备方法，包括以下工艺步骤：

（1）聚己内酯的制备：氮气保护下，以甲苯为溶剂，锌酸亚锡为催化剂，ε-己内酯与双（2 - 羟基乙基）二硫醚以54:1～ 60:1的摩尔比，于100～ 110℃下聚合18～ 24小时；聚合反应完后用二氯甲烷稀释、甲醇沉淀，过滤，洗涤，干燥即得；

（2）聚己内酯大分子RAFT试剂的制备：以二氯甲烷为溶剂，使聚己内酯、2-(十二烷硫基硫羰基硫基)-2-甲基丙酸、4-(二甲基氨基)吡啶和N,N′-二环己基碳二亚胺，在室温下避光搅拌反应24～ 48小时；过滤除去副产物二环己基脲，滤液浓缩后用甲醇沉淀，过滤、真空干燥，即得产物；

（3）目标嵌段共聚物的制备：氮气气氛下，以THF为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，聚己内酯大分子RAFT试剂与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺进行RAFT反应，反应结束后，用正己烷沉淀，过滤，再用无水甲醇溶解沉淀物，然后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心，除去小分子即得目标嵌段共聚物。

3.如权利要求2所述基于二硫键还原响应的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述催化剂锌酸亚锡的用量是ε-己内酯质量的1～ 2%。

4.如权利要求2所述基于二硫键还原响应的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述聚己内酯、2-(十二烷硫基硫羰基硫基)-2-甲基丙酸、4-(二甲基氨基)吡啶和N,N′-二环己基碳二亚胺的摩尔比是1:4:1:4.8～ 1:6:2:8。

5.如权利要求2所述基于二硫键还原响应的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，聚己内酯大分子RAFT试剂与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的摩尔比为1:40～ 1:60。

6.如权利要求2所述基于二硫键还原响应的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中， RAFT聚合反应的温度为50～ 60℃，反应时间为16～ 24小时。

7.如权利要求2所述基于二硫键还原响应的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，引发剂偶氮二异丁腈的用量为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺摩尔量的0.5～ 1%。

8.利用如权利要求1所述基于二硫键还原响应的药物载体制备5-氟尿嘧啶载药胶束的方法，将基于二硫键还原响应的药物载体和5-氟尿嘧啶充分溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在剧烈搅拌下缓慢滴加至磷酸缓冲液中，继续搅拌10～ 12小时，然后在磷酸缓冲液中透析24～ 48小时，得到载药胶束溶液。

9.如权利要求8所述制备5-氟尿嘧啶载药胶束的方法，其特征在于：聚合物与5-氟尿嘧啶的投料质量比为1:1～ 1:2。