CN102085177A - 一种可还原降解纳米载药胶束及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可还原降解纳米载药胶束及其制备方法，属于生物医药技术和纳米医学技术领域。一种可还原降解纳米载药胶束，其特征在于它的结构通式为：MPEG-CA-PCL，其中CA为含二硫键的聚胱胺；MPEG是分子量为475～5000DA的聚乙二醇单甲醚；PCL是聚己内酯。其制备方法包括如下步骤：第一步：利用N，N′-双(丙稀酰)胱胺与乙醇胺的迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺，然后利用羟基对己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物；第二步：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚混合，加入紫杉醇(PTX)，通过透析的方法制得纳米载药胶束。该方法高效，简单。

Description

一种可还原降解纳米载药胶束及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可还原降解纳米载药胶束及其制备方法，属于生物医药技术和纳米医学技术领域。

背景技术

聚合物载药胶束在药物传递和基因载体方面的研究快速发展。聚合物胶束作为药物载体时，药物可以通过简单的物理包埋、静电作用或共价键键合方法载入聚合物胶束。聚合物胶束拥有完美的核壳结构，其纳米级的粒径和胶束外壳的亲水作用使其不易被网状内皮系统吞噬，并可阻止蛋白质和细胞的吸附。聚合物胶束的粒径与病毒和脂蛋白等天然结构极为相似，且外壳有亲水性链段如PEG能避免吞噬细胞的吞噬。因此，聚合物胶束在血液中长时间循环并保持稳定，使其能够在目标部位(如肿瘤组织、炎症组织)停留较长的时间，通过增强渗透作用(EPR)达到被动靶向的作用。聚合物胶束作为药物载体可以对小分子药物起到增溶作用。同时降低小分子抗癌药物的毒性。由于聚合物胶束能够进入到病变部位的血管或炎症组织处而不影响正常组织，这样药物就有可能只在病患处释放，从而减少副作用的发生；因此大批科学家投入聚合物载药胶束的研究中。

基于二硫键还原敏感性的生物可降解聚合物引起了广大科学家的关注，被广泛地应用于制备高效传递及可控释放的生物医学材料。由于二硫键在还原剂硫醇例如二硫苏糖醇(DTT)的作用下容易断裂，因此还原敏感聚合物依赖于硫醇浓度在数分钟到数小时的时间范围内快速可控降解。有趣的是，在人体的不同组织以及细胞内外谷胱苷肽的浓度存在明显的差别。例如在体液和细胞外，GSH浓度较低(2-20μM)，此时还原敏感聚合物能体液和细胞外稳定存在。而在细胞内(约0.5-10mM)和肿瘤组织(比正常组织高约4倍)中，此时由于GSH浓度较高，还原敏感聚合物中的二硫键会发生迅速断裂，最终高分子聚合物发生快速降解。这一重要特性已被广泛地用于药物和基因对肿瘤组织及细胞内的高效传递。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可还原降解纳米载药胶束及其制备方法，该方法高效、简单。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种可还原降解纳米载药胶束，其特征在于它的结构通式为：MPEG-CA-PCL，

其中CA为含二硫键的聚胱胺(这里的缩写的CA的化学结构中间含有S-S，所以称CA为含二硫键的聚胱胺)；MPEG是分子量为475～5000DA的聚乙二醇单甲醚；PCL是聚己内酯。

本发明提供的这种基于二硫键还原敏感的聚合物前药由三个功能部分组成：(1)聚乙二醇单甲醚亲水链段和含二硫键的聚胱胺亲水链段做为胶束纳米粒子的壳层；(2)含二硫键的聚胱胺为主链构成可还原降解的组分；(3)聚己内酯组成疏水部分作为纳米粒子的核层。

用结构式可以表示如下：

结构式中，m为与己内酯反应的胱胺单元数目；q为未与己内酯反应的胱胺单元数目。

一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

第一步：利用N，N′-双(丙稀酰)胱胺与乙醇胺的迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺，然后利用羟基对己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物；对于以上反应可以分为三步：

(1)：胱胺二盐酸盐与丙烯酰氯的取代反应得到N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)：10mmol的胱胺二盐酸盐溶于含有10mL氯仿和15mL、3.5MNaOH混合溶液中，加热至50℃，逐滴加入含有20mmol丙烯酰氯的5mL氯仿，反应15min并一直保持反应液的温度为50℃；然后趁热过滤、萃取，取有机相冷却至室温得白色结晶固体，过滤、重结晶、真空干燥得白色结晶固体的N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)；

(2)：利用N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)与乙醇胺进行迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺：2.60g(10mmol)的N，N′-双(丙烯酰)胱胺与0.61g(10mmol)乙醇胺溶于11mL的甲醇和水的混合液中，甲醇与水的体积比为10/1v/v，聚合反应避光进行，并在氮气保护、室温下反应10天，随后加入过量的10％mol(即1mmol)乙醇胺继续反应2天以除去未反应的丙烯酰胺基团，得到反应液；然后在反应液中加入100mL的去离子水，用3M HCI调节反应液pH1～3，用截留分子量3500DA的透析袋透析6天，透析结束后，冷冻干燥得到带羟基的含二硫键的聚胱胺；

(3)：利用羟基引发己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物：将带羟基的含二硫键的聚胱胺置于烧瓶中，通过甲苯共沸蒸馏除水；然后在烧瓶内加入N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)、己内酯单体和催化剂辛酸亚锡，其中带羟基的含二硫键的聚胱胺与N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)的摩尔比为1∶10，带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比为1∶15～60，催化剂辛酸亚锡与己内酯单体的摩尔比为1∶1000～10000；通入30分钟氮气，110℃～130℃反应24h，得到反应液；将反应液倒入100mL的乙醚中，反复沉淀；然后将得到的聚合物用冷乙醚淋洗3次；最后真空干燥得到CA-PCL聚合物(黄色粉末)；

第二步：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚混合，加入紫杉醇(PTX)，通过透析的方法制得纳米载药胶束；对于以上反应可以分为两部分：

(1)：制备羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)：将4.95g(2.5mmol)的聚乙二醇单甲醚(MPEG-475～5000DA)和20g甲苯置于烧瓶内，升温至140℃共沸除水；然后加入10g(10mmol)琥珀酸酐，混合物在150℃下搅拌反应5h，得到反应液；然后将反应液倒入乙醚中反复沉淀；最终产物在乙醇中重结晶2次，得到羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)；

(2)：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)混合，加入紫杉醇(PTX)，通过透析的方法制得可还原降解纳米载药胶束：按CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚的摩尔比为1∶0.2～1，选取CA-PCL聚合物和羧基封端的聚乙二醇单甲醚，按紫杉醇与CA-PCL聚合物的质量比分别为1∶1～100，选取紫杉醇；按CA-PCL聚合物与二甲亚砜的配比为10mg∶1.0mL，选取二甲亚砜；按CA-PCL聚合物与去离子水的配比为10mg∶1.0mL，选取去离子水；

将CA-PCL聚合物、羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)溶解于二甲亚砜中，摇晃使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液；然后在上述聚合物溶液中加入紫杉醇，轻微搅拌使其混合均匀；然后向其中逐滴滴加去离子水，搅拌2h，得到溶液；将得到的溶液用截留分子量3500DA的透析袋在室温下透析3天，得到一种可还原降解纳米载药胶束。

本发明提供的一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法的合成路线如下：

本发明的有益效果在于：

1、利用迈克尔加成、开环聚合等反应得到聚合物前体并用自组装的方法制得可还原降解纳米载药胶束，该方法高效、简单。

2、聚乙二醇单甲醚亲水链段为胶束纳米粒子的壳层；聚己内酯组成疏水部分作为纳米粒子的核层；含有二硫键的聚胱胺为主链作为可还原降解的组分，因此该聚合物具有对体内还原剂(如谷胱苷肽)敏感的性能，可以被用于药物对肿瘤组织及细胞内的高效传递和定位释放；利用二硫键的还原敏感性实现药物对肿瘤组织及细胞内的高效传递和定位释放，提高了药物的临床疗效和生物利用度。

附图说明

图1为CBA(a)，CA(b)，CA-PCL(c)的核磁共振谱图。

图2为带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比分别为1∶15的CA-PCL聚合物分别在含有DTT和没有DTT的四氢呋喃溶液的分子量变化图。

图3MPEG-CA-PCL纳米胶束的DLS。结果显示，随着MPEG-COOH与CA-PCL摩尔比增加，纳米胶束尺度略微增加。

图4为载有紫杉醇的MPEG-CA-PCL纳米胶束的体外药物释放研究图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法，它包括如下步骤：

第一步：利用N，N′-双(丙稀酰)胱胺与乙醇胺的迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺，然后利用羟基对己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物；对于以上反应可以分为三步：

(1)：胱胺二盐酸盐与丙烯酰氯的取代反应得到N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)：10mmol胱胺二盐酸盐(半胱胺盐酸盐)溶于含有10mL氯仿和15mL、3.5MNaOH混合溶液中，加热至50℃，逐滴加入含有20mmol丙烯酰氯的5mL氯仿，反应15min，并一直保持反应液的温度为50℃；然后趁热过滤、萃取，取有机相冷却至室温得白色结晶固体，过滤、重结晶、真空干燥得白色结晶固体的N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)；

(2)：利用N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)与乙醇胺进行迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺：2.60g(10mmol)的N，N′-双(丙烯酰)胱胺与0.61g(10mmol)乙醇胺溶于11mL的甲醇和水的混合液中进行聚合反应，甲醇与水的体积比为10/1v/v，聚合反应避光进行，并在氮气保护、室温下反应10天，随后加入过量的10％mol(即1mmol)乙醇胺继续反应2天以除去未反应的丙烯酰胺基团，得到反应液；然后在反应液中加入100mL的去离子水，用3M HCI调节反应液pH 1～3，用截留分子量3500DA的透析袋透析6天，透析结束后，冷冻干燥得到带羟基的含二硫键的聚胱胺；

(3)：利用羟基引发己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物：将带羟基的含二硫键的聚胱胺置于烧瓶中，通过甲苯共沸蒸馏除水；然后在烧瓶内加入N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)、己内酯单体和催化剂辛酸亚锡，其中带羟基的含二硫键的聚胱胺与N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)的摩尔比为1∶10，带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比为1∶15，催化剂辛酸亚锡与己内酯单体的摩尔比为1∶1000；通入30分钟氮气，110℃反应24h，得到反应液；将反应液倒入100mL的乙醚中，反复沉淀(沉淀2～5次)；然后将得到的聚合物用冷乙醚淋洗3次；最后真空干燥得到CA-PCL聚合物(黄色粉末)；

第二步：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚混合，加入紫杉醇(PTX)，通过透析的方法制得纳米载药胶束；对于以上反应可以分为两部分：

(1)：制备羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)：将4.95g(2.5mmol)的聚乙二醇单甲醚(MPEG-1900)和20g甲苯置于烧瓶内，升温至140℃共沸除水；然后加入10g(10mmol)琥珀酸酐，混合物在150℃下搅拌反应5h，得到反应液；然后将反应液倒入乙醚中反复沉淀(沉淀2～5次)；最终产物在乙醇中重结晶2次，得到羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)；

(2)：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)混合，加入紫杉醇(PTX)，通过透析的方法制得可还原降解纳米载药胶束：称取10mg CA-PCL聚合物，13mg羧基封端的聚乙二醇单甲醚(MPEG-COOH)溶解于1.0ml DMSO(二甲亚砜)中(羧基封端的聚乙二醇单甲醚待CA-PCL聚合物完全溶解于DMSO的时候加入，CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚的摩尔比为1∶0.2～1)，摇晃使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液；然后在上述聚合物溶液中加入1.0mg紫杉醇，轻微搅拌使其混合均匀；然后向其中逐滴滴加1.0mL去离子水，搅拌2h，得到溶液；将得到的溶液用截留分子量3500DA的透析袋在室温下透析3天，得到一种可还原降解纳米载药胶束。

图1为CA-PCL共聚物合成的核磁共振图，各谱峰的归属已在核磁共振图中标出，证明了聚合物为CA-PCL。

实施例2：

同实施例1的实验方法，固定带羟基的含二硫键的聚胱胺的量以及催化剂辛酸亚锡的量，改变己内酯单体的加入量，使带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比分别为1∶15，1∶30，1∶60。其余步骤同实施例1。

实施例3：

同实施例1的实验方法，固定带羟基的含二硫键的聚胱胺的量以及己内酯单体的加入量，改变催化剂辛酸亚锡的加入量，催化剂辛酸亚锡与己内酯单体的摩尔比为1∶1000，1∶5000，1∶10000。其余步骤同实施例1。

实施例4：

同实施例1的实验方法，改变羟基对己内酯进行开环反应的反应温度，温度分别为110℃，120℃，130℃。其余步骤同实施例1。

实施例5：

同实施例1的实验方法，固定带羟基的含二硫键的聚胱胺的量，催化剂辛酸亚锡以及己内酯单体的加入量，改变MPEG的分子量(分子量分别为：475DA，1900DA，5000DA)，其余步骤同实施例1。

图2为带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比分别为1∶15的CA-PCL聚合物分别在含有DTT和没有DTT的四氢呋喃溶液的分子量变化图。图2说明了二硫键发生断裂，聚合物在DTT还原条件下发生降解。

实施例6：

同实施例1的实验方法，固定带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比分别为1∶15。改变CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚MPEG-COOH的摩尔比为1∶0.2，1∶0.5，1∶1。其余步骤同实施例1。

图3MPEG-CA-PCL纳米胶束的DLS。其中(a)CA-PCL/MPEG-COOH＝1∶0.2，(b)CA-PCL/MPEG-COOH＝1∶0.5，(c)CA-PCL/MPEG-COOH＝1∶1。图3说明了随着CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚MPEG-COOH的摩尔比的增加，胶束尺度略微增加。

实施例7：

同实施例1的实验方法，固定CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚MPEG-COOH的摩尔比为1∶1，改变紫杉醇的加入量，使紫杉醇与CA-PCL聚合物加入量的质量比分别为1∶1，1∶10，1∶100。

图4为紫杉醇与CA-PCL聚合物加入量的质量比为1∶1时，得到的MPEG-CA-PCL纳米胶束的体外药物释放研究图。

在上述实施例中，制得了粒径为50～200nm的可还原降解的聚合物前药纳米胶束。上述实施例仅用以说明本发明但并不局限于此，应该理解在不脱离发明的精神范围内还可有多种变通或替换方案。

Claims (5)

1.一种可还原降解纳米载药胶束，其特征在于它的结构通式为：MPEG-CA-PCL，

其中CA为含二硫键的聚胱胺；MPEG是分子量为475～5000DA的聚乙二醇单甲醚；PCL是聚己内酯。

2.如权利要求1所述的一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

第一步：利用N，N′-双(丙稀酰)胱胺与乙醇胺的迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺，然后利用羟基对己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物；

第二步：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚混合，加入紫杉醇，通过透析的方法制得可还原降解纳米载药胶束。

3.根据权利要求2所述的一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法，其特征在于所述第一步具体分为如下三步：

(1)：胱胺二盐酸盐与丙烯酰氯的取代反应得到N，N′-双(丙烯酰)胱胺：10mmol的胱胺二盐酸盐溶于含有10mL氯仿和15mL、3.5MNaOH混合溶液中，加热至50℃，逐滴加入含有20mmol丙烯酰氯的5mL氯仿，反应15min并一直保持反应液的温度为50℃；然后趁热过滤、萃取，取有机相冷却至室温得白色结晶固体，过滤、重结晶、真空干燥得白色结晶固体的N，N′-双(丙烯酰)胱胺；

(2)：利用N，N′-双(丙烯酰)胱胺(CBA)与乙醇胺进行迈克尔加成得到带羟基的含二硫键的聚胱胺：2.60g的N，N′-双(丙烯酰)胱胺与0.61g乙醇胺溶于11mL的甲醇和水的混合液中，甲醇与水的体积比为10/1，聚合反应避光进行，并在氮气保护、室温下反应10天，随后加入过量的10％mol乙醇胺继续反应2天以除去未反应的丙烯酰胺基团，得到反应液；然后在反应液中加入100mL的去离子水，用3M HCI调节反应液pH 1～3，用截留分子量3500DA的透析袋透析6天，透析结束后，冷冻干燥得到带羟基的含二硫键的聚胱胺；

(3)：利用羟基引发己内酯进行开环反应得到CA-PCL聚合物：将带羟基的含二硫键的聚胱胺置于烧瓶中，通过甲苯共沸蒸馏除水；然后在烧瓶内加入N，N′-二甲基甲酰胺、己内酯单体和催化剂辛酸亚锡，其中带羟基的含二硫键的聚胱胺与N，N′-二甲基甲酰胺的摩尔比为1∶10，带羟基的含二硫键的聚胱胺与己内酯单体的摩尔比为1∶15～60，催化剂辛酸亚锡与己内酯单体的摩尔比为1∶1000～10000；通入30分钟氮气，110℃～130℃反应24h，得到反应液；将反应液倒入100mL的乙醚中，沉淀；然后将得到的聚合物用冷乙醚淋洗3次；最后真空干燥得到CA-PCL聚合物。

4.根据权利要求2所述的一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法，其特征在于所述第二步具体分为如下二步：

(1)：制备羧基封端的聚乙二醇单甲醚：将4.95g的聚乙二醇单甲醚和20g甲苯置于烧瓶内，升温至140℃共沸除水；然后加入10g琥珀酸酐，在150℃下搅拌反应5h，得到反应液；然后将反应液倒入乙醚中反复沉淀；最终产物在二氯甲烷和乙醚的混合液中重结晶2次，得到羧基封端的聚乙二醇单甲醚；

(2)：利用第一步得到CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚混合，加入紫杉醇，

通过透析的方法制得可还原降解纳米载药胶束：按CA-PCL聚合物与羧基封端的聚乙二醇单甲醚的摩尔比为1∶0.2～1，选取CA-PCL聚合物和羧基封端的聚乙二醇单甲醚，按紫杉醇与CA-PCL聚合物的质量比分别为1∶1～100，选取紫杉醇；按CA-PCL聚合物与二甲亚砜的配比为10mg∶1.0mL，选取二甲亚砜；按CA-PCL聚合物与去离子水的配比为10mg∶1.0mL，选取去离子水；

将CA-PCL聚合物、羧基封端的聚乙二醇单甲醚溶解于二甲亚砜中，摇晃使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液；然后在上述聚合物溶液中加入紫杉醇，轻微搅拌使其混合均匀；然后向其中逐滴滴加去离子水，搅拌2h，得到溶液；将得到的溶液用截留分子量3500DA的透析袋在室温下透析3天，得到一种可还原降解纳米载药胶束。

5.根据权利要求4所述的一种可还原降解纳米载药胶束的制备方法，其特征在于聚乙二醇单甲醚的分子量为475～5000DA。

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