CN105769929A - 一种熊果酸复合益生菌的制备方法 - Google Patents

一种熊果酸复合益生菌的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种熊果酸复合益生菌的制备方法，属于医学领域。本发明从苦丁茶中提取熊果酸并纯化，并制成含有熊果酸的发酵培养基，分别将乳酸菌菌株、双歧杆菌、嗜热链球菌接种到发酵培养基中，进行好养、厌氧培养，将培养完成的培养液分离后收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤、超声波细胞粉碎机破碎处理，分离得上清液、回收溶剂后结晶，最后分离纯化即可，本发明制得的产物结合了熊果酸和多种益生菌的优点，不仅使熊果酸的活性更高，消炎、抗氧化、增强免疫等功效更明显，而且制备工艺简单、产品纯度高、应用广泛。

Description

一种熊果酸复合益生菌的制备方法
技术领域
本发明公开了一种熊果酸复合益生菌的制备方法，属于医学领域。
背景技术
熊果酸又名乌索酸，乌苏酸，是存在于天然植物中的一种三菇类化合物，具降低高脂模型小鼠血脂，降低血糖等多种生物学效应。近年来发现它具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用，极有可能成为低毒高效的新型抗癌药物。另外，熊果酸具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。
熊果酸的抗氧化作用对人体的抗衰老、皮肤祛斑、祛色素都有积极作用。日本1983～2004年的有关熊果酸的29篇专利中，有10篇是关于熊果酸的皮肤美容
保健方面的应用，作为化妆品，熊果酸性质稳定，颜色和气味不随时间改变，而且有很好的触摸感，因此在美容护肤品中有广泛的应用。
目前国内外对于益生菌的功能特性研究得比较成熟，已知确切功效和潜在功效达十余种之多，但对其抗氧化活性的研究仍处于探索阶段。尽管对益生菌抗氧化机理的认识还比较模糊，但诸多研究者认为，益生菌的抗氧化作用主要是其胞内的抗氧化成分和氧化还原调控系统起作用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：针对目前熊果酸虽大量存在于天然植物中，但其结
构复杂、不溶于水，其生理活性的利用率不高，限制其应用的问题，提供了一种熊果酸复合益生菌的制备方法，本发明从苦丁茶中提取熊果酸并纯化，并制成含有熊果酸的发酵培养基，分别将乳酸菌菌株、双歧杆菌、嗜热链球菌接种到发酵培养基中，进行好养、厌氧培养，将培养完成的培养液分离后收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤、超声波细胞粉碎机破碎处理，分离得上清液、回收溶剂后结晶，最后分离纯化即可，本发明制得的产物结合了熊果酸和多种益生菌的优点，不仅使熊果酸的活性更高，消炎、抗氧化、增强免疫等功效更明显，而且制备工艺简单、产品纯度高、应用广泛。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）取80～90g苦丁茶，先将其放入50～60℃烘箱中干燥5～6h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到80～100目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在80～90℃下回流提取2～3次，每次2～3h，回流结束后将提取液用0.25～0.30μm微孔滤膜过滤，得滤液；
（2）将上述滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；
（3）取15～20mL上述熊果酸浓缩液和50～80mL去离子水、8～12g柠檬酸氢二铵、8～12g磷酸二氢钾、15～18g牛肉膏、15～20g蛋白胨、3～5g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.2～6.6，配制成发酵培养基，将发酵培养基在600～700W超声功率下超声处理10～15min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；
（4）分别选取10～15株乳酸菌菌株、5～8株双歧杆菌和6～10株嗜热链球菌
接种上述含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在35～37℃下好养培养5～7h，再在38～40℃下厌氧培养10～15h；
（5）将上述培养完成后的培养液在4800～5000g离心分离12～15min，分离后
收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤2～3次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到2.3～3.8×109CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在300～350W和0～5℃冰浴条件下破碎处理8～10min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在6000～7000g离心分离15～20min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为2.0～3.5，并置于0～5℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。
本发明值得的产品为淡黄色晶体颗粒，熔点296～302℃，20℃下，在水中的溶解度为1.2～1.5g/100g水，易溶于氯仿、乙醇、甲醚等有机溶剂；具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、增强免疫、降低血糖等多种生物学效应，还具有很强的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。
本发明的有益效果是：
（1）本发明制得的产物结合了熊果酸和多种益生菌优点，使熊果酸的活性更高，消炎、抗氧化、增强免疫等功效更明显；
（2）本发明制备工艺简单、分离纯化效率高、产品纯度高，可广泛应用于医药和化妆品中。
具体实施方式
首先取80～90g苦丁茶，先将其放入50～60℃烘箱中干燥5～6h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到80～100目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在80～90℃下回流提取2～3次，每次2～3h，回流结束后将提取液用0.25～0.30μm微孔滤膜过滤，得滤液；将滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；取15～20mL熊果酸浓缩液和50～80mL去离子水、8～12g柠檬酸氢二铵、8～12g磷酸二氢钾、15～18g牛肉膏、15～20g蛋白胨、3～5g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.2～6.6，配制成发酵培养基，将发酵培养基在600～700W超声功率下超声处理10～15min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；分别选取10～15株乳酸菌菌株、5～8株双歧杆菌和6～10株嗜热链球菌加入含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在35～37℃下好养培养5～7h，再在38～40℃下厌氧培养10～15h；将培养完成后的培养液在4800～5000g离心分离12～15min，分离后收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤2～3次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到2.3～3.8×109CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在300～350W和0～5℃冰浴条件下破碎处理8～10min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在6000～7000g离心分离15～20min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为2.0～3.5，并置于0～5℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。
实例1
首先取80g苦丁茶，先将其放入50℃烘箱中干燥5h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到80目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在80℃下回流提取2次，每次2h，回流结束后将提取液用0.25μm微孔滤膜过滤，得滤液；将滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；取15mL熊果酸浓缩液和50mL去离子水、8g柠檬酸氢二铵、8g磷酸二氢钾、15g牛肉膏、15g蛋白胨、3g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.2，配制成发酵培养基，将发酵培养基在600W超声功率下超声处理10min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；分别选取10株乳酸菌菌株、5株双歧杆菌和6株嗜热链球菌加入含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在35℃下好养培养5h，再在38℃下厌氧培养10h；将培养完成后的培养液在4800g离心分离12min，分离后收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤2次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到2.3×109CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在300W和0℃冰浴条件下破碎处理8min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在6000g离心分离15min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为2.0，并置于0℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。
本发明值得的产品为淡黄色晶体颗粒，熔点296℃，20℃下，在水中的溶解度为1.2g/100g水，易溶于氯仿、乙醇、甲醚等有机溶剂；具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、增强免疫、降低血糖等多种生物学效应，还具有很强的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。
实例2
首先取85g苦丁茶，先将其放入55℃烘箱中干燥5.5h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到90目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在85℃下回流提取2次，每次2.5h，回流结束后将提取液用0.27μm微孔滤膜过滤，得滤液；将滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；取17mL熊果酸浓缩液和65mL去离子水、10g柠檬酸氢二铵、10g磷酸二氢钾、17g牛肉膏、17g蛋白胨、4g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.4，配制成发酵培养基，将发酵培养基在650W超声功率下超声处理13min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；分别选取13株乳酸菌菌株、6株双歧杆菌和8株嗜热链球菌加入含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在36℃下好养培养6h，再在39℃下厌氧培养13h；将培养完成后的培养液在4900g离心分离14min，分离后收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤2次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到3.3×109CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在325W和3℃冰浴条件下破碎处理9min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在6500g离心分离17min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为3.0，并置于3℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。
本发明值得的产品为淡黄色晶体颗粒，熔点299℃，20℃下，在水中的溶解度为1.4g/100g水，易溶于氯仿、乙醇、甲醚等有机溶剂；具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、增强免疫、降低血糖等多种生物学效应，还具有很强的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。
实例3
首先取90g苦丁茶，先将其放入60℃烘箱中干燥6h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到100目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在90℃下回流提取3次，每次3h，回流结束后将提取液用0.30μm微孔滤膜过滤，得滤液；将滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；取20mL熊果酸浓缩液和80mL去离子水、12g柠檬酸氢二铵、12g磷酸二氢钾、18g牛肉膏、20g蛋白胨、5g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.6，配制成发酵培养基，将发酵培养基在700W超声功率下超声处理15min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；分别选取15株乳酸菌菌株、8株双歧杆菌和10株嗜热链球菌加入含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在37℃下好养培养7h，再在40℃下厌氧培养15h；将培养完成后的培养液在5000g离心分离15min，分离后收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤3次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到3.8×109CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在350W和5℃冰浴条件下破碎处理10min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在7000g离心分离20min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为3.5，并置于5℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。
本发明值得的产品为淡黄色晶体颗粒，熔点302℃，20℃下，在水中的溶解度为1.5g/100g水，易溶于氯仿、乙醇、甲醚等有机溶剂；具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、增强免疫、降低血糖等多种生物学效应，还具有很强的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。

Claims (1)

1.一种熊果酸复合益生菌的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）取80～90g苦丁茶，先将其放入50～60℃烘箱中干燥5～6h，将干燥后的苦丁茶研磨、粉碎，过筛得到80～100目苦丁茶粉末，按固液比1:10与质量分数90%乙醇混合，在80～90℃下回流提取2～3次，每次2～3h，回流结束后将提取液用0.25～0.30μm微孔滤膜过滤，得滤液；
（2）将上述滤液通过D-101树脂柱吸附，分别用水和质量分数20%乙醇溶液进行洗脱至无色，收集质量分数20%乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至原体积10%，即得熊果酸浓缩液；
（3）取15～20mL上述熊果酸浓缩液和50～80mL去离子水、8～12g柠檬酸氢二铵、8～12g磷酸二氢钾、15～18g牛肉膏、15～20g蛋白胨、3～5g硫酸镁混合，混合均匀后调节pH值为6.2～6.6，配制成发酵培养基，将发酵培养基在600～700W超声功率下超声处理10～15min，处理结束后过滤得滤液，向滤液中按体积比5:1加入质量分数20%的乙醇溶液，混合后得到含有熊果酸发酵培养基；
（4）分别选取10～15株乳酸菌菌株、5～8株双歧杆菌和6～10株嗜热链球菌接种上述含有熊果酸发酵培养基中进行培养，先在35～37℃下好养培养5～7h，再在38～40℃下厌氧培养10～15h；
（5）将上述培养完成后的培养液在4800～5000g离心分离12～15min，分离后收集菌体，并用pH为6.8磷酸盐缓冲液洗涤2～3次，将冲洗后的菌体再次加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，调整菌数到2.3～3.8×109CFU/mL，然后用超声波细胞粉碎机在300～350W和0～5℃冰浴条件下破碎处理8～10min，工作5s，间歇5s，将破碎后的悬浊液在6000～7000g离心分离15～20min，收集上清液，并进行减压蒸馏，回收溶剂，用质量分数35%盐酸调节浓缩液pH值为2.0～3.5，并置于0～5℃的水浴中，待固体完全析出后过滤，将过滤物重新溶于无水乙醇中重结晶，过滤，得过滤物即可。
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