CN105745202A - 新型2,6-二氨基嘧啶衍生物 - Google Patents

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川畑亘
浅见齐子
泽匡明
入江隆行
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Abstract

本发明的课题是提供新型2,6?二氨基嘧啶衍生物。解决方案为式(I)代表的2,6?二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐。(式中，R1表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的烷氧基，Ar表示任选具有取代基的芳基、任选具有取代基的杂芳基，Z1和Z2表示碳原子、或者Z1和Z2中任一个或两个表示氮原子，Q表示选自以下结构(a)或(b)的结构，R2表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的环烷基，R3表示氢原子、卤素原子，Y表示氮原子或碳原子，结构(a)中虚线和实线的双线表示双键或单键)。

Description

新型2,6-二氨基嘧啶衍生物
技术领域
本发明涉及一种药物，尤其涉及具有BTK抑制作用的新型2,6-二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐。
背景技术
布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)是非受体酪氨酸激酶的Tec家族成员之一，是在除T淋巴细胞和自然杀伤细胞以外的所有造血系细胞类型中表达的重要信号传导酶(signaling enzyme)。BTK是与B细胞的存活、分化、增殖和活化等相关的重要控制因子，在B细胞的信号传导中发挥重要作用(非专利文献1、2)。细胞表面的B细胞受体(B-cell receptor，BCR)介由存在于其下游的BTK将信号传导至细胞内，因此认为B细胞的信号传导途径的异常活化促进了B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病等的癌细胞的增殖和存活(非专利文献3)。另外，已知BTK在其他许多细胞的信号途径中也起到重要作用，据说BTK还与变应性疾病、自身免疫疾病和炎性疾病等有关(非专利文献1)。例如，已知BTK在肥大细胞中对高亲和力IgE受体(FcεRI)的信号传导起着重要作用，BTK缺陷的肥大细胞中脱粒减少、促炎性细胞因子的产生减少(非专利文献4)。另外，在BTK缺陷小鼠的实验中，暗示了BTK与系统性红斑狼疮(SLE)有关(非专利文献5)。进而BTK突变小鼠对胶原诱导性关节炎的发病显示出抵抗性(非专利文献6)。因此，具有BTK抑制活性的化合物对例如癌、B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病等与BTK信号有关的疾病的治疗有用，进而对变应性疾病、自身免疫疾病和炎性疾病、骨病等的治疗也有用。
迄今为止，虽然具有BTK抑制作用的化合物已被报道，且专利文献1、专利文献2、专利文献3等中记载了含嘧啶环的BTK抑制剂，但是对于6位为氨基的本发明的2,6-二氨基嘧啶衍生物还未具体记载，另外，关于本发明的2,6-二氨基嘧啶衍生物具有极其优异的BTK抑制作用也尚未公开。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2008/033834号公报
专利文献2：国际公开WO2009/137596号公报
专利文献3：国际公开WO2013/083666号公报
非专利文献
非专利文献1：Satterthwaite, A.B. and Witte, O.N., Immunol. Rev., 2000,175, 120-127
非专利文献2：Kurosaki, T., Curr. Opin. Immunol., 2000, 12, 276-281
非专利文献3：Davis, R.E., et al., Nature, 2010, 463, 88-92
非专利文献4：Ellmeier, W., et al., FEBSJ., 2011), 278, 1990-2000
非专利文献5：Halcomb, K.E., Mol.Immunol., 2008, 46(2), 233-241
非专利文献6：Jansson, L. andHolmdahl, R., Clin. Exp. Immunol., 1993, 94,459-465。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种药物，特别提供具有BTK抑制作用的新型2,6-二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐。
用于解决问题的方案
本发明通过以下(1)~(2)而实现，
(1)下式(I)代表的2,6-二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐：
(式中，R1表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的烷氧基，Ar表示任选具有取代基的芳基、任选具有取代基的杂芳基，Z1和Z2表示碳原子、或者Z1和Z2中任一个或两个表示氮原子，Q表示选自以下结构(a)或(b)的结构：
R2表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的环烷基，R3表示氢原子、卤素原子，Y表示氮原子或碳原子，结构(a)中虚线和实线的双线表示双键或单键)；
(2)上述(1)所述的2,6-二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其中，Q为结构(a)。
发明的效果
本发明人为了解决上述课题，对嘧啶衍生物进行了各种合成、结构活性相关研究，结果发现上述式(I)代表的新型2,6-二氨基嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐具有非常高的BTK抑制活性，而且显示出优异的药物动力学，从而完成了本发明。
本发明所提供的化合物作为对于例如自身免疫疾病、炎性疾病、骨病、淋巴瘤之类的癌等已知与通过BTK的异常细胞应答相关的疾病的预防或治疗用药物(药物组合物)有用。另外，作为BTK抑制剂也适用于实验用、研究用的试剂。
附图说明
图1表示实施例1和2的化合物浓度依赖性地在Ramos细胞内抑制BCR信号，抑制钙流入细胞内(试验例3)。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明的新型2,6-二氨基嘧啶衍生物为下式(I)代表的化合物，
(式中，R1表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的烷氧基，Ar表示任选具有取代基的芳基、任选具有取代基的杂芳基，Z1和Z2表示碳原子、或者Z1和Z2中任一个或两个表示氮原子，Q表示选自以下结构(a)或(b)的结构：
R2表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的环烷基，R3表示氢原子、卤素原子，Y表示氮原子或碳原子，结构(a)中虚线和实线的双线表示双键或单键)。
上述式(I)中：
作为卤素原子可列举出氟、氯、溴等。
作为任选具有取代基的芳基的芳基部分，可为任意碳原子数6至14的芳基，具体可列举出苯基、萘基、茚基等。
作为任选具有取代基的杂芳基的杂芳基部分，可列举出单环芳香族杂环基和杂环芳香族稠环基，作为单环芳香族杂环基，例如可列举出含有选自氮原子、硫原子和氧原子中的至少一个杂原子的5或6元单环芳香族杂环基等。具体可列举出吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基等，作为杂环芳香族稠环，例如可列举出含有选自氮原子、硫原子和氧原子中的至少一个杂原子且由3至8元环稠合而成的二环稠合杂环基等。具体可列举出四氢异喹啉基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异喹啉基等。
作为任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的环烷基的烷基部分，可为任意的碳原子数1至3的直链、支链或环状烷基，具体可列举出甲基、异丙基、环丙基、叔丁基等。
作为任选具有取代基的烷氧基的烷氧基部分，可为任意的具有碳原子数1至3的直链、支链或环状烷基的烷氧基，具体可列举出甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基等。
作为任选具有取代基的芳基、任选具有取代基的杂芳基、任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的烷氧基的取代基，若无特别说明，可以在化学上可能的任意位置具有任意种类的1或2个以上取代基，取代基为2个以上时，各取代基可以相同也可以不同，例如可列举出卤素原子、取代或未取代烷基、取代或未取代烷氧基、取代或未取代氨基、硝基、氰基、羟基、取代或未取代烷基氨基、取代或未取代氨基甲酰基、羧基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、取代或未取代酰氨基等。另外，取代基彼此可形成键，可形成饱和或不饱和环。
本发明的化合物(I)例如根据取代基的种类有时存在异构体。本说明书中，虽然有时仅对这些异构体的一个形态的化学结构进行了记载，但本发明也包括结构上可能产生的所有异构体(几何异构体、光学异构体、互变异构体等)，还包括异构体单体、或者它们的混合物。
作为本发明的化合物(I)或其药学上可接受的盐的具体化合物，可列举出以下化合物或其药学上可接受的盐：
2-(3-{6-氨基-2-[(4-吗啉代苯基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(4-吗啉代苯基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮
4-({4-氨基-6-[3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)-2-(羟甲基)苯基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡咯-2-腈
2-(3-{6-氨基-2-[(4-甲氧基苯基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-(叔丁基)-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-[3-(6-氨基-2-{[1-(环丙基甲基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-4-基)-2-(羟甲基)苯基]-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
4-({4-氨基-6-[3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)-2-(羟甲基)苯基]嘧啶-2-基}氨基)-1-环丙基-1H-吡咯-2-腈
2-{3-[6-氨基-2-(吡啶-2-基氨基)嘧啶-4-基]-2-(羟甲基)苯基}-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-[3-(6-氨基-2-{[1-(2,2-二氟乙基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-4-基)-2-(羟甲基)苯基]-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-[3-(6-氨基-2-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}嘧啶-4-基)-2-(羟甲基)苯基]-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-[3-(6-氨基-2-{[4-(吗啉代甲基)苯基]氨基}嘧啶-4-基)-2-(羟甲基)苯基]-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{2-[(5-乙酰基-1-甲基-1H-吡咯-3-基)氨基]-6-氨基嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{2-[(1H-吡唑-4-基)氨基]-6-氨基嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡咯-3-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟酞嗪(phthalazin)-1(2H)-酮
2-(3-{6-氨基-2-[(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮
2-(4-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-3-(羟甲基)吡啶-2-基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
2-(4-{6-氨基-2-[(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-3-(羟甲基)吡啶-2-基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
4-({4-氨基-6-[3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-2-(羟甲基)苯基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡咯-2-腈
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-8-氟-6-(1-甲基环丙基)异喹啉-1(2H)-酮
2-{3-[6-氨基-2-({1-[1-(羟甲基)环丙基]-1H-吡唑-4-基}氨基)嘧啶-4-基]-2-(羟甲基)苯基}-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮。
另外，作为本发明的化合物(I)的药学上可接受的盐，可列举出与盐酸、硫酸、碳酸、磷酸等所成的无机酸盐；与富马酸、马来酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等所成的有机酸盐等。而且，本发明还包括与钠、钾等所成的碱金属盐；与镁、钙等所成的碱土金属盐；与低级烷基胺、低级醇胺等所成的有机胺盐；与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等所成的碱性氨基酸盐；以及铵盐等。
本发明的化合物(I)及其药学上可接受的盐可以通过例如以下方法制备。应予说明，以下所示的制备方法中，当所定义的基团在实施方法的条件下改变、或者不适合实施该方法时，可以通过有机合成化学中常用的方法，例如官能团的保护、去保护[T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley&Sons,Inc.,1999]等手段容易地制备。另外，根据需要还可以改变引入取代基等反应步骤的顺序。
以下说明中使用的缩写、符号的含义如下：
DCM：二氯甲烷
DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺
EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
HOBt：1-羟基苯并三唑
THF：四氢呋喃
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
TEA：三乙胺
CDCl3：氘代氯仿。
[本发明的化合物(I)的制备方法]
式(I)代表的本发明的化合物可以按照例如方案1进行制备。
[方案1]
(式中，R1、Q、Ar、Z1和Z2含义与上述相同，W表示硼酸基(boronyl)或硼酸酯基。)。
本发明的化合物(I)可以使用化合物(II)和化合物(III)通过铃木偶联反应等交叉偶联反应来制备(例如，铃木偶联反应的条件参照公知文献(N.Miyaura, etal, J. Am.Chem. Soc., 107,972(1985)., N.Miyaura, A.Suzuki, Chem. Rev. 95, 2457(1995))等)。即，可以在钯、镍等金属催化剂的存在下，根据需要使用碱和添加剂来实施。作为反应所用的溶剂，可列举出THF、二噁烷、甲苯、二甲氧基乙烷、甲醇、乙醇、乙腈等。另外，这些溶剂也适宜两种以上混合使用，或者进而与水混合使用。优选为THF与水的混合溶剂、甲苯与甲醇和水的混合溶剂、或者二噁烷。化合物(II)的用量相对于化合物(III)优选为当量或过量，更优选为1当量至10当量。根据需要为了使反应加速可以添加碱，作为碱通常使用碳酸钠、碳酸铯、碳酸钾等。所用的碱的用量相对于化合物(III)可列举出1当量至10当量，优选为1当量至5当量。作为金属催化剂，可以使用用于交叉偶联的市售易获得的钯催化剂(例如PdCl2(dppf)、Pd2(dba)3、Pd(PPh3)4等)，相对于化合物(III)，优选添加催化量，即0.1当量至0.5当量。
为了使反应加速可以根据需要加入添加剂，作为添加剂例如可列举出rac-BINAP等，相对于化合物(III)可以使用0.01当量至1当量。可以通过在0℃至200℃之间反应数分钟至数日，优选在10℃至100℃之间反应1小时至36小时来进行合成。或者，还可以通过使用微波合成装置在例如60℃至150℃的温度条件下反应数分钟至数小时来进行合成。
另外，用作方案1的原料的化合物(II)可以通过例如方案2所示的方法来制备。
[方案2]
(式中，R1、Q、Z1、Z2和W含义与上述相同，X表示卤素。)。
化合物(II)可以通过用正丁基锂等使化合物(IV)活化后与硼酸酯反应进行制备。即，化合物(II)可以通过以下方式而得到：用1~5摩尔当量、优选为1~1.5摩尔当量的正丁基锂处理化合物(IV)进行锂化，再与1~5摩尔当量、优选为1~1.5摩尔当量的硼酸酯反应。
溶剂只要是对反应惰性的溶剂即可，没有特别限定，可优选使用THF。
反应温度通常为-100℃至-30℃，优选为-80℃至-60℃。反应时间没有特别限定，通常例如为0.1小时至12小时，优选例如为0.2小时至6小时。
另外，化合物(II)还可以通过以下方式得到：使化合物(IV)与1~5摩尔当量、优选为1~1.5摩尔当量的金属镁和催化剂量的碘在醚系溶剂中、-10℃至所用溶剂的沸点之间的温度下进行反应制成格氏试剂，再与1~5摩尔当量、优选为1~1.5摩尔当量的硼酸酯反应。反应温度通常为-30℃至-100℃，优选为-60℃至-80℃。反应时间没有特别限定，通常例如为0.1小时至12小时，优选例如为0.2小时至6小时。
进而，化合物(II)可以通过以下方式得到：在有机溶剂中，钯、镍等金属催化剂和碱的存在下，使化合物(IV)与1~5摩尔当量、优选为1~3摩尔当量的二硼酯(diboron ester)进行偶联反应。
作为金属催化剂，可以使用用于交叉偶联的市售易获得的钯催化剂(例如PdCl2(dppf)、Pd2(dba)3、Pd(PPh3)4等)，相对于化合物(IV)，优选添加催化量，即0.1当量至0.5当量。作为碱通常使用乙酸钾等。所用的碱的用量相对于化合物(IV)可列举出1当量至10当量，优选为1当量至5当量。
溶剂只要是对反应惰性的溶剂即可，没有特别限定，可优选使用二噁烷。
反应温度通常为0℃至200℃，优选为10℃至100℃。反应时间没有特别限定，通常例如为0.2小时至48小时，优选例如为1小时至36小时。
这些反应均在惰性气体(氩、氮等)气氛中、无水条件下进行较理想。
用作方案2的原料的化合物(IV)可以通过例如方案3所示的方法来制备。
[方案3]
(式中，R1、Q、Z1、Z2和X含义与上述相同，化合物(VI)的X1、X2表示相同或各自独立地不同的卤素原子。)。
化合物(IV)可以通过以下方式得到：在极性溶剂中、金属催化剂的存在下，使用碱使化合物(V)与1~5摩尔当量、优选为1.5~3摩尔当量的化合物(VI)反应。
溶剂只要是对反应惰性的溶剂即可，没有特别限定，可优选使用二噁烷。
在进行本偶联反应之际，还可以根据需要适当组合有机合成化学中常用的方法对化合物(VI)的R1进行保护、去保护从而制备化合物(IV)。例如，可以使用化合物(VI)的羟基、氨基官能团的保护、去保护[T.W. Greene, Protective Groups in OrganicSynthesis 3rd Edition, John Wiley&Sons, Inc., 1999]，或者使用化合物(VI)的羟基前体即醛衍生物。
反应例如可以通过通常在80℃至200℃之间反应0.5小时至200小时来进行，优选在100℃至150℃下反应1小时至100小时来进行。反应还适宜在微波照射条件下进行。
作为所用的金属催化剂，可以使用市售易获得的钯催化剂(例如PdCl2(dppf)、Pd2(dba)3、Pd(PPh3)4等)、或者碘化铜(I)，优选相对于化合物(V)添加0.01当量至2当量金属催化剂。
作为所用的碱，可为例如碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钠，优选使用碳酸铯、碳酸氢钠，其用量相对于化合物(V)例如为1~10摩尔当量、优选为2~5摩尔当量。另外，还可以根据需要添加0.1当量至0.5当量的4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)进行合成。
化合物(VI)可以使用市售品，或者通过公知方法或以其为基准的方法得到。
用作方案3的原料的化合物(V)中，Q为结构(a)、虚线和实线的双线为双键的化合物(V-a-i)和化合物(V-a-ii)可以通过例如方案4所示的方法来制备。
[方案4]
(式中，X、W、R2和R3含义与上述相同。)。
化合物(V-a-i)可以通过以下方式制备：将化合物(VII)的羧酸转换为氨基甲酰基后，利用交叉偶联反应引入R2基得到化合物(IX)，将化合物(IX)用于使用N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛进行的环化反应。
另一方面，化合物(V-a-ii)可以通过以下方式制备：将化合物(VII)的羧酸转换为酯后，将苯环上的甲基氧化成醛得到化合物(XI)，使用肼将化合物(XI)环化，利用交叉偶联反应引入R2基。
方案4的起始原料即化合物(VII)、(X)、以及R2-W可以使用市售品，或者通过公知方法或以其为基准的方法得到。
用作方案3的原料的化合物(V)中，Q为结构(a)、虚线和实线的双线为单键的化合物(V-a-iii)可以通过例如方案5所示的方法来制备。
[方案5]
(式中，X、W、R2和R3含义与上述相同。)。
化合物(V-a-iii)可以通过以下方式制备：通过化合物(XV)与叠氮化钠的施密特(Schmidt)重排反应得到化合物(XVI)，将化合物(XVI)用于与R2基的交叉偶联反应。
方案5的起始原料即化合物(XV)和R2-W可以使用市售品，或者通过公知方法或以其为基准的方法得到。
用作方案3的原料的化合物(V)中，Q为结构(b)的化合物(V-b)可以通过例如方案6所示的方法来制备。
[方案6]
(式中，X、W、R2和R3含义与上述相同。)。
化合物(V-b)可以通过以下方式制备：将化合物(X)的苯环上的甲基溴化得到化合物(XIII)，用氨处理化合物(XIII)使其环化，然后与硼酸R2-W进行交叉偶联反应。
方案6的起始原料即化合物(X)和R2-W可以使用市售品，或者通过公知方法或以其为基准的方法得到。
用作方案1的原料的化合物(III)可以通过例如方案7所示的方法来制备。
[方案7]
(式中，Ar含义与上述相同。)。
化合物(III)可以通过以下方式得到：使ArNH2与1~5摩尔当量、优选为1~1.5摩尔当量的4-氨基-2,6-二氯嘧啶在极性溶剂中、根据需要在酸催化剂存在下进行反应。
溶剂只要是对反应惰性的溶剂即可，没有特别限定，可优选使用二甲氧基乙烷和乙醇。
反应温度通常为0℃至200℃，优选为50℃至150℃。反应时间没有特别限定，通常例如为0.2小时至24小时，优选例如为1小时至18小时。
方案7的起始原料即4-氨基-2,6-二氯嘧啶可以使用市售品，ArNH2可以使用市售品，或者通过公知方法或以其为基准的方法得到。
另外，本发明的化合物(I)还可以根据例如方案8制备。
[方案8]
(式中，R1、Q、Ar、Z1和Z2含义与上述相同。)。
本发明的化合物(I)可以通过ArNH2对化合物(XVI)的取代反应来制备。该取代化反应的条件与根据上述方案7制备化合物(III)的方法的条件相同。
用作方案8的原料的化合物(XVI)可以通过例如方案9所示的方法来制备。
[方案9]
(式中，R1、Q、W、Z1和Z2含义与上述相同。)。
化合物(XVI)可以通过使用化合物(II)和4-氨基-2,6-二氯嘧啶的交叉偶联反应来制备。该交叉偶联反应的条件与根据上述方案1制备本发明的化合物(I)的方法中的条件相同。
上述方案中，W所代表的硼酸基可为碱金属或碱土金属盐的形式，另外作为硼酸酯基的具体例，可列举出：硼酸二甲基酯基、硼酸二乙基酯基、硼酸二丁基酯基、硼酸二环己基酯基、硼酸乙二醇酯基、硼酸丙二醇酯基(硼酸1,2-丙二醇酯基、硼酸1,3-丙二醇酯基)、硼酸新戊二醇酯基、硼酸邻苯二酚酯基、硼酸甘油酯基、硼酸三羟甲基乙烷酯基、硼酸二乙醇胺酯基、硼酸三乙醇胺酯基等硼酸酯基；硼酸酐基等。
应予说明，通过将上述方法适当组合，实施有机合成化学中常用的方法(例如氨基的烷基化反应、将烷硫基氧化成亚砜基或磺基的反应、将烷氧基转换为羟基或羟基转换为烷氧基的反应)，可以得到在所需位置具有所需官能团的本发明的化合物(I)。
[本发明的化合物(I)的用途]
本发明的化合物(I)或其药学上可接受的盐可以制备成适合于口服给药、胃肠外给药或局部给药的常规药物制剂(药物组合物)的形态。
用于口服给药的制剂包括片剂、颗粒、粉末、胶囊等固体制剂、以及糖浆等液体制剂。这些制剂可以通过常规方法制备。固体制剂可以通过使用乳糖、玉米淀粉等淀粉、微晶纤维素等结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钙、滑石粉、硬脂酸镁等之类的常规的药物载体进行制备。胶囊可以通过将由此制成的颗粒或粉末包入胶囊内进行制备。糖浆可以通过将本发明的化合物(I)或其药学上可接受的盐溶解或悬浮在含有蔗糖、羧甲基纤维素等的水溶液中进行制备。
用于胃肠外给药的制剂包括滴注等注射剂。注射制剂也可通过常规方法制备，还可以适当加入等渗剂(例如甘露醇、氯化钠、葡萄糖、山梨醇、甘油、木糖醇、果糖、麦芽糖、甘露糖)、稳定剂(例如亚硫酸钠、白蛋白)、防腐剂(例如苄醇、对羟基苯甲酸甲基)中。
本发明的化合物(I)或其药学上可接受的盐的用量可以根据疾病的严重程度、患者的年龄和体重、给药形态等而改变，通常成人可在每日1mg~1000mg的范围内，并根据口服途径或胃肠外途径分1次、2次或3次给药。
另外，本发明的化合物(I)或其药学上可接受的盐也可以作为BTK抑制剂用作实验用、研究用的试剂。
实施例
以下列举实施例和试验例等对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于这些实施例。
化合物的鉴定通过氢核磁共振谱(1H-NMR)和质谱(MS)进行。若无特别说明，1H-NMR在400MHz下进行测定，另外根据化合物和测定条件有时无法清晰地观测到可交换氢。应予说明，br.是指宽信号(broad)。
HPLC制备色谱法可以使用市售ODS柱，若无特别说明以水/甲醇(含甲酸)作为洗脱液通过梯度洗脱进行制备。
实施例1
2-(3-{6-氨基-2-[(4-吗啉代苯基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
(第1步骤)
在氮气氛中，向冷却至0℃的4-溴-2-氟-6-甲基苯甲酸(13.0g，55.8mmol)的THF溶液(100mL)中加入1,1’-羰基二咪唑(11.8g，72.5mmol)，0℃下搅拌2小时。用5分钟向本反应液中滴加28%氨水溶液(10mL)，室温下进一步搅拌2日。将反应混合物在减压下浓缩成约50mL后，加入6M盐酸(30mL)，用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将所得有机层合并，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，得到4-溴-2-氟-6-甲基苯甲酰胺(11.0g)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.22 (dt, J = 1.8, 0.8 Hz, 1H), 7.15 (dd, J =9.0, 1.9 Hz, 1H), 6.06 - 5.60 (m, 2H), 2.44 (s, 3H); LCMS (m/z): 231.9 [M+H]+。
(第2步骤)
在氮气氛中，向4-溴-2-氟-6-甲基苯甲酰胺(11.0g)的甲苯(110mL)和水(11mL)的混合溶液中加入环丙基硼酸(6.11g，71.1mmol)、三环己基膦(0.80g，2.84mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(0.43g，0.47mmol)、以及碳酸钾(19.65g，142.0mmol)，115℃下搅拌14小时。冷却至室温后，将析出的固体滤出，所得固体用乙醚(ether)和水洗涤，得到4-环丙基-2-氟-6-甲基苯甲酰胺(3.3g)。进而，滤液用乙酸乙酯(2×200mL)萃取，将所得有机层合并，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到4-环丙基-2-氟-6-甲基苯甲酰胺(5.3g)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.80 - 6.70 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 11.3, 1.6Hz, 1H), 5.99 - 5.59 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.89 - 1.80 (m, 1H), 1.03 - 0.98(m, 2H), 0.73 - 0.65 (m, 2H); LCMS (m/z): 194.0 [M+H]+。
(第3步骤)
在氮气氛中，向采用与第2步骤同样的方法制成的4-环丙基-2-氟-6-甲基苯甲酰胺(8.6g，44.5mmol)的2-甲基四氢呋喃溶液(100mL)中加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(7.0g，58.8mmol)，60℃下搅拌2小时。将反应溶液减压浓缩后，向所得残渣中加入2-甲基四氢呋喃(10mL)。向所得溶液中滴加1mol/L叔丁醇钾的THF溶液(68.1mL，68.1mmol)，65℃下搅拌1日。冷却至室温后，将反应混合物加入1M盐酸水溶液(200mL)中。向所得溶液中加入异丙醇(300mL)，减压蒸馏除去溶剂。将所得固体滤出，得到6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮(7.7g)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11.06 (s, 1H), 7.16 (d, J = 1.6 Hz, 1H),7.11 (dd, J = 7.1, 5.7 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.41 (dd, J= 7.1, 2.3 Hz, 1H), 2.07 - 1.95 (m, 1H), 1.08 - 1.01 (m, 2H), 0.86 - 0.79 (m,2H); LCMS (m/z): 204.1 [M+H]+。
(第4步骤)
在氮气氛中，向6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮(2.6g，12.8mmol)的DMF溶液(25mL)中加入2-溴-6-氯苯甲醛(3.65g，16.63mmol)、碳酸钾(3.54g，25.6mmol)和碘化铜(I)(0.49g、2.56mmol)，110℃下搅拌1日。反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释后，将不溶物过滤，滤液用水和饱和食盐水依次洗涤后，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到2-氯-6-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苯甲醛(2.7g)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.18 (s, 1H), 7.84 - 7.78 (m, 1H), 7.75(dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.6 Hz, 1H), 6.64 (dd,J = 7.5, 2.2 Hz, 1H), 2.14 - 2.01 (m, 1H), 1.14 - 1.06 (m, 2H), 0.92 - 0.83(m, 2H); LCMS (m/z): 342.1 [M+H]+。
(第5步骤)
在氮气氛中，向冷却至0℃的2-氯-6-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苯甲醛(2.5g，7.32mmol)的DCM(26mL)和异丙醇(13mL)的混合溶液中加入硼氢化钠(0.42g，11.0mmol)，0℃下搅拌2小时。向反应溶液中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将所得有机层合并，用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，得到2-[3-氯-2-(羟甲基)苯基]-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮(2.3g)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.55 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.40 (t, J =8.0 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.08 - 7.00 (m, 2H), 6.82 (dd, J= 12.7, 1.7 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 4.71 - 4.61 (m, 1H),4.46 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.43 - 3.29 (m, 1H), 2.03 - 1.97 (m, 1H), 1.18 -1.10 (m, 2H), 0.88 - 0.81 (m, 2H); LCMS (m/z): 343.9 [M+H]+。
(第6步骤)
在氮气氛中，向2-[3-氯-2-(羟甲基)苯基]-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮(2.26g，6.59mmol)的DCM溶液(30mL)中加入吡啶(2.36mL，29.3mmol)和乙酰氯(1.56mL，21.95mmol)，室温下搅拌1日。向反应混合物中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将所得有机层合并，用水和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到乙酸2-氯-6-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苄酯(2.3g)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.53 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 7.46 - 7.39(m, 1H), 7.22 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.04 - 6.98 (m, 2H), 6.80 (dd, J =12.6, 1.7 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 12.5 Hz, 1H),4.98 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.02 - 1.96 (m, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.16 - 1.10 (m,2H), 0.86 - 0.81 (m, 2H); LCMS (m/z): 386.0 [M+H]+。
(第7步骤)
在氮气氛中，向采用与第6步骤同样的方法制成的乙酸2-氯-6-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苄酯(4.8g，12.44mmol)的二噁烷溶液(180mL)中加入双(频哪醇合)二硼(9.48g，37.3mmol)、双(二亚苄基丙酮)钯(0)(0.36g，0.62mmol)、2,4,6-三异丙基-2’-(二环己基膦基)联苯(0.59g，1.24mmol)、以及乙酸钾(3.66g，37.3mmol)，65℃下加热16小时。将反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释后，对不溶物进行硅藻土过滤。向滤液中加入水(200mL)，用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。将所得有机层合并，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化。向所得油状残渣中加入己烷，将析出的固体滤出，得到乙酸2-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(dioxaborolan)-2-基)苄酯(3.05g)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.93 (dd, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 7.47 (t, J =7.6 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.00(d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 12.7, 1.7 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 7.4, 2.1Hz, 1H), 5.45 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 2.03 - 1.93(m, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.34 (s, 12H), 1.15 - 1.08 (m, 2H), 0.87 - 0.80 (m,2H); LCMS (m/z): 478.2 [M+H]+。
(第8步骤)
使用微波反应装置使4-氨基-2,6-二氯嘧啶(736mg，4.49mmol)和4-吗啉代苯胺(400mg，2.24mmol)的二甲氧基乙烷溶液(18mL)在120℃下反应12小时。将反应混合物冷却至室温后，对不溶物进行过滤，向滤液中加入水，用乙酸乙酯萃取。将所得有机层用水和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到6-氯-N2-(4-吗啉代苯基)嘧啶-2,4-二胺(218mg)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.06 (s, 1H), 7.61 - 7.50 (m, 2H), 6.89 -6.79 (m, 4H), 5.84 (s, 1H), 3.76 - 3.69 (m, 4H), 3.05 - 2.97 (m, 4H); LCMS(m/z): 306.1 [M+H]+。
(第9步骤)
向第7步骤中制成的乙酸2-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄酯(54mg，0.11mmol)和6-氯-N2-(4-吗啉代苯基)嘧啶-2,4-二胺(35mg，0.11mmol)的二甲氧基乙烷溶液(1.7mL)中，加入四(三苯基膦)钯(0)(13.2mg，0.011mmol)和碳酸钾(32mg，0.23mmol)的水溶液(0.57mL)，使用微波反应装置在110℃下反应10分钟。向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取。将所得有机层用水和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到2-(3-{6-氨基-2-[(4-吗啉代苯基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮与其乙酰基保护体的混合物。将所得混合物溶解在甲醇(2mL)中，加入碳酸钾(100mg，0.724mmol)，室温下搅拌2小时。将反应混合物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。将所得有机层用水和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，得到标题化合物(23mg)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.87 (s, 1H), 7.62 - 7.48 (m, 4H), 7.43 -7.24 (m, 3H), 6.99 (dd, J = 13.2, 1.7 Hz, 1H), 6.88 - 6.79 (m, 2H), 6.74 (s,2H), 6.60 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.03 - 4.95 (m, 1H), 4.33- 4.24 (m, 1H), 4.11 - 4.00 (m, 1H), 3.76 - 3.69 (m, 4H), 3.04 - 2.97 (m,4H), 2.13 - 2.02 (m, 1H), 1.14 - 1.03 (m, 2H), 0.91 - 0.82 (m, 2H) LCMS (m/z): 579.1 [M+H]+。
实施例2
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮
(第1步骤)
向4-氨基-2,6-二氯嘧啶(469mg，2.86mmol)和1-甲基-1H-吡唑-4-胺(139mg，1.43mmol)的乙醇溶液(2.8mL)中滴加2M盐酸2滴，80℃下搅拌3.5小时。冷却至室温后，对不溶物进行过滤。将滤液用水稀释，用乙酸乙酯萃取。将所得有机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到6-氯-N2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺(40mg)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.16 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.44 (s, 1H),6.97 - 6.71 (m, 2H), 5.80 (s, 1H), 3.77 (s, 3H) ; LCMS (m/z): 225.1 [M+H]+。
(第2步骤)
向实施例1的第7步骤中制成的乙酸2-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄酯(121mg，0.25mmol)、以及采用与第1步骤同样的方法制成的6-氯-N2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺(57mg，0.25mmol)的二甲氧基乙烷溶液(3.8mL)中，加入四(三苯基膦)钯(0)(29.3mg，0.025mmol)和碳酸钾(70mg，0.5mmol)的水溶液(1.2mL)，使用微波反应装置在110℃下反应10分钟。向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取。将所得有机层用水和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，所得残渣用柱色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮与其乙酰基保护体的混合物。将所得混合物溶解在甲醇(2mL)中，加入碳酸钾(100mg，0.724mmol)，室温下搅拌2小时。将反应混合物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。将所得有机层用水和饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，得到标题化合物(78mg)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.95 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.58 - 7.44(m, 3H), 7.44 - 7.31 (m, 2H), 7.27 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 13.3,1.6 Hz, 1H), 6.79 (s, 2H), 6.61 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 6.06 (s, 1H), 5.15(s, 1H), 4.33 - 4.24 (m, 1H), 4.12 - 3.98 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 2.13 - 2.02(m, 1H), 1.15 - 1.03 (m, 2H), 0.92 - 0.82 (m, 2H); LCMS (m/z): 498.5 [M+H]+。
实施例3~26
以下的实施例化合物[表1-1]~[表1-2]采用下列方法制备：使用各自对应的原料(市售品，或由市售化合物通过公知方法或以其为基准的方法进行衍生物化所得的化合物)，按照上述实施例记载的方法，根据需要适当组合有机合成化学中常用的方法。
另外，各化合物的物理化学数据示于[表2-1]~[表2-2]。
[表1-1]
。
[表1-2]
。
[表2-1]
。
[表2-2]
。
实施例27
2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮盐酸盐
室温下向实施例2中制成的2-(3-{6-氨基-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2H)-酮(100mg，0.20mmol)的乙醇悬浮液(2mL)中加入2M盐酸-乙醇溶液(0.1mL，0.20mmol)，搅拌1小时。向反应溶液中加入乙酸乙酯，将所得固体滤出，得到标题化合物(73mg)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 13.00 - 11.91 (m, 1H), 9.80 - 9.44 (m, 1H),8.75 - 8.15 (m, 2H), 8.12 - 7.97 (m, 1H), 7.72 - 7.51 (m, 4H), 7.37 - 7.24(m, 2H), 7.01 (dd, J = 13.2, 1.7 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H),6.25 (s, 1H), 5.74 - 4.72 (m, 1H), 4.37 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.26 (d, J =12.5 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.14 - 2.03 (m, 1H), 1.16 - 1.05 (m, 2H), 0.92 -0.82 (m, 2H); LCMS (m/z): 498.3 [M+H]+。
试验例1
对BTK的活性抑制试验
(去磷酸化BTK的制备)
去磷酸化BTK通过以下方式得到：向生物素化BTK蛋白质BTN-BTK(Carna Biosciences,Inc.制)酶溶液中加入λ蛋白磷酸酶(New England BioLabs公司制，Code No.P0753S)和MnCl2，使浓度分别达到10U/μg、2mM，4℃下反应一夜后，采用抗DYKDDDDK-tag抗体琼脂糖凝胶层析将λ蛋白磷酸酶除去，然后使用10DG脱盐柱(Desalting Column)进行缓冲液交换。
(激酶活性的测定方法)
使用QuickScout Screening Assist(商标)MSA(Carna Biosciences, Inc.制市售试剂盒)，通过迁移率变动分析(MSA)法对激酶活性进行测定。激酶反应的底物采用试剂盒附带的FITC标记SRCtide肽。使用试验缓冲液[20mM HEPES、0.01% Triton X-100(商标)、2mM二硫苏糖醇(dithiothreitol)、pH7.5]，调节为底物(4μM)、MgCl2(20mM)、ATP(200μM)，制成底物混合液。另外，用试验缓冲液将去磷酸化BTK稀释至0.6nM，制成酶溶液。用DMSO进一步由被测化合物的10mM DMSO溶液稀释为10个浓度(0.00003mM、0.0001mM、0.0003mM、0.001mM、0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3mM、1mM)，各浓度溶液分别用试验缓冲液稀释25倍，作为药物溶液(4%DMSO溶液)。将药物溶液或对照溶液(4%DMSO-试验缓冲液)5μL、底物混合液5μL、以及酶溶液10μL在聚丙烯制384孔板的孔中进行混合，室温下反应1小时后，添加60μL试剂盒附带的终止缓冲液使反应停止。随后，使用LabChip EZ Reader II系统(Caliper Life Sciences公司制)，按照分析试剂盒的试验方案(protocol)测定反应溶液中的底物(S)和磷酸化的底物(P)的量。
(BTK抑制活性的评价方法)
将分离的底物和磷酸化的底物的各个峰的高度分别作为S和P，另外添加试验缓冲液代替酶溶液作为空白进行测定。
被测化合物的抑制率(%)按照下式计算：
抑制率(%)＝(1-(C-A)/(B-A))×100
其中，A、B、C分别表示空白孔的P/(P+S)、对照溶液孔的P/(P+S)、化合物添加孔的P/(P+S)。
另外，通过抑制率和被测化合物浓度(对数)的回归分析计算IC50值。
(评价结果)
本发明化合物对去磷酸化BTK的IC50值为1μM以下，表明本发明化合物显示出强抑制活性。代表性化合物的去磷酸化BTK抑制活性示于表3。
[表3]
。
试验例2
细胞内BTK的自身磷酸化活性抑制试验
(所用细胞的培养)
Ramos细胞(2G6.4C10、ATCC公司，No.CRL-1923)在T75烧瓶中，使用添加有10%FBS(AusGene公司)和5%青霉素-链霉素(Nacalai Tesque, Inc.)的RPMI-1640培养基(GIBCO公司、＃A10491-01)(以下称为生长培养基)，在5%CO2培养箱内进行培养。
(被测化合物的添加)
用除去血清的RPMI-1640培养基(以下称为培养基)将培养后的Ramos细胞稀释至细胞密度7.5×106cells/mL，37℃下保温45分钟。将细胞悬浮液按每份1mL等分于2.0mL试管中后，用培养基将被测化合物的0.3mM DMSO溶液稀释至0.9μM，添加500μL稀释至0.9μM的被测化合物溶液，在被测化合物的终浓度为0.3μM的条件下于37℃培养1小时。然后，添加用培养基稀释的抗IgM抗体(Invitrogen，H15100)使终浓度达到10μg/mL，37℃下培养10分钟。
(蛋白质的提取)
向通过离心操作回收细胞所得的团粒(pellets)中添加100μL的Lysis缓冲液[在RIPABuffer(×1)(Cell Signaling Technology公司)中添加1% 磷酸酶抑制剂 Cacktail 3(Sigma公司、No.P0044)、1% 磷酸酶抑制剂 Cacktail (Nacalai Tesque, Inc.、No.07575)和1mM 苯甲基磺酰氟(PMSF)而成的缓冲液]，轻微搅拌后静置10分钟。通过离心操作(15000rpm、15分钟)回收上清液，对蛋白质量进行定量。与SDS-样品缓冲液混合，95℃下反应5分钟，使蛋白质变性，得到样品溶液。向4-20%的梯度丙烯酰胺凝胶(gradientacrylamide gel，COSMO BIO Co., Ltd.、No.414879)的各孔内按每孔5μL上样样品溶液，进行电泳。然后，使用iBlot凝胶转移系统(Life Technologies Corporation)将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜。
(BTK或磷酸化BTK的检测)
用2%ECL主要阻断试剂(prime blocking Reagent，GE HEALTHCARE)对转移后的PVDF膜进行阻断处理，然后，使用抗BTK小鼠抗体(BDtransduction laboratory公司、No.611116)或抗磷酸化BTK兔抗体(pY223、EPITOMICS公司、No.2207-1)作为一抗，4℃下反应1夜。未反应的一抗用TBST缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.1% Tween20)洗涤后，使用HRP标记的抗小鼠IgG山羊抗体(Life Technologies Corporation、No.62-6520)或者抗兔IgG山羊抗体(Life Technologies Corporation、No.65-6120)作为二抗，在添加有2%ECL主要阻断试剂的TBST缓冲液中、室温下反应1小时。未反应的二抗用TBST缓冲液洗涤后，使用ECL主要蛋白质印迹法实验系统(Prime Western Blotting Detection System，GEHEALTHCARE)，按照附带的试验方案进行反应，然后使用CCD相机(ATTO、Light-CaptureII)，通过化学发光对各条带进行检测。通过光密度测定法(ATTO CS Analyzer ver3.0)将检测出的条带数值化，以未添加化合物且IgM刺激组的磷酸化BTK条带的发光为100%、以未添加化合物且IgM无刺激组的磷酸化BTK条带的发光为0%，从各组中条带的强度计算出抑制率。应予说明，各磷酸化BTK条带由总BTK进行校正。
本试验中使用的一抗和二抗的组合及稀释浓度如下所示。
[表4]
。
试验例2的结果表明，本发明的化合物对于“细胞内BTK的自身磷酸化活性作用”也具有强抑制作用。
试验例3
Ramos细胞内钙离子变化抑制试验
通过测定本发明的化合物对“抗IgM抗体的BCR刺激引起的细胞内钙流入”的作用来验证本发明的化合物所引起的细胞内BTK抑制。
(细胞悬浮液以及钙指示剂的添加)
在测定前一天，将Ramos细胞再悬浮于新鲜的生长培养基(与试验例2相同的生长培养基)中培养至细胞密度达到1.0×106cells/mL，次日，通过离心操作回收细胞，用添加有5%青霉素-链霉素(Nacalai Tesque, Inc.)的RPMI-1640培养基(培养基1)进行洗涤。将该细胞再悬浮于添加有1%Ultra Low IgG FBS(GIBCO，＃16250)和5%青霉素-链霉素(NacalaiTesque, Inc.)的RPMI-1640培养基(培养基2)中使细胞密度达到2.0×106cells/mL，然后将细胞悬浮液按每孔100μL添加至覆有多聚赖氨酸的微孔板(BD BioCoatTM、＃356692)的各孔中，离心操作(700rpm、3分钟)后，在37℃的5%CO2培养箱内培养1小时。将钙指示剂Fluo-8NW载染料(dye-loading)溶液(AAT Bioquest，＃36315)按每孔100μL添加至各孔中，在37℃的5%CO2培养箱内进一步培养30分钟。
(被测化合物的添加)
用DMSO由被测化合物的10mM DMSO原液进一步稀释为0.2mM，另将不含被测化合物的DMSO溶液作为对照，将稀释液和对照液分别用培养基2稀释47.6倍，按每孔10μL添加到上述板的各孔中，37℃下培养10分钟(被测化合物的终浓度：0.2μM)。
(钙离子浓度的测定)
Ramos细胞内钙离子浓度是使用酶标仪(SynergyH1)对钙指示剂Fluo-8NW的荧光强度进行测定(Ex/Em＝490/525nm)。测定基线15秒钟后，在上述各孔中添加用培养基2稀释至10.4μg/mL的抗IgM抗体(Invitrogen、＃H15100)50μL(最终浓度2.0μg/mL)，进行BCR刺激，进一步进行150秒测定。
图1表示实施例1和实施例2的化合物的结果。如图1所示，本发明的化合物抑制了“抗IgM抗体的BCR刺激引起的细胞内钙离子变化”，可理解为有效抑制了BCR信号。
产业适用性
本发明所提供的化合物作为对于例如自身免疫疾病、变应性疾病之类的炎性疾病、骨病、淋巴瘤之类的癌等已知与通过BTK的异常细胞应答相关的疾病的预防或治疗用药物(药物组合物)有用。另外，作为BTK抑制剂，对于实验用、研究用的试剂有用。

Claims (2)

1.下式(I)代表的2,6-二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐：
式中，R1表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的烷氧基，Ar表示任选具有取代基的芳基、任选具有取代基的杂芳基，Z1和Z2表示碳原子、或者Z1和Z2中任一个或两个表示氮原子，Q表示选自以下结构(a)或(b)的结构：
R2表示任选具有取代基的低级烷基、任选具有取代基的环烷基，R3表示氢原子、卤素原子，Y表示氮原子或碳原子，结构(a)中虚线和实线的双线表示双键或单键。
2.权利要求1所述的2,6-二氨基嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其中，Q为结构(a)。
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