CN105732768A

CN105732768A - 两亲性多肽和杂合脂质体及其制备方法以及载药杂合脂质体及其制备方法

Info

Publication number: CN105732768A
Application number: CN201410743416.2A
Authority: CN
Inventors: 赵颖; 聂广军; 季天骄; 郎佳妍; 覃好
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-12-08
Also published as: CN105732768B

Abstract

两亲性多肽和杂合脂质体及其制备方法以及载药杂合脂质体及其制备方法。本发明公开了一种酶响应性的两亲性多肽，该多肽的结构如式(1)所示：其中，R为氨基酸残基，n为4-10的整数，n个R相同或不同，且所述n个R构成至少一种能够被酶水解的多肽片段。本发明还提供了一种酶响应性的杂合脂质体及其制备方法，该方法包括：将本发明所述的两亲性多肽与磷脂接触。本发明还提供了一种酶响应性的载药杂合脂质体及其制备方法，该方法包括：将本发明所述的两亲性多肽、药物化合物和磷脂接触。利用本发明提供的酶响应性的两亲性多肽制备得到的药物载体具有特异性高、载药效果好、释药速率适中以及稳定性好的优点，而且，本发明的制备方法简便，成本低。

Description

两亲性多肽和杂合脂质体及其制备方法以及载药杂合脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料研究领域，具体地，涉及一种酶响应性的两亲性多肽、一种酶响应性的杂合脂质体的制备方法以及通过该方法制备得到的酶响应性的杂合脂质体、一种载药杂合脂质体的制备方法以及通过该方法制备得到的载药杂合脂质体。

背景技术

近年来纳米药物载体的开发和研究受到了广泛的关注。纳米药物载体具有很多优势，例如：纳米颗粒易于制备、修饰加工且可控性好，可保护药物、基因或功能性分子免受机体或一些酶类的降解作用等。某些纳米颗粒在充当“载体”角色的同时，还具有免疫佐剂的功能。

而脂质体是一种人工囊泡结构，脂质体在水中时，磷脂分子的亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径可以控制在25-1000nm范围内，制备脂质体时通常会掺杂一定质量的胆固醇，使其结构稳定。由于脂质体优良的亲水和疏水性能，因此可以可作为基因、蛋白以及小分子药物载体。

利用天然脂质体作为药物载体时具有以下几方面的优势：尺寸可控，操作简单；成本低，废物少；载药效率高，可载亲水、疏水药物。然而，天然脂质体缺少功能，而人工合成的脂质体虽然便于修饰功能基团，但成本大幅增加，且合成过程也更加繁琐。

另外，对于一些疾病，尤其是当今对人类威胁最大的恶性肿瘤，药物的靶向运输以及肿瘤的抗药性始终是临床的难题；且肿瘤组织有着复杂的微环境，其大量的间质细胞在阻止药物运输方面起着重要的作用。对于酶响应性材料的设计，多肽具有特有的优势，通过设计，将含有酶切位点的多肽序列设计到材料中，材料便可能具有酶响应活性，从而实现肿瘤的诊断或治疗。然而，目前利用多肽设计酶响应性材料时仍然存在多肽合成成本相对较高的缺点。而且，修饰到材料上时，通常需要过量的多肽，难以保证利用率，同时，化学反应操作相对复杂，很难做到大量生产。因此，开发特异性高、制备方法简单、释药速率快的酶响应性药物载体很有必要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种酶响应性的两亲性多肽，同时利用该酶响应性的两亲性多肽制备得到的药物载体具有特异性高、载药效果好、释药速率适中以及稳定性好的优点，而且，本发明的制备方法简便，成本低。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供一种酶响应性的两亲性多肽，该多肽的结构如式(1)所示：

其中，R为氨基酸残基，n为4-10的整数，n个R相同或不同，且n个R构成至少一种能够被酶水解的多肽片段。

第二方面，本发明提供一种酶响应性的杂合脂质体的制备方法，该方法包括：将两亲性多肽与磷脂进行接触，其中，所述两亲性多肽为本发明所述的两亲性多肽。

第三方面，本发明提供一种由上述方法制备得到的酶响应性的杂合脂质体；优选所述杂合脂质体的平均粒径为40-200nm。

第四方面，本发明提供一种酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，该方法包括：将两亲性多肽、药物化合物和磷脂进行接触，其中，所述两亲性多肽为本发明所述的两亲性多肽。

第五方面，本发明提供一种由上述方法制备得到的酶响应性的载药杂合脂质体；优选所述载药杂合脂质体的平均粒径为40-200nm。

利用本发明提供的酶响应性的两亲性多肽制备得到的药物载体具有特异性高、载药效果好、释药速率适中以及稳定性好的优点，而且，本发明的制备方法简便，成本低。

特别地，本发明提供的杂合脂质体可以利用天然磷脂制备得到，从而使得本发明提供的杂合脂质体和载药杂合脂质体具有很好的生物相容性以及生物安全性。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1表示通过透射电镜观察实施例4中的酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1的形貌图。

图2表示通过激光粒度分析仪测得的实施例4中的酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1的粒径分布图。

图3表示通过透射电镜观察实施例4中的酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1被酶切释药后的形貌图。

图4表示实施例4中的酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1在有酶切条件下的释药曲线。

图5表示实施例4中的酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1在无酶切条件下的释药曲线。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“溶液”的范围并不限于分散质的粒子直径小于1nm的分散系(真溶液)，而是泛指均一的液态混合物，可以包括胶状分散体(胶体溶液)。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，液体的体积数值均为标准状态下的数值。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，所述“第一”和“第二”不代表先后次序，仅用于区分，本领域技术人员不应理解为对本发明的技术方案的限制。

在本发明中，所述4-10的整数包括4、5、6、7、8、9和10中的任意整数。

在本发明中，在式(1)中，所述“R_n”表示n个R依次连接的重复单元。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，所述的接触或混合可以在搅拌的条件下进行。搅拌的速度可以为常规的选择。本发明的发明点主要在于结构如式(1)所示的酶响应性的两亲性多肽以及由此酶响应性的两亲性多肽与磷脂(特别是天然磷脂)接触和/或混合所获得的杂合脂质体及其制备方法，本发明的技术方案中对接触和/或混合的操作方法并没有特别的限定。

第一方面，本发明提供了一种酶响应性的两亲性多肽，该多肽的结构如式(1)所示：

在本发明中，所述氨基酸残基可以为任意种类的氨基酸残基。

根据本发明提供的如式(1)所示的两亲性多肽，对其中的多肽片段的合成方法没有特别的限定，可以为本领域内常规的合成的方法，例如可以通过固相合成法合成本发明所述的由n个R构成的能够被酶水解的多肽片段。

优选情况下，在本发明中，所述n个R构成至少一种能够被酶水解的多肽片段能够特异性地被在肿瘤部位特异表达的酶水解或剪切。

根据本发明所述的酶响应性的两亲性多肽，其中，所述多肽片段可以包括能够被金属基质蛋白酶家族(MMPs)和/或成纤维激活蛋白酶(FAP-α)水解的多肽片段。

更加优选情况下，在本发明中，所述金属基质蛋白酶家族包括金属基质蛋白酶II(MMP-2)。

在本发明中，需要特别说明的是，所述酶响应性的两亲性多肽可以采用本领域内常规使用的方法进行制备，本领域技术人员在了解了本发明的所述酶响应性的两亲性多肽的结构式后可以采用现有技术提供的方法进行制备，例如本发明的实施例中示例性地采用如下所述的文献1提供的类似方法进行制备：

文献1：JingxiaoChen等，Biomaterials，2011，Vol32，1678-1684。

第二方面，本发明提供了一种酶响应性的杂合脂质体的制备方法，该方法包括：将两亲性多肽与磷脂进行接触，其中，所述两亲性多肽为本发明所述的两亲性多肽。

根据本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法，其中，需要特别说明的是，由于所述两亲性多肽为本发明所述的两亲性多肽，因此，关于本发明前述的两亲性多肽的定义、范围以及解释均适用于本发明的酶响应性的杂合脂质体的制备方法中，本发明在此不再赘述。

根据本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法，其中，所述接触的条件可以包括：pH值为6-8，优选为6.5-7.5。

根据本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法，其中，所述接触的条件可以包括：接触的温度为4-45℃，优选为20-40℃。

根据本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法，其中，所述接触的条件可以包括：接触的时间为1-60min，优选为1-30min。

在本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法中，相对于每重量份的两亲性多肽，所述磷脂的用量可以为1-40重量份，优选为5-20重量份。

优选情况下，在本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法中，所述磷脂优选为天然磷脂；特别优选所述磷脂为卵磷脂。

在本发明所述酶响应性的杂合脂质体的制备方法中，所述天然磷脂例如可以包括天然大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂中的至少一种。

需要特别说明的是，在本发明中，在制备所述酶响应性的杂合脂质体时，可以加入适量的胆固醇，使得获得的酶响应性的杂合脂质体结构稳定。

根据本发明的一种优选的具体实施方式，所述酶响应性的杂合脂质体的制备方法可以包括：将本发明所述的酶响应性的两亲性多肽与第一溶剂(可以包括甲醇、乙醇、二氯甲烷和三氟乙醇中的至少一种)混合得到溶液A，并且将所述磷脂和胆固醇溶于第二溶剂(可以包括二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮中的至少一种)，形成溶液B；然后再将所述溶液A和溶液B进行接触。

在本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法中，该方法还可以包括：旋蒸除去所述两亲性多肽与磷脂接触后得到的产物中的溶剂，然后成膜，得到第一产物；用磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)溶解所述第一产物后依次进行第一超声和离心分离；再次向离心分离后得到的下层白色或乳白色沉淀中加入所述PBS缓冲液，然后进行第二超声，即可以得到分散均匀的本发明所述的酶响应性的杂合脂质体。

在本发明中，对两次所述PBS缓冲液的用量均没有特别的限定，本领域技术人员可以在本领域的常规用量范围内进行选择。

根据本发明所述的酶响应性的杂合脂质体的制备方法制备得到的酶响应性的杂合脂质体为大小均一且稳定的囊泡结构。

根据本发明的另一种优选的具体实施方式，本发明的酶响应性的杂合脂质体的制备方法包括：

1)将所述酶响应性的两亲性多肽与第一溶剂混合，得到溶液A；并且将所述磷脂和胆固醇溶于第二溶剂，得到溶液B；

2)将步骤1)中的所述溶液A和溶液B进行接触；

3)旋蒸除去步骤2)中两亲性多肽与磷脂接触后得到的产物中的溶剂，得到第一产物；

4)用PBS缓冲液溶解步骤3)中的所述第一产物后依次进行第一超声和离心分离；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的下层白色或乳白色沉淀中加入所述PBS缓冲液，然后进行第二超声，得到酶响应性的杂合脂质体。

第三方面，本发明提供一种由上述方法制备得到的酶响应性的杂合脂质体。

根据本发明所述的酶响应性的杂合脂质体，优选情况下，所述杂合脂质体的平均粒径为40-200nm。

第四方面，本发明提供一种酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，该方法包括：将两亲性多肽、药物化合物和磷脂接触，其中，所述两亲性多肽为本发明所述的两亲性多肽。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，其中，需要特别说明的是，由于该方法中的所述两亲性多肽为本发明前述的两亲性多肽，因此，关于本发明前述的两亲性多肽的定义、范围以及解释均适用于本发明的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，本发明在此不再赘述。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，其中，所述接触的条件可以包括：pH值为6-8，优选为6.5-7.5。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，其中，所述接触的条件可以包括：接触的温度为4-45℃，优选为20-40℃。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，其中，所述接触的条件可以包括：接触的时间为1-60min，优选为1-30min。

在本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，相对于每重量份的两亲性多肽，所述磷脂的用量可以为1-40重量份；优选为5-20重量份。

在本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，相对于每重量份的两亲性多肽，所述药物化合物的用量为0.5-10重量份；优选为1-5重量份。

优选情况下，在本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，所述优选磷脂为天然磷脂。

在本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，所述天然磷脂例如可以包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂中的至少一种。

需要特别说明的是，在本发明中，在制备所述酶响应性的载药杂合脂质体时，可以加入适量的胆固醇，使得获得的酶响应性的载药杂合脂质体结构更加稳定。

在本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，所述药物化合物可以包括抗肿瘤化疗药物和抗纤维化药物中的至少一种。

优选情况下，在本发明所述的方法中，所述药物化合物可以包括亲水性药物和疏水性药物中的至少一种。

特别优选情况下，在本发明所述的方法中，所述药物化合物例如可以为阿霉素、紫杉醇、长春碱、顺铂、喜树碱、姜黄素和吡啡尼酮中的至少一种。更优选为阿霉素。

在本发明中，为了形成更加稳定的酶响应性的载药杂合脂质体，在包载疏水性药物化合物模型中，优选将所述疏水性药物化合物进行预处理，以阿霉素为例，可以采用如下方法对本发明所述的药物化合物进行预处理：

按照文献(EunSeongLee等.可控释放杂志(J.Control.Release)2005,103,405)提供的方法，将盐酸阿霉素溶解在二甲基亚砜中，并加入适量三乙胺，室温条件下进行避光反应；然后进行透析并将所得透析袋中样品冻干，得到经过预处理后疏水性的阿霉素。

根据本发明的一种优选的具体实施方式，当所包载的药物化合物为疏水性药物化合物时，所述酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法可以包括：将本发明所述的酶响应性的两亲性多肽与所述第一溶剂混合得到溶液A，并且将所述磷脂、胆固醇和经过预处理后的疏水性药物化合物溶于所述第二溶剂中，形成溶液C；然后再将所述溶液A和溶液C进行接触。

在本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，该方法还可以包括：旋蒸除去两亲性多肽、疏水性药物化合物和磷脂进行接触后得到的产物中的溶剂，得到第一产物；向第一产物中加入PBS缓冲液后依次进行第一超声和离心分离；再次向离心分离后得到的沉淀中加入所述PBS缓冲液，然后进行第二超声，即可以得到分散均匀的本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体。

在本发明中，所述第一超声和第二超声的条件可以相同或不同，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，本发明对此没有特别的限定。并且，所述酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中的第一超声和第二超声也可以相应地与所述酶响应性的杂合脂质体的制备方法中的第一超声和第二超声相同。

在本发明所述酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法中，对两次所述PBS缓冲液的用量均没有特别的限定，本领域技术人员可以在本领域的常规用量范围内进行选择。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法制备得到的酶响应性的杂合脂质体为大小均一且稳定的囊泡结构。

根据本发明的另一种优选的具体实施方式，当所包载的药物化合物为疏水性药物化合物时，本发明的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法包括：

1)将所述酶响应性的两亲性多肽与第一溶剂混合，得到溶液A；并且将所述磷脂、疏水性药物化合物和胆固醇溶于第二溶剂，得到溶液C；

2)将步骤1)中的所述溶液A和溶液C进行接触；

3)旋蒸除去步骤2)中两亲性多肽、药物化合物和磷脂接触后得到的产物中的溶剂，得到第一产物；

4)用PBS缓冲液溶解步骤3)中的所述第二产物后依次进行第一超声和离心分离；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的沉淀中加入所述PBS缓冲液，然后进行第二超声，得到酶响应性的载药杂合脂质体。

根据本发明的另一种优选的具体实施方式，当所包载的药物化合物为亲水性药物化合物时，本发明的酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法包括：

2)将步骤1)中的所述溶液A和溶液B进行接触；

3)旋蒸除去步骤2)中两亲性多肽和磷脂接触后得到的产物中的溶剂，得到第一产物，并向其中加入含有所述亲水性药物化合物的PBS缓冲液，得到第二产物；

4)将所述第二产物依次进行第一超声和离心分离；

第五方面，本发明提供了一种由上述方法制备得到的酶响应性的载药杂合脂质体。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体，优选所述酶响应性的载药杂合脂质体的平均粒径为40-200nm。

根据本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体，所述酶响应性的载药杂合脂质体中包载的药物化合物中的浓度可以为0.01-10mmol/L；优选情况下，所述酶响应性的载药杂合脂质体中包载的药物化合物中的浓度可以为0.05-5mmol/L。

在本发明中，所述溶液A是指含有所述第一溶剂和两亲性多肽的溶液；所述溶液B是指含有所述第二溶剂、所述磷脂和胆固醇的溶液；所述溶液C是指含有所述第二溶剂、所述磷脂、疏水性药物化合物和胆固醇的溶液。

在本发明中，本领域的技术人员可以采用本领域常规使用的手段进行接触和/或混合，只要能够获得本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体即可，例如本发明的实施例中采用透析的方法实现两亲性多肽与药物化合物接触和/或混合以获得本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所使用的各种原料均来自商购。

在以下实施例和对比例中，所使用的PBS缓冲液的浓度均为0.01mol/L。

制备例1

本制备例用于合成本发明式(1)所示结构的两亲性多肽，其中，n为7，且构成所述能够被酶水解的多肽片段的7个氨基酸残基依次为异亮氨酸残基、脯氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、亮氨酸残基、精氨酸残基和丝氨酸残基，且多肽片段中首端的异亮氨酸残基与式(1)所示结构中相应的羧基连接，末端的丝氨酸残基与式(1)所示结构中相应的氨基连接。

根据文献(JingxiaoChen等，Biomaterials，2011，Vol32，1678-1684)提供的方法，合成如式(1)所示的两亲性多肽T1。

经质谱(飞行时间质谱，MALDI-TOF，BRUKER，microflex.LRF，USA)鉴定，两亲性多肽T1的分子量为2209Da。

制备例2

本制备例用于合成本发明式(1)所示结构的两亲性多肽，其中，n为8，且构成所述能够被酶水解的多肽片段的9个氨基酸残基依次为甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺且多肽片段中首端的甘氨酸与式(1)所示结构中相应的羧基连接，末端的谷氨酰胺与式(1)所示结构中相应的氨基连接。

采用如制备例1所述的方法合成如式(1)所示的两亲性多肽T2。

制备例3

本制备例用于合成本发明式(1)所示结构的两亲性多肽，其中，n为4，且构成所述能够被酶水解的多肽片段的4个氨基酸残基依次为脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甘氨酸且多肽片段中首端的脯氨酸与式(1)所示结构中相应的羧基连接，末端的甘氨酸与式(1)所示结构中相应的氨基连接。

采用如制备例1所述的方法合成如式(1)所示的两亲性多肽T3。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述的酶响应性的杂合脂质体及其制备方法。具体地，本实施例1的方法为：

1)将1mg两亲性多肽T1与1mL甲醇混合，得到溶液A；并且将8mg天然大豆卵磷脂和2mg胆固醇溶于15mL二氯甲烷，得到溶液B；

2)将所述溶液B置于100mL圆底烧瓶中，在搅拌条件下，将所述溶液A加入到所述圆底烧瓶中混合均匀，其中，混合的温度为35℃，混合反应时间为20min；

3)用旋转蒸发仪除去步骤2)中两亲性多肽T1与磷脂混合后得到的产物中的溶剂，在所述圆底烧瓶中得到一层均匀的膜，即为第一产物；

4)用5mL的PBS缓冲液溶解步骤3)中的所述第一产物，搅拌均匀后进行第一超声5min，然后将超声后得到的溶液在10000转/分钟转速下进行离心分离5min；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的下层沉淀中加入3mL的PBS缓冲液，然后进行第二超声2min，得到酶响应性的杂合脂质体Lipo-1。

通过透射电镜(美国FEI，TecnaiG220S-TWIN，200kV)观察发现所述酶响应性的杂合脂质体Lipo-1为大小较均一、稳定的囊泡形结构，通过激光粒度仪(DLS)(英国马尔文，ZetasizerNanoZS)测得平均粒径约为80nm，分散指数(PDI)为0.125。

实施例2

本实施例用于说明本发明所述的酶响应性的杂合脂质体及其制备方法。具体地，本实施例2的方法为：

1)将1mg两亲性多肽T2与1mL甲醇混合，得到溶液A；并且将15mg大豆卵磷脂和3mg胆固醇溶于20mL二氯甲烷，得到溶液B；

2)将所述溶液B置于100mL圆底烧瓶中，在搅拌条件下，将所述溶液A加入到所述圆底烧瓶中混合均匀，其中，混合的温度为35℃，混合反应时间为15min；

3)用旋转蒸发仪除去步骤2)中两亲性多肽T2与磷脂混合后得到的产物中的溶剂，在所述圆底烧瓶中得到一层均匀的膜，即为第一产物；

4)用6mL的PBS缓冲液溶解步骤3)中的所述第一产物，搅拌均匀后进行第一超声7min，然后将超声后得到的溶液在10000转/分钟转速下进行离心分离4min；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的下层白色沉淀中加入3mL的PBS缓冲液，然后进行第二超声3min，得到酶响应性的杂合脂质体Lipo-2。

通过透射电镜观察发现所述酶响应性的杂合脂质体Lipo-2为大小较均一、稳定的囊泡形结构，平均粒径约为82nm，分散指数(PDI)为0.132。

实施例3

本实施例用于说明本发明所述的酶响应性的杂合脂质体及其制备方法。具体地，本实施例3的方法为：

1)将1mg两亲性多肽T3与1mL甲醇混合，得到溶液A；并且将12mg天然大豆卵磷脂和3mg胆固醇溶于18mL二氯甲烷，得到溶液B；

2)将所述溶液B置于100mL圆底烧瓶中，在搅拌条件下，将所述溶液A加入到所述圆底烧瓶中混合均匀，其中，混合的温度为30℃，混合反应时间为10min；

3)用旋转蒸发仪除去步骤2)中两亲性多肽T3与磷脂混合后得到的产物中的溶剂，在所述圆底烧瓶中得到一层均匀的膜，即为第一产物；

4)用4mL的PBS缓冲液溶解步骤3)中的所述第一产物，搅拌均匀后进行第一超声10min，然后将超声后得到的溶液在10000转/分钟转速下进行离心分离6min；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的下层白色沉淀中加入5mL的PBS缓冲液，然后进行第二超声1min，得到酶响应性的杂合脂质体Lipo-3。

通过透射电镜观察发现所述酶响应性的杂合脂质体Lipo-3为大小较均一、稳定的囊泡形结构，平均粒径约为85nm，分散指数(PDI)为0.136。

制备例4

本制备例用于制备本发明的模型性疏水性药物，也即对所述药物化合物(阿霉素)进行预处理。

按照文献(EunSeongLee等.可控释放杂志(J.Control.Release)2005,103,405)提供的方法，将20mg盐酸阿霉素(CAS：25316-40-9)溶解在5mL二甲基亚砜中，然后加入60μL三乙胺，室温(25℃)条件下避光反应8h；然后透析24h，期间每4小时换一次水；所得透析袋中样品进行冻干，即得到疏水性阿霉素。

实施例4

本实施例用于说明本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体(包载疏水性药物)的制备方法。具体地，本实施例4的方法为：

1)将1mg两亲性多肽T1与1mL甲醇混合，得到溶液A；并且将8mg大豆卵磷脂、2mg制备例4中的疏水性阿霉素和2mg胆固醇溶于15mL二氯甲烷，得到溶液C；

2)将所述溶液C置于100mL圆底烧瓶中，在搅拌条件下，将所述溶液A加入到所述圆底烧瓶中混合均匀，其中，混合的温度为35℃，混合反应时间为25min；

3)用旋转蒸发仪除去步骤2)中两亲性多肽T1、疏水性阿霉素与磷脂混合后得到的产物中的溶剂，在所述圆底烧瓶中得到一层均匀的膜，即为第一产物；

4)用5mL的PBS缓冲液溶解步骤3)中的所述第一产物，搅拌均匀后进行第一超声5min，然后将超声后得到的溶液在10000转/分钟转速下进行离心分离2min；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的下层红色沉淀中加入5mL的PBS缓冲液，然后进行第二超声5min，得到酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1。

通过透射电镜观察发现所述酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-1为大小较均一、稳定的囊泡形结构，平均粒径为80nm，分散指数(PDI)为0.122，具体地，所述载药杂合脂质体Y-Lipo-1在透射电镜下的形貌图如图1所示；且所述载药杂合脂质体Y-Lipo-1通过激光粒度分析仪测得的粒径分布结果如图2所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明所述的酶响应性的载药杂合脂质体(包载疏水性药物)的制备方法。具体地，本实施例5的方法为：

2)将所述溶液B置于100mL圆底烧瓶中，在搅拌条件下，将所述溶液A加入到所述圆底烧瓶中混合均匀，其中，混合的温度为35℃，混合反应时间为25min；

3)用旋转蒸发仪除去步骤2)中两亲性多肽T1与磷脂混合后得到的产物中的溶剂，得到第一产物，并向其中加入5mL含有2mg的盐酸阿霉素的PBS缓冲液，得到第二产物；

4)将所述第二产物进行第一超声5min，然后将超声后得到的溶液在10000转/分钟转速下进行离心分离5min；

5)再次向经过步骤4)中离心分离后得到的下层红色沉淀中加入5mL的PBS缓冲液，然后进行第二超声5min，得到酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-2。

通过透射电镜观察发现所述酶响应性的载药杂合脂质体Y-Lipo-2为大小较均一、稳定的囊泡形结构，平均粒径为80nm，分散指数(PDI)为0.132。

测试例1

本测试例用于测定载药杂合脂质体中的药物包封率。

将实施例4和实施例5中分别制备的内包有阿霉素的载药杂合脂质体Y-Lipo-1和Y-Lipo-2分别溶解在2mL二甲基亚砜中，利用紫外分光光度计测定阿霉素浓度(吸收峰设在481nm)。根据溶液中阿霉素的浓度计算Y-Lipo-1和Y-Lipo-2中阿霉素的包封率。

载药杂合脂质体对阿霉素的包封率％＝(阿霉素浓度(mg/L)×溶液体积(L)/阿霉素原始加入量(mg))×100％。

测得载药杂合脂质体Y-Lipo-1中阿霉素的包封率为42.5％；载药杂合脂质体Y-Lipo-2中阿霉素的包封率为42.3％。

测试例2

本测试例用于说明在体系中存在MMP-2时，载药杂合脂质体Y-Lipo-1和Y-Lipo-2中药物化合物阿霉素的释放速度。

将实施例4中制备的载药杂合脂质体Y-Lipo-1用截留分子量为1kDa的透析袋在1L中性磷酸缓冲液(pH为7.4，150mmol/L)中透析48h，在不同时间点取出1mL磷酸缓冲液，利用紫外分光光度计测定阿霉素浓度(吸收峰设在481nm)。为确保透析液体积不变，再将取出的1mL磷酸缓冲液倒回透析液中。

阿霉素的释放率％＝(M_t/M)×100％

其中，M_t是时间t时透析液中的阿霉素积累量(mg)，M是药物载体中阿霉素的总量(mg)，所述药物载体中阿霉素的总量通过药物载体中阿霉素的包封率计算得到。

重复上述释放测试3次，取计算平均值并制作曲线，如图4所示。结果显示，在存在MMP-2蛋白酶的环境下，阿霉素在3h内即可释放大部分。透射电镜结果显示：释药后载药杂合脂质体Y-Lipo-1表面有破损，表面有孔洞，具体如图3所示。

测试例3

本测试例用于说明在体系中无MMP-2时，载药多肽杂合脂质体Y-Lipo-1中药物化合物阿霉素的释放速度。

将实施例4中制备的Y-Lipo-1用截留分子量为1kDa的透析袋在1L中性磷酸缓冲液(pH为7.4，150mmol/L)中透析48h，在不同时间点取出1mL磷酸缓冲液，利用紫外分光光度计测定阿霉素浓度(吸收峰设在481nm)。为确保透析液体积不变，再将取出的1mL磷酸缓冲液倒回透析液中。

阿霉素的释放率％＝(M_t/M)×100％

其中，M_t是时间t时透析液中的阿霉素积累量(mg)，M是杂合脂质体中阿霉素的总量(mg)，所述载药杂合脂质体中阿霉素的总量通过载药脂质体中阿霉素的包封率计算得到。

重复上述释放测试3次，取计算平均值并制作曲线，如图5所示。结果显示，不存在MMP-2的环境下，阿霉素在48h内仅释放不到40％。

通过以上测试例可以得知，本发明提供的酶响应性的载药多肽杂合脂质体特异性高、载药效果好、释药速度适中且稳定性好。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种酶响应性的两亲性多肽，其特征在于，该多肽的结构如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的两亲性多肽，其中，所述多肽片段包括能够被金属基质蛋白酶家族和/或成纤维激活蛋白酶水解的多肽片段。

3.一种酶响应性的杂合脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括：将两亲性多肽与磷脂进行接触，其中，所述两亲性多肽为权利要求1或权利要求2所述的两亲性多肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述接触的条件包括：pH值为6-8，接触的温度为4-45℃，接触的时间为1-60min。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，相对于每重量份的两亲性多肽，所述磷脂的用量为1-40重量份；优选所述重量份为5-20。

6.由权利要求3-5中任意一项所述的方法制备得到的酶响应性的杂合脂质体；优选所述杂合脂质体的平均粒径为40-200nm。

7.一种酶响应性的载药杂合脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括：将两亲性多肽、药物化合物和磷脂进行接触，其中，所述两亲性多肽为权利要求1或权利要求2所述的两亲性多肽。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述接触的条件包括：pH值为6-8，接触的温度为20-40℃，接触的时间为1-60min。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，相对于每重量份的两亲性多肽，所述磷脂的用量为1-40重量份，优选为5-20重量份；所述药物化合物的用量为0.5-10重量份，优选为1-5重量份。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述药物化合物包括抗肿瘤化疗药物和抗纤维化药物中的至少一种。

11.由权利要求7-10中任意一项所述的方法制备得到的酶响应性的载药杂合脂质体；优选所述载药杂合脂质体的平均粒径为40-200nm。