CN109939623A

CN109939623A - 一种单烷基磷酸酯（盐）囊泡及其制备与应用

Info

Publication number: CN109939623A
Application number: CN201910255833.5A
Authority: CN
Inventors: 杜娜; 高美华; 王春省; 侯万国; 李海平
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-04-01
Also published as: CN109939623B

Abstract

本发明涉及一种单烷基磷酸酯(盐)囊泡及其制备与应用。单烷基磷酸酯(盐)常温下在水中的溶解度低，且无法构筑囊泡结构，限制了应用。向单烷基磷酸酯(盐)和水的分散体系中加入助溶剂短直链脂肪醇或/和胍基化合物，提高了单烷基磷酸酯(盐)在水中的溶解度，同时诱导单烷基磷酸酯(盐)囊泡在常温下的自发形成。本发明囊泡的粒径介于50～500nm之间，其膜厚度介于3.6～3.9nm之间，其溶液pH值介于6.0～6.9之间。该囊泡表现出选择渗透性、生物相容性和优越的稳定性，将其应用为分子反应器实现了系列酶级联反应。此外，本发明囊泡在药物载体、纳米粒子合成、化妆品和生物膜模拟等领域具有潜在的应用价值。

Description

一种单烷基磷酸酯(盐)囊泡及其制备与应用

技术领域

本发明属于囊泡制备技术领域，具体涉及一种单烷基磷酸酯(盐)囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

所谓囊泡，是由闭合双亲分子层包裹微水相而形成的一种有序聚集体，亲水性的极性头分别朝向囊泡的内部和外部，与水相接触；疏水性的双分子层则形成疏水区域，远离水相，一般为球形或者椭球型。由于囊泡的独特核壳结构，在生物细胞膜模拟、催化反应、纳米颗粒合成和药物传输控释等领域有着重要的应用前景。

早期的囊泡制备主要是利用机械力方法，如超声振荡法、挤压法、机械过滤法、均质剪切法、干膜超声波法、乙醇注射法、氯仿注射法及逆向蒸发法等。这些通过向体系中输入能量的物理方法制备过程繁琐复杂，且制备得到的囊泡稳定性比较差，限制了囊泡的研究和应用。现在人们多用自组装形成法，即在合适的体相溶液的物理化学条件下双亲分子自组装形成囊泡，如通过pH值、温度、盐度的调节以及有机添加剂或重金属离子的加入等来诱导囊泡的自发形成。自发形成法所得囊泡的尺寸、膜厚和渗透性等可通过改变表面活性剂链长或者助表面活性剂相对量来调控，且其制备过程简单、所得囊泡稳定性好，因而日益受到人们的关注。

单烷基磷酸酯及其盐(MAPs)是表面活性剂中很重要的一种类型，由于其在结构上和生理学上的作用类似于天然磷脂，性质极为温和，对皮肤和眼睛几乎无刺激，是理想的膏霜乳化剂。其具有优良的抗静电性、柔软调理性、乳化分散性，其刺激性小、温和、易冲洗、泡沫丰富细腻，洗后滑爽，被广泛用于皮肤护理产品中。同时由于单烷基磷酸及其盐类囊泡具有优良的抗静电、乳化分散、润滑、耐酸耐碱等特性，在化纤、纺织、皮革、塑料、造纸、医药、生物膜模拟等领域也具有潜在的应用前景。日本专利文件JP2015127322A公开了β-支链单烷基磷酸酯/碱性中和剂囊泡分散溶液及其制备方法。该专利文件中利用碱性中和剂使单烷基磷酸酯生成其对应的盐而提高溶解度。而且，β-支链单烷基磷酸酯及其盐具有较低的Krafft点(25～30℃)，故可以在接近室温条件下构建囊泡结构。但是，直链单烷基磷酸酯及其盐的Krafft点相对较高(≥45℃)，碳链较长的单烷基磷酸酯及其盐的溶解性较差，室温下在水中的溶解度仅几十微克/升，有的甚至不溶于水，所以其在常温下极易分相产生沉淀，大部分相关实验操作须在高温下完成，限制了其在诸多领域的应用。因此，提高其常温下在水中的溶解度成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种常温下提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，该方法工艺简单，操作方便，适于大规模生产。

本发明的第二目的在于提供一种单烷基磷酸酯及其盐类囊泡及其制备方法，所述囊泡具有特定的核壳结构，稳定性好、均一性好、尺寸可控、具备选择渗透性，能够包覆亲水性物质、增溶疏水性物质。

本发明的第三目的在于提供一种上述的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡的应用，所述的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡能够用作酶级联反应的分子反应器，进行生物膜模拟。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种常温下提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，包括步骤如下：

向单烷基磷酸酯或其盐(分散相)和水(分散介质)的分散体系中加入助溶剂，所述的助溶剂为短直链脂肪醇或/和胍基化合物。

根据本发明，优选的，所述的短直链脂肪醇为C₃-C₆链长的短直链脂肪醇，进一步优选为正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇；

优选的，当使用短直链脂肪醇作为助溶剂时，助溶剂的加入量为分散体系质量的0.50～90wt.％，进一步优选1～30wt.％。

根据本发明，优选的，所述的胍基化合物为盐酸胍、硝酸胍、磷酸胍、硫酸胍、磺酸胍、碳酸胍、C₂-C₈链长的胍基脂肪酸、精氨酸；

优选的，当使用胍基化合物作为助溶剂时，助溶剂的加入量为分散体系质量的0.01～10wt.％，进一步优选0.01～6wt.％。

根据本发明，优选的，所述的单烷基磷酸酯及其盐为直链烷基磷酸酯及其盐，进一步优选C₈-C₁₆链长的直链单烷基磷酸酯或其盐。对于碳链较长的(例如：C₁₂以上的)含支链的烷基磷酸酯及其盐也有增加溶解度的作用。

根据本发明，常温下提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，是以单烷基磷酸酯或其盐为分散相，水为分散介质，短直链脂肪醇或/和胍基化合物为助溶剂。

根据本发明，优选的，所述的单烷基磷酸酯及其盐为C₈-C₁₆链长的直链单烷基磷酸酯及其盐；进一步优选为：辛基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，癸基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，月桂基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，肉豆蔻基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，棕榈基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐。

根据本发明，所述的单烷基磷酸酯及其盐，可在助溶剂的存在下，改善其溶解度，可将单烷基磷酸酯及其盐的在常温下、水中的质量分数提高到0.03～13wt.％。

根据本发明，一种单烷基磷酸酯及其盐类囊泡，包括如下组分：

单烷基磷酸酯或其盐，质量分数为0.03～1.6wt.％；短直链脂肪醇助溶剂，质量分数为0.03～9.0wt.％；胍基化合物助溶剂，质量分数为0.01～5.0wt.％，余量为水；

短直链脂肪醇助溶剂和胍基化合物助溶剂二者任选一种或二者组合。

根据本发明，优选的，所述的囊泡包括如下组分：单烷基磷酸酯或其盐，质量分数为0.10～0.35wt.％；短直链脂肪醇助溶剂，质量分数为0.5～4.50wt.％；胍基化合物助溶剂，质量分数为0.08～1.00wt.％，余量为水。

根据本发明，优选的，所述的囊泡的粒径介于50～500nm之间，进一步优选粒径介于100～300nm之间，囊泡膜厚度介于3.6～3.9nm之间，外观及物理化学性质都与传统囊泡相似。

根据本发明，优选的，所述的囊泡，其pH值介于6.0～6.9之间。

本发明的囊泡为均一、稳定的体系，在常温下可稳定放置12个月以上。

根据本发明，上述囊泡的制备方法，包括步骤如下：

室温下将单烷基磷酸酯或单烷基磷酸酯盐、助溶剂和水混合，搅拌均匀，囊泡自发形成。该制备方法简单、方便、成本低。

具体操作时可先通过实验制作表面活性剂/助溶剂/水的三元相图，测认单烷基磷酸酯及其盐类囊泡相区，根据相图选择单烷基磷酸酯或其盐，助溶剂和水的比例。

本发明采用助溶剂诱导法，制备得到单烷基磷酸酯及其盐类囊泡，且此类囊泡表现出低临界聚集浓度、选择渗透性、生物相容性和优越的高温稳定性、冻融稳定性以及时间稳定性，可用于药物载体、纳米粒子合成、化妆品和生物膜模拟等领域。

根据本发明，上述的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡的应用，用作酶级联反应的分子反应器。

本发明的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡用作酶级联反应的分子反应器，载酶效率高，酶活回收率高，能够有效递送开关分子及信号分子，实现酶级联反应。

根据本发明，优选的，所述单烷基磷酸酯及其盐类囊泡用作酶级联反应的分子反应器，相关催化酶包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶、胆碱氧化酶、磷酸酯酶、辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、尿素酶、尿酸酶、肌酸酶和漆酶。

与现有技术相比，本发明的技术特点和有益效果如下：

1、本发明首次提出了通过添加助溶剂提高单烷基磷酸酯及其盐常温下在水中的溶解度的方法，常温下将其溶解度从1×10^-6～1×10^-3wt.％提高至0.03～13wt.％。

2、本发明优选的助溶剂不仅提高了单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度，而且同时诱导了单烷基磷酸酯及其盐类囊泡的自发形成。

3、本发明的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡为均一、稳定的体系，粒径为50～500nm，膜厚为3.6～3.9nm，在常温下可稳定放置12个月以上。其表现出选择渗透性、生物相容性和优越的稳定性，可用于药物载体、纳米粒子合成、分子反应器、化妆品和生物膜模拟等领域。

4、本发明囊泡的制备方法简单易行、条件温和、成本低，仅将所述的单烷基磷酸酯或其盐、助溶剂和水混合均匀即可自发形成囊泡。

5、本发明的囊泡可用作酶级联反应的分子反应器，载酶效率高，酶活回收率高，能够模拟细胞膜，有效递送开关分子及信号分子，实现酶级联反应。

附图说明

图1为实施例1中单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇/水的三元相图以及囊泡溶液的表观照片。

图2为实施例1中单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡的负染色透射电子显微(TEM)图。

图3为实施例1中单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡的动态激光光散射(DLS)粒径分布图。

图4为实施例1中单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡的小角X-射线散射(SAXS)图。

图5为实施例1中在单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡分子反应器中，酶级联反应产物的吸收光谱强度随时间的变化。

图6为实施例2中单月桂基磷酸酯一钠盐/正戊醇囊泡的负染色透射电子显微(TEM)图。

具体实施方式

以下通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1：

称取单月桂基磷酸酯一钠盐0.006～20g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～50wt.％的白色浑浊分散体系，加入正丁醇0.1～170.53g(0.50～81wt.％)，其溶解度由1.7×10^-4wt.％提高至0.03～13wt.％。图1为单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇/水的三元相图和单相区的表观照片。由图1可知，单月桂基磷酸酯一钠盐在助溶剂正丁醇的存在下，产生澄清透明单相区其表观溶解度在三元体系中可达到13wt.％。

称取单月桂基磷酸酯一钠盐0.006～0.048g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.24wt.％的分散体系，加入正丁醇0.10～1.65g(0.5～7.60wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

囊泡样品的负染色TEM照片如图2所示。由图2可知，单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇自发形成了囊泡，囊泡的粒径范围在100～200nm之间。

囊泡样品进行DLS分析，结果如图3所示，囊泡的粒径分布为200～300nm。

囊泡样品进行SAXS分析，结果如图4所示，囊泡双层膜的厚度为3.81nm。

将单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取GOx(葡萄糖氧化酶)和HRP(辣根过氧化物酶)作为酶级联反应的催化酶。包封GOx的单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡，记为GOx@囊泡；包封HRP的单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡，记为HRP@囊泡。

GOx@囊泡和HRP@囊泡的制备方法：

将400μLGOx(4mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钠盐(0.15wt.％)、0.85g正丁醇(4.1wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到GOx@囊泡溶液。透析法(200KDaMWCO)除去未包封的GOx，透析时间1小时。

将200μLHRP(1mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钠盐(0.15wt.％)、0.85g正丁醇(4.1wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到HRP@囊泡溶液。透析法(50KDaMWCO)除去未包封的HRP，透析时间1小时。

将2mL GOx@囊泡溶液、2mL HRP@囊泡溶液、200μL苯酚(0.9mg/mL)和200μL4-氨基安替比林(2.25mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入100μL葡萄糖(0.1mol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝500nm)监测酶级联反应活性。如图5所示，酶级联反应最终产物醌亚胺的吸收光谱强度随时间增大，单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例2：

称取单月桂基磷酸酯一钠盐0.006～2.3g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～10wt.％的白色浑浊分散体系，加入正戊醇0.1～1.42g(0.50～6.00wt.％)，其溶解度由1.7×10^-4wt.％提高至0.03～7wt.％。

称取单月桂基磷酸酯一钠盐0.006～0.054g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.27wt.％的分散体系，加入正戊醇0.10～0.39g(0.50～1.9wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

囊泡样品的负染色TEM照片如图6所示，单月桂基磷酸酯一钠盐/正戊醇自发形成了囊泡，囊泡的粒径范围在100～300nm之间。

将单月桂基磷酸酯一钠盐/正戊醇囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取UOX(尿酸酶)和HRP(辣根过氧化物酶)作为酶级联反应的催化酶。包封UOX的单月桂基磷酸酯一钠盐/正戊醇囊泡，记为UOX@囊泡，包封HRP的单月桂基磷酸酯一钠盐/正戊醇囊泡，记为HRP@囊泡。

UOX@囊泡和HRP@囊泡的制备方法：

将300μLUOX(2mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钠盐(0.15wt.％)、0.33g正戊醇(1.62wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到UOX@囊泡溶液。透析法(50KDaMWCO)除去未包封的UOX，透析时间3小时。

将300μL HRP(1mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钠盐(0.15wt.％)、0.33g正戊醇(1.62wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到HRP@囊泡溶液。透析法(50KDaMWCO)除去未包封的HRP，透析时间3小时。

将2mLUOX@囊泡溶液、2mL HRP@囊泡溶液、50μL 3，5，3′，5′-四甲基联苯胺(TMB，1mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入100μL尿酸(5mmol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝635nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物TMB多聚体的吸收光谱强度随时间增大，单月桂基磷酸酯一钠盐/正戊醇囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例3：

称取单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐0.012～2.3g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.06～10wt.％的白色浑浊分散体系，加入盐酸胍0.002～0.46g(0.010～2.0wt.％)，其溶解度由1×10^-5wt.％提高至0.03～3.0wt.％。

称取单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐0.006～0.12g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.60wt.％的分散体系，加入盐酸胍0.004～0.20g(0.020～1.0wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

将单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐/盐酸胍囊泡作酶级联反应的分子反应器，选取ChOx(胆碱氧化酶)和HRP(辣根过氧化物酶)作为酶级联反应的催化酶。包封ChOx的单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐/盐酸胍囊泡，记为ChOx@囊泡；包封HRP的单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐/盐酸胍囊泡，记为HRP@囊泡。

ChOx@囊泡和HRP@囊泡的制备方法：

将400μLChOx(3mg/mL)、0.06g单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐(0.30wt.％)、0.12g盐酸胍(0.6wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到ChOx@囊泡溶液。透析法(200KDaMWCO)除去未包封的ChOx，透析时间3小时。

将500μL HRP(1mg/mL)，0.06g单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐(0.30wt.％)、0.12g盐酸胍(0.6wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到HRP@囊泡溶液。透析法(50KDaMWCO)除去未包封的HRP，透析时间3小时。

将2mL ChOx@囊泡溶液、2mL HRP@囊泡溶液、250μL苯酚(0.9mg/mL)和250μL4-氨基安替比林(2.25mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入200μL葡萄糖(0.1mol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝500nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物醌亚胺的吸收光谱强度随时间增大，单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐/盐酸胍囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例4：

称取单辛基磷酸酯0.006～20g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～50wt.％的白色浑浊分散体系，加入正丙醇0.1～155g(0.50～79wt.％)，其溶解度由9.2×10^-4wt.％提高至0.03～6.6wt.％。

称取单辛基磷酸酯0.006～0.058g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.29wt.％的分散体系，加入正丙醇0.10～1.40g(0.5～6.37wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

将单辛基磷酸酯/正丙醇囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取SUC(蔗糖酶)和GOx(葡萄糖氧化酶)作为酶级联反应的催化酶。包封SUC的单辛基磷酸酯/正丙醇囊泡，记为SUC@囊泡，包封GOx的单辛基磷酸酯/正丙醇囊泡，记为GOx@囊泡。

SUC@囊泡和GOx@囊泡的制备方法：

将200μL SUC(5mg/mL)、0.05g单辛基磷酸酯(0.24wt.％)、0.53g正丙醇(2.57wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到SUC@囊泡溶液。透析法(200KDa MWCO)除去未包封的SUC，透析时间3小时。

将200μL GOx(1mg/mL)、0.05g单辛基磷酸酯(0.24wt.％)、0.53g正丙醇(2.57wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到GOx@囊泡溶液。透析法(200KDa MWCO)除去未包封的GOx，透析时间3小时。

将2mLSUC@囊泡溶液、2mL GOx@囊泡溶液、60μL 3，5，3′，5′-四甲基联苯胺(TMB，1mg/mL)、20μL HRP(2mg/mL)，在37℃下混合，摇匀。向其中加入100μL蔗糖(0.1mol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝635nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物TMB多聚体的吸收光谱强度随时间增大，单辛基磷酸酯/正丙醇囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例5：

称取单癸基磷酸酯钙0.006～5g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～20wt.％的白色浑浊分散体系，加入正己醇0.01～1.21g(0.05～4.61wt.％)，其溶解度由7×10^-4wt.％提高至0.03～2.9wt.％。

称取单癸基磷酸酯钙0.006～0.048g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.24wt.％的分散体系，加入正己醇0.010～0.52g(0.05～2.53wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

将单癸基磷酸酯钙/正己醇囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取UOX(尿酸酶)和HRP(辣根过氧化物酶)作为酶级联反应的催化酶。包封UOX的单癸基磷酸酯钙/正己醇囊泡，记为UOX@囊泡，包封HRP的单癸基磷酸酯钙/正己醇囊泡，记为HRP@囊泡。

UOX@囊泡和HRP@囊泡的制备方法：

将250μLUOX(2mg/mL)、0.033g单癸基磷酸酯钙(0.16wt.％)、0.21g正己醇(1.03wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到UOX@囊泡溶液。透析法(50KDa MWCO)除去未包封的UOX，透析时间3小时。

将200μL HRP(1mg/mL)、0.033g单癸基磷酸酯钙(0.16wt.％)、0.21g正己醇(1.03wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到HRP@囊泡溶液。透析法(50KDa MWCO)除去未包封的HRP，透析时间3小时。

将2mLUOX@囊泡溶液、2mL HRP@囊泡溶液、200μL苯酚(0.9mg/mL)和200μL 4-氨基安替比林(2.25mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入120μL尿酸(1mmol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝500nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物醌亚胺的吸收光谱强度随时间增大，单癸基磷酸酯钙/正己醇囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例6：

称取单棕榈基磷酸酯0.006～10g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～33wt.％的白色浑浊分散体系，加入精氨酸0.002～0.46g(0.010～1.51wt.％)，其溶解度由2.7×10^-6wt.％提高至0.03～2.30wt.％。

称取单棕榈基磷酸酯0.006～0.05g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.25wt.％的分散体系，加入精氨酸0.005～0.22g(0.025～1.08wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

将单棕榈基磷酸酯/精氨酸囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取GA(葡萄糖淀粉酶)和GOx(葡萄糖氧化酶)作为酶级联反应的催化酶。包封GA的单棕榈基磷酸酯/精氨酸囊泡，记为GA@囊泡，包封GOx的单棕榈基磷酸酯/精氨酸囊泡，记为GOx@囊泡。

GA@囊泡和GOx@囊泡的制备方法：

将300μLGA(2mg/mL)、0.035g单棕榈基磷酸酯(0.17wt.％)、0.16g精氨酸(0.80wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到GA@囊泡溶液。透析法(200KDa MWCO)除去未包封的GA，透析时间3小时。

将300μL GOx(1mg/mL)、0.035g单棕榈基磷酸酯(0.17wt.％)、0.16g精氨酸(0.80wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到GOx@囊泡溶液。透析法(200KDa MWCO)除去未包封的GOx，透析时间3小时。

将2mLGA@囊泡溶液、2mL GOx@囊泡溶液、50μL 3，5，3′，5′-四甲基联苯胺(TMB，1mg/mL)、10μL HRP(2mg/mL)，在37℃下混合，摇匀。向其中加入100μL淀粉(10mmol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝635nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物TMB多聚体的吸收光谱强度随时间增大，单棕榈基磷酸酯/精氨酸囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例7：

称取单月桂基磷酸酯一钠盐0.006～20g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～50wt.％的白色浑浊分散体系，加入正丁醇0.1～160g(0.50～78wt.％)，加入盐酸胍0.01～5.50g(0.050～2.67wt.％)，其溶解度由1.7×10^-4wt.％提高至0.03～13wt.％。

称取单月桂基磷酸酯一钠盐0.006～0.048g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.03～0.24wt.％的分散体系，加入正丁醇0.10～1.50g(0.5～6.80wt.％)，加入盐酸胍0.080～0.38g(0.40～1.73wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

将单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇/盐酸胍囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取GOx(葡萄糖氧化酶)和HRP(辣根过氧化物酶)作为酶级联反应的催化酶。包封GOx的单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇/盐酸胍囊泡，记为GOx@囊泡，包封HRP的单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇/盐酸胍囊泡，记为HRP@囊泡。

GOx@囊泡和HRP@囊泡的制备方法：

将300μLGOx(4mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钠盐(0.15wt.％)、0.40g正丁醇(1.95wt.％)、0.11g盐酸胍(0.54wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到GOx@囊泡溶液。透析法(200KDa MWCO)除去未包封的GOx，透析时间3小时。

将300μL HRP(1mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钠盐(0.15wt.％)、0.40g正丁醇(1.95wt.％)、0.11g盐酸胍(0.54wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到HRP@囊泡溶液。透析法(50KDa MWCO)除去未包封的HRP，透析时间3小时。

将2mLGOx@囊泡溶液、2mL HRP@囊泡溶液、70μL 3，5，3′，5′-四甲基联苯胺(TMB，1mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入150μL葡萄糖(0.1mol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝635nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物TMB多聚体的吸收光谱强度随时间增大，单月桂基磷酸酯一钠盐/正丁醇/盐酸胍囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

实施例8：

称取单月桂基磷酸酯一钾盐0.012～15g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.06～42wt.％的白色浑浊分散体系，加入磷酸胍0.008～0.60g(0.04～1.68wt.％)，其溶解度由2.6×10^-4wt.％提高至0.06～2.40wt.％。

称取单月桂基磷酸酯一钾盐0.012～0.050g，分散至20mL水中，得到质量分数为0.06～0.25wt.％的分散体系，加入磷酸胍0.01～0.25g(0.05～1.23wt.％)，振荡，涡旋，即可得到一系列囊泡溶液。

将单月桂基磷酸酯一钾盐/磷酸胍囊泡作为酶级联反应的分子反应器，选取UOX(尿酸酶)和HRP(辣根过氧化物酶)作为酶级联反应的催化酶。包封UOX的单月桂基磷酸酯一钾盐/磷酸胍囊泡，记为UOX@囊泡，包封HRP的单月桂基磷酸酯一钾盐/磷酸胍囊泡，记为HRP@囊泡。

UOX@囊泡和HRP@囊泡的制备方法：

将300μLUOX(2mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钾盐(0.15wt.％)、0.13g磷酸胍(0.64wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到UOX@囊泡溶液。透析法(50KDaMWCO)除去未包封的UOX，透析时间3小时。

将300μL HRP(1mg/mL)、0.03g单月桂基磷酸酯一钾盐(0.15wt.％)、0.13g磷酸胍(0.64wt.％)依次分散至20mL水中，振荡，涡旋，得到HRP@囊泡溶液。透析法(50KDaMWCO)除去未包封的HRP，透析时间3小时。

将2mLUOX@囊泡溶液、2mL HRP@囊泡溶液、200μL苯酚(0.9mg/mL)和200μL 4-氨基安替比林(2.25mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入120μL尿酸(1mmol/L)引发级联反应，使用分光光度法(λ_max＝500nm)监测酶级联反应活性。酶级联反应最终产物醌亚胺的吸收光谱强度随时间增大，单月桂基磷酸酯一钾盐/磷酸胍囊泡分子反应器中实现了酶级联反应。

对比例1：

选取长链醇辛醇作为助溶剂，称取0.03～10g单月桂基磷酸酯一钠盐、0.001～30g辛醇分散至50mL水中，振荡、涡旋，样品分层，有大量油滴和晶体析出，常温下无法形成均一、稳定的囊泡溶液。

对比例2：

选取带有支链的异戊醇作为助溶剂，称取0.01～20g单癸基磷酸酯钙盐、0.001～50g异戊醇分散至50mL水中，振荡、涡旋，样品分层，有大量油滴和晶体析出，常温下无法形成均一、稳定的囊泡溶液。

对比例3：

选取不含胍基的甘氨酸作为助溶剂，称取0.01～20g单肉豆蔻基磷酸酯一钾盐、0.001～50g甘氨酸分散至50mL水中，振荡、涡旋，样品分层，有大量晶体析出，常温下无法形成均一、稳定的囊泡溶液。

对比例4：

选取蛋黄卵磷脂质体作为分子反应器，准确称量0.1g蛋黄卵磷脂于50mL圆底蒸馏烧瓶中，加入适量氯仿溶解，用旋转蒸发仪除去氯仿，通入氮气吹干痕量氯仿，常温下放置在真空干燥箱中过夜。干燥的磷脂薄膜通入氮气后，保存在-20℃中待用。分别将GOx(20μg/mL)和HRP(30μg/mL)的甘氨酸缓冲溶液(pH＝8.0)与干燥后的磷脂膜混合，置于37℃水浴恒温振荡器中孵化(2h)，用脂质体挤出器负载孔径为5μm聚碳酸酯膜反复挤压11次，得到包封酶的脂质体，记为酶@脂质体，其粒径分布在1.5～3μm之间。透析法(200KDaMWCO)除去未包封的酶，透析时间3小时。

将2mL GOx@脂质体溶液、2mL HRP@脂质体溶液、200μL苯酚(0.9mg/mL)和200μL 4-氨基安替比林(2.25mg/mL)在37℃下混合，摇匀。向其中加入100μL葡萄糖(0.1mol/L)引发级联反应，利用分光光度法(λ_max＝500nm)监测酶级联反应活性，反应产物吸收光谱强度随时间无变化，酶级联反应未实现，蛋黄卵磷脂质体未能应用为分子反应器。

与之相比，本发明提供一种常温下提高单烷基磷酸酯及其盐在水中溶解度的方法，同时诱导了单烷基磷酸酯及其盐类囊泡的自发形成，制备方法简单易行、条件温和，且此类囊泡表现出低临界聚集浓度、选择渗透性、生物相容性和优越的稳定性，单烷基磷酸酯及其盐类囊泡用作酶级联反应的分子反应器，载酶效率高，酶活回收率高，能够有效递送开关分子及信号分子，实现酶级联反应。

Claims

1.一种常温下提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，包括步骤如下：

向单烷基磷酸酯或其盐和水的分散体系中加入助溶剂，所述的助溶剂为短直链脂肪醇或/和胍基化合物。

2.根据权利要求1所述的提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，其特征在于，所述的短直链脂肪醇为C₃-C₆链长的短直链脂肪醇；

所述的胍基化合物为盐酸胍、硝酸胍、磷酸胍、硫酸胍、磺酸胍、碳酸胍、C₂-C₈链长的胍基脂肪酸或精氨酸。

3.根据权利要求2所述的提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，其特征在于，所述的短直链脂肪醇为正丙醇、正丁醇、正戊醇或正己醇。

4.根据权利要求1所述的提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，其特征在于，当使用短直链脂肪醇作为助溶剂时，助溶剂的加入量为分散体系质量的0.50～90wt.％；

当使用胍基化合物作为助溶剂时，助溶剂的加入量为分散体系质量的0.01～10wt.％。

5.根据权利要求1所述的提高单烷基磷酸酯及其盐在水中的溶解度的方法，其特征在于，所述的单烷基磷酸酯及其盐为C₈-C₁₆链长的直链单烷基磷酸酯及其盐；优选为：辛基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，癸基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，月桂基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，肉豆蔻基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐，棕榈基磷酸酯及其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、锌盐。

6.一种单烷基磷酸酯及其盐类囊泡，其特征在于，包括如下组分：

单烷基磷酸酯或其盐，质量分数为0.03～1.6wt.％；短直链脂肪醇助溶剂，质量分数为0.03～9.0wt.％；胍基化合物助溶剂，质量分数为0.01～5.0wt.％，余量为水。

7.根据权利要求6所述的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡，其特征在于，所述的囊泡的粒径介于50～500nm之间，囊泡膜厚度介于3.6～3.9nm之间，所述的囊泡pH值介于6.0～6.9之间，所述的囊泡在常温下可稳定放置12个月以上。

8.权利要求6或7所述囊泡的制备方法，包括步骤如下：

室温下将单烷基磷酸酯或单烷基磷酸酯盐、助溶剂和水混合，搅拌均匀，囊泡自发形成。

9.权利要求6或7所述的单烷基磷酸酯及其盐类囊泡的应用，用作酶级联反应的分子反应器。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述单烷基磷酸酯及其盐类囊泡用作酶级联反应的分子反应器，相关催化酶包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶、胆碱氧化酶、磷酸酯酶、辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、尿素酶、尿酸酶、肌酸酶和漆酶。