CN108348467A - 用于改进聚合物囊泡中功能性蛋白质的包封的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

制备聚合物体包封的功能性蛋白质悬浮液的方法可包括将一定量的嵌段共聚物与一定量的低分子量聚乙二醇(PEG)热混合至少30分钟，将所得PEG/聚合物制剂混合并冷却至室温，将功能性蛋白质溶液的等分试样加入到含有该PEG/聚合物制剂的样品中，并进行至少三个稀释步骤，其中产生的聚合物体用该功能性蛋白质逐渐饱和。加入的功能性蛋白质溶液的等分试样可以具有与PEG/聚合物样品约0.5:1至1.5:1的体积比，并且热混合可以在90‑100℃进行。

Description

用于改进聚合物囊泡中功能性蛋白质的包封的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2015年7月2日提交的美国临时专利申请序列号62/187,942以及于2016年6月30日提交的美国非临时专利申请序列号15/198,836的优先权，两者都在此通过引用整体纳入。
有关联邦资助的研究的声明
本发明的工作得到了国立卫生研究院的资助(研究ID#1R43CA159527-01A1和研究ID#1R43AI096605-01)。因此美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
天然和合成蛋白质提供了无与伦比的一系列独特的生物功能，可用于人类治疗应用。然而，它们的临床实用性常常受到生物化学不稳定性，不良药理学性质以及诱导不良免疫原性的可能性的限制。在具有附连的聚乙二醇(PEG)聚合物链(例如纳米颗粒)的长循环载剂(即PEG化的载剂)中的纳入生物分子如蛋白质可缓解此类问题。然而，PEG化的载剂中大量功能性蛋白质的稳定包封已被证明是具有挑战性的。最初开发用于小分子药物递送的常规包封技术需要高能量的输入和/或使用有机溶剂来形成颗粒，因此不适合用于生物学复杂且更不稳定的大分子。
具体而言，常规封装技术的示例可以包括薄膜再水合，直接水合和电形成，其可以用于将具有独特生物学功能的小分子和蛋白质包封到聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)产生的聚合物体中。例如，亚甲基蓝(mBlue；Mw＝319.85g/mol)可以用作模型小分子，并且肌红蛋白(Mb；Mw＝17,600Da)可以用于具有独特生物学功能的模型蛋白质(即，储氧)。已经比较了使用薄膜再水合和直接水合技术将亚甲基蓝和肌红蛋白包封到PEO-b-PBD中的效率。具体而言，使用这些已建立的技术，量化全功能肌红蛋白的最大包封基于许多特征。例如，分别使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)和UV-Vis吸收光谱法(也称为分光光度法)来测量肌红蛋白血红素基团中铁的浓度和还原-氧化反应(“氧化还原”)。通过低温透射电子显微镜(cryo-TEM)和动态光散射(DLS)分别验证聚合物体包封的肌红蛋白(PEM)的形态学和稳定性。使用Hemeox分析仪测量氧在各种分压下的平衡氧结合和释放。尽管薄膜再水合和直接水合技术允许成功包封亚甲基蓝，但肌红蛋白的包封均匀性差。因此，产生PEM的改进方法将对人类治疗应用有益。
概述
各实施方式包括制备聚合物体包封的功能性蛋白质悬浮液的方法，通过将一定量的嵌段共聚物与一定量的低分子量聚乙二醇(PEG)热混合至少30分钟，将所得PEG/聚合物制剂混合并冷却至室温，将功能性蛋白质溶液的等分试样加入到含有该PEG/聚合物制剂的样品中，并进行至少三个稀释步骤，其中产生的聚合物体用该功能性蛋白质逐渐饱和。在一些实施方案中，加入的等分试样与PEG/聚合物样品的体积比为约0.5：1至1.5：1。在一些实施例中，热混合在90-100℃进行。在一些实施方案中，每个稀释步骤包括向样品中添加额外量的功能性蛋白质溶液，将所得功能性蛋白质分散体在PEG/聚合物制剂中混合，并且超声处理所得分散体至少30分钟。
在一些实施例中，进行至少三个稀释步骤，包括以连续方式进行第一，第二和第三稀释步骤。在一些实施方案中，在第一步骤中添加额外量的溶液包括添加第一量的功能性蛋白质溶液，使得该第一量与PEG/聚合物制剂的体积比为约1：1。在一些实施方案中，在第二步骤中添加额外量的溶液包括添加第二量的功能性蛋白质溶液，使得该第二量与PEG/聚合物制剂的体积比为约2：1。在一些实施方案中，在第三步骤中加入额外量的溶液包括加入第三量的功能性蛋白质溶液，使得该第三量与PEG/聚合物制剂的体积比为约5：1。实施方式的方法还可以包括进行第四稀释步骤，其中在第四步骤中添加额外量的溶液包括添加第四量的功能性蛋白质溶液，使得第四量与PEG/聚合物制剂的体积比是约5：1。实施方式的方法还可以包括在至少三个稀释步骤之后使用蛋白水解从聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液中的聚合物体中去除表面相关蛋白。在一些实施方案中，使用蛋白水解包括在室温下用0.4重量％的链霉蛋白酶溶液处理混合的PEG/聚合物/蛋白样品至少18小时，并且允许在4℃下透析PEG/聚合物/蛋白质样品至少12小时。
在一些实施方案中，功能性蛋白质的溶液可以是氧合肌红蛋白(oxyMb)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的150mg/mL溶液。实施方式的方法还可以包括通过将磷酸盐缓冲盐水中的150mg/mL高铁肌红蛋白(metMb)的溶液与足量的1重量％连二亚硫酸钠(Na2S2O4)组合以将metMb还原成oxyMb来制备功能性蛋白质的溶液。在一些实施方案中，嵌段共聚物可以是两亲性二嵌段共聚物。在一些实施例中，两亲性二嵌段共聚物可以是聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)。在一些实施方案中，将一定量的两亲性二嵌段共聚物与一定量的低分子量PEG热混合至少30分钟包括将5-15mg的聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)与5-15mg的500kDa PEG(PEG500)热混合至少1小时。在一些实施方案中，将一定量的两亲性二嵌段共聚物与一定量的低分子量PEG热混合至少50分钟包括将10mg的聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)与10mg的500kDa PEG(PEG500)热混合1小时。在一些实施方案中，将所述量的两亲性二嵌段共聚物与所述量的低分子量PEG热混合至少30分钟可包括将10mg的聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)与10mg的500kDa PEG(PEG500)热混合1小时。在一些实施方案中，加入功能性蛋白质溶液的等分试样可以包括向含有PEG/聚合物制剂的样品添加10μL的oxyMb溶液。在一些实施例中，热混合可以在约95℃进行。
附图的简要说明
纳入本文并构成本说明书一部分的附图示出了示例性实施方式，并且与各种实施方式的描述一起用于解释本文中的特征。
图1是使用现有技术包封多种蛋白质的结果表。
图2是用于小分子和蛋白质包封的两种聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(即，PEO-b-PBD)二嵌段共聚物及其聚合物体配方的性能表。
图3A和3B是显示优化直接水合方案中各种步骤以改善特定PEO-b-PBD制剂的聚合物体中肌红蛋白包封的结果的图。
图3C和3D是显示肌红蛋白氧化速率和蛋白水解中与表面相关的肌红蛋白损失作为时间函数的图。
图3E是显示使用肌红蛋白与磷酸盐缓冲盐溶液的各种比例时，与肌红蛋白的包封率相比的最终重量百分比的图。
图4是显示根据各种实施方式的使用渐进饱和方案和OB29聚合物体包封一系列蛋白质的包封结果的表格。
图5A是根据各种实施方式制备的聚合物体组分的示意图。
图5B是用于形成聚合物体包封的肌红蛋白的现有薄膜再水合方案的示意图。
图5C是用于形成聚合物体包封肌红蛋白的现有直接水合方案的示意图。
图6A和6B是显示使用现有方案将亚甲基蓝包封到由特定PEO-b-PBD制剂形成的聚合物体中的结果的图。
图6C和6D是显示使用现有方案将肌红蛋白包封到由特定PEO-b-PBD制剂形成的聚合物体中的结果的图。
图7A是各种实施方式中用于形成聚合物体包封的肌红蛋白的渐进饱和方案的示意图。
图7B和7C是说明使用图7A的渐进饱和方案将肌红蛋白包封入由特定PEO-b-PBD制剂形成的聚合物体中的结果的图。
图7D是总结图7B和7C所示结果的表格。
图7E的表格显示游离肌红蛋白和在蛋白水解和链霉蛋白酶处理之前通过渐进饱和制备的聚合物体包封的肌红蛋白的O2平衡曲线获得的达到50％饱和度(P50)所需的氧分压。
图8A是显示使用各种实施方式的渐进饱和技术将肌红蛋白包封入由两种特定PEO-b-PBD制剂形成的聚合物体的结果的图。
图8B和8C是使用各种实施方式的渐进饱和技术从由每种特定PEO-b-PBD制剂形成的聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液中的囊泡的cryo-TEM图像。
图8D是显示使用各种实施方式的渐进饱和技术由特定PEO-b-PBD制剂形成的聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液的平均流体动力学直径。
图8E是显示游离氧合肌红蛋白和使用各种实施方式的渐进饱和技术由特定PEO-b-PBD制剂形成的氧化的聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液的氧平衡曲线的图。
发明详述
将参考附图详细描述各实施方式。只要可能，在所有附图中使用相同的附图标记来表示相同或类似的部分。对特定示例和实现方式的参考是用于说明目的，并不意图限制权利要求的范围。
各种实施方式包括用于生成PEM的改进方法，其可以包括识别薄膜再水合和直接水合方案的防止有效摄取和/或损害蛋白质功能的关键参数，并且进行这些关键参数的迭代优化。结果，各种实施方式提供了通用技术，其能够将增加量的功能性蛋白质包封在带中性电荷的和完全PEG化的聚合物囊泡内。也就是说，各种实施方式包括用于将肌红蛋白包封在聚合物体中的新的“渐进饱和”方法。
纳米颗粒载剂可以克服与递送功能性蛋白质相关的许多挑战，从而使各种大分子药物的临床开发成为可能。纳米颗粒载剂可以包括例如脂质体(即天然磷脂的自组装囊泡)和聚合物体(即嵌段共聚物的自组装聚合物囊泡)，以及胶束，全氟化碳乳剂等。为此，聚合物体具有与常规脂质体相比有利的性质，因为脂质体通常具有高的膜渗透性和低的体内稳定性。然而，很少有比较研究来建立和验证用于将大量蛋白质包封在中性荷电和/或PEG化聚合物体中的单一的、可放大的和一般化的策略。通过优化和组合来自各种基于脂质体的包封方法的不同步骤，各种实施方式提供了新的渐进饱和技术，其允许功能性蛋白质在纳米级聚合物囊泡中的改进包封。各种实施方式证明了可以实现的聚合物体负荷的程度(即，蛋白质与聚合物的重量百分比)和蛋白质的包封效率(相对于用于聚合物体形成的初始量)之间的平衡。此外，在各种实施方式中，蛋白质水解步骤准确地量化了可在由渐进饱和技术形成的聚合物体悬浮液中获得的包封蛋白质(即，期望结果)以及表面相关(即，非特异性结合)产物的量。尽管有报道使用现有的脂质体包封技术以高效率在一些聚合物体内装载大量蛋白质，但这样的报道不涉及区分包封的和表面相关的蛋白质。
因此，各种实施方式中的渐进饱和技术可以提供更强大、可放大且一般化的策略，用于在完全PEG化和带中性荷电的聚合物体中以可以实现进一步的转化进展的数量和效率来包封蛋白质。
哺乳动物细胞中蛋白质功能的选择性和有效调节是大多数分子疗法的主要活性，其中绝大多数可用试剂是有机小分子(小于或等于800Da)。然而，最近的研究表明，只有一小部分人类蛋白质组对小分子疗法敏感。此外，小分子成功靶向的蛋白质的功能多样性仍然非常低。也就是说，大约40％的处方药靶向一类蛋白质，即G蛋白偶联受体。然而，小分子疗法的使用是有限的，因为小药物分子本质上不能处理在许多生物学重要界面处发现的延伸接触表面。
最近，生物大分子如蛋白质显示出显著的临床效用，这在很大程度上是由于其能够克服与传统小分子疗法相关的这些显著限制。当与小分子与其生物靶标相互作用相比时，大分子治疗剂具有更高的折叠能(通常约7-20kcal/mol)，这允许采用更大且更精确的三维构型，这通常是高效结合和/或控制复杂的生物学功能所需的。因此，大分子可以实现优异的结合选择性和更有效的靶上活性。目前，正在使用的少量大分子疗法，包括全球大约200种可用的蛋白质药物，已经显示出作为药物开发新领域的高潜力。尽管如此，一些障碍阻碍了大分子作为人类治疗剂的发展，包括：(i)商业规模生产的难度和/或费用，(ii)病理生理环境中或长期储存发生的生物化学不稳定性，(iii)阻碍有效组织穿透的短循环半衰期和大位阻，以及(iv)与其促进严重不良反应的潜力相关的风险，例如诱导抗独特型抗体和/或免疫复合物形成。为了克服这些限制中的一些，大多数药物化合物或者使用生物相容性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或透明质酸)或者脂质体(即，基于脂质的囊泡)用于蛋白质络合和体内递送。
与更常规的制剂相比，合成的纳米颗粒可以表现出优异的性质以增强药物递送。特别地，在纳米颗粒种类中，聚合物体(即，由两性嵌段共聚物组成的自组装聚合物囊泡)可以提供有益的纳米级递送平台。尽管基于脂质的囊泡(即脂质体)已经广泛用于生物医学研究，但是这些基于磷脂的药物递送载剂有固有的材料限制，包括受损的悬浮稳定性，过早的药物释放和有限的产品保质期。相反，聚合物体由更高分子量的两亲性嵌段共聚物形成，赋予了宽泛且可调的运载体性质。例如，聚合物体能够：(i)通过非共价相互作用轻松且稳定地加载各种治疗有效载荷，(ii)机械稳定性比由相似分子量共聚物构建的脂质体或胶束结构高5至50倍，(iii)不需要昂贵的制造后纯化的经济和大规模生产，以及(iv)由各种共聚物组合物的结构赋予生物化学性质的多样性。这些特性可能包括完全PEG化的表面和可调的体内循环时间，位点特异性靶向，环境响应性和完全生物降解。
将蛋白质纳入纳米颗粒可能会增强它们的药理学表现并改善其靶上活性。已开发的用于将蛋白质包封进纳米颗粒的方法利用静电相互作用纳入一些高度阴离子性蛋白质，或对原始蛋白质进行化学或基因修饰以形成高效和可重复的纳米颗粒。这种方法的例子包括薄膜再水合(即，干燥聚合物的再水合)，其导致聚合物体包封的蛋白质的低收率。另一种示例性方法是直接水合，其用途通常限于小规模制备(例如小于1mL)。另一种示例性方法是电形成，其仅为有限数量的蛋白质(即，高度带电的蛋白质)提供有用的结果。另一种示例性方法是中空纤维挤出，其涉及在蛋白质溶液存在下挤出预先形成的囊泡。尽管中空纤维挤出技术已用于脂质体包封的蛋白的大规模制备，但聚合物体形成需要升高的温度和压力，这限制了其广泛的适用性。
现有技术需要输入用于颗粒形成的热能、电能、超声波或机械能，或者可选地使用有机共溶剂，其可能破坏蛋白质的结构和/或功能，使得包封更具挑战性并且限制效用。因此，在各种包封技术中，需要一种通用方法，其能够将大量的天然蛋白质结合到中性电荷和/或PEG化纳米颗粒。
尽管采用各种脂质体包封技术使得能够容易地将小分子纳入聚合物体内，但这些方法不能直接应用于功能性蛋白的可放大包封。通常，在下述参数之间进行平衡：可以包封的水性蛋白质的最大浓度(即mg蛋白质/mL溶液)，包含聚合物体结构的蛋白质与聚合物的最终加载比率(即，w/w％蛋白质/聚合物)和/或蛋白质包封效率(即，保留的初始蛋白质悬浮液的百分比)。此外，这些参数中的每一个的值都高度依赖于蛋白质的性质，精确的嵌段共聚物制剂以及所使用的包封方法。例如，图1中的表格显示了将各种蛋白质包封到聚合物体中的现有结果。各种实施方式提供了一种替代的、优化的和可再现的方法，以有效地将增加量的功能性蛋白质包封在聚合物体中。各种实施方式的新开发的“渐进饱和”技术易于放大、具有高度可重复性和一般化，用于产生增加量的聚合物体包封的蛋白质，其可以实现新的和多样的生物医学应用。
在各种实施方式中，使用PEO-b-PBD共聚物来形成具有完全PEG化表面的聚合物体。这些表面不带电和不可降解；提供了理想的系统来确保囊泡的完整性并最小化不需要的蛋白质相互作用或修饰。使用两种不同分子量的PEO-b-PBD聚合物“OB18”二嵌段共聚物和“OB29”二嵌段共聚物来确定结果的普遍性，因为它们涉及不同最小尺寸、PEG长度和膜芯厚度的聚合物体。图2提供了一张表格，显示了OB18和OB29的各种属性的比较。亚甲基蓝(mBlue；Mw＝319.85g/mol)在水悬浮液中高度稳定，并具有强的近红外吸光度，能够进行现成的分光光度检测，其用作模型小分子以建立使用现有方法包封的各种基线参数。这样的基线参数包括含水性悬浮液浓度，最终重量百分比和包封效率。使用与具有治疗潜力的其他小蛋白质相当的尺寸和热稳定性(即变性高于60℃)的肌红蛋白(Mb；Mw＝17,600Da)作为模型蛋白。肌红蛋白还具有强烈的紫外线(UV)吸光度，可根据其含铁血红素基团的氧化还原状态确定其功能状态。另外在其他研究中使用肌红蛋白，使得能够使用现有技术将结果与其他包封进行比较，如以上关于图1所讨论的。亚甲基蓝容易包封在高温下通过薄膜再水合形成的PEO-b-PBD聚合物体中，当分别在40和60℃形成时，产生最终的mBlue-聚合物重量比为4.1和5.0w/w％。但是，类似的情况只会导致肌红蛋白降解。
当通过薄膜再水合形成囊泡时，由于干共聚物膜被水合，首先形成薄片(又称海绵状结构)作为膜膨胀中的亲水性嵌段。进一步的膨胀导致转化为六角形包装的囊泡并最终转化成完全分散的聚合物体。当在可溶性小分子(或蛋白质)的溶液中尝试薄膜再水合时，这些水溶性物质吸附到出芽薄片的表面，随后它们采用自发(或优选)曲率。在形成过程中，这些膜优先弯曲离开含有较高浓度吸附物质的水性隔室，从而排除囊泡包封中的水溶性试剂。最终，能量输入可以克服这种自发表面张力以促进囊泡包封。需要的能量的量随着吸附分子的大小和囊泡的膜厚度而变化。因此，虽然容易通过输入热(和/或声波)能通过薄膜再水合破坏脂质体并实现有效的小分子和蛋白质加载，但这种输入仅能够使小分子有效地包封入聚合物体悬浮液中。在作为溶剂分散和均聚物添加的混合而开发的直接水合方法中，亲水性聚合物PEG500二甲醚(DME)用于破坏形成聚合物薄片中疏水链的相互作用。随后添加水溶液，促进了从具有分散蛋白质的出芽薄片的囊泡自组装，并导致水性包封改进；观察到包封效率高达37％。使用23℃直接水合，聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液可具有大于10％的包封率，其中包封的肌红蛋白物质显示良好的悬浮性质和完整蛋白质的特征吸收光谱。然而，发现这些聚合物体包封的悬浮液中肌红蛋白的最终加载量仅为约0.3w/w％Mb/聚合物。在添加蛋白酶溶液以诱导所有表面相关(即非特异性结合)蛋白质的蛋白水解时，发现PEM悬浮液的最终Mb组成甚至更低，即小于0.1w/w％Mb/聚合物。对于转化(translational)治疗应用，治疗性蛋白质在聚合物体载剂的水性腔内的加载量最终是必须最大化的量度，以最小化引入受试者的相关运载体的量。因此，使用标准直接水合的这种包封是不充分的。
在各种实施方式中，渐进饱和方案提供有效生成PEM悬浮液。通过利用17-450kDa范围内的多种不同蛋白质进一步建立蛋白质包封的渐进饱和的普遍性，以使许多新型治疗组合物的临床前研究成为可能的量产生纳米级聚合物体。具体而言，渐进饱和法和直接水合法之间的差异可能涉及添加5个随后体积的功能性蛋白质溶液来稀释PEG/聚合物混合物以替代用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的额外稀释。
具体而言，各种实施方式的渐进饱和方法涉及在约95℃加热10mg聚合物和10mgPEG约1小时。样品混合物可以离心并冷却至室温。可以用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)(例如1重量％)将高铁肌红蛋白(metMb)溶液(例如，PBS中的150mg/mL)还原成氧合肌红蛋白(oxyMb)。从得到的oxyMb溶液中，可以按1:1体积比的比例将一部分(即等分试样)加入到样品混合物中，充分混合然后在室温下超声处理约30分钟。特别地，等分试样可以是10μM的oxyMb溶液。样品混合物可以用多个稀释步骤进一步稀释。具体而言，每个稀释步骤可涉及加入一定体积的oxyMb溶液(例如，150mg/mL于PBS中)，随后在室温下充分混合并超声处理约30分钟。在稀释步骤中使用的oxyMb溶液的体积可以是这样的量，其中oxyMb溶液与原始样品混合物的体积比为1:1、2:1、5:1和5:1，10μL，然后是20、50和100μL。在稀释步骤后，可以将所得样品在室温下超声处理另外30分钟，随后在约4℃下使用1000kDa分子量截止膜透析至少30小时。表面相关的肌红蛋白可以通过用0.4重量％链霉蛋白酶溶液处理通过蛋白水解除去，然后在约4℃下透析至少12小时(例如1000kDa的分子量截止值)。在各种实施方式中，可以在蛋白水解之前和之后测量所得聚合物体悬浮液的肌红蛋白包封。具体而言，肌红蛋白的浓度可以使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)来测量，而肌红蛋白的血红素基团中的铁的氧化还原状态可以使用UV-Vis吸收光谱来定量。
这些渐进饱和步骤为将肌红蛋白包封在OB 18聚合物体中提供了有利的结果，如图3A-3E所示。例如，图3A显示，根据所述渐进饱和方案(即在每个稀释步骤后在室温下约30分钟)，当不使用超声处理时(如在常规技术中)和通过使用超声处理获得的聚合物体包封的肌红蛋白中Mb与聚合物的最终重量百分比(即，w/w％Mb/聚合物)。如图3A所示，约6的Mb与聚合物的最终重量百分比(即，w/w％Mb/聚合物)可由包含该超声处理的方案产生的聚合物体包封的肌红蛋白所实现。因此，基于通过直接水合产生的聚合物体包封的肌红蛋白产生的最终重量百分比，在每次稀释步骤后，在室温下超声处理样品约30分钟可以使包封效率增加超过30倍。
图3B显示使用高铁肌红蛋白溶液(如在常规技术中)和通过使用渐进饱和技术中的oxyMb，所获得的聚合物体包封的肌红蛋白中的Mb与聚合物的最终重量百分比(即，w/w％Mb/聚合物)。图3C显示肌红蛋白氧化率(表示为随时间形成的metMb的百分比)作为肌红蛋白暴露于不同溶液条件的函数。图3D显示了表面相关的Mb的去除量(％Mb损失)作为各种oxyMb体积的蛋白水解时间的函数。图3E显示，稀释步骤中使用的oxyMb溶液与PBS的各种体积比产生的聚合物体包封的肌红蛋白中，Mb与聚合物的最终重量百分比(即，w/w％Mb/聚合物)与包封率(％Mb EE)的对比。具体地说，图3E中的样品经蛋白水解18小时以除去表面相关的肌红蛋白，并使用紫外-可见吸收光谱进行定量。
因此，与用直接水合方案产生的聚合物体包封的肌红蛋白(即，0.1-0.3w/w％Mb/聚合物)相比，根据各种实施方式使用渐进饱和产生聚合物体包封的肌红蛋白(即，4-6w/w％Mb/聚合物)中所获得的最终Mb与聚合物的重量比可被显著提高。不希望受限于特定理论，使用渐进饱和步骤实现的加载容量可能是由于在初始稀释步骤期间不完全的聚合物体形成，以及每次随后添加蛋白质溶液所伴随的进一步包封。
开发渐进饱和方案包括优化和组合来自多种脂质体形成方法的各种步骤。对影响肌红蛋白终浓度的因素，OB18聚合物体运载体内可达到的相对加载水平(即w/w％蛋白质/聚合物)和肌红蛋白包封的效率进行了系统评估。例如聚合物的分子量、蛋白质的氧化状态和浓度、缓冲溶液的pH和性质、确切的聚合物水合条件(即时间、温度和混合技术)、超声处理步骤的数量和持续时间以及添加或避免冻融循环等因素都对最终聚合物体包封的蛋白质产物的浓度和保真度有影响。
此外，与使用现有技术产生的聚合物体包封的肌红蛋白相比，由渐进饱和产生的聚合物体包封的肌红蛋白也表现出Mb终浓度的增加。例如，通过直接水合产生的聚合物体包封的肌红蛋白中的Mb的终浓度小于溶液中的约0.5mg/ML，而在各种实施方式中通过渐进饱和产生的聚合物体包封的肌红蛋白的Mb的终浓度可以大于溶液中的约2.0mg/mL。
使用cryo-TEM来验证囊泡形态，使用渐进饱和法制备的聚合物体包封肌红蛋白悬浮液在4℃，23℃和37℃条件下保存超过一个月时，未见聚集体形成迹象。渐进饱和技术可以进一步用于在PEO-b-PBD聚合物体内成功包封大小范围为17-450kDa的各种其他蛋白质。
不希望受限于特定的理论，Mb包封效率与Mb与聚合物的最终重量比之间可以存在直接的平衡，其可以基于用于每个添加步骤的游离Mb的浓度来实现。为了确保最终产品满足利用聚合物体输送载剂的目标-即改善生物化学稳定性，增加循环半衰期，使副作用最小化，并实现相关蛋白的受控释放，对于表面相关的蛋白质优选蛋白质的水性包封。使用在大范围的分子量和大小范围内变化的不同蛋白质，包括与治疗相关的抗体和酶相关的蛋白质，可以使用各种实施方式技术。例如，渐进饱和技术可用于将肌红蛋白包封在由OB29二嵌段共聚物组成的基于PEO-b-PBD的聚合物体系统中。在各种实施方式中，渐进饱和技术可用于包封许多其他蛋白质中的任何一种，包括但不限于抗体(例如免疫球蛋白G(IgG)和功能性酶(例如过氧化氢酶))。
如以上关于图2所示，当与OB 18二嵌段共聚物相比时，OB29二嵌段共聚物具有较小的分子量并且产生具有更短PEG刷边界(1.3对比3.9kDa)，更薄的双层膜(9.6nm对比14.8nm)和更小的平均流体动力学直径(130对比200nm)的聚合物体。在各种实施方式中，使用渐进饱和度在OB29聚合物体中包封肌红蛋白提供了与来自OB 18聚合物体的那些相似的结果。在各种实施方式中，渐进饱和技术可以使用任何基于PEG的形成聚合物体的嵌段共聚物来应用，所述嵌段共聚物包括由PEG和为生物可降解聚合物的疏水性嵌段(例如，生物可降解聚酯，聚(酰胺)，聚(肽)，聚(核酸)等)组成的任何两亲性聚合物。可形成疏水性嵌段的生物可降解聚酯的示例包括但不限于聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚(己内酯)，聚(甲基己内酯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(羟基戊酸酯)，聚(羟基己酸酯)，聚(羟基辛酸酯)和聚(三亚甲基碳酸酯)。
渐进饱和技术的普遍性通过使用OB29聚合物体包封几种较大蛋白质的类似结果得到进一步证明。图4显示了使用渐进饱和方案和OB29聚合物体包封肌红蛋白，血红蛋白(Hb)(64kDa)，牛血清白蛋白(BSA)(66kDa)，IgG(150kDa)，过氧化氢酶(250kDa)，纤维蛋白原(340kDa)和去铁铁蛋白(450kDa)的包封结果。
本发明旨在通过下述实施例举例说明但不受其限制。
实验部分
进行比较和定量研究是为了建立概括性方法，用于生产可放大量的包封功能性蛋白质的中性电荷和完全PEG化的聚合物体。通过使用由OB18和OB29二嵌段共聚物组成的聚合物体制剂来检查小分子和蛋白质包封的差异。如以上关于图2所示，这两种PEO-b-PBD聚合物和由其形成的聚合物体在分子量和最终囊泡膜厚度方面不同。使用亚甲基蓝(mBlue；Mw＝319.85g/mol)作为模型小分子和肌红蛋白(Mb；Mw＝17,600Da)作为具有独特生物学功能(即氧储存和释放)的模型蛋白。图5A显示了由两亲性二嵌段共聚物制成的聚合物体以及可以包封或附连于聚合物体上的水不溶性试剂和水溶性物质。例如，用于将水溶性试剂结合到PEO-b-PBD聚合物体内的常规囊泡形成技术包括薄膜再水合和直接水合，其方案分别在图5B和5C中示出。比较了由每种薄膜再水合和直接水合方法产生的PEO-b-PBD聚合物体中亚甲基蓝和肌红蛋白的包封。为了定量能够氧结合的全功能性蛋白质的包封，通过ICP-OES测量聚合物体包封的肌红蛋白中的铁浓度，并通过UV-Vis吸收光谱法测量肌红蛋白血红素基团中铁的氧化还原态。
与使用现有技术产生的PEM相比，由渐进饱和产生的PEM表现出可以重复获得的Mb的终浓度增加(例如，从溶液中小于约0.5mg/mL到溶液中大于约2.0mg/mL)，和Mb与聚合物的最终重量比增加(从小于1w/w％Mb/聚合物到大于约3-4w/w％Mb/聚合物)。此外，由渐进饱和产生的PEM显示PEM悬浮液中蛋白质包封的总体效率的增加(从小于约5％增加至大于约90％)。使用cryo-TEM来验证囊泡形态，使用渐进饱和开发的PEM悬浮液在4℃，23℃和37℃时超过一个月没有显示聚集体形成的迹象。
材料
PEO(3900)-b-PBD(6500)(OB18)和PEO(1300)-b-PBD(2500)(OB29)购自聚合物源公司(Polymer Source)(加拿大魁北克省多瓦尔)。马骨骼肌Mb，牛血清血红蛋白(Hb)，牛血清白蛋白(BSA)，过氧化氢酶(C)，纤维蛋白原(F)，连二亚硫酸钠，聚(乙二醇)二甲醚(PEG；Mn＝约500)，灰色链霉菌蛋白酶(“链霉蛋白酶”)和二氯甲烷(DCM)购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国圣路易斯)。马脾脏去铁铁蛋白(aFr)购自阿法埃莎公司(AlfaAesar)(美国瓦德希尔市)。免疫球蛋白G(IgG)购自LEE生物溶液公司(LEE Biosolutions)(美国圣路易斯)。透析管和小瓶购自光谱实验室公司(Spectrum Laboratories)(美国多明格斯牧场)。氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，mBlue和Triton X-100购自飞世尔科技公司(Fisher Scientific)(美国萨瓦尼)。除非另有说明，所有化学品均为试剂级。
使用DelsaTMNano，一种动态光散射(DLS)仪器(贝克曼库尔特(Beckman Coulter)，美国印第安纳波利斯)测量粒度。使用GenesysTM 10S UV-Vis分光光度计(赛默科学公司(Thermo Scientific)，美国萨瓦尼)通过吸收光谱测定Mb和mBlue浓度。使用Micro BCA蛋白质分析试剂盒，利用UV-Vis分光光度法并遵循制造商的方案(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology)；美国伊利诺州洛克福德)进一步测量聚合物体悬浮液中所有蛋白质的浓度。使用Vista-PRO CCD ICP-OES(美国瓦里安公司(Varian))测定聚合物体包封的Mb悬浮液中的铁浓度。使用HemoxTM分析仪(TCS科学公司(TCS Scientific)，美国宾夕法尼亚州纽宏(New Hope))研究氧平衡结合。使用Gene Pulser(伯乐公司(Bio-Rad)，美国加利福尼亚州赫尔克里斯)进行电形成。
方法
薄膜再水合法
10mg的OB 18聚合物溶于200μL的DCM中。将聚合物溶液沉积在Teflon晶片(15mm×15mm)上，随后在室温(RT)下干燥30分钟。在室温下将膜进一步保持在真空下过夜以确保DCM蒸发。对于亚甲基蓝包封，然后将聚合物膜在23、40或60℃时与磷酸盐缓冲盐水(PBS；10mM，pH 7.4)中的亚甲基蓝溶液(21mg/mL)水合24-48小时。将样品在室温下超声处理30分钟，随后使用液氮进行冻融循环(x10)。样品在RT下透析(MW截止值＝100kDa)30小时。对于肌红蛋白包封，将聚合物膜在23、40和60℃用PBS(10mM，pH7.4)中的肌红蛋白溶液(150mg/mL)水合60小时。然后将样品在RT下超声30分钟，然后在4℃透析(MW截止值＝1000kDa)30小时。
直接水合方法
将10mg OB18和10mg PEG在1.5mL离心管中于95℃加热20分钟。将样品混合并冷却至室温，然后加入PBS(10mM，pH 7.4)中10μL亚甲基蓝溶液(21mg/mL)或肌红蛋白溶液(150mg/mL)。然后用20、70和900μL PBS稀释样品并在每次添加/稀释后充分混合(通过涡旋)。然后将样品在室温或4℃(截止分子量1000kDa)透析30小时以分别去除未包封的亚甲基蓝或肌红蛋白。
定量mBlue/Mb
使用UV-Vis分光光度计通过测量665nm(mBlue)或410nm(Mb)处的溶液吸光度来测定包封在纯化的聚合物体悬浮液中的亚甲基蓝或肌红蛋白的量。使用已知浓度的系列稀释液生成亚甲基蓝和肌红蛋白的校准曲线。为了测量聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液中的铁含量(作为该样品中肌红蛋白浓度的确证)，加入5-10％(v/v)的Triton X-100，通过在王水中98℃加热3小时消化混合物，随后用去离子水稀释。对实验样品进行ICP-OES，并且与该标准校准曲线比较确定它们的铁含量。对于每种悬浮液，将肌红蛋白的浓度(通过紫外-可见吸收光谱法计算)与经由ICP-OES或经由微BCA测定(次级UV-Vis方法)获得的浓度相比较。对聚合物体中的水性包封剂的加载量进行定量并表示为包含悬浮液中囊泡的包封剂与聚合物的最终重量百分比(例如w/w％Mb/聚合物)。
定量metMb
使用改进的UV-Vis吸收方案定量聚合物体悬浮液中的高铁肌红蛋白(metMb，即具有Fe(III)-血红素基团的氧化Mb)，所述方案先前针对测量氰化高铁血红蛋白水平而建立。简而言之，针对空白参考(去离子水)，测量630nm处肌红蛋白的吸光度(L1)。加入一滴KCN溶液(1份10％KCN和1份50mM磷酸盐，pH7.6)并与处理过的肌红蛋白样品混合。该反应步骤对于将metMb转化为在630nm不吸收的氰化高铁肌红蛋白(氰化Mb)是必需的。2分钟后，针对作为空白参照的去离子水，在630nm处测量吸光度(L2)。使用公式1确定metMb的浓度：
其中E＝3.7(cm·mM)-1并且是630nm处的metMb的消光系数，并且D1是本实验中的稀释因子(比色杯长度＝1cm)。
为了确定肌红蛋白的浓度，加入一滴20％K3(Fe(CN)6)并与处理过的肌红蛋白样品混合。使溶液反应2分钟，再加入一滴10％KCN并混合。然后在540nm测量样品的吸光度(L3)。使用公式2确定总metMb的浓度：
其中E＝11.3(cm·mM)-1，并且是540nm处氰化metMb的消光系数；D2是稀释因子(比色杯长度＝1cm)。
使用公式3确定原始溶液中metMb的百分比：
聚合物体的结构表征
将聚合物体悬浮液稀释在PBS溶液中，使用标准1.5mL半微量Plastibrand聚苯乙烯比色皿(VWR公司，美国亚特兰大)通过DLS测量流体动力学直径。空白聚合酶体和聚合物体包封的肌红蛋白的形态通过cryo-TEM(JEOL 2100F，USA)显示。简而言之，将聚合物体样品悬浮在微过滤网格中，使用液体乙烷(-183℃)快速玻璃化，然后装载到低温样品架上，用于200kV的cryo-TEM成像。
使用常规方法进行聚合物体悬浮液中mBlue和Mb的包封
为了建立聚合物体悬浮液中小分子和蛋白质包封的比较基线，最终浓度、重量百分比(即包封的试剂的重量与包含纳米颗粒的聚合物的重量相比)以及包封亚甲基蓝的效率分别通过用OB 18聚合物体通过薄膜再水合技术形成。图6A显示40℃时(即4.1w/w％mBlue/聚合物)和60℃时(即，5.0w/w％mBlue/聚合物)用于亚甲基蓝包封的最终聚合物体组合物的重量百分比结果。当在室温下(即23℃)尝试薄膜再水合时，发现亚甲基蓝的包封是可忽略的(结果未显示)，这可能是由于观察到聚合物薄膜在水合48-72小时之后没有膨胀。基于PEO-b-PBD的聚合物体需要输入用于囊泡形成的能量，其通常通过使用升高的温度(例如，大于45℃)来支持。
为了提高低温包封的效率(这在使用不稳定蛋白质时是必要的)，还通过直接水合法研究了mBlue的包封。图。图6B显示在23℃使用直接水合(即，1.2w/w％mBlue/聚合物)产生的聚合物体悬浮液中mBlue与聚合物的最终重量百分比。
接着，最初发现，23℃时通过薄膜再水合形成的聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液包含约2.7w/w％Mb/聚合物。在添加蛋白水解步骤以任何除去表面相关Mb(即非特异性结合的游离蛋白质)后，发现聚合物体的最终组成仅为0.5w/w％Mb/聚合物，表明非常少量的蛋白质被包封在聚合物体内。图6C显示了在添加的蛋白水解步骤之前和之后，在23℃使用薄膜再水合产生的聚合物体悬浮液中Mb与聚合物的最终重量百分比。
为了改善聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液中肌红蛋白的浓度和最终重量百分比，再次尝试在40和60℃利用薄膜再水合在较高温度下生产聚合物体。然而，这样的测试仅导致蛋白质变性和聚集。相比之下，通过在23℃直接水合制备的聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液显示出完整肌红蛋白的良好胶体性质和特征吸收光谱，但是在这些聚合物体包封的肌红蛋白悬浮液中Mb与聚合物的最终加载比低。图6D显示了在蛋白水解之前(即，显示0.3w/w％Mb/聚合物)和蛋白水解后(即0.1w/w％Mb/聚合物)，在23℃使用直接水合产生的聚合物体悬浮液中Mb与聚合物的最终重量百分比。
对常规方法的修改
直接水合和薄膜再水合技术的特征在实验条件下迭代评估，以改善功能性蛋白质的聚合物体包封。
超声的影响
在直接水合方案后，加入OB18聚合物和PEG后，将样品混合，冷却至室温，加入PBS(10mM，pH7.4)中的10μL Mb溶液(150mg/mL)。然后用10,20,50和100μL的Mb溶液进一步稀释样品，随后在每个额外的稀释步骤后混合并超声处理：A)0分钟或B)30分钟。所有样品然后在4℃透析30小时(分子量截止值1000kDa)。最终的Mb浓度、Mb与聚合物的重量百分比以及所得聚合物体悬浮液中Mb包封的效率通过UV-Vis吸收光谱学，ICP-OES进行测量并对比。
在试图通过采用用于囊泡形成的直接水合方案包封OB 18聚合物体中的Mb时，发现在最终的PEM悬浮液中可再现地获得的Mb与聚合物的重量比再次非常低(例如，约0.2w/w％Mb/聚合物)。然而，如果样品在每次稀释步骤后在室温下超声处理30分钟(即在引入额外体积的水溶液以稀释悬浮液中聚合物的浓度后超声处理)，则包封效率可以增加30倍以上。如以上关于图3A所讨论的，PEM悬浮液中Mb的相对量可增加至约6.0w/w％Mb/聚合物，支持将该超声处理步骤添加至原始直接水合方案中。
混合技术的效果(在有机溶剂中溶解聚合物对比加入加热)
将使用有机溶剂的影响与加入加热以将OB18与PEG500均聚物混合以在直接水合方案的第一步期间改善聚合物溶解进行对比。关于聚合物形成的最终产量，以及最终关于可以通过每种方法获得的蛋白质包封的浓度和效率，对这些策略进行了比较。如果首先通过溶于DCM将两种聚合物混合(随后在有机溶剂蒸发后形成聚合物体)，则PEM悬浮液中Mb与聚合物的最终重量比为约2w/w％Mb/聚合物。相比之下，将干燥OB18和PEG500初始加热至95℃持续1小时改进了混合并且促进了更有效的聚合物生成，在最终的PEM悬浮液中产生明显更高的Mb与聚合物的最终重量比(即约5w/w％Mb/聚合物)，对应于更大量的包封的蛋白。
在直接水合方案之后，将10mg OB18和10mg PEG通过在95℃加热1小时或者通过溶解于DCM(50μL)中混合，随后在室温下真空干燥过夜。使用相同的方案进行进一步包封，每次稀释步骤后加入30分钟的超声处理。通过UV-Vis吸收光谱和ICP-OES测定最终悬浮液中的Mb浓度并进行比较。
Mb氧化态的影响(即，利用oxyMb与metMb进行聚合物体包封)
当首先用连二亚硫酸钠还原起始Mb储备溶液以转化全部高铁肌红蛋白(即，metMb)至氧合肌红蛋白(即oxyMb)形式时，发现肌红蛋白包封进一步增强。与含有Fe(III)的metMb形式相比，OxyMb含有具有亚铁状态铁(即Fe(II))的中心血红素基团，这提高了蛋白质的溶解性。在直接水合方案中将oxyMb溶液用于所有随后的稀释步骤之前，通过对该oxyMb溶液进行透析将其进一步脱盐，发现这对于增加Mb在PEM悬浮液中的加载(即，Mb与聚合物的最终重量比)是必需的。如以上关于图3B所讨论的，当在最初的方案步骤中使用oxyMb时，形成了包含6w/w％Mb/聚合物的PEM悬浮液，与使用metMb时得到的4w/w％Mb/聚合物相比，这是一个统计学显著的改进。
改变直接水合方案以使聚合物和PEG的初始混合物暴露至95℃加热1小时(而不是20分钟)。通过对每个稀释步骤使用oxyMb(即Fe(II)Mb)对比metMb，研究Mb的血红素基团的铁氧化态对聚合物体包封效率的影响。通过将冻干的Mb溶解在PBS中来制备MetMb溶液；用1重量％的Na2S2O4处理相同的溶液以获得还原的Mb形式(oxyMb)。通过UV-Vis吸收光谱和ICP-OES测量聚合物体中的Mb包封，并进行比较。
超声和温度对Mb氧化的影响
发现在聚合物体包封的初始步骤中使用的40％以上的oxyMb在50℃时2小时内被再氧化为metMb。相反，如果较低温度用于聚合物体形成(例如，在40℃加热2小时)，则仅从初始oxyMb溶液产生约15％metMb。如上面关于图3C所讨论的，无论加入超声处理或所利用的功率如何，50℃时Mb氧化的速率也显著高于40℃时的Mb氧化速率。因此，确定超声处理对Mb氧化没有影响，因此它优先用于促进聚合物混合并提供界面能以增加聚合物体的形成。
最初的Mb溶液(150mg/mL)用Na2S2O4还原并且经受各种条件，包括在40℃(有或没有超声处理)或50℃加热2-5小时。通过使用氰化高铁血红蛋白方法测量总聚合物体包封的Mb悬浮液中metMb的百分比来确定Mb氧化。
蛋白水解的影响
形成后，用0.4％链霉蛋白酶溶液在室温下处理PEM悬浮液多至18小时，以检查完全消化任何表面相关(即非特异性结合)Mb所需的时间。如以上关于图3D所讨论的，观察到所有表面相关的Mb在2小时内被消化，并且增加的链霉蛋白酶暴露时间或浓度都不会进一步增加Mb损失，因此表明仅保留包封的Mb。
使用不同的蛋白初始溶液浓度(即50,75和150mg/mL)，然后在4℃透析至少30小时(分子量截止值1000kDa)，将Mb包封在OB18聚合物体中。随后用0.4重量％链霉蛋白酶溶液在室温下处理样品18小时，并再次在4℃透析过夜。通过UV-Vis吸收光谱和ICP-OES测量聚合物体中的Mb包封(蛋白水解之前和之后)，并进行比较。
Mb包封效率(即，％Mb EE)的提高
用各种Mb与PBS的体积比(即“Mb:PBS”)进行五组实验以建立最佳的Mb浓度，用于我们在原始“直接水合”方案的修改中的每个后续稀释步骤。值得注意的是，当Mb:PBS增加时，PEM悬浮液中的最终w/w％Mb/聚合物也增加；但是，结果是Mb包封效率(即，％Mb EE)降低。换句话说，当使用最大化浓缩的Mb溶液(即，Mb:PBS＝190：0和150mg/mL oxyMb)进行所有稀释步骤时，最终的Mb与聚合物的质量比最大化。如以上关于图3E所讨论的，当Mb:PBS最小(即10：180)时，％Mb EE最大。由于最终聚合物体悬浮液中的蛋白质量最终是必须针对治疗施用优化的度量(为了使引入受试者的相关运载体聚合物的量最小化)，确定纯Mb溶液(150mg oxyMb/mL)将用于最终包封方案中的每个稀释步骤，使PEM悬浮液中的最终w/w％Mb/聚合物最大化。
在基本的直接水合方案之后，首先将10mg聚合物和10mg PEG在1.5mL微量离心管中在95℃加热1小时，随后冷却至RT。然后通过添加10,10,20,50和100μL的稀释剂稀释混合物。对5个稀释步骤中的每一个，使用两种不同的溶液并进行比较：PBS和/或Mb悬浮液(即，PBS中的150mg/mL Mb)。在步骤1、2、3、4和5中用作稀释剂的Mb与PBS的最终(v/v)比(即“Mb:PBS”)为10:180、20:170、40:150、90:100和190:0。然后使用0.4重量％链霉蛋白酶对样品进行蛋白水解，并再次在4℃透析过夜(截止分子量1000kDa)。使用UV-Vis吸收光谱法测量Mb包封。使用公式4计算Mb包封率：
其中v1＝未包封Mb的初始体积(mL)，c1＝未包封Mb的初始浓度(mg/mL)，v2＝透析和蛋白水解后获得的聚合物体包封的Mb的体积(mL)，并且c2＝透析和蛋白水解后获得的包封Mb的浓度(mg/mL)。
使用渐进饱和生成聚合物体包封的蛋白质悬浮液。
通过在各种实施方式中纳入每个步骤，建立了渐进饱和技术，如图7A所示，其极大地改善了上面关于图5C讨论的原始直接水合方案的结果。使用渐进饱和方案，发现在基于OB18的PEM悬浮液中Mb的最终含量在蛋白水解之前和之后分别为6.1和3.2w/w％Mb/聚合物。通过ICP-OES定量各聚合物体悬浮液中的铁含量(完整血红素基团的数量)证实了UV-Vis测量的蛋白质浓度。如图7B所示，发现聚合物体中Mb的最终加载比率在蛋白水解之前和之后分别为7.9和5.1w/w％Mb/聚合物。如图7C所示，通过UV-Vis吸收光谱法测定metMb(相对于这些悬浮液中总Mb含量)的百分比，发现其在非蛋白水解(PEM-SE)和蛋白水解(PEM-SE)的样品中分别为约8％和6％。图7D是针对基于OB18的PEM悬浮液的测量特性(即，结果)的表格，如关于图7B和7C所讨论的。
聚合物体包封的蛋白质悬浮液的稳定性
使用优化的渐进饱和技术制备OB18包封的Mb悬浮液。样品在4、23和37℃储存3周。在预定的时间点，样品用PBS稀释并通过DLS测定平均粒度和分布。
在聚合物体包封的Mb悬浮液中氧的平衡结合
使用HemoxTM-分析仪在37℃获得游离的和聚合物体包封的Mb的悬浮液中氧的平衡结合和解离曲线。允许样品饱和至147mmHg的pO2(使用压缩空气)，然后脱氧(使用压缩氮气流)。通过双波长光谱法记录氧化和脱氧的游离和聚合物体包封的Mb悬浮液的吸光度作为pO2的函数。将氧平衡曲线拟合至四参数(A0,A∞,P50,n)Hill模型(公式5)。在这个模型中，A0和A∞分别表示在0mmHg和147mmHg处的吸光度。pO2表示氧气的分压；并且，P50表示样品被氧气50％饱和时O2的分压。最后，n代表样本的协同性系数。
图7E显示了游离肌红蛋白(Mb)样品、使用渐进饱和技术制备的蛋白水解前的聚合物体包封的肌红蛋白样品(PEM-SE)和使用渐进饱和技术制备的链霉蛋白酶处理后的聚合物体包封的肌红蛋白样品(PEM-E)获得的P50值(以mmHg为单位)。
最终PEM悬浮液的表征
通过DLS和cryo-TEM测量最终的基于OB 18和基于OB29的PEM悬浮液的尺寸分布。图8A提供了按照DLS评估的使用渐进饱和制备的基于OB18和基于OB29的PEM悬浮液中颗粒的平均值流体动力学直径。图8B和8C分别显示了基于OB18和基于OB29的PEM悬浮液中囊泡的cryo-TEM图像。这些结果证实OB18聚合物体的平均粒径约为200nm，OB29聚合物体的平均粒径为130nm。具有聚合物体的基于OB18的PEM悬浮液的稳定性在三周内和在不同温度下进一步检查，基于悬浮液中一致的颗粒数量和稳定的尺寸分布证明没有聚集。图8D显示了在各种温度(即，4℃，23℃和37℃)下通过渐进饱和制备的基于OB18的PEM悬浮液中通过DLS测定的颗粒的平均流体动力学直径作为时间的函数。最后，通过双波长光谱法证实了包封的Mb在PEM悬浮液中的功能状态(即保留了Mb结合和释放氧的能力)。图8E显示游离oxyMb和氧化的基于OB18的PEM悬浮液的氧平衡曲线。误差线表示平均值的标准偏差，每个条件n≥3次实验重复。PEM的氧平衡曲线、P50(即Mb被氧气50％饱和时的O2分压)与溶液中的游离Mb的非常相似。
使用不同分子量的蛋白质和嵌段共聚物进行聚合物体包封
使用不同大小的蛋白质：即Mb(17kDa)，血红蛋白(Hb；64kDa)，牛血清白蛋白(BSA；66kDa)，免疫球蛋白G(IgG：150kDa)，过氧化氢酶(250kDa)，纤维蛋白原(340kDa)和去铁铁蛋白(450kDa)，测试渐进饱和技术的普遍性；将每种蛋白质以其最大溶解度溶解于PBS(10mM，pH 7.4)中，分别对应于150、150、40、20、50、50和25mg/mL的最终悬浮液浓度。遵循渐进饱和方案以将这些蛋白质包封在OB29聚合物体中。游离蛋白质在4℃透析至少30小时(截止分子量1000kDa)。通过用0.4重量％链霉蛋白酶溶液处理然后在4℃透析过夜(分子量截止值1000kDa)通过蛋白水解除去表面相关蛋白。利用UV-Vis分光光度法并遵循制造商的方案(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology)，美国伊利诺州洛克福德)，通过微BCA测定对聚合物体悬浮液中的蛋白质包封(蛋白水解前后)进行定量。将蛋白质的最终浓度除以聚合物的最终浓度并表示为包含悬浮液中的聚合物体的蛋白质与聚合物的最终重量比(例如，w/w％Mb/聚合物)。
统计学分析
数据表示为平均值±平均值的标准偏差(SD)。每种情况最少使用三次实验重复。使用GraphPad软件(美国圣地亚哥)进行单向方差分析(ANOVA)。P值<0.05时认为有统计学显著性。

Claims (15)

1.制备聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液的方法，包括
将一定量的嵌段共聚物与一定量的低分子量聚乙二醇(PEG)热混合至少30分钟，其中所述热混合在90-100℃进行；
将得到的PEG/聚合物制剂混合并冷却至室温；
将所述功能性蛋白质的溶液的等分试样加入到含有所述PEG/聚合物制剂的样品中，其中添加的等分试样与PEG/聚合物制剂的体积比为约0.5:1至约1.5:1；和
进行至少三个稀释步骤，使得产生的聚合物体逐渐被所述功能性蛋白质饱和，其中每个稀释步骤包括：
向样品中添加额外量的所述功能性蛋白质的溶液；
在PEG/聚合物制剂中混合所述功能性蛋白质的所得分散体；和
超声处理所得的分散体至少30分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其中，进行所述至少三个稀释步骤包括以连续方式进行第一、第二和第三稀释步骤，其中
在第一步骤中添加额外量的溶液包括添加第一量的功能性蛋白质溶液，使得所述第一量与PEG/聚合物制剂的体积比为约1：1；
在第二步骤中添加额外量的溶液包括添加第二量的功能性蛋白质溶液，使得所述第二量与PEG/聚合物制剂的体积比为约2：1；和
在第三步骤中添加额外量的溶液包括添加第三量的功能性蛋白质溶液，使得所述第三量与PEG/聚合物制剂的体积比为约5：1。
3.如权利要求2所述的方法，其中，进行所述至少三个稀释步骤还包括进行第四稀释步骤，其中在第四步骤中添加额外量的溶液包括添加第四量的功能性蛋白质溶液，使得所述第四量与PEG/聚合物制剂的体积比是约5：1。
4.如权利要求1所述的方法，还包括，使用蛋白水解在至少三个稀释步骤之后从聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液中的聚合物体中去除表面相关蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其中使用蛋白水解包括：
在室温下用0.4重量％链霉蛋白酶溶液处理PEG/聚合物/蛋白质样品至少18小时；和
允许混合的PEG/聚合物/蛋白质样品在4℃透析至少12小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述功能性蛋白质的溶液包含在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的氧合肌红蛋白的150mg/mL溶液。
7.如权利要求6所述的方法，还包括通过以下步骤制备所述功能性蛋白质的溶液：
将磷酸盐缓冲盐水中的150mg/mL高铁肌红蛋白(metMb)溶液与足量的1重量％连二亚硫酸钠(Na2S2O4)组合以将metMb还原成氧合肌红蛋白(oxyMb)。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述嵌段共聚物包含两亲性二嵌段共聚物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述两亲性二嵌段共聚物包含聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)。
10.如权利要求1所述的方法，其中将所述一定量的嵌段共聚物与所述一定量的低分子量PEG热混合至少30分钟包括将5-15mg聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)与5-15mg的500kDa PEG(PEG500)热混合至少1小时。
11.如权利要求1所述的方法，其中：
将所述两亲性二嵌段共聚物与所述低分子量PEG热混合至少30分钟包括将10mg的聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丁二烯)(PEO-b-PBD)与10mg的500kDa PEG(PEG500)热混合1小时；和
加入所述功能性蛋白质的溶液的等分试样包括向含有所述PEG/聚合物制剂的样品添加10μL的氧合肌红蛋白溶液。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述热混合在约95℃进行。
13.一种组合物，包含：
聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液，其中所述悬浮液通过以下步骤制备：
将一定量的嵌段共聚物与一定量的低分子量聚乙二醇(PEG)热混合至少30分钟，其中所述热混合在90-100℃进行；
将得到的PEG/聚合物制剂混合并冷却至室温；
将所述功能性蛋白质的溶液的等分试样加入到含有所述PEG/聚合物制剂的样品中，其中添加的等分试样与PEG/聚合物制剂的体积比为约0.5:1至约1.5:1；和
进行至少三个稀释步骤，使得产生的聚合物体逐渐被所述功能性蛋白质饱和，其中每个稀释步骤包括：
向样品中添加额外量的所述功能性蛋白质的溶液；
在PEG/聚合物制剂中混合所述功能性蛋白质的所得分散体；和
超声处理所得的分散体至少30分钟。
14.一种治疗对象的方法，所述方法包括：
制备聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液，其中制备所述悬浮液包括：
将一定量的嵌段共聚物与一定量的低分子量聚乙二醇(PEG)热混合至少30分钟，其中所述热混合在90-100℃进行；
将得到的PEG/聚合物制剂混合并冷却至室温；
将所述功能性蛋白质的溶液的等分试样加入到含有所述PEG/聚合物制剂的样品中，其中添加的等分试样与PEG/聚合物制剂的体积比为约0.5:1至约1.5:1；和
进行至少三个稀释步骤，使得产生的聚合物体逐渐被所述功能性蛋白质饱和，其中每个稀释步骤包括：
向样品中添加额外量的所述功能性蛋白质的溶液；
在PEG/聚合物制剂中混合所述功能性蛋白质的所得分散体；和
超声处理所得的分散体至少30分钟；和
将聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液给予所述对象，其中所述悬浮液通过以下步骤制备：
15.制备聚合物体包封的功能性蛋白质的悬浮液的方法，包括
将一定量的嵌段共聚物与一定量的低分子量聚乙二醇(PEG)热混合；
将所述功能性蛋白质的溶液的等分试样加入到含有所述PEG/聚合物制剂的样品中；和
进行至少一个稀释步骤，使得产生的聚合物体逐渐被所述功能性蛋白质饱和。
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