CN105713932A - 一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法，包括（1）菌种培养：以MRS培养基进行乳杆菌的培养，获得乳杆菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；（2）发酵培养：在发酵培养基中接入克雷伯氏菌种子液，进行微氧发酵，发酵过程中流加葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L；（3）发酵调控：在发酵末期将发酵液pH调至5～6，接入乳杆菌种子液，在低pH条件下进行好氧发酵。本发明方法能够有效脱除发酵液中葡萄糖的残留，有利于下一步双水相、精馏等精制方式的实施，适用于大规模生产应用。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法。
背景技术
2,3-丁二醇可以作为一种潜在的平台化合物，替代传统的平台化合物，用于大规模合成甲乙酮（优良溶剂）和1,3-丁二烯（广泛应用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯等领域）。除此之外，2,3-丁二醇还可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等，2,3-丁二醇的氧化产物3-羟基丁酮和丁二酮可作为食用香料使用；同时，因其热值较高，与乙醇、甲醇相当，故可作为燃料添加剂；2,3-丁二醇酯化后可生成聚氨酯泡沫的前体；2,3-丁二醇与乙酸反应生成2,3-丁二醇二乙酸酯，该酯可加到奶油中改善风味；2,3-丁二醇在我国还被添加到白酒中，以改善白酒的风味。2,3-丁二醇脱氢变成双乙酰，双乙酰在食品工业中作为一种具有很高价值的风味剂。2,3-丁二醇的L型异构体可用于抗冻剂。2,3-丁二醇酯化物能作为制作药物和化妆品的前体。其它潜在的用途包括用于制作墨水、增塑剂、湿润剂。目前2,3-丁二醇的合成主要采用以石油裂解物为来源的化学法，但随着石油资源的大量消耗和不可再生资源价格的节节攀升，发展环境友好的生物基化学品的生物炼制技术已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环、实现经济社会可持续发展的战略需求。
微生物发酵制备2,3-丁二醇的过程中，通常以葡萄糖作为碳源。葡萄糖来源广泛，并且能够被众多微生物利用，目前作为通用碳源，广泛应用于各种发酵生产中。在以葡萄糖为碳源，经生物转化生产2,3-丁二醇过程中，除底物添加葡萄糖外，在发酵周期内还需要进行葡萄糖补加，因此葡萄糖的消耗量较大。由于添加的葡萄糖并不能完全被微生物利用，因此在发酵液中通常会产生部分残留，通常浓度为5g/L。残留的葡萄糖会对2,3-丁二醇产品分离提纯造成很大困难，主要表现在：葡萄糖水溶性好，通常与2,3-丁二醇共同存在与水相中，经常规的分离手段，难以高效脱除，从而影响2,3-丁二醇提取纯度；葡萄糖在加热条件下，易与蛋白类大分子反应，生成有色度物质，影响2，3-丁二醇的品质；目前高纯度的2,3-丁二醇是经过减压精馏获得，但葡萄糖在高温条件下会明显的结焦现象，从而减慢了2,3-丁二醇的蒸发速率，降低了2,3-丁二醇产品的收率。
由于发酵液中残留的葡萄糖难以有效去除，采用常规分离方式难以获得高纯度的2,3-丁二醇产品，因此近年来开发了双水相萃取技术、沸石吸附技术用于2,3-丁二醇产品的分离。CN200710010203.9公开了一种从发酵液中分离2,3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征在于向2,3-丁二醇的发酵液中加入无机盐和亲水有机物形成新型双水相，从而达到萃取分离发酵液中2,3-丁二醇的目的。CN200810024865.6公开了一种利用疏水硅沸石吸附分离发酵液中2,3-丁二醇的方法，其特征在于将菌种发酵制得的2,3-丁二醇发酵液预处理后用疏水硅沸石对2,3-丁二醇进行吸附，吸附后用无水乙醇脱附，脱附液除去乙醇后得到2,3-丁二醇。这些工艺虽然能够通过不同方式，排除了葡萄糖对2,3-丁二醇分离过程的影响，但处理方式过程复杂，均不同程度的添加了有机溶剂，难以规模应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法。本发明方法能够有效脱除发酵液中葡萄糖的残留，有利于下一步双水相、精馏等精制方式的实施，适用于大规模生产应用。
本发明微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法，包括以下步骤：
（1）菌种培养：以MRS培养基进行乳杆菌的培养，获得乳杆菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；
（2）发酵培养：在发酵培养基中接入克雷伯氏菌种子液，进行微氧发酵，发酵过程中流加葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L；
（3）发酵调控：在发酵末期将发酵液pH调至5～6，接入乳杆菌种子液，在低pH条件下进行好氧发酵。
本发明方法中，所采用的乳杆菌为干酪乳杆菌；所采用克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌。
本发明方法中，种子液的培养过程如下：菌种保藏液与种子培养基的体积比为1：100～1：500，在温度为30℃～40℃，搅拌速度为100rpm～400rpm，pH值为6～7的条件下培养至对数生长期，培养过程中保持厌氧或微氧条件。
本发明方法中，发酵过程如下：以葡萄糖为底物发酵，克雷伯氏菌种子液和发酵培养基的体积比为1：8～1：20，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为200rpm～500rpm，pH值为6～7。
本发明方法中，微氧发酵时通入流速小于0.05vvm的空气。
本发明方法中，发酵初始葡萄糖底物浓度控制在50g/L～100g/L。发酵过程中，通过流加形式补充浓度为200g/L～400g/L的葡萄糖溶液，使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L。
本发明方法中，在发酵末期以5mol/L～10mol/L硫酸将pH调至5～6，并加入乳杆菌种子液，乳杆菌种子液和发酵液体积比为1：8～1：20。发酵末期是指发酵培养进行40h以后。
本发明方法中，好氧发酵时通入流速为0.5vvm～1vvm的空气。
本发明通过发酵末期环境诱导、优势菌种的添加手段，能够有效消耗发酵液中葡萄糖的残留量，降低了后续提取难度，能够提高2,3-丁二醇的收率，更有利于工业应用。与现有技术相比，具有以下优点：
（1）微生物对葡萄糖的摄取主要采用主动运输的方式，细胞内葡萄糖的相对浓度较高。当细胞自溶后，胞内富集的葡萄糖会从新进入发酵液中，因此经灭菌处理后，发酵液中葡萄糖浓度通常要高于发酵结束时发酵液残糖浓度。本发明在发酵末期，通过低pH、高渗透压等调控的手段，提高发酵菌株的自溶率，使葡萄糖完全溶液溶解于发酵液中，从而加强了葡萄糖的脱除效果；
（2）乳杆菌具有高效的葡萄糖代谢能力，并且能够对低pH、高渗透压进行较好的耐受。本发明在发酵末期，通过乳杆菌的加入，以微生物代谢的方式，脱除发酵液中残留的葡萄糖，工艺简单，操作简便，效果明显。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的效果，但不构成对本发明的限制。
本发明实施例中，以Waters2695分离系统与Waters2414示差检测器构成液相分析系统，其中分离柱选用AminexHPX-87H有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以葡萄糖、琥珀酸、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇、乙醇标准样品建立标准图谱，反应过程中定时测量反应体系中葡萄糖的消耗情况、产物2,3-丁二醇的积累情况。
本发明实施例中，所用的菌种为克雷伯杆菌（Klebsiellapneumoniae），来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，保藏编号为CGMCCNO.0798；干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种FY-04，保藏编号为CGMCCNO.3269。
本发明实施例中，种子培养基及发酵培养基的配方如表1所示。
表1培养基配方
| 配方 | LB培养基（/L） | MRS基本培养（/L） | 发酵用培养（/L） |
| Tryptone | 10g | 10g | — |
| Yeast Extrac | 5g | 5g | — |
| NaCl | 10g | — | — |
| 葡萄糖 | — | 20g | 100g |
| 醋酸钠 | — | 5g | — |
| 柠檬酸二铵 | — | 2g | — |
| MgSO4·7H2O | — | 0.52g | 0.25g |
| MnSO4·H2O | — | 0.28g | 0.001g |
| 吐温80 | — | 0.1g | — |
| K2HPO4·3H2O | — | — | 13.7g |
| KH2PO4 | — | — | 2g |
| (NH4)2SO4 | — | — | 6.6g |
| (NH4)2HPO4 | — | — | 3.3g |
| FeSO4·7H2O | — | — | 0.05g |
| ZnSO4·7H2O | — | — | 0.001g |
| CaCl2 | — | — | 0.01g |
| EDTA | — | — | 0.05g |
实施例1
（1）种子液培养：取液体保藏的克雷伯杆菌（Klebsiellapneumoniae）菌种保藏液2mL加入800mL的LB培养基中，混合于1L种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为37℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在7.0，培养过程中保持微氧，培养11h至对数期。
取液体保藏的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）菌种保藏液2.5mL加入1000mL的MRS培养基中，混合于1L种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为35℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在6.0，培养过程中保持微氧，培养20h至对数期。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积选择15L，上罐体积为8L。具体步骤如下：
a、分别取800mL克雷伯杆菌种子液加入到7.2L发酵培养基中；
b、发酵过程控制培养温度为37℃，搅拌速度为200rpm，过程中以30%NaOH调节pH，使其控制为7，该过程保持微氧发酵；
c、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，并及时通过流加的方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在30g/L水平。
（3）发酵开始40h后，用5mol/L硫酸将pH调至5，并加入1L干酪乳杆菌种子液，并通入0.5vvm空气，进行好氧发酵。
发酵48h结束，最终产物中2,3-丁二醇浓度为82.52g/L，葡萄糖0.10g/L。
实施例2
（1）种子液培养：取液体保藏的克雷伯杆菌（Klebsiellapneumoniae）菌种保藏液3mL加入900mL的LB培养基中，混合于1L种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为37℃，搅拌速度设为300rpm，pH控制在6.5，培养过程中保持微氧，培养15h至对数期。
取液体保藏的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）菌种保藏液6mL加入1800mL的MRS培养基中，混合于2.5L种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为35℃，搅拌速度设为100rpm，pH控制在6.0，培养过程中保持微氧，培养24h至对数期。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积选择15L，上罐体积为8L。具体步骤如下：
a、分别取900mL克雷伯杆菌种子液加入到8.1L发酵培养基中；
b、发酵过程控制培养温度为37℃，搅拌速度为200rpm，过程中以30%NaOH调节pH，使其控制为7，该过程保持微氧发酵；
c、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖消耗情况，并及时通过流加的方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在30g/L水平。
（3）发酵开始45h后，用5mol/L硫酸将pH调至5.5，并加入1.8L干酪乳杆菌种子液，并通入1vvm空气，进行好氧发酵。
发酵50h结束，最终产物中2,3-丁二醇浓度为92.64g/L，葡萄糖0.05g/L。
比较例1
采用克雷伯氏菌单一菌种发酵，菌种培养及发酵过程控制与实施例1相同。发酵48h，最终产物中2,3-丁二醇浓度为83.62g/L，葡萄糖6.24g/L。
比较例2
采用克雷伯氏菌单一菌种发酵，菌种培养及发酵过程控制与实施例2相同。发酵50h，最终产物中2,3-丁二醇浓度为93.32g/L，葡萄糖5.25g/L。
比较例3
种子培养及发酵培养与实施例1相同。不同之处在于：发酵40h后，不经pH调节，直接加入1L干酪乳杆菌种子液，并通入0.5vvm空气，进行好氧发酵。经48h，最终产物中2,3-丁二醇浓度为83.33g/L，葡萄糖3.42g/L。
比较例4
种子培养及发酵培养与实施例1相同。不同之处在于：发酵40h后，用5mol/L硫酸将pH调至5，但是不加干酪乳杆菌种子液，并通入0.5vvm空气，进行好氧发酵。经48h，最终产物中2,3-丁二醇浓度为81.26g/L，葡萄糖9.15g/L。
Claims (10)
1.一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）菌种培养：以MRS培养基进行乳杆菌的培养，获得乳杆菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；
（2）发酵培养：在发酵培养基中接入克雷伯氏菌种子液，进行微氧发酵，发酵过程中流加葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L；
（3）发酵调控：在发酵末期将发酵液pH调至5～6，接入乳杆菌种子液，在低pH条件下进行好氧发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所采用的乳杆菌为干酪乳杆菌；所采用克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：种子液的培养过程如下：菌种保藏液与种子培养基的体积比为1：100～1：500，在温度为30℃～40℃，搅拌速度为100rpm～400rpm，pH值为6～7的条件下培养至对数生长期，培养过程中保持厌氧或微氧条件。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵过程如下：以葡萄糖为底物发酵，克雷伯氏菌种子液和发酵培养基的体积比为1：8～1：20，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为200rpm～500rpm，pH值为6～7。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：微氧发酵时通入流速小于0.05vvm的空气。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：发酵初始葡萄糖浓度控制在50g/L～100g/L。
7.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：发酵过程中，通过流加浓度为200g/L～400g/L的葡萄糖溶液，使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在发酵末期以5mol/L～10mol/L硫酸将pH调至5～6。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：乳杆菌种子液和发酵液体积比为1：8～1：20。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：好氧发酵时通入流速为0.5vvm～1vvm的空气。
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