CN105678110B - 一种样本组合分析核酸序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于样本组合分析核酸序列的方法。通过将需要分析的多个样本按照特定的组合方式分成若干组，并确保每个样本在不同的y组(y≧2)、且仅为y组中被分析y次，然后每个组按照一个分析样品实施对核酸序列分析，最后根据若干组样品的分析结果，组合判断具体样本的分析结果。该方法针对单个指标的特征核酸片段序列，且在多样本中只有极少数样本具有该特征核酸片段序列，其目的是利用组合方式，通过对远小于样本数的样品实施分析，确定具有该特征核酸片段序列的样本。该方法可以显著提高大样本的分析效率、大幅度降低分析成本。

Description

一种样本组合分析核酸序列的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种通过组合方法大幅度减少分析样品数，分析特定核酸序列片段的方法。

背景技术

人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，通过对某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。越来越多核酸分析技术的出现为样本检测提供操作简单、价格便宜的方法成为可能。尽管如此，但对于涉及一类大样本中阳性样本只有比例很少的分析对象而言，如果每个单个样本都进行检测，则分析成本过高、时间耗用过长。如对100个人中的某个突变位点的分析，按照“突变”定义意味着这100个人中绝大多数样本为野生型，可能只有少数几个、甚至也可能不存在突变型的样本。但如果不对每个样本进行分析则又不可能对样本进行分型；又比如区分感冒发热病人与某种禽流感患者、或者从体检的人群中筛查艾滋病患者等等。这些相对于阴性样本占有绝大多数、阳性样本只占有很少比例的分析对象而言，一方面检测是必要的，另一方面，实施单个样本的检测费用又相对过高、耗时太长，有时还会因为费用、或者耗时而不得不选择放弃某些必需要检测项目，给个人、社会带来经济上的损失、甚至生命的危害。

针对某个特定核酸序列的定性分析而言，如果分析样本中存在这段核酸序列（有），可以称为阳性样本；如果不存在这段核酸序列（无），则可以称为阴性样本。因此，现行对单个样本实施分析这段核酸序列的结果只能给出“有（阳性）”或者“无（阴性）”的信息，而且两者必为其一。同样地，对一个由若干个样本混合的样品实施分析，在检测限范围内，它同样可以给出“阳性”或者“阴性”的信息，而且两者必为其一。很明显，如果这个混合样本分析的结果是“阴性”，那么无论这个混合样本由多少个样本混合而来，都可以从这一单个结果判断出这些所有的样本全部为“阴性”。对于分析像点突变这样的核酸序列而言，如果假定100个样本中含有一个“阳性”样本（很明显，根据“点突变”的定义，这一假设是合乎实际情况的），如果将这100个样本分成10组，每组由10个样本均匀混合，那么这10组的分析结果一定是9组结果为“阴性”，1组结果为“阳性”。因而，我们通过10组混合样品的分析，可以确定100个样本中其中的90个样本为“阴性”。而对于那1组结果为“阳性”的10个样本而言，则无法分辨出其中的哪一个属于“阳性”样本，即这10个样本均是“阳性”样本可能者。

组合分析方法为从那1组结果为“阳性”的10个样本中分辨出其中的一个“阳性”样本、或者至少为减少可能“阳性”样本数目，为下一步的分析减少分析的数目提供了可能。

很明显，对100个样本进行有效分析，无论是单个分析、或者是组合分析，一定需要有100个独立的信息与之对应，即每个样本均对应一个独立的信息。对于一组混合样品而言，它分析的信息同样归属于（混合的）所有单个样本的信息。这10组独立的信息无法通过组合的办法获得新的独立的信息。因此，虽然从它的“阴性”结果可以知晓所有单个样本的信息均为“阴性”，但从它的“阳性”结果则无法推知单个样本的信息的具体信息。为了获得单个样本的信息，很明显需要继续增加独立的信息。如果每个样本在不同混合样本组中被测定2次、且仅为2，那么一个“阳性”样本所归属的这两个不同的混合组中（在检测限内）就一定能够获得“阳性”的分析结果。这种情况下，根据每个组分析结果，其每组结果的组合方式就可以提供比组数目更多的独立信息。要得到每个样本的具体信息，其实验得到的独立信息数就必须大于或者等于分析的总样本数。一个样本被分配到两个不同的组分析两次，其组数M和能够提供的不同信息数X之间根据组合原理有如下关系： X= M(M-1)/2。样本分析的最大数目N与X之间的关系为：X≥N。每组混合最多样本数为(M-1)、最少为1。当然，当阳性样本超过1个时，则阳性样品组会超过两组，这种情况下会出现不能确定的阳性样本，需要对这些不能确定的阳性样本进一步分析。类似地，一个样本被分配到y个不同的组中分析y次，其组数M和能够提供的不同信息数X之间根据组合原理有如下关系： X= [M(M-1) (M-2)…(M-y)]/[y(y-1)(y-2)…×2×1。同样地，根据这些组的分析结果信息，并将其信息进行组合，在有y组、且只有y组为阳性结果的情况下可以完全确定单个样本的信息；而当阳性结果的组数大于y时，则可以确定可能的阳性样本、并通过对可能的阳性样本进一步的分析确定其耽搁样本的具体信息。因此，原理上，在组数固定的情况下，样本被分析的次数越多，每组能够组合的样本数目也就随之增加。但在实际的分析中，需要考虑阳性样本不断被稀释的检测灵敏度，样本组合操作过程复杂程度，选择合适的分组方式。

本发明提出一种基于一个样本被析两次的样本组合分析核酸序列的方法，其目的是针对多样本中只有极少数样本中含有单个指标的特征核酸片段序列提供一种快速、准确、低成本的分析方法，从而实现对大样本的分析、并确定其单个样本的具体信息分析，或者完成对大样本的初筛分析。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：

提供一种基于样本组合方法分析核酸序列的检测方法，快速、准确、低成本实施对大样本的分析、并确定其单个样本的具体分析信息。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种基于样本组合分析核酸序列的方法，将需要分析的N个样本(N﹥3)按照特定的样品组合方式分成M组，然后每组按照一个分析样品实施对特征核酸序列片段分析，含有特征核酸序列片段为阳性、不含有特征核酸序列片段为阴性，最后根据M组样品的分析结果，组合判断N个样本中每个具体样本的分析结果，包括如下步骤 ：

a. N个样本的分组，即：样本分组的数目M通过分析的样本数N、每个样本被分析的次数y来确定的（y≥2），组数M与N、y的关系满足：[M(M-1) (M-2)…(M-y)]/[y(y-1)(y-2)…×2×1≦N，对每个样本设唯一编号，对每组样品设唯一的编号、由若干不同样本等量混匀组成，在选定分析方法的检测限内，每组样品包含的样本数最多为yN/M、最少为1，使得同一样本必须分在不同的y组、且只能分在不同的y个组中，即所有样本均需在不同的y组样品中被分析y次；

b. 对每组混合样品进行分析；

c.确定每个样本的信息，每个样本的信息是指根据M组样品得到M个分析结果按照如下方法进行确定：

c-1. M个分析结果无一组样品为阳性结果：N个样本均为阴性；

c-2. M个分析结果中有y组样品为阳性结果：则N个样本中只有有1个阳性标本，其具体样本编号为样品阳性信息的y组所共有的样本编号；

c-3. M个分析结果中有P(y≤P≤M)组样品为阳性结果：N个样本中有(P-1)个阳性，其具体样本通过阳性信号两组的共有样本编号找出(P-1)+(P-2)+(P-3)+…+3+2+1个可能的样本。

其中，所述特征核酸序列为阳性样本含有、阴性样本不含有的核酸序列片段，核酸序列片段可以是包括点突变、甲基化、插入、缺失等单个碱基的变化，也可以是多个碱基的变化、或者样本外的表征另一物种、传统物种中混入的转基因物种、特定环境中的某个微生物的特征序列，特征核酸序列在N个样本中阴性样本占绝大多数，阳性样本占少数。

本发明的有益效果是：

提供了一种基于样本组合方法分析核酸序列的检测方法。通过将需要分析的多个样本按照特定的组合方式分成若干组，并确保每个样本在不同的两组、且仅为两组中被分析两次，然后每组按照一个分析对象实施对核酸序列分析，最后根据若干组的分析结果，组合判断具体样本的分析结果。该方法针利用组合方式，通过远小于样本数的分析对象确定样本分析信息，可以显著分析的数量、大幅度降低分析成本和节省分析时间。与传统的核酸序列分析相比，本方法不仅可以大幅度减少分析的样品数目、节约时间，提高分析效率；同时也可以大幅度减少对分析试剂的使用量，从而大幅度降低分析成本。

具体实施方式

下面将结合表格，对本发明作进一步的说明。

如 表1所示，N个分析样本分成M组的一种样本具体组合方式，其中，每个样本被分析2次、且只被分析两次，即每个样本被组合到两个、且只为两个不同的组中进行分析，最大分析样本数N要小于或者等于最大独立信息数M(M-1)/2。样本组合分组应该按照阳性样本的比例来进行。例如，当阳性样本的比例低于1%时，可以选择将样本组合成15组来实施分析这100个样本；而当阳性样本的比例大于1%、小于2%时，既可以选择组合15组来实施分析这100个样本；也可以选择分成两大组，每大组分析50个样本分成11组来实施。表格中所有的样本编号均为大于1的正整数、且至左往右，从上到下均为整数递增关系（≧0）。

在分析结果只有两组为阳性信息的前提下，一个具体的阳性样本的确定方式：从两阳性信号组中找出相同的样本编号，该编号即为阳性样本、其余样本为阴性样本。如当A、B两组为阳性信息，其余组均为阴性信息，则可以从A、B组中找出相同的样本编号为1，即样本1为阳性样本、其余样本为阴性样本；依次类推。

当根据表1分组、在分析结果分别有3、4、5、…、x组为阳性信息的前提下，同样地，分别从3、4、5、…、x组中找出相同的样本编号，其相同的样本编号数目分别为3、6、10、15、…、(x-1)+(x-2)+(x-3)+…+3+2+1，这些样本编号均为可能的阳性样本、其余样本为阴性样本。由于这些样本数目仍然不能具体其定是否为阳性样本，需要继续进行单个或者组合式分析。

表1. N个分析样本分成M组的一种样本具体组合方式

例如，如表1-1所示，每个样本被分析2次、且只被分析两次，45样本分成10组的一种样本具体组合方式。根据最大分析样本数N要小于或者等于最大独立信息数M(M-1)/2的关系：当N=45，则M至少为10，即至少需要10组才能组合完成45个样本的分析。

表1-1. 45样本分成10组的一种样本具体组合方式

表1-2为每个样本被分析2次、且只被分析两次，55个样本个分成11组的一种样本具体组合方式。根据最大分析样本数N要小于或者等于最大独立信息数M(M-1)/2的关系：当N=55，则M至少为11，即至少需要11组才能组合完成55个样本的分析。

表1-2. 55个样本个分成11组的一种样本具体组合方式

组	样本编号
		K	1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
L	1、11、12、13、14、15、16、17、18、19
		M	2、11、20、21、22、23、24、25、26、27
N	3、12、20、28、29、30、31、32、33、34
		O	4、13、21、28、35、36、37、38、39、40
P	5、14、22、29、35、41、42、43、44、45
		Q	6、15、23、30、36、41、46、47、48、49
R	7、16、24、31、37、42、46、50、51、52
		S	8、17、25、32、38、43、47、50、53、54
T	9、18、26、33、39、44、48、51、53、55
		U	10、19、27、34、40、45、49、52、54、55

表1-3为每个样本被分析2次、且只被分析两次，92～105样本的一种样本组合分组方法。根据最大分析样本数要小于或者等于最大独立信息数的关系，至少需要15组才能组合完成92～105个样本的分析。如，当分析数目为100个样本时，每组最多样本数为14个，最少为11个。

表1-3. 92～105个样本分成15组的一种样本具体组合方式

再如表2所示，当每个样本被分析3次、且只被分析3次，即每个样本被组合到三个、且只为三个不同的组中进行分析，56个样本个分成8组的一种样本具体组合方式。根据一个样本被分配到y个不同的组分析y次，其组数M和能够提供的不同信息数X之间根据组合原理如下关系： X= [M(M-1) (M-2)…(M-y)]/[y(y-1)(y-2)…×2×1。当y=2、X=56时，M=8，即至少需要8组才能组合完成56个样本的分析。

在分析结果只有三组为阳性信息的前提下，一个具体的阳性样本的确定方式：从三阳性信号组中找出相同的样本编号，该编号即为阳性样本、其余样本为阴性样本。如当、、三两组为阳性信息，其余组均为阴性信息，则可以从、、三组中找出相同的样本编号为1，即样本1为阳性样本、其余样本为阴性样本；依次类推。

当根据表2分组、在分析结果分别有3、4、5、…、x组为阳性信息的前提下，同样地，分别从3、4、5、…、x组中找出相同的样本编号，其相同的样本编号数目分别为3、6、10、15、…、(x-1)+(x-2)+(x-3)+…+3+2+1，这些样本编号均为可能的阳性样本、其余样本为阴性样本。由于这些样本数目仍然不能具体其定是否为阳性样本，需要继续进行单个或者组合式分析。

类似地，当一个样本被分配到y个不同的组分析y次，其组数M和能够提供的不同信息数X之间根据组合原理如下关系： X= [M(M-1) (M-2)…(M-y)]/[y(y-1)(y-2)… ×2×1。因此，可以根据选择的y、X值确定M的数值。在这种分组情况下，分析结果只有y组为阳性信息，则可以一个具体的阳性样本的确定方式：从y组阳性信号中找出相同的样本编号，该编号即为阳性样本、其余样本为阴性样本；而当阳性信息组大于y组时，同样地可以从这些阳性信息组找出相同的样本编号、但这些样本编号均为可能的阳性样本、需要继续进行单个或者组合式分析。

表2. 56个样本分成10组的一种样本具体组合方式

组数	样本编号
			1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
	1、2、3、4、5、6、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36
			1、7、8、9、10、11、22、23、24、25、26、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46
	2、7、12、13、14、15、22、27、28、29、30、37、38、39、40、47、48、49、50、51、52
			3、8、12、16、17、18、23、27、31、32、33、37、41、42、43、47、48、49、53、54、55
	4、9、13、16、19、20、24、28、31、34、35、38、41、44、45、47、50、51、53、54、56
			5、10、14、17、19、21、25、29、32、34、36、39、42、44、46、48、50、52、53、55、56
	6、11、15、18、20、21、26、30、33、35、36、40、43、45、46、49、51、52、54、55、56

实施例1：基于样本组合线粒体突变位点C3206T位点的DNA芯片分型

1、基因组DNA样本制备

首先，对100个人血液样本进行编号，编号从1、2、3、…、100，将编号1～45样本按照表1-1进行组合分成10组，编号46～100按照表1-2进行组合分成11组，一共分成21组并标记相应的分组编号。然后将这21组血液混合样品采用血液线粒体DNA提取试剂盒(mtDNAExtractor (R) WB KIT，WAKO）提取线粒体DNA，并按照下列步骤分别对21组混合样品进行下列步骤2～7操作。

2、PCR

50 μL的PCR扩增体系包含: 200 ng基因组DNA，0.2mM dNTP，0.8 μM丙烯酰胺修饰的正向引物 5’-GCAGCCGCTATTAAAGGTTCG和0.8 μM反向引物5’-GGGCTCT GCCATCTTAACAAA，2 U Taq DNA聚合酶， 1×扩增缓冲液，1.5 mM MgCl2。扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环（94℃变性30秒～55℃退火45秒～72℃延伸45秒），最后72℃延伸7分钟。

3、PCR产物的浓缩

加200μL的-20℃的95%乙醇于PCR产物中，在-20℃下冷冻状态下放置3小时，10000转速下离心4分钟，将上层清液移出，并在50℃干燥30分钟，得到PCR产物浓缩沉淀物。

4、DNA芯片的制备

使用喷射式点样仪将含PCR产物浓缩沉淀物，3.5%丙烯酰胺单体（29：1，丙烯酰胺：双丙烯酰胺），20%甘油，1% 过硫酸铵和平衡去离子水的预聚液均匀混合，并确保PCR产物完全溶解。然后，按照预先设计的点样模式、将预聚液点样至丙烯酰胺修饰的玻片上，并设置空白样本。最后采用N,N,N’,N’-四甲基乙二胺介导的直接聚合方法固定PCR产物，制备DNA芯片（Xiao P F, et al. Electrophoresis, 2006, 27(19): 3904-3915）。

5、单链DNA的制备

将固定了PCR产物的芯片在0.1 M NaOH溶液中电泳（100 mA）10分钟，清除未固定的DNA链和其它杂质，然后再置于1×TBE溶液（1 L水溶液中含6.05克Tris 碱(C4H11NO3)、3.085克硼酸、0.372克EDTA（乙二胺四乙酸））中电泳(5 V/cm)10分钟以去除凝胶中的NaOH，制备DNA芯片单链模扳。

6、标记探针与单链模板的杂交

用浓度2 μM 标记的一对双标记探针（5’-Cy5-TGGGGACGATGAG，Cy3-GGGTGTGGGTATA）与 1×杂交缓冲液、平衡去离子水混合后加到DNA芯片上。杂交反应条件为：80℃放置5分钟，冷却至室温，然后37℃杂交至1小时。杂交后，用双蒸水清洗玻片，氮气吹干。

7、DNA芯片信号的获取与分析

杂交完成后，将DNA芯片放置在1×TBE溶液中，4℃电泳(4 V/cm)5分钟，去除未杂交的探针。用双蒸水清洗后吹干玻片，然后用芯片扫描仪对凝胶芯片进行Cy5、Cy3荧光扫描。根据Cy3信号判断每个样品的PCR、及其单链DNA制备是否成功，并按照Cy5信号为阳性信息、Cy3信号为阴性信息确定每组样品的信息。

8、单个样本的分型

根据DNA芯片反应对21组样品进行的分析，确定每组样品的“阳性”、“阴性”属性。然后将A～J的10组（表1-1）、K～U的11组（表1-2）分别进行组合分析：如果A～J（或者K～U）中只有2组为阳性信息，则表明只有一个样本为“阳性”，可从2组阳性信息组中找出相同编号样品即为突变型，其余样本均为“阴性”，即为野生型；A～J（或者K～U）中多于2组为“阳性”信息，则先找出可能的阳性样本编号（在阳性信息组中出现2次的样本编号即是），然后再对这些数目不多的样本采用焦测序、或者Sanger测序等方法进行单个分析。

实施例2：基于样本组合线粒体突变位点A5301G位点的焦磷酸测序分型

1、基因组DNA样本制备

首先，对56个人血液样本进行编号，编号从1、2、3、…、100，然后根据表2进行组合分组，并标记为、、、…、，共分8组。然后将这8组血液混合样品采用血液线粒体DNA提取试剂盒(mtDNA Extractor (R) WB KIT，WAKO）提取线粒体DNA，并按照下列步骤分别对8组混合样品进行下列步骤2～5操作。

2、PCR

50μL的PCR扩增体系包含: 200 ng线粒体DNA，0.2mM dNTP，0.8 μM正向引物 5’-biotin-CAATTACCCACATAGGATGA和0.8 μM反向引物5’-AGGCGTAGGTAGAAG TAGAGGTT，2 UTaq DNA聚合酶，1×扩增缓冲液，1.5 mM MgCl₂。扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环（94℃变性30秒～55℃退火45秒～72℃延伸45秒），最后72℃延伸7分钟。

3、单链DNA的制备

（1）Sepharose beads准备

使用Vertex混匀Sepharose beads；将需要使用的Sepharoe beads总量（每样本5μL）转移到一个Eppendorf管中；

（2） PCR产物与Sepharose beads结合

将上述Sepharose beads与PCR产物（50 μL反应体积）混合，并在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；

（3）测序单链DNA制备

在Vacuum prep workstation中，样品板中依次加入180 mL高纯水、70%乙醇、washing buffer和120 mL Denaturation buffer；打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒；然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取Sepharose beads（在beads与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；将vacuum prep tool放入70%乙醇中5秒；然后移到denatureation buffer中5秒；再移到washing buffer中清洗5-10秒；关掉泵；将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放Sepharose beads。使用高纯水清洗vacuum prep tool；

4、测序引物与单链PCR产物杂交

在结合单链DNA的Sepharose bead中加入含有0.3μM (5’-AGGGTGGGCTATGATGGTGGGGA) binding buffer，使得平均每个样品约有50 μL的体积，将混合物混匀；将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80°C，2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。

5、Pyrosequencing反应

在试剂仓中加入测序所需的各种试剂 (PyroMark Gold Q96 SQA Reagents)，将包含磁珠固定PCR样本的8组样品置于96孔板中，和试剂仓一同放入测序仪中，并设定测序参数。完成对8组样品的序列定量分析、确定每组样品的信息：如果采用单核苷酸加入方式测序，则T¹C⁰峰型样品为野生型（阴性）；T^1-xC^x峰型样品为突变型（阳性）(见下表)。如果采用两核苷酸加入方式测序，则CG⁰AT¹峰型样品为野生型（阴性）；CG^2xAT^1+x峰型样品为突变型（阳性）(见下表)。很明显，两核苷酸加入方式测序比单核苷酸加入方式测序具有更高的分析灵敏度。

6、单个样本的分型

根据Pyrosequencing反应对8组样品进行的分析，确定每个样品的“阳性”、“阴性”属性。如果8组样本中只有2组为阳性信息，则表明只有一个样本为“阳性”，然后从2组阳性信息组中找出相同编号即为阳性样本编号，即样本为突变型；其余样本均为“阴性”，即野生型。如果分析确定样品为“阳性”如果对8组样品的分析多于2组为“阳性”信息，则先找出可能的阳性样本编号（在阳性信息组中出现2次的样本编号即是），然后再对这些数目不多的样本进行焦测序实施单个样本分析。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种基于样本组合分析核酸序列的方法，其特征在于，将需要分析的N个样本按照特定的样本组合方式分成M组，其中N﹥3；然后每组按照一个分析样本实施对特征核酸序列片段分析，含有特征核酸序列片段为阳性、不含有特征核酸序列片段为阴性，最后根据M组样本的分析结果，组合判断N个样本中每个具体样本的分析结果，包括如下步骤 ：

a. N个样本的分组，即：样本分组的数目M通过分析的样本数N、每个样本被分析的次数y来确定的，其中y≥2，组数M与N、y的关系满足：[M(M-1) (M-2)…(M-y)]/[y(y-1)(y-2)…×2×1]≦N，对每个样本设唯一编号，对每组样本设唯一的编号、由若干不同样本等量混匀组成，在选定分析方法的检测限内，每组样本包含的样本数最多为yN/M、最少为1，使得同一样本必须分在不同的y组、且只能分在不同的y个组中，即所有样本均需在不同的y组样本中被分析y次；

b. 对每组混合样本进行分析；

c.确定每个样本的信息，每个样本的信息是指根据M组样品得到M个分析结果，每个样本的信息按照如下方法进行确定：

c-1. M个分析结果无一组样本为阳性结果：N个样本均为阴性；

c-2. M个分析结果中有y组样本为阳性结果：则N个样本中只有1个阳性标本，其具体样本编号为样本阳性信息的y组所共有的样本编号；

c-3. M个分析结果中有P组样本为阳性结果，其中y≤P≤M：N个样本中有(P-1)个阳性样本，其具体通过阳性信号两组的共有样本编号找出(P-1)+(P-2)+(P-3)+…+3+2+1个可能的样本。

2.根据权利要求1所述的基于样本组合分析核酸序列的方法，其特征在于步骤b中每组混合样本的核酸序列分析方法包括对单组样本的分析和多组样本的并行分析，分析技术包括桑格测序，焦测序，DNA芯片、熔点曲线、定量PCR、质谱、色谱、电泳分析方法。