CN105658203B

CN105658203B - 含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂

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Publication number: CN105658203B
Application number: CN201480058606.9A
Authority: CN
Inventors: 多田贵广; 加贺美和宏; 横田志朗; 菊池健太
Original assignee: Activus Pharma Co Ltd
Current assignee: Activus Pharma Co Ltd
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2034-11-07
Also published as: CA2929361C; IL245406B; JPWO2015068397A1; US20160271057A1; MX2016005764A; AU2014345193A1; IL245406A0; TW202027726A; RU2016122544A; BR112016010358A2; KR20210054068A; EP3067045A1; RU2016122544A3; TWI691341B; CN105658203A; AU2014345193C1; EP3067045A4; CA2929361A1; RU2707748C2; AU2014345193B2

Abstract

本发明的目的在于提供含有大环内酯类抗菌剂作为有效成分的水性悬浮液。具体而言，本发明的目的在于提供含有可实用化的大环内酯类抗菌剂作为有效成分的医药组合物。为此，本发明提供含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒及分散稳定剂的水性悬浮剂、纳米微粒的平均粒径为500nm以下且90％粒径为1500nm以下的水性悬浮剂、含有该水性悬浮液的非口服给药用医药组合物、注射剂、滴眼剂、或滴耳剂，更具体而言，提供用于眼的炎症性疾病的治疗或预防的滴眼剂、或用于耳的炎症性疾病的治疗或预防的滴耳剂。

Description

含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂

交叉引用

本申请基于2013年11月8日在日本提出申请的日本特愿2013-231796号而要求优先权，该申请中记载的内容全部作为参考而被直接援引在本说明书中。另外，本申请中引用的全部专利、专利申请及文献中记载的内容全部作为参考而被直接援引在本说明书中。

技术领域

本发明涉及含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂及其利用。

背景技术

红霉素、罗红霉素、克拉霉素及阿奇霉素等大环内酯类抗菌剂主要通过口服给药而被使用，但正谋求其作为注射剂、滴眼剂、滴耳剂等局部适用制剂的利用。然而，这些药剂由于是溶解性低的难溶性药物，因此，很难将它们制成液体制剂。这些中，红霉素容易溶解在甲醇、乙醇、丙酮中，在醚中稍易溶解，但是极难溶解于水。另外，克拉霉素在丙酮、氯仿中稍易溶解，但是不易溶解于甲醇、乙醇、醚，且基本不溶于水。由此可知，克拉霉素不仅难溶于水，而且与红霉素相比，难以溶解于生物实验所使用的有机溶剂中，很难制成溶液。因此，为了将难溶性药物制成注射剂、滴眼剂、滴耳剂等局部制剂而加以利用，已知有制成使药物悬浮而成的水性悬浮剂的制剂。例如，已报道了包含难溶性药物的纳米微粒(难溶性药物的微粒的90％以上为粒径小于1000nm的微粒)和解粒剂的局部给药用的水性悬浮剂(专利文献1)。另外，据报道，含有难溶性药物、聚乙烯吡咯烷酮及藻酸或其盐的滴眼剂、滴耳剂等水性悬浮剂的再分散性优异(专利文献2)。

另外，已知难溶性药剂在口服摄取时的生物利用率低，而为了对其加以改善，已研究了各种可溶化、悬浮化。例如，已有通过将克拉霉素与L-抗坏血酸2-葡糖苷一起进行粉碎可提高溶解性的报道(非专利文献1)。另外，还有如下报道：通过将具有小于2000nm的有效平均粒径的(难溶性的)活性物质粒子与表面稳定剂及浸透压活性晶体生长抑制剂一起制成纳米粒子液体给药组合物，可以抑制溶解/再结晶、活性物质的凝聚，从而实现稳定化(专利文献3)；通过将具有小于2000nm的有效平均粒径的克拉霉素与表面稳定剂一起进行配合，可制成溶解性更高、口服摄取时的生物学利用能力更高的制剂(专利文献4)。

进一步，关于克拉霉素等难溶性药物的注射剂等非口服给药形态，迄今为止已报道了各种研究。例如，克拉霉素等难溶性药物在经注射而给药时，存在会出现注射部位疼痛的问题。为了解决该问题，已报道了下述方法：制成脂肪乳剂的方法(专利文献5)、将难溶性药物包埋于脂质体内的方法(专利文献6)、以及在胆汁酸盐的胶束内配合难溶性药物的方法(专利文献7)。

另一方面，据报道，大环内酯类抗菌剂通过局部给药，对于角膜炎、尤其是由LASIK术后的非结核性抗酸菌引起的角膜炎而言是有效的(非专利文献2)。特别是，克拉霉素在动物实验中显示出适于由非结核性抗酸菌引起的角膜炎治疗。据报道，关于对非结核性抗酸菌的作用，相比于阿奇霉素，克拉霉素具有4～8倍的作用。作为这些滴眼剂、滴耳剂等局部给药制剂化的尝试，阿奇霉素的滴眼剂已通过利用了DuraSite(注册商标)技术的制剂化而付诸实用，而克拉霉素的滴眼剂尚未实用化。关于克拉霉素的滴眼给药，已公开了一种将使克拉霉素粉末溶解于甲醇并用生理盐水进行稀释而成的溶液对兔经滴眼而进行给药的方法，根据报道，经过该给药，克拉霉素会滞留于角膜(非专利文献3)。另一方面，还有如下报道：即使同样地将口服给药用克拉霉素颗粒的无菌水悬浮液用生理盐水进行稀释而成的克拉霉素悬浮液进行给药，在角膜也不会检测到克拉霉素，而是在眼表面引起炎症(非专利文献4)。在阿奇霉素的滴眼剂的临床试验中，也在1～2％的患者中确认到这样的刺激作用。

另一方面，关于滴耳剂，已报道了用于持续给药的滴耳用制剂(专利文献8)、用于使大环内酯类抗菌剂在鼓膜内长期局部存在的制剂(专利文献9)等，但尽管如此，以克拉霉素、阿奇霉素等大环内酯类抗菌剂为有效成分的滴耳剂尚未实用化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-119456号公报

专利文献2：国际公开WO2002/015878号公报

专利文献3：国际公开WO2004/006959号公报

专利文献4：国际公开WO2007/008537号公报

专利文献5：国际公开WO90/14094号公报

专利文献6：国际公开WO98/33482号公报

专利文献7：日本特开平3-169807号公报

专利文献8：美国专利公开2013/0216609号公报

专利文献9：国际公开WO2004/050021号公报

非专利文献

非专利文献1：Yutaka Inoue等、International Journal of Pharmaceutics(2007)331:38-45

非专利文献2：Joon-Young Hyon等、Arch Ophthalmol(2004)122:1166-1169

非专利文献3：Robert H.Gross等、Invest Ophthalmol Vis Sci(1995)36(5):965-968

非专利文献4：Jonas, J. Kuehne等、Am J Ophthalmol(2004)138:547-553

发明内容

发明要解决的问题

尽管对于这样的含有难溶性药物的水性液剂已进行了各种研究，但仍然难以实现含有克拉霉素等难溶性药物的注射剂、滴眼剂、滴耳剂等水性悬浮剂的实用化，期待开发出刺激性更低、灭菌容易、经时稳定性及分散稳定性优异的可适用于广泛的难溶性药物的注射剂及局部给药用水性悬浮剂、特别是滴眼剂及滴耳剂。

因此，本发明的目的在于提供刺激性更低、灭菌容易、经时稳定性及分散稳定性优异的含有大环内酯类抗菌剂作为有效成分的水性悬浮液。更具体而言，本发明的目的在于提供含有可实用化的大环内酯类抗菌剂作为有效成分的注射剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂和/或吸入剂等水性医药组合物。特别是，本发明的目的在于提供澄清性、(长期)分散性、保存稳定性、角膜滞留性、房水转移性优异、刺激性低的含有大环内酯类抗菌剂作为有效成分的注射剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂和/或吸入剂。另外，本发明的目的在于提供含有作为大环内酯类抗菌剂的克拉霉素作为有效成分的上述水性悬浮液、或注射剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂和/或吸入剂。

解决问题的方法

本发明人等经过深入研究后发现，含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒及分散稳定剂、表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调整剂的水性悬浮剂，澄清性、(长期)分散性、保存稳定性、角膜滞留性及房水转移性优异，作为水性医药组合物是优异的。特别是，本发明人等发现，通过使大环内酯类抗菌剂的纳米微粒为平均粒径(以下称为“Dv”)在500nm以下且90％粒径(以下称为“D90”)在1500nm以下(优选Dv在300nm以下且D90在400nm以下、或Dv在200nm以下且D90在300nm以下)的微粒，可以获得非常优异的效果。

因此，在一实施方式中，本发明涉及含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂，优选涉及纳米微粒的Dv为500nm以下且D90为1500nm以下的水性悬浮剂。例如，本发明的水性悬浮剂含有通过将大环内酯类抗菌剂、生理上可接受的盐和/或生理上可接受的糖、生理上可接受的多元醇和/或水、以及分散稳定剂混合而制造的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒。

进一步，本发明人等发现，在上述水性悬浮剂中，使用作为表面活性剂的聚氧乙烯氢化蓖麻油、且/或使用作为增稠剂的羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素作为分散稳定剂时，其适于作为水性医药组合物来利用。特别是，本发明人等发现，含有聚氧乙烯氢化蓖麻油(HCO-60(表面活性剂))、和羟丙基甲基纤维素(HPMC(高分子的增稠剂))或甲基纤维素(MC(高分子的增稠剂))作为分散稳定剂的大环内酯类抗菌剂的眼用局部适用制剂，由于HPMC或MC为高分子，因此可以期待其与角膜/结膜的粘膜之间发生相互作用的效果，而由于在本制剂中纳米粒子变得稳定，因此可基于HPMC或MC的效果而期待角膜滞留性，进一步，由于滞留时间变长，因此还可以期待房水转移性。

另外，本发明人等发现，通过采用纳米粒子，可期待大环内酯类抗菌剂的溶解性的提高，由此可以期待给药量的减少。此外，本发明人等惊讶地发现，通过采用本发明的纳米粒子或纳米粒子制剂，可降低以往成为问题点的大环内酯类抗菌剂的刺激性，进而完成了本发明。

因此，在一实施方式中，本发明涉及含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒(优选纳米微粒的Dv为500nm以下且D90为1500nm以下)的水性悬浮剂。例如，本发明包括含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒(优选纳米微粒的Dv为500nm以下且D90为1500nm以下)及分散稳定剂的水性悬浮剂。另外，本发明涉及上述分散稳定剂为表面活性剂、抗凝聚剂、粘度调整剂的水性悬浮剂。在本发明的优选实施方式中，上述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚山梨酯80、聚乙二醇单硬脂酸酯和/或聚氧乙烯化聚丙二醇，且/或上述抗凝聚剂为聚乙烯醇、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮，且/或上述粘度调整剂为甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或羟乙基纤维素。例如，本发明也可以是含有包含HCO-60(表面活性剂)和HPMC或MC(高分子的增稠剂)作为分散稳定剂的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮液。

另外，在另一实施方式中，本发明涉及含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒、还任选地含有分散稳定剂的水性医药组合物。在本说明书中，所述水性医药组合物表示水性的液体状或凝胶状的医药组合物，具体表示在水性的液体中悬浮有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的状态的医药组合物。由此，在没有特别地相反记载的情况下，在本说明书中，医药组合物表示水性的医药组合物。水性医药组合物包含注射剂及局部适用制剂。由此，在没有特别地相反记载的情况下，在本说明书中，局部适用制剂表示用于局部给药的水性的制剂。

具体而言，本发明的注射剂可以是用于全身性或局部的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防的注射剂，包含静脉注射用、皮下注射用、肌肉注射用、点滴用等的注射剂。另外，局部适用制剂包含眼用局部适用制剂、耳用局部适用制剂、鼻用局部适用制剂、或肺用局部适用制剂，更具体而言，包含用于眼、耳、鼻或肺的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防的医药组合物，例如滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、及吸入剂。本发明的局部适用制剂可优选为用于眼的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防的眼用局部适用制剂、用于耳的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防的耳用局部适用制剂、用于鼻的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防的鼻用局部适用制剂、或者是用于肺的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防的肺用局部适用制剂。

另外，就本发明的水性医药组合物而言，可以通过向需要该水性医药组合物的患者的局部进行有效量的给药而将其用于炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防。即，在一实施方式中，本发明涉及炎症性疾病或感染性疾病的治疗方法或预防方法，其包括：将含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒还任选地含有分散稳定剂的水性悬浮剂、或包含该水性悬浮剂的医药组合物向需要该水性悬浮剂或医药组合物的患者进行有效量的给药。例如，本发明包括炎症性疾病或感染性疾病的治疗方法或预防方法，其包括：将含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒还任选地含有分散稳定剂的局部适用制剂向需要该制剂的患者的局部进行有效量的给药。

或者，本发明涉及大环内酯类抗菌剂的纳米微粒(以及任选含有的分散稳定剂)在制造水性医药组合物(例如，注射剂及局部适用制剂)中的用途。另外，本发明包括含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒(优选纳米微粒的Dv为500nm以下且D90为1500nm以下)(以及任选含有的分散稳定剂)的水性悬浮剂在制造水性医药组合物(例如，注射剂及局部适用制剂)中的用途。

在本说明书中，所述“大环内酯类抗菌剂”只要是具有大环内酯骨架、且具有抗菌作用的化合物则没有特殊限制。作为大环内酯骨架，可以是14～16元环大环内酯，优选为14元环大环内酯。作为大环内酯类抗菌剂，可列举例如红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、罗他霉素及吉他霉素，优选为红霉素、克拉霉素、或阿奇霉素，最优选为克拉霉素。

在本说明书中，所述“水性悬浮剂”是指，悬浮有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性液剂，优选为医疗用水性悬浮液制剂。本说明书中的水性悬浮剂及医药组合物在不妨碍其作为医药品的用途的范围内也可以具有粘性，除了水状制剂以外，还包括凝胶状制剂。在本说明书中，水性悬浮剂及医药组合物包含注射剂及局部适用制剂。在本说明书中，所述“局部”是指身体的一部分，例如，是患部、其周边、或存在患部的脏器等，优选为眼、耳、鼻(上呼吸道)或肺(下呼吸道)。所述“局部适用制剂”是指以局部地给药为目的的医药组合物。优选局部适用制剂为眼用局部适用制剂(例如，滴眼剂)、耳用局部适用制剂(例如，滴耳剂)、鼻用局部适用制剂(例如，滴鼻剂)、及肺用局部适用制剂(例如，吸入剂)。在本说明书中，水性悬浮剂可以构成其自身能够作为医药品而给药的医药组合物，也可以是提供能够通过适宜地添加其它成分、稀释剂而给药的医药组合物的的悬浮剂(例如，医药组合物的原料)。

本说明书中的水性悬浮剂优选具有下述中的任一性质或2种以上性质，即，在通过搅拌等而分散的24小时后(优选为2天后、3天后、4天后、5天后、6天后或7天后)(室温)，(1)无法通过肉眼而确认到沉淀、(2)澄清性高、(3)无法通过显微镜观察而观察到凝聚物、结晶。本说明书中的含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂优选为自封入试验管开始的7天后无法通过肉眼而确认到沉淀物、澄清性高、且无法通过显微镜观察而确认到凝聚物、结晶的水性悬浮剂。

澄清性可基于日本药典收录的澄清性试验法而进行判定。具体而言，可按照以下程序进行判定：在福尔马肼(Formazin)标准乳浊液5mL中加入水并使其达到100mL，得到浑浊的比较液。以使液层达到深度30mm或40mm的方式分别取被检水性悬浮剂及新配制的浑浊的比较液置于内径15mm的无色透明的玻璃制平底试验管中，在散射光中使用黑色的背景、自上方进行观察并加以比较。当被检水性悬浮剂的澄清性与水或所使用的溶剂相同、或其浑浊程度为浑浊的比较液以下时，可判定为澄清性高。或者，针对被检水性悬浮剂及新配制的浑浊的比较液，使用层长50mm的吸收池，以水或所使用的溶剂作为对照，通过紫外可见吸光度测定法进行试验，测定660nm处的透过率，当被检水性悬浮剂的透过率为浑浊的比较液以上时，可判定为澄清性高。

在另一实施方式中，本发明的局部适用制剂为角膜滞留性高的眼用局部适用制剂。被检水性悬浮剂的角膜滞留性可基于例如Jonas,J.Kuehne等、Am J Ophthalmol(2004)138:547-553中记载的方法进行试验。具体而言，向兔眼给药被检水性悬浮剂，并测定角膜中的药剂浓度，在角膜中的药剂浓度高于标准液剂(例如，已被报道可作为眼用局部适用制剂而进行了试验的制剂，例如，对于克拉霉素的情况而言，为口服给药用克拉霉素颗粒的无菌水悬浮液(参见Jonas,J.Kuehne等、Am J Ophthalmol(2004)138:547-553)，下同)的情况下，可判定为角膜滞留性高。

在某一实施方式中，本发明的水性悬浮剂为刺激性低的水性悬浮剂。这里，所述刺激性低是指，在将该水性悬浮剂向对象给药时，与以往被使用的含有相同有效成分的水性制剂相比，刺激性的反应(例如，发红、肿胀、充血等炎症性反应)程度低。关于被检水性悬浮剂的刺激性高低与否，例如，可基于Jonas,J.Kuehne等、Am J Ophthalmol(2004)138:547-553中记载的方法对兔眼给药被检水性悬浮剂并测定眼的炎症的程度，当其炎症的程度低于标准液剂(同上)的情况下，可判定为刺激性低。更具体而言，对于滴眼剂的情况而言，可如下地判定刺激性：将大环内酯类抗菌剂的浓度为1.0％的制剂以30分钟～数小时间隔1天滴眼1～20次，观察给药前、最终给药后1、3、5、24小时的角膜、虹膜及结膜，并按照Draize的评价基准(参见OECDGUIDELINES FOR TESTING OF CHEMICALS 405(24 Feb.1987)AcuteEye Irritation/Corrosion)进行评分。

在本说明书中，所述“表面活性剂”是即使作为医药品添加物向人给药也不显示毒性的表面活性剂，只要是不会妨碍大环内酯类抗菌剂的作用的表面活性剂则没有特殊限制，例如，可列举Poloxamer 407、Poloxamer 235、Poloxamer 188等聚氧乙烯(以下称为“POE”)-聚氧丙烯(以下称为“POP”)嵌段共聚物；Poloxamine等乙二胺聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物加成物；POE(20)山梨聚糖单月桂酸酯(聚山梨酯20)、POE(20)山梨聚糖单油酸酯(聚山梨酯80)、聚山梨酯60等POE山梨聚糖脂肪酸酯类；POE(60)氢化蓖麻油等POE氢化蓖麻油；POE(9)月桂基醚等POE烷基醚类；POE(20)POP(4)十六烷基醚等POE-POP烷基醚类；POE(10)壬基苯基醚等POE烷基苯基醚类；POE(10)壬基苯基醚等POE烷基苯基醚类；POE(105)POP(5)二醇、POE(120)POP(40)二醇、POE(160)POP(30)二醇、POE(20)POP(20)二醇、POE(200)POP二醇(70)、POE(3)POP(17)二醇、POE(42)POP(67)二醇、POE(54)POP(39)二醇、POE(196)POP(67)二醇等POE-POP二醇类等非离子型表面活性剂；烷基二氨基乙基甘氨酸等甘氨酸型、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱等乙酸甜菜碱型、咪唑啉型等的两性表面活性剂；POE(10)月桂基醚磷酸钠等POE烷基醚磷酸及其盐、月桂酰基甲基丙氨酸钠等N-酰基氨基酸盐、烷基醚羧酸盐、N-椰油酰基甲基牛磺酸钠等N-酰基牛磺酸盐、十四烯磺酸钠等磺酸盐、月桂基硫酸钠等烷基硫酸盐、POE(3)月桂基醚硫酸钠等POE烷基醚硫酸盐、α-烯烃磺酸盐等阴离子表面活性剂；烷基胺盐、烷基季铵盐(苯扎氯铵、苄索氯铵等)、烷基吡啶鎓盐(十六烷基氯化吡啶鎓、十六烷基溴化吡啶鎓等)等阳离子表面活性剂等。本发明的水性悬浮剂中，作为表面活性剂，可含有1种表面活性剂，或者，也可以含有2种以上表面活性剂。作为表面活性剂，优选为聚氧乙烯氢化蓖麻油60(HCO-60)、聚山梨酯80(吐温80)、聚乙二醇单硬脂酸酯(MYS-40)、和/或聚氧乙烯化聚丙二醇(ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール)。

另外，在本说明书中，“抗凝聚剂”是可以防止大环内酯类抗菌剂的凝聚、向人体给药时不显示毒性的物质，只要是不会妨碍大环内酯类抗菌剂的作用的抗凝聚剂则没有特殊限制，例如，可列举：烷基硫酸盐、N-烷酰基甲基牛磺酸盐、乙醇、甘油、丙二醇、柠檬酸钠、甘油磷脂(卵磷脂(磷脂酰胆碱)(例如，精制大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酸、及溶血磷脂酰甘油)、及鞘脂质(sphingophospholipid)(鞘磷脂(sphingomyelin)、神经酰胺、鞘糖脂、或神经节苷脂)等磷脂、D-山梨糖醇、乳糖、木糖醇、阿拉伯树胶、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、烷基苯磺酸盐、磺基琥珀酸酯盐、聚氧乙烯化聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲纤维素钠、羧基乙烯基聚合物(CVP)、N-酰基谷氨酸盐、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、酪蛋白钠、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、苯扎氯铵、苄索氯铵等。本发明的水性悬浮剂中，作为抗凝聚剂，可含有1种，或者，也可以含有2种以上抗凝聚剂。作为抗凝聚剂，优选为聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

在本说明书中，所述“粘度调整剂”是能够调节本发明的水性悬浮剂的粘度的物质，是即使作为医药品添加物向人给药也不显示毒性的物质，只要是不会妨碍大环内酯类抗菌剂的作用的物质则没有特殊限制，例如，可列举多糖类或其衍生物(阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄原胶、角豆胶、瓜尔胶、愈疮木脂、榅桲籽、达尔曼胶(ダルマンガム)、黄蓍树胶、安息香胶、刺槐豆胶、酪蛋白、琼脂、藻酸、糊精、葡聚糖、卡拉胶、明胶、胶原蛋白、果胶、淀粉、多聚半乳糖醛酸、甲壳素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、弹性蛋白、肝素、类肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、硫酸软骨素等)、神经酰胺、纤维素衍生物(甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、纤维素、硝基纤维素等)、聚乙烯醇(完全或部分皂化物)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸乙烯酯、聚丙烯酸、羧乙烯基聚合物、聚乙烯亚胺、聚环氧乙烷、聚乙二醇、核糖核酸、脱氧核糖核酸、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物等、及其药理学可接受的盐类(例如，藻酸钠)等。本发明的水性悬浮剂中，作为粘度调整剂，可含有1种，或者，也可以含有2种以上粘度调整剂。作为粘度调整剂，优选为甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、和/或羟乙基纤维素(HEC)。

作为本说明书中的分散稳定剂，优选为表面活性剂和/或增稠剂，更优选为聚氧乙烯氢化蓖麻油、羟丙基甲基纤维素、和/或甲基纤维素，例如，可以是聚氧乙烯氢化蓖麻油和羟丙基甲基纤维素、或聚氧乙烯氢化蓖麻油和甲基纤维素。

在本说明书中，也可作为分散稳定剂使用的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调整剂(以下，在本段中称为“药剂”)可以附着或吸附于大环内酯类抗菌剂的纳米粒子的表面。这样的药剂在粉碎工序前被添加的情况下，通过附着或吸附于大环内酯类抗菌剂的纳米粒子的表面，可抑制粉碎工序中的纳米粒子的凝聚。另外，通过附着或吸附于大环内酯类抗菌剂的纳米粒子的表面，在水性悬浮液中也具有抑制凝聚的效果。需要说明的是，在本说明书中，作为分散稳定剂的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调整剂附着或吸附于大环内酯类抗菌剂的纳米粒子的表面，是指这些药剂的至少一部分附着或吸附于纳米粒子表面(有利于表面修饰)，而并不是指在水性悬浮剂中不存在既未附着也未吸附的这些药剂。在另一表述中，由于作为分散稳定剂的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调整剂可以对大环内酯类抗菌剂的纳米粒子的表面进行表面修饰，因此可以称其为大环内酯类抗菌剂的“表面修饰剂”。

本发明的水性悬浮剂所含有的大环内酯类抗菌剂为纳米微粒状。该大环内酯类抗菌剂的平均粒径(Dv)为500nm以下、优选为400nm以下、300nm以下、200nm以下、150nm以下，最优选为145nm以下。例如，大环内酯类抗菌剂的平均粒径的范围可以为20～500nm、20～400nm、20～300nm、20～200nm、优选为50～400nm、50～300nm、50～200nm、50～150nm。另外，该大环内酯类抗菌剂的90％粒径(D90)为1500nm以下、优选为1200nm以下、1000nm以下、800nm以下、700nm以下、600nm以下、500nm以下、400nm以下、300nm以下、200nm以下，最优选为197nm以下。例如，大环内酯类抗菌剂的90％粒径(D90)的范围可以为50～1200nm、50～1000nm、50～800nm、50～700nm，优选为80～800nm、80～700nm、80～600nm、80～500nm，进一步优选为100～600nm、100～500nm、100～400nm、100～300nm。就本发明的水性悬浮剂而言，由于作为其有效成分的大环内酯类抗菌剂为纳米微粒状，因此能够实现利用过滤器的灭菌，由此，能够容易地进行对活性成分的物理化学性质的影响小的灭菌。

本发明的水性悬浮剂所含有的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒优选为通过将大环内酯类抗菌剂、生理上可接受的盐和/或生理上可接受的糖、生理上可接受的多元醇和/或水、及分散稳定剂混合而制造的纳米微粒。更优选本发明的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒为通过将大环内酯类抗菌剂、生理上可接受的盐和/或生理上可接受的糖、生理上可接受的多元醇和/或水、及分散稳定剂混合而制造的、且通过在粉碎中或粉碎后添加卵磷脂而制造的纳米微粒。

发明的效果

含有本发明的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒(及分散稳定剂)的水性悬浮剂的澄清性、(长期)分散性、保存稳定性、角膜滞留性及房水转移性优异，刺激性低，灭菌容易，且经时稳定性及分散稳定性优异，因此可以作为非口服给药用医药组合物使用。

附图说明

[图1]示出了血浆中的克拉霉素浓度的经时变化的坐标图。图中，纵轴表示血浆中的克拉霉素浓度(ng/mL)，横轴表示经过时间(小时)。图中，圆表示0.3％纳米化制剂、四方表示1％纳米化制剂、三角表示1％原粉制剂。

[图2]示出了眼房水中的克拉霉素浓度的经时变化的坐标图。图中，纵轴表示眼房水中的克拉霉素浓度(ng/mL)，横轴表示经过时间(小时)。图中，圆表示0.3％纳米化制剂、四方表示1％纳米化制剂、三角表示1％原粉制剂。

[图3]示出了结膜中的克拉霉素浓度的经时变化的坐标图。图中，纵轴表示结膜中的克拉霉素浓度(ng/mL)，横轴表示经过时间(小时)。图中，圆表示0.3％纳米化制剂、四方表示1％纳米化制剂、三角表示1％原粉制剂。

[图4]示出了基于秦野等/中村等的评价基准的药效试验的结果的坐标图。纵轴表示得分、横轴表示菌液摄取后的经过天数。黑圆表示对照组(媒介物(vehicle))、白圆表示AzaSite给药组、黑三角表示0.3％纳米化克拉霉素制剂给药组、白三角表示1％纳米化克拉霉素制剂给药组、黑四方表示1％克拉霉素原粉制剂给药组。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。

[图5]示出了基于Draize等的评价基准的药效试验的结果的坐标图。纵轴表示得分、横轴表示菌液摄取后的经过天数。黑圆表示对照组(媒介物)、白圆表示AzaSite给药组、黑三角表示0.3％纳米化克拉霉素制剂给药组、白三角表示1％纳米化克拉霉素制剂给药组、黑四方表示1％克拉霉素原粉制剂给药组。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。

[图6]示出了基于秦野等/中村等的评价基准的药效试验的结果的坐标图。纵轴表示得分、横轴表示菌液摄取后的经过天数。黑圆表示对照组(媒介物)、白圆表示AzaSite给药组、黑三角表示0.3％纳米化克拉霉素制剂给药组、白三角表示1％纳米化克拉霉素制剂给药组、黑四方表示1％克拉霉素原粉制剂给药组。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。

[图7]示出了基于Draize等的评价基准的药效试验的结果的坐标图。纵轴表示得分、横轴表示菌液摄取后的经过天数。黑圆表示对照组(媒介物)、白圆表示AzaSite给药组、黑三角表示0.3％纳米化克拉霉素制剂给药组、白三角表示1％纳米化克拉霉素制剂给药组、黑四方表示1％克拉霉素原粉制剂给药组。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。

具体实施方式

1.含有大环内酯类抗菌剂的微粒的水性悬浮剂

大环内酯类抗菌剂的微粒可通过将大环内酯类抗菌剂、生理上可接受的盐和/或生理上可接受的糖、生理上可接受的多元醇和/或水、及分散稳定剂混合而制造。优选本发明的大环内酯类抗菌剂的微粒通过在进行粉碎的工序中或该工序后添加卵磷脂而制造。

可用于大环内酯类抗菌剂的微粒的制造的多元醇只要是能够在不特别地引起生理学上的问题的情况下摄取的多元醇则没有特殊限制。作为生理上可接受的多元醇，优选为相对于盐的溶解性低的多元醇、相对于水的溶解性高的多元醇、凝固点低的多元醇和/或引火点高的多元醇。另外，在要简便地进行粉碎后的除去的情况下，生理上可接受的多元醇优选为相对于水的溶解性高的多元醇。

作为多元醇，可列举例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、及二乙二醇等，优选为丙二醇或甘油。作为多元醇的粘度，优选为1～100,000(mPa·s)、更优选为5～10,000(mPa·s)、进一步优选为10～2,000(mPa·s)。

相对于作为粉碎对象的有机化合物1质量份，多元醇的使用量优选为0.2～50质量份、更优选为0.4～15质量份、进一步优选为0.6～10质量份。另外，所使用的多元醇的种类可以考虑作为粉碎对象的有机化合物的溶解性而适当确定。进一步，该多元醇可以使用1种多元醇、也可以将2种以上多元醇混合使用。

可用于本实施方式涉及的制造方法的盐只要是能够在不特别地引起生理学上的问题的情况下摄取的盐则没有特殊限定。作为生理学上可接受的盐，优选为相对于多元醇的溶解性低的盐、相对于水的溶解性高的盐和/或吸湿性少且具有适于有机化合物的微粉碎化的硬度的盐。作为盐，更优选为具备这些性质中的2种以上的盐。盐在多元醇中的溶解度优选为10(质量/容量)％以下。另外，在要使粉碎后的盐的除去简便的情况下，适宜的盐是相对于水的溶解性高的盐。

作为适宜的盐，可列举例如：氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾、硫酸钙、苹果酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、柠檬酸二氢钠、柠檬酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、及磷酸氢二钾等。作为更适宜的盐，可列举氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸钙、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾等，优选为氯化钠。

另外，对于盐，也可以在与大环内酯类抗菌剂混合之前进行粉碎等来调整粒径。在预先调整盐的粒径的情况下，作为粒子的Dv，可以为例如5～300μm、10～200μm，优选为0.01～300μm，更优选为0.1～100μm，进一步优选为0.5～50μm。另外，相对于有机化合物1质量份，该盐的使用量优选为0～100质量份、更优选为0.2～50质量份、进一步优选为0.5～30质量份。进一步，该盐可以使用1种盐、也可以将2种以上盐混合使用。

例如，本发明的大环内酯类抗菌剂的微粒可依次经由“粉碎工序”、“卵磷脂的混合工序”、“过滤/水洗工序”及“干燥工序”而制造。但其中，也可以将“粉碎工序”与“卵磷脂的混合工序”统合成一个工序，边进行粉碎在粉碎粒子中混合卵磷脂。包含大环内酯类抗菌剂的微粒的悬浮液的制造可优选如下地进行：在经由各工序而得到的大环内酯类抗菌剂的微粒中根据需要而加入分散剂并与水混合。例如，包含大环内酯类抗菌剂的微粒的悬浮液也可以如下地制造：省略“过滤/水洗工序”及“干燥工序”，在经由“粉碎工序”及“卵磷脂混合工序”而得到的大环内酯类抗菌剂的微粒中根据需要而加入分散剂并与水混合。以下，针对“粉碎工序”、“卵磷脂的混合工序”、“过滤(分离)/水洗工序”及“干燥工序”进行说明。

(粉碎工序)

在大环内酯类抗菌剂的微粒的制造方法中，用于对大环内酯类抗菌剂进行湿式粉碎的粉碎装置只要是具有通过机械手段使大环内酯类抗菌剂变得微细的能力的装置则可以没有特殊限制地使用。作为该粉碎装置，可列举例如：捏合机、双辊磨机、三辊磨机、轮碾机、哈佛研磨机(Hoover Muller)、叶轮混炼分散机、双螺杆挤压机等通常使用的粉碎装置。

在粉碎大环内酯类抗菌剂时，优选将有机化合物、盐及分散稳定剂投入粉碎装置内，边少量多次地加入多元醇边进行混炼。混炼时的粘度可根据待粉碎的大环内酯类抗菌剂、盐、多元醇的种类而适当确定。粉碎温度可以考虑到待粉碎的大环内酯类抗菌剂、粉碎装置等而适当确定。作为粉碎温度，只要是能够减少大环内酯类抗菌剂的熔融或分解的温度即可，没有特殊限制，优选为-50～50℃、更优选为-20～30℃、最优选为-10～25℃。另外，粉碎时间可以考虑到待粉碎的大环内酯类抗菌剂、粉碎装置等而适当确定。粉碎时间可以为例如0.5～50小时左右，优选为1～30小时、更优选为1.5～20小时、最优选为2～10小时。

相对于作为粉碎对象的大环内酯类抗菌剂1质量份，分散稳定剂的使用量优选为0.002～10质量份、更优选为0.01～5质量份、进一步优选为0.1～1质量份。另外，所使用的分散稳定剂的种类可以考虑到作为粉碎对象的有机化合物的种类而适当确定。进一步，分散稳定剂可以使用1种、也可以将2种以上的不同种类混合使用。

(卵磷脂的混合工序)

卵磷脂可与粉碎中或粉碎终止后的混炼物混合。需要说明的是，该混炼物中也可以不含分散稳定剂。混合工序可以如下地进行：在利用粉碎装置进行粉碎之后或在粉碎中混合卵磷脂，从而在相同的粉碎装置内继续进行混炼。此外，也可以准备混合用的另一装置(混合装置)，将粉碎后的混炼物转移到该混合装置中，并向其中添加卵磷脂来进行混合工序。相对于作为粉碎对象的大环内酯类抗菌剂1质量份，卵磷脂的使用量优选为0.01～10质量份、更优选为0.05～2质量份、进一步优选为0.1～1.0质量份。就卵磷脂而言，可以单独添加，也可以添加多元醇与卵磷脂的混和物。该情况下，就卵磷脂与多元醇的混合比(重量比)而言，相对于卵磷脂1质量份，多元醇为1～10质量份、更优选为1.5～5质量份、进一步优选为2～4质量份。

(过滤(分离)/水洗工序)

混合卵磷脂之后，可以根据需要进行过滤及水洗从而将盐及多元醇除去。具体而言，可以通过将混合卵磷脂后的混炼物添加到溶剂中并使用均化器等混合至均一之后进行过滤及水洗，从而将盐及多元醇除去。作为将该混炼物混合至均一时所使用的溶剂，只要是容易溶解多元醇及盐、且不易溶解经微粉碎后的大环内酯类抗菌剂的生理学上可接受的溶剂则没有特殊限定。作为该溶剂，优选水，但也可以使用水以外的溶剂。作为该水以外的溶剂，包括例如乙酸、甲醇、乙醇等有机溶剂与水的混合液。另外，过滤方法并无特殊限定，可以利用通常被用于过滤大环内酯类抗菌剂的含有物的公知的方法进行。作为该过滤方法，包括例如减压过滤法、加压过滤法、超滤膜法。另外，作为与过滤同样地除去盐及多元醇的方法，包括离心分离法。离心分离的具体方法为：在将混合卵磷脂后的混炼物添加到溶剂中并使用均化器等混合至均一之后，利用离心分离机使经微粉碎后的有机化合物沉降，从而除去上清。通过重复该操作，可以除去盐及多元醇。可以通过测定上清液的电导率而求出洗涤的终点。即，例如在上清液的电导率为10μS/cm时，则可以预测氯化钠的浓度为约5ppm，因此只要结合物质的特性而确定终点的电导率即可。

经微粉碎后的大环内酯类抗菌剂的粒子通常具有高表面能，因此容易发生凝聚。因此，可以在将盐等除去之后添加用于防止二次凝聚的添加剂。作为该抗二次凝聚剂，包括例如：烷基硫酸盐、N-烷酰基甲基牛磺酸盐、乙醇、甘油、丙二醇、柠檬酸钠、精制大豆卵磷脂、磷脂、D-山梨糖醇、乳糖、木糖醇、阿拉伯树胶、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、烷基苯磺酸盐、磺基琥珀酸酯盐、聚氧乙烯化聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲纤维素钠、羧基乙烯基聚合物(CVP)、N-酰基谷氨酸盐、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、酪蛋白钠、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、苯扎氯铵、苄索氯铵等。特别是，优选烷基硫酸盐及N-烷酰基甲基牛磺酸盐，其中，特别优选十二烷基硫酸钠及N-肉豆蔻酰基甲基牛磺酸钠。抗二次凝聚剂可以使用1种，也可以将2种以上抗二次凝聚剂混合使用。

(干燥方法)

在将盐及多元醇除去(即使是未完全除去的情况下，只要能够减少则称为“除去”)之后，通过根据需要进行干燥处理，可以将用于盐等的除去的溶剂从经微粉碎后的大环内酯类抗菌剂的粒子中除去。该干燥方法没有特殊限定，可以利用通常用于干燥有机化合物的方法来进行。作为该干燥方法，包括例如减压干燥法、冷冻干燥法、喷雾干燥法、冷冻喷雾干燥法等。该干燥中的干燥温度、干燥时间等并无特殊限制，但为了保持医疗用复合有机化合物粒子的化学稳定性以及防止粒子的二次凝聚，优选在低温下进行该干燥，优选利用减压干燥法、冷冻干燥法、喷雾干燥法、冷冻喷雾干燥法进行。

(悬浮)

对于在“粉碎工序”、“卵磷脂的混合工序”、“过滤/水洗工序”及“干燥工序”中的任意工序的终止时刻得到的大环内酯类抗菌剂的微粒(例如，经“粉碎工序”及“卵磷脂混合工序”而得到的大环内酯类抗菌剂的微粒)，可以通过根据需要加入分散剂并与水混合，并根据需要实施超声波处理而使其悬浮。

本说明书中的所述“平均粒径”或“Dv”是指，利用动态光散射光子相关法而测定的粒度分布中的算术平均直径。所述50％粒径(也称为中值粒径、D50)是指，在将粉体自某一粒径起分为2部分时，大粒径一侧与小粒径一侧达到等量的粒径。所述“90％粒径”是指，在利用上述测定法测定的粒度分布中，自粒径小的一侧起依次从0(最小)到100％(最大)进行计数时，位于达到90％的位置处的粒径(D90)。所述“10％粒径”是指，在利用上述测定法测定的粒度分布中，自粒径小的一侧起依次从0(最小)到100％(最大)进行计数时，位于达到10％的位置处的粒径(D10)。特别是在本说明书中记载的水性悬浮剂为粘性的情况下，在没有特殊说明的情况下，平均粒径(Dv)及90％粒径(D90)是指经粘度补正后的平均粒径(Dv)及90％粒径(D90)。关于基于动态光散射光子相关法的测定方法、粒度分布的计算方法、及粘度补正方法，在本技术领域中是被广泛公知的。

2.医药组合物

另外，本发明涉及含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的医药组合物。优选本发明的医药组合物为非口服给药用医药组合物，例如，可以使本发明的医药组合物为注射剂或局部适用制剂。在本说明书中，所述“局部适用制剂”是指，以局部给药为目的的制剂、或适于局部给药的制剂。在本说明书中，医药组合物的种类没有特殊限制，作为剂型，可列举：眼用局部适用制剂(例如，滴眼剂)、耳用局部适用制剂(例如，滴耳剂)、鼻用局部适用制剂(例如，滴鼻剂)、悬浮剂、软膏、乳霜剂、凝胶剂、吸入剂、注射剂(例如，静脉注射用注射剂、皮下给药用注射剂、肌肉注射用注射剂、点滴)等。这些制剂可以按照常规方法制备。优选本发明的医药组合物含有分散稳定剂。对于注射剂的情况而言，可以使本发明的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒悬浮于水中来制备，但也可以根据需要而使其悬浮于生理盐水或葡萄糖溶液中，另外，还可以添加分散剂、缓冲剂、保存剂。本发明的医药组合物例如可以制备成静脉内给药用、肌肉内给药用、或皮下给药用等的注射剂、点滴剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、吸入剂等形态的非口服给药用医药组合物。

本发明的医药组合物也可以含有药理学可接受的载体(制剂用添加物)。对于用于医药组合物的制造的制剂用添加物的种类、相对于有效成分的制剂用添加物的比例、或医药组合物的制造方法，本领域技术人员可根据组合物的形态而适当选择。作为制剂用添加物，可使用无机或有机物质、或固体或液体的物质，一般而言，可以以相对于有效成分重量为1重量％～90重量％的范围配合。具体而言，作为这样的物质的例子，可列举：乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、糊精、环糊精、淀粉、蔗糖、硅酸铝镁、合成硅酸铝、羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钙、离子交换树脂、甲基纤维素(MC)、明胶、阿拉伯树胶、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、轻质无水硅酸、硬脂酸镁、滑石、黄蓍树胶、膨润土、硅酸镁铝(veegum)、氧化钛、山梨聚糖脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、甘油、脂肪酸甘油酯、精制羊毛脂、甘油明胶、聚山梨酯、聚乙二醇、植物油、蜡、液体石蜡、白色凡士林、碳氟化合物、非离子型表面活性剂、丙二醇、水、苯扎氯铵、盐酸、氯化钠、氢氧化钠、乳酸、钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、Poloxamer 407、聚卡波菲等。

本发明的水性悬浮剂或医药组合物可以以试剂盒的形态与外罩、容器、稀释剂、浊液剂、和/或关于制备方法/给药方法的说明书共同包含。在以试剂盒形式供给本发明的水性悬浮剂或医药组合物的情况下，可以使该水性悬浮剂或医药组合物中的不同构成成分分别包装在不同的容器中并使它们包含在一个试剂盒中，或者，也可以仅使该水性悬浮剂或医药组合物中的一部分以上的构成成分(至少包含大环内酯类抗菌剂的纳米微粒)包含在试剂盒中、而将其它构成成分与试剂盒相区别地提供。另外，在以试剂盒形式供给本发明的水性悬浮剂或医药组合物的情况下，由于会得到本发明的水性悬浮剂或医药组合物，因此优选在即将使用之前混合必要的构成成分。

例如，可以使本发明的试剂盒为以下的试剂盒：

(a)一种试剂盒，其用于制备含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的医药组合物，其中，该试剂盒具备大环内酯类抗菌剂的纳米微粒；

或者，

一种试剂盒，其用于制备含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的医药组合物，其中，该试剂盒具备含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂。

(b)上述(a)所述的试剂盒，其中，上述纳米微粒的平均粒径为500nm以下且D90粒径为1500nm以下。

(c)上述(a)或(b)所述的试剂盒，其中，上述纳米微粒是通过将大环内酯类抗菌剂、生理上可接受的盐和/或生理上可接受的糖、生理上可接受的多元醇和/或水、以及分散稳定剂混合而制造的微粒。

(d)上述(a)～(c)中任一项所述的试剂盒，其中，上述大环内酯类抗菌剂为红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、罗他霉素、或吉他霉素。

(e)上述(a)～(d)中任一项所述的试剂盒，其还具备分散稳定剂。

(f)上述(e)所述的试剂盒，其中，上述分散稳定剂为表面活性剂、抗凝聚剂、粘度调整剂。

(g)上述(f)所述的试剂盒，其中，上述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚山梨酯80、聚乙二醇单硬脂酸酯、和/或聚氧乙烯化聚丙二醇；

(h)上述(f)所述的试剂盒，其中，上述抗凝聚剂为聚乙烯醇、聚乙二醇、和/或聚乙烯吡咯烷酮。

(i)上述(f)所述的试剂盒，其中，上述粘度调整剂为甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和/或羟乙基纤维素。

(j)上述(a)～(i)中任一项所述的试剂盒，其中，含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的医药组合物的刺激性低。

(k)上述(a)～(j)中任一项所述的试剂盒，其中，以含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂的形式具备大环内酯类抗菌剂的纳米微粒。

(l)上述(a)～(k)中任一项所述的试剂盒，其是用于制备非口服给药用医药组合物的试剂盒。

(m)上述(l)所述的试剂盒，其是用于制备注射剂或局部适用制剂的试剂盒。

(n)上述(m)所述的试剂盒，其是用于制备眼用局部适用制剂、耳用局部适用制剂、鼻用局部适用制剂、或肺用局部适用制剂的试剂盒。

(o)上述(n)所述的试剂盒，其是用于制备滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、或吸入剂的试剂盒。

(p)上述(a)～(o)中任一项所述的试剂盒，其是用于制备眼、耳、鼻、或肺的炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药的试剂盒。

由此，在一实施方式中，本发明也可以是含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性医药组合物的制备方法，该制备方法包括：将含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂与稀释剂混合。或者，本发明也可以是含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂或水性医药组合物的制备方法，该制备方法包括：将大环内酯类抗菌剂的纳米微粒与悬浮剂混合。

特别是，在制备本发明的医药组合物(例如，注射剂、眼用局部适用制剂(优选为滴眼剂)、耳用局部适用制剂(优选为滴耳剂)、鼻用局部适用制剂(优选为滴鼻剂)、或肺用局部适用制剂(优选为吸入剂))的情况下，关于其pH及浸透压，以作为局部适用制剂可接受为限度，没有特殊限制，但优选为pH5～9.5、更优选为pH6～9、进一步优选为pH7～9。作为该制剂(软膏剂以外的情况)相对于生理盐水的浸透压比，例如为0.3～4.3、优选为0.3～2.2、特别优选为0.5～1.5左右。pH、浸透压的调节可使用pH调整剂、等渗剂、盐类等、利用在本技术领域中公知的方法进行。

在本说明书中，悬浮剂和/或稀释剂可以含有水作为主成分。另外，在本说明书中，医药组合物、悬浮剂和/或稀释剂也可以根据需要而含有作为添加物的增稠剂、表面活性剂、防腐剂、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、等渗剂、缓冲剂等各种添加剂。

作为防腐剂、杀菌剂或抗菌剂，可列举例如：山梨酸或其盐(山梨酸、山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸三氯卡班等)、对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、利凡诺、甲紫(methylrosanilinium chloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基氯化吡啶鎓、十六烷基溴化吡啶鎓、氯己定或其盐、聚六亚甲基双胍、烷基多氨基乙基甘氨酸、苄醇、苯乙醇、氯丁醇、异丙醇、乙醇、苯氧基乙醇、磷酸锆的银、汞溴红、聚维酮碘等的负载体、硫柳汞、脱氢乙酸、氯二甲苯酚、氯酚、间苯二酚、邻苯基苯酚、异丙基甲基苯酚、麝香草酚、扁柏油酚、磺酰胺、溶菌酶、乳铁蛋白、三氯生、8-羟基喹啉、十一碳烯酸、辛酸、丙酸、苯甲酸、卤卡班(ハロカルバン)、噻苯达唑、多粘菌素B、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、聚赖氨酸、过氧化氢、泊利氯铵、Glokill(商品名:例如，Glokill PQ、Rhodia公司制)、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚氧乙烯氯化二甲亚铵(Poly(oxyethylene dimethyliminio)ethylene(dimethylimino)ethylenedichloride))、聚亚乙基多胺-环氧氯丙烷二甲胺缩聚物(商品名:例如，Busan1157、Bachmann公司制)、双胍化合物(Cosmosil CQ(商品名、含有约20重量％的聚六亚甲基双胍盐酸盐、Apishia公司制))等、及其药理学可接受的盐类等。

作为pH调整剂，可列举例如：无机酸(盐酸、硫酸、磷酸、聚磷酸、硼酸等)、有机酸(乳酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、丙酸、乙酸、天冬氨酸、ε-氨基己酸、谷氨酸、氨基乙基磺酸等)、葡萄糖酸内酯、乙酸铵、无机碱(碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等)、有机碱(单乙醇胺、三乙醇胺、二异丙醇胺、三异丙醇胺、赖氨酸等)、硼砂、及其药理学可接受的盐类等。

作为等渗剂，可列举例如：无机盐类(例如，氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫代硫酸钠、乙酸钠等)、多元醇类(例如，甘油、丙二醇、乙二醇、1,3-丁二醇等)、糖类(例如，葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)等。

作为缓冲剂，可列举例如：Tris缓冲剂、硼酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、碳酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、乙酸缓冲剂、ε-氨基己酸、天冬氨酸盐等。具体可列举：硼酸或其盐(硼酸钠、四硼酸钾、偏硼酸钾等)、磷酸或其盐(磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等)、碳酸或其盐(碳酸氢钠、碳酸钠等)、柠檬酸或其盐(柠檬酸钠、柠檬酸钾等)等。

本发明的医药组合物的制备可适当地利用公知的方法进行，例如，可以如下地进行：在蒸馏水或纯化水等适当的稀释剂中将含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒的水性悬浮剂和任意的配合成分混合，调整至上述浸透压及pH，并在无菌环境中进行高压蒸气灭菌或过滤灭菌处理，并进行无菌填充至经过洗涤灭菌后的容器中。

可以将本发明的医药组合物制成炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药。例如，可以使本发明的医药组合物用于由感染引起的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防。由此，本发明包含用于作为医药(炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药)使用的水性悬浮剂，该水性悬浮剂含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒及分散稳定剂。

在本说明书中，所述炎症性疾病或感染性疾病包括全身性的炎症性疾病及感染性疾病、以及局部性的炎症性疾病或感染性疾病。炎症性疾病中，除了由感染引起的炎症性疾病以外，还包括过敏性的炎症性疾病(例如，过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮肤炎、过敏性湿疹、过敏性哮喘、过敏性肺炎)。作为全身性的炎症性疾病，可列举：浅层/深层皮肤感染症、淋巴管/淋巴节炎、乳腺炎、骨髓炎、扁桃体炎、肺炎、肾盂肾炎、尿道炎、淋菌感染症、梅毒、子宫内感染、猩红热、白喉、百日咳、外伤/热水及手术等的二次感染、咽/喉炎、支气管炎、慢性呼吸道病变的二次感染、冠周炎、牙周组织炎、破伤风、膀胱炎、前列腺炎、感染性肠炎、颌骨炎、感染性关节炎、胃炎等全身的炎症性疾病或感染性疾病。

具体而言，可以将本发明的医药组合物用于治疗或预防眼的炎症性疾病及感染性疾病以及这些疾病所附带的多种症状。作为眼的炎症性疾病及感染性疾病，可列举例如：包含眼睑炎、眼睑结膜炎、睑板腺炎、急性或慢性麦粒肿、霰粒肿、泪囊炎、泪腺炎及酒渣性痤疮的眼睑的症状；包含结膜炎、新生儿眼炎及沙眼的结膜的症状；包含角膜溃疡、浅层角膜炎及间质性角膜炎、角膜结膜炎、异物及术后感染症的角膜的症状；以及包含眼内炎、感染性葡萄膜炎及术后感染症的眼前房及葡萄膜的症状。作为感染症的预防，包括在手术等外科处置前、在与表现出感染性症状者接触前进行给药。在用于预防的情况下，例如可以在下述处置或手术之前给药：眼睑成形术、霰粒肿的摘除、睑板缝合术、用于泪小管或泪管排液系统的手术、以及与眼睑和泪器相关的其它外科处置这样的外科处置；包含翼状胬肉、睑裂斑及肿瘤的摘除、结膜移植、割伤、灼伤及擦伤这样的外伤性的伤、及结膜遮盖术的结膜的手术；包含异物的除去、角膜切开术及角膜移植的角膜的手术；包含光折射率处置的折射率手术；包含滤泡的过滤的青光眼手术；眼前房的穿刺；虹膜切除术；白内障手术；视网膜手术；以及与眼外肌相关的手术。另外，新生儿眼炎的预防也包括在本说明书的预防中。

例如，可以将本发明的医药组合物用于耳的炎症性疾病或感染性疾病所附带的多种症状的治疗或预防。作为耳的炎症性疾病或感染性疾病，可列举例如中耳炎或外耳炎。作为感染症的预防，包括手术以及其它疑似的感染性状态或接触之前的术前处置。作为预防性情况的例子，可列举伴随耳的外伤或损伤的外科性处置及其它手术或处置之前的治疗。

另外，可以将本发明的医药组合物用于治疗或预防鼻的炎症性疾病或感染性疾病所附带的多种症状。需要说明的是，在整个本说明书中，所述“鼻的炎症性疾病或感染性疾病”、及“鼻用局部适用制剂”的用语中的“鼻”表示的是包含上呼吸道整体的含义，例如包含鼻腔、鼻咽、咽及喉。作为鼻的炎症性疾病或感染性疾病，可列举例如鼻窦炎、过敏性鼻炎、及鼻炎。

另外，可以将本发明的医药组合物用于肺的炎症性疾病或感染性疾病所附带的多种症状的治疗或预防。需要说明的是，在整个本说明书中，所述“肺的炎症性疾病或感染性疾病”及“肺用局部适用制剂”的用语中的“肺”表示的是包含下呼吸道全体整体的含义，例如包含气管、支气管、细支气管及肺。作为肺的炎症性疾病或感染性疾病，可列举例如肺炎、支气管炎、过敏性肺炎、及哮喘等。

本发明的医药组合物更优选用于由多种细菌或寄生虫引起的感染性疾病(例如，眼、耳、鼻或肺的感染性疾病)的治疗或预防。作为这样的微生物，可列举例如：包含金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的葡萄球菌属；包含肺炎链球菌及酿脓链球菌以及C、F及G群的链球菌及草绿色链球菌的链球菌属；包含生物型III的流感杆菌；软下疳菌；卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)；包含淋菌及脑膜炎菌的奈瑟菌属；包含沙眼披衣菌(Chlamydiatrachomatis)、鹦鹉披衣菌(Chlamydia psittaci)及肺炎披衣菌(Chlamydia pneumoniae)的披衣菌属；包含人结核杆菌及鸟结核杆菌细胞内复合体以及包含海洋分枝杆菌(Mycobacterium Marinamu)、两栖分枝杆菌(Mycobacterium Forutsuitsumu)及龟结核杆菌的非典型分枝杆菌的分枝杆菌属；百日咳菌；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；双道类杆菌(Bacteroides Bivius)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；消化链球菌(Peptostreptococcus)属；伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；肺炎支原体；梅毒螺旋体；尿浆菌(Ureaplasma urealyticum)；弓形体属；疟疾；以及孢子虫(Nosema)。

3.治疗方法/预防方法

本发明的医药组合物通过向需要其的患者进行有效量的给药，可以用于炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防。因此，本发明涉及炎症性疾病或感染性疾病的治疗方法或预防方法，其包括：将包含含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒(及分散稳定剂)的水性悬浮剂的医药组合物向需要该医药组合物的患者进行有效量的给药。这里，成为对象的患者是指被分类为哺乳类的任意动物，但并不限定于此。作为例子，包括人；犬、猫、兔等宠物；牛、猪、羊、马等家畜动物，优选为人。

本发明的医药组合物的给药量及给药次数没有特殊限制，可根据治疗对象疾病的恶化/进展的防止和/或治疗的目的、疾病的种类、患者的体重、年龄等条件、基于医生的判断而适当选择。一般而言，成人每日的给药量为0.01～1000mg(有效成分重量)左右，一天可给药1次或数次。给药路径为注射或局部给药，可列举例如静脉注射、肌肉内注射、或皮下注射、点滴、滴眼、滴耳、滴鼻、经皮、经粘膜、吸入等。

本发明的医药组合物为注射剂的情况下，对于成人，可以按照一天量0.001～100mg(有效成分重量)进行连续给药或间歇给药。

在本发明的水性医药组合物为局部给药用的情况下，可对患部、患部的周边部或包含患部的脏器等的局部直接给药。例如，可以将本发明的医药组合物制成眼用局部适用制剂、耳用局部适用制剂、鼻用局部适用制剂、或肺用局部适用制剂。在本发明的医药组合物为局部给药用制剂的情况下，可以日常地适用，也可以在局部的炎症性疾病或感染性疾病发病之后适用任意的次数。另外，适用量可根据症状等适当调整，通常每天滴眼1～6次左右，1次适用1～3滴左右。

以下，结合实施例对本发明进行更为详细的说明，但其并不限定本发明的范围。需要说明的是，本申请说明书整体中引用的文献通过参照而将其整体援引至本申请说明书中。

(实施例1)克拉霉素粉碎Dough(面团)的制作

在0.5L TRIMIX(井上制作所制)中进料平均粒径10,370nm的克拉霉素(熔点:217-220℃；Assia Chemical Industries Ltd.)10g、经过粉碎的氯化钠(平均粒径:5μm)10g、甘露糖醇(和光纯药工业公司制)60g、聚乙烯吡咯烷酮K25(和光纯药工业公司制)3g、及氢化大豆卵磷脂PHOSPHOLIPON 90H(H.Holstein公司制)5g，混合至均一之后，注入甘油20g，使内容物保持为生面团(こね粉)状，于5℃进行了5小时粉碎。所得混炼面团的回收量为93g(回收率86％)。

向所得混炼面团100mg中加入0.1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)3g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了数分钟分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制)对克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)144.7nm、10％粒径(D10)81.4nm、50％粒径(D50)124.6nm、90％粒径(D90)197.0nm。

(实施例2)分散剂(表面活性剂)的研究

(1)克拉霉素0.1％制剂的制作(HCO-60；Nihon Surfactant kogyo公司制)

在50mL的玻璃样品瓶(vial)中量取实施例1中得到的TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)0.5g，并向其中加入0.1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)水溶液44g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。然后，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制，下同)对该分散液中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)146.0nm、10％粒径(D10)72.5nm、50％粒径(D50)119.2nm、90％粒径(D90)220.3nm。

(2)克拉霉素0.1％制剂的制作(吐温80；关东化学公司制)

除了将上述实施例2(1)中的“0.1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)”替换为“0.1％吐温80(关东化学公司制)”以外，与实施例2(1)同样地进行了处理。克拉霉素的粒度分布为：平均粒径(Dv)198.5nm、10％粒径(D10)84.3nm、50％粒径(D50)154.9nm、90％粒径(D90)291.3nm。

(3)克拉霉素0.1％制剂的制作(MYS-40；Nihon Surfactant kogyo公司制)

除了将上述实施例2(1)中的“0.1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)”替换为“0.1％MYS-40(Nihon Surfactant kogyo公司制)”以外，与实施例2(1)同样地进行了处理。克拉霉素的粒度分布为：平均粒径(Dv)142.2nm、10％粒径(D10)72.4nm、50％粒径(D50)118.8nm、90％粒径(D90)208.1nm。

(实施例3)纳米化克拉霉素分散液的稳定性试验

将实施例2中制作的纳米化克拉霉素的各分散液约4mL分注于9mL的螺纹瓶中并盖紧盖子，于室温下保存，通过目测等对1天后的稳定性进行了评价。结果如表1所示。由该结果表明，HCO-60作为分散剂是优异的。

[表1]

实施例2	(1)	(2)	(3)
				分散剂	HCO-60	吐温80	MYS-40
沉淀的量	少	多	多
				澄清性	高	悬浮	悬浮
显微镜观察	无凝聚物/结晶	有凝聚物	有结晶物
				综合评价	○	×	×

(实施例4)增稠剂的研究

(1)克拉霉素0.1％制剂的制作(HPMC 60SH-50；信越化学工业公司制)

在50mL的玻璃样品瓶中量取实施例1中得到的 TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)1g，并向其中加入0.1％HCO-60水溶液44g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，使用高压均化器(型号:L01、SANWA ENGINEERING株式会社制)于高压(90MPa)进行了分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制，下同)对该分散液中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)154.9nm、10％粒径(D10)77.1nm、50％粒径(D50)113.2nm、90％粒径(D90)224.9nm。

在上述分散液中添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g并利用磁力搅拌器进行搅拌，最后加入纯化水而调整为89g进行搅拌混合，得到了最终制剂。利用粒度分布测定装置对该制剂中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)327.8nm、10％粒径(D10)189.5nm、50％粒径(D50)284.4nm、90％粒径(D90)423.0nm。进一步，通过粘度补正对粒度分布进行再计算的结果为：平均粒径(Dv)170.1nm、10％粒径(D10)98.6nm、50％粒径(D50)148.6nm、90％粒径(D90)223.3nm。

(2)克拉霉素0.1％制剂的制作(HPMC 60SH-4000；信越化学工业公司制)

除了将上述实施例4(1)中的“添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g并利用磁力搅拌器进行搅拌”替换为“添加0.9％HPMC 60SH-4000水溶液22g并利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行1分钟分散”以外，进行与实施例4(1)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)1017.7nm、10％粒径(D10)441.8nm、50％粒径(D50)818.3nm、90％粒径(D90)1629.6nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)219.4nm、10％粒径(D10)98.5nm、50％粒径(D50)183.6nm、90％粒径(D90)370.2nm。

(3)克拉霉素0.1％制剂的制作(HPMC 65SH-4000；信越化学工业公司制)

除了将上述实施例4(2)中的“添加0.9％HPMC 60SH-4000水溶液22g”替换为“添加1％HPMC 65SH-4000水溶液23g”以外，进行与实施例4(2)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)990.1nm、10％粒径(D10)424.8nm、50％粒径(D50)840.2nm、90％粒径(D90)1565.5nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)219.4nm、10％粒径(D10)93.5nm、50％粒径(D50)183.4nm、90％粒径(D90)342.0nm。

(4)克拉霉素0.1％制剂的制作(HPMC 90SH-4000SR；信越化学工业公司制)

除了将上述实施例4(2)中的“添加0.9％HPMC 60SH-4000水溶液22g”替换为“添加1％HPMC 90SH-4000SR水溶液8g”以外，进行与实施例4(2)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)425.0nm、10％粒径(D10)146.9nm、50％粒径(D50)332.6nm、90％粒径(D90)715.6nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)219.4nm、10％粒径(D10)71.1nm、50％粒径(D50)157.7nm、90％粒径(D90)334.4nm。

(5)克拉霉素0.1％制剂的制作(MC SM-15；信越化学工业公司制)

除了将上述实施例4(1)中的“添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g”替换为“添加1％MC SM-15水溶液33g”以外，进行与实施例4(1)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)325.5nm、10％粒径(D10)158.1nm、50％粒径(D50)271.3nm、90％粒径(D90)474.8nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)167.8nm、10％粒径(D10)81.4nm、50％粒径(D50)141.1nm、90％粒径(D90)246.9nm。

(6)克拉霉素0.1％制剂的制作(MC SM-100；信越化学工业公司制)

除了将上述实施例4(1)中的“添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g”替换为“添加1％MC SM-100水溶液33g”以外，进行与实施例4(1)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)608.4nm、10％粒径(D10)258.8nm、50％粒径(D50)499.1nm、90％粒径(D90)979.6nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)199.8nm、10％粒径(D10)81.6nm、50％粒径(D50)160.5nm、90％粒径(D90)321.3nm。

(7)克拉霉素0.1％制剂的制作(PVA-204C；Kuraray公司制)

除了将上述实施例4(1)中的“添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g”替换为“添加2％PVA-204C水溶液33g”以外，进行与实施例4(1)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)197.1nm、10％粒径(D10)109.3nm、50％粒径(D50)169.1nm、90％粒径(D90)268.6nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)142.4nm、10％粒径(D10)80.1nm、50％粒径(D50)123.3nm、90％粒径(D90)196.1nm。

(8)克拉霉素0.1％制剂的制作(PEG-4000；关东化学公司制)

除了将上述实施例4(1)中的“添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g”替换为“添加2％PEG-4000水溶液33g”以外，进行与实施例4(1)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)160.6nm、10％粒径(D10)82.1nm、50％粒径(D50)133.1nm、90％粒径(D90)235.6nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)149.4nm、10％粒径(D10)68.0nm、50％粒径(D50)110.3nm、90％粒径(D90)201.1nm。

(9)克拉霉素0.1％制剂的制作(PVP K30；和光纯药工业公司制)

除了将上述实施例4(1)中的“添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g”替换为“添加4％PVP K30水溶液33g”以外，进行与实施例4(1)同样的处理，得到了最终制剂。粘度补正前的粒度分布为：平均粒径(Dv)212.7nm、10％粒径(D10)108.2nm、50％粒径(D50)176.4nm、90％粒径(D90)309.4nm。另外，粘度补正后的粒度分布为：平均粒径(Dv)157.0nm、10％粒径(D10)78.9nm、50％粒径(D50)130.4nm、90％粒径(D90)231.4nm。

(实施例5)制剂的稳定性试验

(1)增稠剂对稳定性的影响的研究1

将实施例4中制作的纳米化克拉霉素的各分散液约4mL分注于9mL的螺纹瓶中并盖紧盖子，于40℃保存，通过目测等对7天后的稳定性进行了评价。结果如表2所示。根据该实验结果表明，HPMC(60SH-50)和MC(SM15)作为增稠剂是优异的。

[表2]

(2)增稠剂对稳定性的影响的研究2

由于根据实施例5(1)表明，HPMC及MC作为增稠剂是优异的，因此，进一步为了考察HPMC的种类和MC的种类对稳定性的影响而进行了试验。将实施例4中制作的纳米化克拉霉素的各分散液约4mL分注于9mL的螺纹瓶中并盖紧盖子，于25℃保存，通过目测等对14天后的稳定性进行了评价。结果如表3所示。由该结果表明，实施例4(2)、(3)、(4)及(6)中使用的HPMC系列和MC系列均适宜作为增稠剂。

[表3]

(实施例6)体外(In vitro)抗菌试验(最小抑菌浓度试验)

(1)制剂的制作：克拉霉素0.3％制剂的制作

在50mL的玻璃样品瓶中量取实施例1中得到的TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)3g，并向其中加入1％HCO-60水溶液10g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟分散处理。利用粒度分布测定装置对该分散液中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)246.0nm、10％粒径(D10)103.7nm、50％粒径(D50)196.4nm、90％粒径(D90)393.8nm。

在上述分散液中添加0.9％HPMC 60SH-50水溶液22g并利用磁力搅拌器进行搅拌，最后加入纯化水而调整为89g进行搅拌混合，得到了最终制剂。利用粒度分布测定装置对该制剂中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)328.9nm、10％粒径(D10)167.3nm、50％粒径(D50)270.4nm、90％粒径(D90)481.2nm。进一步，通过粘度补正对粒度分布进行再计算的结果为：平均粒径(Dv)162.4nm、10％粒径(D10)82.0nm、50％粒径(D50)133.6nm、90％粒径(D90)239.9nm。

(2)最小抑菌浓度(MIC)测定试验

应用基于微量液体稀释法的最小抑菌浓度(MIC)测定法(日本化学疗法学会标准法)进行了MIC试验。作为被检物质，使用了实施例6(1)中制备的克拉霉素悬浮液(被检物质1)，作为用于比较的对照(control)，使用了未粉碎的克拉霉素悬浮液(被检物质2)、克拉霉素的DMSO溶液(被检物质3)。

(2-1)含被检物质的培养基的制备

将各被检物质在稀释调整前利用旋涡混合器进行了15秒钟以上搅拌。作为金黄色葡萄球菌亚种.球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus))接种用培养基，利用水解酪蛋白(Mueller Hinton)II肉汤培养基将含克拉霉素的样品(被检物质1～3)稀释为250μg/mL之后，进行2倍系列稀释，制备了所含的最终药剂浓度为0.012～25μg/mL的培养基。另外，作为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)接种用培养基，利用水解酪蛋白II肉汤培养基将含克拉霉素的样品(被检物质1～3)稀释为1000μg/mL之后，进行2倍系列稀释，制备了所含的最终药剂浓度为0.049～100μg/mL的培养基。

制作的各含有被检物质的培养基按照每1孔0.1±0.02mL分注于U字型微孔板。作为对照，将不含药剂的培养基分别分注于2孔。

(2-2)接种菌液的制备

利用水解酪蛋白II琼脂培养基对金黄色葡萄球菌亚种.球菌(Staphylococcusaureus subsp. aureus)或绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)进行培养过夜。使琼脂平板上的新鲜培养菌在灭菌生理盐水中以相当于0.5McFarand(约10⁸CFU/mL)悬浮，并利用灭菌生理盐水将其进一步稀释至10倍(约10⁷CFU/mL)，制备了接种菌液。

(2-3)接种菌液的接种及培养

在分注有含被检物质的培养基及不含被检物质的培养基的各孔中接种上述(2-2)中制备的金黄色葡萄球菌亚种.球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus))或绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的接种菌液0.005mL(最终接种菌量:约10⁴CFU/孔)。将在不含被检物质的培养基孔中未接种菌液的情况作为阴性对照。接种后，于35±1℃进行了18～24小时培养。

(2-4)判定

对用于对照的不含被检物质的培养基孔中的发育进行确认之后，以肉眼未确认到菌的发育的孔中的最小药剂浓度作为最小抑菌浓度(MIC)。具体而言，在肉眼可观察到混浊或直径1mm以上的沉淀的情况下、以及虽然沉淀物的直径在1mm以下但可观察到2个以上沉淀块的情况下，判定为发育阳性(+)，在肉眼未确认到混浊或沉淀的情况下、以及虽然发生沉淀但直径为1mm以下且为1个的情况下，判定为发育抑制(-)。

(3)结果

结果如表4所示。由该结果表明，经过了纳米化的克拉霉素与未粉碎及溶解的克拉霉素保持了同等的抗菌活性。

[表4]

(实验例7)眼刺激性试验

(1)纳米化克拉霉素悬浮剂的制作

(1-1)克拉霉素的粉碎

在1L TRIMIX(井上制作所制)中进料平均粒径10,370nm的克拉霉素(熔点:217-220℃；Assia Chemical Industries Ltd.)30.1g、甘露糖醇(和光纯药社制)90.1g、聚乙烯吡咯烷酮K25(和光纯药工业公司制)8.9g、及氢化大豆卵磷脂PHOSPHOLIPON 90H(H.Holstein公司制)12.0g，混合至均一之后，注入甘油21.5g，使内容物保持为生面团状，于5℃进行了5小时粉碎。所得混炼面团的回收量为136.6g(回收率84％)。

(1-2)纳米化克拉霉素的粒度分布测定

向所得混炼面团100mg中加入0.1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)3g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了数分钟分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制)对克拉霉素的粒度分布进行测定的结果，平均粒径(Dv)为159.7nm。

(1-3)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3％)的制作

在50mL的玻璃样品瓶中量取TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)1.25g，并向其中加入1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)水溶液10g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟分散处理。然后，依次添加1％HCO-60水溶液10g、1％HPMC(60SH-50)水溶液17.5g、1M Tris缓冲液7.5g、0.1％苯扎氯铵水溶液0.75g，进一步添加纯化水并使整体量达到75g。最后，利用磁力搅拌器进行30分钟搅拌，得到了纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3％)。

(1-4)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)的制作

在烧杯中量取TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)4.05g，并向其中加入1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)水溶液33.5g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟分散处理。然后，依次添加1％HPMC(60SH-50)水溶液17.5g、1M Tris缓冲液7.5g、0.1％苯扎氯铵水溶液0.75g，进一步添加纯化水并使整体量达到75g。最后，利用磁力搅拌器进行30分钟搅拌，得到了纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)。

(1-5)克拉霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)的制作

在烧杯中量取克拉霉素0.75g，并向其中加入1％HCO-60(Nihon Surfactantkogyo公司制)水溶液33.5g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟分散处理。然后，依次添加1％HPMC(60SH-50)水溶液17.5g、1M Tris缓冲液7.5g、0.1％苯扎氯铵水溶液0.75g，进一步添加纯化水并使整体量达到75g。最后，利用磁力搅拌器进行30分钟搅拌，得到了克拉霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)。

(2)评价试验

(2-1)对兔眼按照每次间隔30分～数小时、每天1次～20次的方式分别滴加(a)生理盐水、上述(1)中制作的(b)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3％)、(c)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)、(d)克拉霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)、或(e)Azasite(注册商标)(阳性对照)(阿奇霉素浓度0.3％)之后，滴加荧光素，观察角膜染色斑，由此对眼刺激性进行评价。

(2-2)对兔的单眼分别滴加50μL的上述(1)中制作的(b)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3％)、(c)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)，经过6小时对眼刺激性进行了目测评价。其结果，(b)及(c)的两纳米化克拉霉素悬浮剂的情况下均未观察到眨眼次数的增加、眼的充血及分泌物，未确认到眼刺激性。

(2-3)按照每次间隔30分～数小时、每天1次～20次的方式对兔的单眼滴加作为对象的生理盐水、对另一眼滴加上述制剂(b)～(e)，并对眨眼次数和眼刺激性进行评价。关于眼刺激性的评价，在给药前、最终给药后1、3、5、24小时针对两眼的角膜、虹膜及结膜进行观察，并按照Draize的评价基准进行评分，从而进行了判定。

可以认为，与作为阳性对照的Azasite的眼刺激性相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的眼刺激性为同等或更低。

(实施例8)使用感染性模型动物的药效试验

(1)使白色兔的角膜受伤之后，向其眼睛滴加绿脓杆菌，由此制作了角膜感染症模型。自菌接种数小时后起，以每天1次～10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另一眼滴加实施例7中制备的制剂(b)～(e)，滴加3天～5天，自菌接种数小时后起，每隔24小时对外眼部感染症状进行观察，并持续进行4～8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中村等的评价基准或Draize的评价基准进行评分，从而进行了判定。

(2)通过在白色兔的结膜囊内接种绿脓杆菌，制作了角膜感染症模型。在确认到角膜炎发病(菌接种5～10小时)之后，以每天1次～10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另一眼滴加实施例7中制备的制剂(b)～(e)，滴加3天～5天，自菌接种数小时后起，每隔24小时对外眼部感染症状进行观察，并持续进行4～8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中村等的评价基准或Draize的评价基准进行评分，从而进行了判定。

(3)使白色兔的角膜受伤之后，向其眼睛滴加金黄色葡萄球菌，由此制作了角膜感染症模型。自菌接种数小时后起，以每天1次～10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另一眼滴加实施例7中制备的制剂(b)～(e)，滴加3天～5天，自菌接种数小时后起，每隔24小时对外眼部感染症状进行观察，并持续进行4～8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中村等的评价基准或Draize的评价基准进行评分，从而进行了判定。

(4)通过向白色兔的角膜基质内注入金黄色葡萄球菌，制作了角膜感染症模型。自菌接种数小时后起，以每天1次～10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另一眼滴加实施例7中制备的制剂(b)～(e)，滴加3天～5天，自菌接种数小时后起，每隔24小时对外眼部感染症状进行观察，并持续进行4～8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中村等的评价基准或Draize的评价基准进行评分，从而进行了判定。

可以认为，与作为阳性对照的Azasite相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的基于目测的眼刺激性(角膜混浊、眼睑结膜充血、眼睑结膜浮肿、眼球结膜充血)为同等或更低。另外可以认为，与作为阳性对照的Azasite相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的抗菌/抗炎症效果为同等或其以上。

(实施例9)使用了炎症性模型动物的药效试验

(1)通过对大鼠的上眼睑结膜注射2％花生四烯酸而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模型)。在注射花生四烯酸之前，每隔15分钟～30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a)～(e)，滴加1次～数次，在注射花生四烯酸3小时～6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评价了对结膜浮肿的抑制效果。

(2)通过对大鼠的上眼睑结膜注射1％角叉菜胶而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模型)。在注射角叉菜胶之前，每隔15分钟～30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a)～(e)，滴加1次～4次，在注射角叉菜胶3小时～6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评价了对结膜浮肿的抑制效果。

(3)通过对大鼠的上眼睑结膜注射1％角叉菜胶而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模型)。另外，在刚刚注射角叉菜胶之后自尾静脉进行1％伊凡氏蓝的给药。在注射角叉菜胶之前，每隔15分钟～30分钟向大鼠的单眼(右眼)滴加实施例7中制备的制剂(b)～(e)、向另一眼(左眼)滴加生理盐水，滴加1次～4次，在注射角叉菜胶3小时～6小时后屠杀大鼠，并摘除眼睑皮肤。将该眼睑皮肤加入Falcon管中，加入甲酰胺并在冰箱内浸渍过夜，使用分光光度计，由620nm的吸光度求出了离心分离后的上清中所含的伊凡氏蓝的色素量。以如下所示的色素漏出量的抑制率评价了对结膜浮肿的抑制效果。

抑制率(％)＝{(左眼的色素漏出量-右眼的色素漏出量)/左眼的色素漏出量}×100

(4)通过对大鼠的上眼睑结膜注射1％福尔马林而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模型)。在注射福尔马林之前，每隔15分钟～30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a)～(e)，滴加1次～4次，在注射福尔马林3小时～6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评价了对结膜浮肿的抑制效果。

(5)通过对大鼠的上眼睑结膜注射10％高岭土而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模型)。在注射高岭土之前，每隔15分钟～30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a)～(e)，滴加1次～4次，在注射高岭土3小时～6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评价了对结膜浮肿的抑制效果。

(6)通过向大鼠的结膜囊内滴加10％巴豆油而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模型)。在滴加巴豆油之前，每隔30分钟～50分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a)～(e)，滴加1次～4次，自最后一次滴加巴豆油起2～6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评价了对结膜浮肿的抑制效果。

(7)通过向兔的玻璃体注入牛血清白蛋白而制作了葡萄膜炎(一次葡萄膜炎)。进一步，在该炎症消退之后(牛血清白蛋白的玻璃体注入27～29天后)，再次由耳静脉注入牛血清白蛋白，使葡萄膜炎复发(二次葡萄膜炎)。对于一次葡萄膜炎和二次葡萄膜炎，以30分钟～数小时间隔向兔眼滴加实施例7中制备的制剂(a)～(e)，每天滴加1次～6次，基于评分标准而对生理盐水滴眼群和制剂给药组的外眼部炎症症状(角膜混浊、眼睑结膜充血、眼睑结膜浮肿、眼球结膜充血)和内眼部炎症症状(虹膜充血、虹膜形态的变化、前房混浊)进行评分，并作为葡萄膜炎的指标。

可以认为，与作为阳性对照的Azasite(注册商标)相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的基于目测的眼刺激性(角膜混浊、眼睑结膜充血、眼睑结膜浮肿、眼球结膜充血)为同等或更低。另外可以认为，与作为阳性对照的Azasite(注册商标)相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的抗炎症效果为同等或其以上。

(实施例10)纳米化克拉霉素悬浮剂的稳定性试验

在容量9mL的螺纹瓶中量取6～8g的实施例7(1)中制作的纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3％及1.0％)，分别在设定为5℃、25℃、40℃的恒温恒湿器中静置，持续14天进行了稳定性试验。在7天后和14天后利用高效液相色谱法(HPLC)对克拉霉素的浓度进行定量，求出以刚制备制剂之后的克拉霉素浓度为100％时的残存率，并由此对稳定性进行了评价。HPLC的分析条件如下所述。

装置：Waters alliance

色谱柱：Inertsil ODS 4.6mm×150mm

柱温：50℃

洗脱液：20mM KH2PO4/CH3CN(8:2)

检测波长：210nm

稳定性试验的结果如表5所示。克拉霉素在5℃、25℃及40℃的各温度下，经14天而未确认到分解，是稳定的。

[表5]

(实施例11)纳米化克拉霉素悬浮剂的眼内动态试验

对兔眼按照5分钟～30分钟的间隔滴加实施例7(1)中制作的(b)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3％)、(c)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)、(d)克拉霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1.0％)、或(e)Azasite(注册商标)(阳性对照)(阿奇霉素浓度0.3％)，滴加1次～10次，利用HPLC或LC/MS/MS等对滴加30分钟、1、2、4、6小时后的外眼部各组织(结膜、角膜、房水)中的克拉霉素浓度进行了测定。

在纳米化克拉霉素悬浮剂中，结膜、角膜及房水中的克拉霉素浓度高于克拉霉素原粉悬浮剂的情况，可以认为，与作为阳性对照的Azasite的情况相比为同等或更高。

(实施例12)克拉霉素粉碎Dough(面团)的制作

在0.5L TRIMIX(井上制作所制)中进料平均粒径10,370nm的克拉霉素(熔点:217-220℃；Assia Chemical Industries Ltd.)30g、甘露糖醇(和光纯药工业公司制)90g、聚乙烯吡咯烷酮K25(和光纯药工业公司制)9g、及氢化大豆卵磷脂PHOSPHOLIPON 90H(H.Holstein公司制)12g，混合至均一之后，注入甘油23.6g，使内容物保持为生面团状，于10℃进行了6小时粉碎。所得混炼面团的回收量为145.8g(回收率88.5％)。

向所得混炼面团100mg中加入0.1％HCO-60(Nihon Surfactant kogyo公司制)3g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了数分钟分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制)对克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)146.8nm、10％粒径(D10)85.5nm、50％粒径(D50)131.1nm、90％粒径(D90)222.0nm。

(实施例13)阿奇霉素粉碎Dough(面团)的制作

在0.5L TRIMIX(井上制作所制)中进料平均粒径74.99μm的阿奇霉素2水和物(熔点:133-135℃；东京化成工业公司制)5g、氯化钠(Tomitasoruto K30、富田制药公司制)60g、氢化大豆卵磷脂(PHOSPHOLIPON 90H、H.Holstein公司制)/甘油(纯正化学公司制)混合物(1:3)8g、及甘油9.6g，使内容物保持为生面团状，于5℃进行了2小时粉碎。所得混炼面团的回收量为74.8g(回收率90.6％)。

向所得混炼面团100mg中加入0.05％MYS-40(Nihon Surfactant kogyo公司制)/0.05％ PRONON 407P(日本油脂公司制)混合液5g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了数分钟分散处理。进一步，添加纯化水45g并使用浴槽型超声波分散机进行了数分钟分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、BeckmanCoulter公司制)对阿奇霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)147.3nm、10％粒径(D10)88.9nm、50％粒径(D50)130.1nm、90％粒径(D90)188.2nm。

(实施例14)罗红霉素粉碎Dough(面团)的制作

在0.5L TRIMIX(井上制作所制)中进料平均粒径121.3μm的罗红霉素(熔点:122-126℃；和光纯药工业公司制)5g、氯化钠(Oshiomicron T-0、赤穗化成公司制)60g、氢化大豆卵磷脂(PHOSPHOLIPON 90H、H.Holstein公司制)/甘油(纯正化学公司制)混合物(1:3)8g、及甘油9.6g，使内容物保持为生面团状，于5℃进行了2小时粉碎。所得混炼面团的回收量为81.6g(回收率98.4％)。

向所得混炼面团100mg中加入0.05％MYS-40(Nihon Surfactant kogyo公司制)/0.05％PRONON 407P(日本油脂公司制)混合液5g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了数分钟分散处理。进一步，添加纯化水25g并使用浴槽型超声波分散机进行了数分钟分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、BeckmanCoulter公司制)对罗红霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)234.5nm、10％粒径(D10)119.0nm、50％粒径(D50)195.0nm、90％粒径(D90)341.5nm。

(实施例15)0.3％纳米化克拉霉素悬浮剂的制作

在50mL的玻璃样品瓶中量取实施例12中得到的TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)2.55g，并向其中加入1％HCO-60水溶液20.0g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟(每次30秒钟，进行2次)分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制)对该分散液中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果，平均粒径(Dv)为219.2nm。

在上述分散液中添加1％HCO-60水溶液20.0g、1％HPMC 60SH-50水溶液35.0g、1MTris缓冲液(pH7.5)15.0g、0.1％苯扎氯铵(BAC)水溶液1.5g并利用磁力搅拌器进行搅拌，最后加入纯化水而调整为150g进行搅拌混合，得到了0.3％制剂。利用粒度分布测定装置对该制剂中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)391.9nm、10％粒径(D10)205.3nm、50％粒径(D50)326.1nm、90％粒径(D90)556.5nm。

(实施例16)1.0％纳米化克拉霉素悬浮剂的制作

在玻璃烧杯中量取实施例12中得到的TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团)5.55g，并向其中加入1％HCO-60水溶液46.7g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制)进行了1～2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MISONIX公司制)进行了1分钟(每次30秒钟，进行2次)分散处理。利用粒度分布测定装置(装置名:DeLsaNano、Beckman Coulter公司制)对该分散液中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果，平均粒径(Dv)为217.6nm。

在上述分散液中添加1％HPMC 60SH-50水溶液23.3g、1M Tris缓冲液(pH7.5)7.5g、0.1％苯扎氯铵(BAC)水溶液1.0g并利用磁力搅拌器进行搅拌，最后加入纯化水而调整为100g进行搅拌混合，得到了1.0％制剂。利用粒度分布测定装置对该制剂中的克拉霉素的粒度分布进行测定的结果为：平均粒径(Dv)548.1nm、10％粒径(D10)294.4nm、50％粒径(D50)484.4nm、90％粒径(D90)785.6nm。

(实施例17)纳米化克拉霉素悬浮剂的眼内药物动态试验

使用实施例15中制作的0.3％纳米化克拉霉素悬浮剂(以下称为0.3％纳米化制剂)、实施例16中制作的1.0％纳米化克拉霉素悬浮剂(以下称为1.0％纳米化制剂)及1.0％克拉霉素原粉悬浮剂(以下称为1.0％原粉制剂)这3种制剂，如下所述地进行了眼内药物动态试验。

轻轻地拉开兔(系Kbl:JW、雄性)的下眼睑，使用移液管将各制剂50μL向左眼的结膜囊内进行单次滴眼给药，然后，缓慢地将上下眼睑合在一起，保持约2秒钟。在滴加30分钟、2、4、6小时后的各时刻采集血浆、眼房水及结膜，并利用LC-MS/MS测定了克拉霉素浓度。

血浆的采集通过以下方法进行。从耳缘静脉采血约1mL之后，迅速进行离心分离(4℃、1710×g、3000rpm)，得到了血浆。对于所得血浆，在进行分析之前在超低温制冷器(-70℃以下)中进行了冷冻保存。

眼房水及结膜的采集通过以下方法进行。进行上述采血之后，将戊巴比妥水溶液进行耳缘静脉内给药而进行麻醉，使其放血安乐死。利用注射用水对眼进行充分洗涤之后，采集了眼房水。然后，采集了结膜。对采集的眼房水及结膜分别测定重量之后，利用液氮进行冷冻在进行分析之前在超低温制冷器(-70℃以下)中进行了冷冻保存。

各试样的前处理通过以下方法进行。对于血浆的情况而言，在血浆20μL中加入乙腈50μL并进行充分搅拌之后，进行离心(13100×g、4℃、5分钟)，将上清2μL注入到LC-MS/MS中。对于眼房水的情况而言，在眼房水20μL中加入乙腈50μL并进行充分搅拌之后，进行离心(13100×g、4℃、5分钟)，将上清2μL注入到LC-MS/MS中。对于结膜的情况而言，加入结膜的湿重量的9倍容量的超纯水而使其均质化，在结膜均浆20μL中加入乙腈50μL并进行充分搅拌之后，进行离心(13100×g、4℃、5分钟)，将上清2μL注入到LC-MS/MS中。

HPLC分析条件如下所示：

色谱柱 Inertsil ODS-4 HP (GL Science公司)

流动相A 20mM 甲酸铵

流动相B 乙腈

MS/MS分析条件如下所示：

离子源(Ion Source)：电喷雾电离(ESI)

扫描类型(Scan Type)：多反应监测(MRM)

极性(Polarity)：正(Positive)

源温度(Source Temperature)：500℃

结果如图1～3所示。显示出：与原粉相比，纳米化克拉霉素向眼房水及结膜的转移性高、向血液的转移性基本同等。

(实施例18)纳米化克拉霉素悬浮剂的药效试验1

使用兔制作角膜溃疡模型，通过金黄色葡萄球菌感染使结膜炎发病，并如下所述地进行了纳米化克拉霉素悬浮剂(滴眼液)的药效评价。

角膜溃疡模型的制作利用下述方法进行。对日本白色种兔(系Slc:JW/CSK、雄性)，在戊巴比妥钠麻醉(耳缘静脉内给药)下利用生理盐水洗涤外眼部，并利用0.4％盐酸奥布卡因对角膜实施了局部麻醉。利用药匙使兔的眼球压迫脱臼，并利用6mm直径的环钻(castroviejo氏角膜移植用环钻)在角膜中央制作圆形的浅伤，在圆形的创伤的内侧，利用26G×1/2 SB针制作了纵横2条“#”字型的到达角膜基质的创伤。

菌液接种利用下述方法进行。使用微量移液管和吸头(tip)，以50μL/眼的比例对角膜滴加1次1×10⁹cfu/mL浓度的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；St.aureusATCC25923株)液，使其眨眼，从眼睑上轻轻地按摩了2～3次。然后再滴加1次并使其眨眼、从眼睑上轻轻地按摩了2～3次(每只眼睛对角膜上滴加给予0.1mL)。

作为被检物质，将AzaSite(1％ azithromycin ophthalmic solution(阿奇霉素滴眼液))、实施例15中制作的0.3％纳米化克拉霉素制剂、实施例16中制作的1.0％纳米化克拉霉素制剂、1.0％克拉霉素原粉悬浮液及媒介物(从上述0.3％纳米化克拉霉素制剂中除去克拉霉素后的组成的物质)用于试验。

被检物质的给药利用以下方法进行。使用微量移液管和吸头，缓慢地拉开下眼睑，向结膜囊内滴加被检物质50μL/眼。给药期间为4天，菌液接种日(首日)为2次给药(菌液接种后4小时和8小时)，在2～4天，每天给药3次(4小时间隔)。

[表6]

观察及药效评价/判定如下所述地进行。角膜感染部位、角膜、虹膜及结膜的临床观察通过裂隙灯显微镜实施，在自菌液接种后第1天开始到菌液接种后第7天为止的7天内，每天实施1次。药效评价/判定采用了如下所示的按照秦野等/中村等的评价基准(表7)的角膜所见的评价及按照Draize J.H.et.al.的评价基准(表8)的角膜/虹膜/结膜所见的评价。需要说明的是，利用Draize J.H.et.al.的评价基准的评价如下所述地进行：

角膜＝A×B×5 (最大80分)

虹膜＝×5 (最大10分)

结膜＝(A+B+C)×2 (最大20分)

总得分＝角膜+虹膜+结膜(最大110分)

[表7]

[表8]

基于秦野等/中村等的评价基准的角膜感染部位的得分结果归纳于表9。另外，图4中示出了各被检物质的得分的经时变化(药效评价)。

[表9]

基于Draize等的评价基准的角膜、虹膜、结膜感染部位的得分结果归纳于表10。图5示出了各被检物质的得分的经时变化(药效评价)。

[表10]

由图4及图5可知，与作为阳性对照的AzaSite相比，纳米化克拉霉素悬浮液(滴眼剂)的抗炎症效果为同等以上。另外，1.0％克拉霉素原粉制剂在第6天之后确认到了抗炎症效果的减弱，但纳米化克拉霉素悬浮液(滴眼剂)持续7天显示出抗炎症效果。由此可知，通过进行纳米化，与原粉相比，可期待药效的长期持续。

(实施例19)纳米化克拉霉素悬浮剂的药效试验2

使用兔制作角膜溃疡模型，通过金黄色葡萄球菌感染使结膜炎发病，进行了纳米化克拉霉素悬浮剂(滴眼液)的药效评价。与实施例18相比，在本实施例中，对于滴眼剂的给药开始时间延迟对治疗效果的影响进行了研究。

与实施例18同样地进行了角膜溃疡模型的制作方法、菌液接种方法及药效评价/判定。被检物质使用了实施例15中制作的0.3％纳米化克拉霉素制剂及媒介物(从上述0.3％纳米化克拉霉素制剂中除去克拉霉素后的组成的物质)。给药次数等归纳于下表。

[表11]

基于秦野等/中村等的评价基准的角膜感染部位的得分结果归纳于表12及表13。图6中示出了各被检物质的得分的经时变化(药效评价)。

[表12]

[表13]

基于Draize等的评价基准的角膜、虹膜、结膜感染部位的得分结果归纳于表14及表15。图7中示出了各被检物质的得分的经时变化(药效评价)。

[表14]

[表15]

由图6及图7可知，即使使滴眼剂的给药开始时间延迟，也可获得同等的抗炎症效果(图7的3群与4群的比较)。另外可知，通过增加滴眼剂的给药次数，可获得更高的抗炎症效果(图7的4群与5群的比较)。

Claims

1.一种水性悬浮剂在制备眼的炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药中的应用，所述水性悬浮剂含有大环内酯类抗菌剂的纳米微粒，所述纳米微粒的平均粒径为500nm以下且D90粒径为1500nm以下，所述纳米微粒是通过将大环内酯类抗菌剂、生理上可接受的糖、生理上可接受的多元醇和/或水、以及分散稳定剂混合而制造的微粒，所述分散稳定剂为表面活性剂和粘度调整剂，所述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油，所述粘度调整剂为甲基纤维素和/或羟丙基甲基纤维素，所述治疗药或预防药为滴眼剂。

2.根据权利要求1中任一项所述的应用，其中，所述大环内酯类抗菌剂为红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、罗他霉素、或吉他霉素。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述水性悬浮剂还含有抗凝聚剂作为分散稳定剂，且所述抗凝聚剂为聚乙烯醇、聚乙二醇、卵磷脂、和/或聚乙烯吡咯烷酮。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述水性悬浮剂的刺激性低。