CN105648050A - 一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法及其分子靶标和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法。通过对山羊miRNA进行全面的鉴定，对比山羊皮肤毛囊生长期、休止期和退行期不同发育时期的差异表达谱，从中筛选出差异表达的miRNA,并通过荧光定量的技术手段对其进行了验证；通过靶基因预测和转录谱差异比较，寻找毛囊调控的基因，对miRNA的功能进行确证；最后确定miRNA-263可以作为毛囊周期发育特定的miRNA。通过鉴定，发现miR-263b与山羊绒周期发育规律一致，其调控的靶基因是山羊绒发育周期通路中的一部分关键基因，其表达的变化能准确反映具体的绒周期阶段，进而能够起到指示周期的作用。所以miR-263b具有重要的科研理论和应用价值，为山羊绒周期发育的预后判断提供新的线索和依据。

Description

一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法及其分子靶标和应用

技术领域

本发明属于分子靶标技术领域，涉及一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法及其分子靶标和应用.

背景技术

内蒙古绒山羊和山羊绒在国际上占有重要地位，是宝贵的种质遗传资源，是畜牧业中最具国际竞争力的一项产业。内蒙古绒山羊以其山羊绒纤细、洁白、柔软、光亮而享誉世界。2008年绒山羊存栏1868万只，生产羊绒7642吨，占全国山羊绒产量的48％、世界山羊绒产量的30％，自治区羊绒企业年销售收入160亿元。绒山羊业已经成为内蒙古自治区重要的民族和民生产业。在市场上，山羊绒的细度和长度决定了它的价值，细度小于14微米，长度大于36毫米的羊绒是普通羊绒价格几倍甚至是几十倍。所以如何产出更细更长的羊绒，一直是绒山羊遗传育种研究的重要课题，具有巨大的科研价值和经济价值。但内蒙古绒山羊的山羊绒加工能力与原料供应不成比例，每年平均缺口6000吨左右，如何提高山羊绒产量和品质已成为确保中国山羊绒品牌的重大战略问题和紧迫任务。

毛囊是毛纤维的“发源地”，它的性状和组织结构决定着毛的品质和产量。绒山羊的皮肤中有两种毛囊，一种是生长粗毛的初级毛囊(Primaryfollicles)，另一种是生长绒的次级毛囊(secondaryfollicles)。毛囊的生长周期一般分为生长期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)三个阶段。曲永年等研究表明辽宁山羊绒从6月开始生长,至翌年3月份逐渐停止生长,绒全年生长期为9个月,7-11月份是辽宁山羊绒生长旺盛期,9月份是辽宁山羊绒生长速度高峰月(曲永年,1995)。达文政等对阿白绒山羊生长研究表明绒从8月份开始生长,绒全年生长期为7个月,到第2年2月结束生长,生长最旺盛的时期是9-11月份(达文政,1992)。他两人的研究说明辽宁绒山羊绒的生长期较长，因此生长期长可能是辽宁绒山羊产绒量高的一大原因。为分析辽宁绒山羊较内蒙古绒山羊绒长、产绒量高的可能原因，李长青等2005年对这两个品种的绒周期进行了组织学研究，发现辽宁绒山羊表皮生发层3月份开始活动,5月份便已形成毛乳头,并开始生绒；内蒙古绒山羊4月份才开始活动；辽宁和内蒙古绒山羊分别于7、8月份基本完成毛囊重建,进入兴盛期,11月份左右细胞开始死亡,12月份进入退行期,2-3月份进入休止期(李长青,2005)。形态学的研究说明辽宁绒山羊表皮开始活动和毛囊重建均比内蒙古绒山羊提前1个月，而绒停止生长的时间基本一致，出绒时间的差异是造成各品种产绒量差异的原因之一。

由以上论述可知，山羊的产绒能力直接与其皮肤中的次级毛囊有关，次级毛囊的大小直接决定了绒的细度，次级毛囊的数量决定了绒的产量，次级毛囊的生长期长短影响绒长和产绒量。因此山羊次级毛囊的周期发育对山羊绒产量和绒品质具有重要作用，研究毛囊周期发育可能增加绒山羊产绒量并改良绒品质。另外，皮肤毛囊周期性发育变化不仅对于生产有重要作用，同时也为皮肤毛囊疾病模型的研究提供了依据。

目前皮肤和绒周期的研究，主要集中在人和小鼠上。山羊毛囊的研究较少，主要集中在个别基因的鉴定上。随着近年来一个新兴的研究领域---microRNA(miRNAs)的开发，使人们从功能的研究上发现了越来越多的作为分子靶标的miRNA，尤其在癌症和疾病的研究方面，因此miRNA的研究逐渐受到人们的重视。

二十年前研究人员最初发现miRNA时，并没有意识到它的重要性。然而，通过传统的克隆方法和生物信息学手段发现在线虫、果蝇、哺乳动物中存在着数百个miRNA，这引起了各领域科学家的重视。目前，在mirbase(http://microrna.sanger.ac.uk/)中，人类基因组已经发现超过2000个成熟的miRNA，约占人类基因的1-4％，这使得其成为最大的一类基因表达调控因子。越来越多的研究人员将注意力转向miRNA的研究。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

目前miRNA在人和小鼠等模式动物上的研究较多，家畜miRNA的研究还相对滞后，主要集中在miRNA的鉴定，以扩大miRBase数据库中现有miRNA的数量(Coutinhoetal.2007；Fengetal.2008；Kimetal.2008；Shaoetal.2008)，研究仅仅涉及少数动物种类。随着数据库中miRNA序列的增加，已开始向不同生物学过程中miRNA功能研究的方向发展(Clopetal.2006；Sweetmanetal.，2008)。目前，家畜miRNA的功能研究已经涉及多种动物的肌肉、脂肪、奶、免疫、生殖、疾病等方面(Xietal.2010；Polyetal.，2004；Kimetal.，2008；Wenguangetal.,2007)。

虽然miRNA对皮肤毛囊的作用目前研究较少。但越来越多的证据支持miRNA在皮肤毛囊的发育具有不可忽视的作用。2006年Andl首次报道了miRNA在皮肤中的研究，表明Dicer蛋白是RNA干扰机制的关键组分，负责miRNA的产生，他们在表皮Dicer缺失小鼠中观察到毛囊外翻至表皮，同时发现，毛囊增殖过程中重要的信号分子Shh和Notch1在出生后7d缺失，毛囊发育不良、再生障碍和错位发育等，表皮过度增殖(Andletal.,2006)。毛囊发育的这些表型变化证实了miRNA在维持动物皮毛的形态发生方面具有作用。同年，美国哈佛医学中心的研究人员通过制备E17.5胎鼠表皮与毛囊的小RNA文库，通过克隆测序获得了皮肤上100多个miRNA，发现91％的皮肤小RNA和63％的毛囊小RNA为miRNA。这一研究发表在Naturegenetic上(Yietal.,2006)。2007年zhang等构建了皮肤毛囊的表达谱芯片，比较了绵羊和山羊的miRNA，获得了159个miRNA,发现了105个山羊和绵羊共表达的miRNA.其中，let-7、miR-17、miR-30、miR-15和miR-8基因的家族高频率表达(Wenguangetal.,2007)。在小鼠和山羊皮肤中发现的大量miRNA，可能预示着miRNA在皮肤毛囊中发挥重要的作用。

2008年Nature上报导改变体内的miR-203的时空表达可以诱导皮肤的分层和分化，miR-203控制表皮细胞的增殖和诱导细胞周期进而促进表皮分化(Yietal.,2008)。2010年英国和美国科学家在小鼠毛发周期不同阶段使用基因芯片探索了miRNA的表达，比较了小鼠毛发的生长期、休止期和退行期miRNA的表达差异，发现在毛囊和皮肤其他组织大量的miRNA显著变化，其中miR-31在生长期和退行期以及休止期变化非常显著(Mardaryevetal.,2010)。这进一步说明miRNA在皮肤毛囊细胞发育和表皮分化以及绒周期的发育中具有重要作用。

miRNA在分子调控和靶标作用的领域成为新的研究热点，尤其在人类的疾病和发育中作为分子靶标的报道已很多。目前还没有miRNA在山羊绒周期发育的靶标的报道。

参考文献：

1曲永年,王薇,高文波等.辽宁绒山羊生长规律研究[J].中国养羊，1995，4：37-38

2达文政,李颖康,赵辉等.阿尔巴斯白绒山羊引种观测[J].宁夏农林科技,1992，

1:45-48

3李长青,尹俊,张燕军等。内蒙古绒山羊与辽宁绒山羊皮肤毛囊周期性变化的比较研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(7)：674-679

4CoutinhoLL,MatukumalliLK,SonstegardTS,etal.DiscoveryandprofilingofbovinemicroRNAsfromimmune-relatedandembryonictissues[J].PhysiolGenomics,2007,29(1):35-43

5FengY,HuangTH,FanB,ZhaoSH.MappingofsixmiRNAsexpressedinporcineskeletalmuscle[J].AnimGenet,2008,39(1):91-92

6KimJI,SCho,JSHong,etal.IdentificationandcharacterizationofnewmicroRNAsfrompig[J].MammalianGenome,2008,19(8):570-580.

7ShaoP,ZhouH，XiaoZD，etal.IdentificationofnovelchickenmicroRNAsAndanalysisoftheirgenomicorganization[J].Gene,2008,418：34-40

8ClopA,MarcqF,TakedaH,etal.AmutationcreatingapotentialillegitimatemicroRNAtargetsiteinthemyostatingeneaffectsmuscularityinsheep[J].NatGenet,2006,38(7):813–818

9SweetmanD,GoljanekK,RathjenT,etal.SpecificrequirementsofMRFsfortheexpressionofmusclespecificmicroRNAs,miR-1,miR-206andmiR-133[J].DevBiol.2008,321(2):491-499

10XiongY，FangJH，YunJP，etal.EffectsofmicroRNA-29onapoptosis，tumorigenicityandprognosisofhepatocellularcarcinoma[J].Hepatology，

2010,51(3)：836-845

11PolyF,ThreadgillD,StintziA.IdentificationofCampylobacterjejuniATCC43431-specificgenesbywholemicrobialgenomecomparisons[J].J Bacteriol,2004,186(14):4781-95

12ZhangWG，WuJH，LiJQ，etal.AsubsetofskinexpressedmicroRNAswithpossiblerolesingoatandsheephairgrowthbasedonexpressionprofilingOfmammalianmicroRNAs[J].Omics,2007,11(4):385-396

13ThomasAndl,ElizabethP.Murchison,etal.ThemiRNAprocessingenzymedicerisessentialforthemorphogenesisandmaintenanceofhairfollicles[J].CurrentBiology，2006,16(10):1041-1049

14YiR,CarrollD，PasolliHA，etal.MorphogenesisinskinisgovernedbydiscretesetsofdifferentiallyexpressedmicroRNAs[J].NatGenet,2006，38(3):356-362

15YiR，PoyMN，StoffelM，etal.AskinmicroRNApromotesdifferentiationbyrepressingstemness[J].Nature，2008,452(7184):225-229

16AndreiN.Mardaryev,MohammedI.Ahmed,NikolaV.Vlahov,etal.MicroRNA-31Controlshaircycle-associatedchangesingeneespressionprogramsoftheskinandhairfollicle[J].theFASEBjournal，2010,24(10):3869-3881

发明内容

针对现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的是提供一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法,该方法以miR263b为分子靶标，其调控的靶基因是位于绒发育周期通路中的一部分关键基因，其表达的变化能准确反映具体的绒周期阶段，进而能够起到指示周期的作用。

实现上述发明目的的技术方案是一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法,,包括下列步骤:

1、样品采集

剪取刚宰杀的1月、5月和10月内蒙古绒山羊体侧约2cm²的皮肤组织，装入冻存管，保存于-180℃液氮罐中。

2、RNA提取与检测

取出冻存的绒山羊1月、5月和10月皮肤组织，放入用液氮预冷的研钵中并加入TRIzol研磨至较细粉末后转入超净工作台融化成液体转移到离心管中，按TRIzol试剂盒步骤提取RNA。把提取的RNA在70℃变性2min后，使用NanoDrop检测样品的浓度、片断大小、RIN值和28S:18S的比值，以鉴定样品完整性。后于-80℃长期冷冻保存。

3、solexa深度测序，构建不同时期绒miRNA数据库

提取的不同时期的RNA送往深圳华大基因公司进行Solexa高通量测序，测序结果去除低质量和接头序列及长度小于18nt的小片段。并通过与Rfam(9.1)数据库以及Genbank的blastn比对鉴定去除rRNA、tRNA、snRNA等非编码RNA。跟miRBase所有物种比，得到保守的miRNA。

4、不同时期miRNA表达谱差异分析及靶基因预测

寻找绒不同时期间共有及特异miRNA进行表达差异分析并运用预测规则进行靶基因预测。

5、利用RT-PCR验证miR-263b

根据miRBase数据库中miRNA成熟体的序列设计茎环反转录引物和实时荧光定量PCR引物，序列分别为miR-263b-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGAAT；miR-263b-AS:CAGACTTGGCACTGGGAGAAT。然后选取不同时期绒差异表达的miR-263b，利用荧光定量RT-PCR技术验证高通量测序结果可靠性。

本发明还有一个目的在于提供一种与山羊绒周期相关的分子靶标miR263bmiR263b，其序列为:CTTGGCACTGGGAGAATTCAC。

本发明还有一个目的在于提供分子靶标miR-263b在判定山羊绒周期不同阶段中的应用。

本发明还有一个目的在于提供分子靶标miR-263b在制备与绒周期不同阶段判定的试剂盒中的应用。

本发明通过目前比较成熟的miRNA高通量测序的技术手段，对山羊miRNA进行了全面的鉴定；通过对比山羊皮肤毛囊生长期、休止期和退行期不同发育时期的差异表达谱，从中筛选出差异表达的miRNA,并通过荧光定量的技术手段对其进行了验证；通过靶基因预测和转录谱差异比较，寻找毛囊调控的基因，对miRNA的功能进行确证；最后确定miRNA-263可以作为毛囊周期发育特定的miRNA,研究表明miRNA-263在生长期明显下调，在毛囊的退行和休止期表达上调，是重要的绒周期发育的分子靶标。

通过鉴定，发现miR-263b与绒周期的发育规律一致，其调控的靶基因位于是绒发育周期通路中的一部分关键基因，其表达的变化能准确反映具体的绒周期阶段，进而能够起到指示周期的作用。所以miR-263b具有重要的科研理论和应用价值，为绒周期的发育的预后判断提供新的线索和依据。

附图说明

图1为miR-263b荧光定量扩增曲线；

图2为miR-263b荧光定量结果。

具体实施方式

以下结合发明人给出的具体实施方式进一步说明本发明的有益效果，而非限制本发明。

1、材料和数据库：

miRNA数据库：miRbase(http://www.miRbase.org/)

miRNA比对：tag2miRNA(华大基因开发)

同源比对软件：BLAST(http://blast.ncbi.nlni.nih.gov/Blast.cgi)

候选miRNA预测：Mireap(http://sourceforge.net/projects/mireap/)

引物在线设计软件：primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂和仪器均可从商业途径获得。

编号	仪器	厂商
			1	离心机5415D	Eppendorf
2	离心机5810R	Eppendorf
			3	分光光度计ND-1000	NanoDrop

4	分光光度计ND-2000	NanoDrop
			5	珀尔帖热循环仪PTC-225	MJ
6	7900HT快速实时PCR系统	Applied Biosystems
			7	凝胶成像系统CBC/UVP I-D001	CapitalBio
8	移液器P-2.5,P-20,P-200,P-1000	Eppendorf

2、方法：

一、探寻绒周期中时空特异表达的miRNA

1、RNA的收集与提取

取出保存于-180℃液氮罐中的1月、5月和10月内蒙古绒山羊体侧皮肤组织，放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织融化；按每100mg组织加入1mLTRIzol，继续研磨至较细粉末，转入超净工作台，待融化后，将液体转移到1.5mL离心管中，每管约1mL，室温放置15min以上；按0.2mL氯仿/1mLTRIzol的比例加入氯仿，漩涡震荡30秒混匀，室温放置2-3min，离心：4℃，12000rpm，15min；将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，按0.5mL异丙醇/1mLTRIzol的比例加入异丙醇，混匀，-20℃放置10min以上，4℃，12000rpm离心15min；弃去异丙醇，加入1mL75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，颠倒几次，4℃，7500rpm离心5min；弃去75％乙醇，超净台中自然干燥15～30min；加入一定体积的Nuclease-FreeWater(视RNA沉淀大小而定)，65℃5～10min助溶；-20℃短期冷冻保存，-80℃长期冷冻保存。

2、总RNA质量检测

将样品在冰上融化后，离心并充分混匀，取1μL样品在70℃变性2min后，使用NanoDrop检测样品的浓度、片断大小、RIN值和28S:18S的比值，以鉴定样品完整性。

3、solexa深度测序

提取的RNA送往深圳华大基因公司，用Solexa高通量测序技术进行测序并进行数据的初步分析，得到小RNA库。

4、构建绒周期不同时期的miRNA数据库

三个时期(生长期10月；退休期1月；休止期5月)的测序结果大小分别为10.94M；12.27M；11.31M。去除低质量和接头序列及长度小于18nt的小片段。并通过与Rfam(9.1)数据库以及Genbank的blastn比对鉴定去除rRNA、tRNA、snRNA等非编码RNA。跟miRBase所有物种比，得到保守的miRNA。

5、对不同时期miRNA表达谱进行差异分析

寻找生长期、休止期和退行期之间的共有及特异miRNA，进行表达差异分析。对两个样品中表达的已知miRNA统计，判断在两样品之间的表达量是否存在显著性差异，并分别使用log2-ratio、Scatterplot图比较两者共同表达的miRNA表达量的差异。具体步骤如下：

(1)首先将两个样品(control和treatment)归一化到同一个量级。

公式：归一化的表达量＝miRNA表达量/样品总表达量*归一量级

(2)然后使用标准化后的结果统计fold_change和P-value及做图。

$p\left(x\right|y)={\left(\frac{N_2}{N_1}\right)}^y\frac{(x+y)!}{x!y{(1+\frac{N_2}{N_1})}^{(x+y+1)}}\begin{array}{c}C(y\≤y_{\min }|x)=\underset{y=0}{\overset{y\≤y_{\min }}{\mathrm{\Σ}}}p\left(y\right|x)\\ D(y\≥y_{\max }|x)=\underset{y\≥y_{\max }}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}p\left(y\right|x)\end{array}$

归一化后，如果两个样品的某个miRNA基因表达量为零，则修改为0.01；如果两个样品的某个miRNA基因表达量都小于1，由于其表达量过低，不参与差异表达分析。

6、靶基因预测

使用如下规则采用软件进行miRNA的靶基因预测:

(1)sRNA与靶基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配)

(2)在miRNA/靶基因复合体中不得有超过2处发生相邻位点的错配

(3)在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第2-12个位点不得有相邻位点都发生错配

(4)miRNA/靶基因复合体的第10-11个位点不得发生错配

(5)在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第1-12个位点不得有超过2.5个错配

(6)miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75％

7、转录谱比较研究

二、对miR-263b进行RT-PCR进行验证

1、设计与合成引物序列

选取绒周期不同阶段均差异表达的miR-263b，利用茎环引物实时荧光定量RT-PCR技术验证高通量测序结果的可靠性。根据miRBase数据库中miRNA成熟体的序列设计茎环反转录引物和实时荧光定量PCR引物，由博奥生物有限公司合成。序列如下：

miR-263b-RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGAAT

miR-263b-AS：CAGACTTGGCACTGGGAGAAT

2、模板制备

剪取刚宰杀的1月、5月和10月内蒙古绒山羊体侧约2cm²的皮肤组织样本各三份装入冻存管，保存于-180℃液氮罐中。

2.1样本总RNA提取

(1)迅速取出组织样本，在电子天平中称重约0.3-0.5g，放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织融化；

(2)按每100mg组织加入1mLTRIzol，继续研磨至较细粉末，转入超净工作台，待融化后，将液体转移到1.5mL离心管中，每管约1mL，室温放置15min以上；

(3)按0.2mL氯仿/1mLTRIzol的比例加入氯仿，漩涡震荡30sec混匀，室温放置2-3min，离心：4℃，12000rpm，15min；

(4)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，按0.5mL异丙醇/1mLTRIzol的比例加入异丙醇，混匀，-20℃放置10min以上，4℃，12000rpm离心15min；

(5)弃去异丙醇，加入1mL75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，颠倒几次，4℃，7500rpm离心5min；

(6)弃去75％乙醇，超净台中自然干燥15～30min；

(7)加入一定体积的Nuclease-FreeWater(视RNA沉淀大小而定)，65℃5～10min助溶；

(8)-20℃短期冷冻保存，-80℃长期冷冻保存。

2.2总RNA质量检测

(1)总RNA浓度、纯度检测-NanoDrop测定RNA浓度、纯度(上样2μL)。

(2)总RNA质量检测-1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测

甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml1×TBEBuffer中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μL甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：120～130V，15～20min。

3、荧光定量PCR检测:

(1)miRNA逆转录反应体系及反应程序

(2)实时定量PCR反应体系与程序

按照以下荧光定量PCR体系将试剂按以下顺序依次加入到200p1Ep管中:

反应物	标准样量
		荧光PCR Master Mix(2×)	10μL
miRNA cDNA	1μL
		miRNA通用引物(10μM)	0.5μL
miRNA特异反转录引物(10μM)	0.5μL
		无酶水	8μL
总体积	20μL

混匀后稍离心，进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为:

(3)对miRNA实时定量PCR产物进行1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测

反应物	体积
		miRNA实时定量PCR产物	2-4μL

2×Loading Buffer	4μL
		总体积	10μL

非变性琼脂糖凝胶：80ml1×TBEBuffer中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μLEtBr混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：120V，15～20min。

图1为miR-263b荧光定量扩增曲线，图2miR-263b荧光定量结果(1为休止期、2为生长期、3为退行期)。荧光定量以5s作为对照，采用2^-△△Ct方法进行分析，表明实验不同处理组之间在生长期、退行期和休止期之间表达发生显著变化，以生长期样本为对照组，miR-263b在休止期发生显著上调，达到22.85倍，在退行期也发生显著上调，达到15.44倍。miRNA对基因的表达具有负调控作用，在生长期表达量显著下降，这与绒生长规律相一致。因此可以通过263的表达变化来判断和鉴识绒周期的变化。

Claims (4)

1.一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法,其特征在于,包括下列步骤:

(1)样品采集

剪取宰杀的绒山羊体侧约2cm²的皮肤组织，装入冻存管，保存于-180℃液氮罐中；

(2)RNA提取与检测

取出冻存的绒山羊1月、5月和10月皮肤组织，放入用液氮预冷的研钵中并加入TRIzol研磨至较细粉末后转入超净工作台融化成液体转移到离心管中，按TRIzol试剂盒步骤提取RNA；把提取的RNA在70℃变性2min后，使用NanoDrop检测样品的浓度、片断大小、RIN值和28S:18S的比值，后于-80℃长期冷冻保存；

(3)solexa深度测序，构建不同时期绒miRNA数据库

提取的不同时期的RNA送往深圳华大基因公司进行Solexa高通量测序，测序结果去除低质量和接头序列及长度小于18nt的小片段；并通过与Rfam(9.1)数据库以及Genbank的blastn比对鉴定去除rRNA、tRNA、snRNA等非编码RNA；跟miRBase所有物种比，得到保守的miRNA；

(4)不同时期miRNA表达谱差异分析及靶基因预测

寻找绒不同时期间共有及特异miRNA进行表达差异分析并运用预测规则进行靶基因预测；

(5)利用RT-PCR验证miR-263b

根据miRBase数据库中miRNA成熟体的序列设计茎环反转录引物和实时荧光定量PCR引物，序列分别为miR-263b-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGAAT；miR-263b-AS:CAGACTTGGCACTGGGAGAAT；然后选取不同时期绒差异表达的miR-263b，利用荧光定量RT-PCR技术验证高通量测序结果可靠性。

2.一种与山羊绒周期相关的分子靶标miR263b，其特征在于：该分子靶标miR263b的序列为:CTTGGCACTGGGAGAATTCAC。

3.权利要求2所述的分子靶标miR-263b在判定山羊绒毛周期不同阶段中的应用。

4.权利要求2所述的分子靶标miR-263b在制备与绒周期不同阶段判定的试剂盒中的应用。