CN105636595B - 用于测定维生素d代谢物的25-oh维生素d衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的生物素D化合物,其在C‑3立体中心通过连接体与标记基团相连接。本发明还涉及用于制备这些维生素D化合物的方法以及中间产物用于制备这些化合物的用途。本发明的另一个目标是通过使用根据本发明的维生素D化合物作为示踪物来定量测定维生素D的方法。本发明还涉及包含根据本发明的化合物的用于测定维生素D的试剂,以及其用于测定维生素D的用途。
Description
本发明涉及新的维生素D化合物,其在C-3立体中心通过连接体与标记基团相连接。本发明还涉及用于制备这些维生素D化合物的方法以及中间产物用于制备这些化合物的用途。
本发明的另一个目标是通过使用根据本发明的维生素D化合物作为示踪物来定量测定维生素D的方法。本发明还涉及包含根据本发明的化合物的用于测定维生素D的试剂,以及其用于测定维生素D的用途。
对于人,充足的维生素D供给是基本的。维生素D最常见的生理形式是维生素D3或维生素D2。维生素D3[Cholecalciferol(胆钙化醇)]最重要的生理有效衍生物是25OHD3(25-羟基维生素D3或钙二醇)]和1,25-(OH)2D3(1-α,25-二羟基维生素D3或钙三醇)。通常,占优势量的维生素D3不像其他维生素那样与食物一起被吸收,而是在UV-光的影响下在皮肤中制造。在这种情况下,7-脱羟基胆固醇通过UV-照射转变为前维生素D3,其中不稳定的中间产物改变结构成为维生素D3。在食物中,维生素D3特别地包含在富含脂肪的鱼类中。可以在体内存在的维生素D的另一个形式是维生素D2[Calciferol(钙化醇)或Ergocalciferol(麦角钙化醇)],其存在于真菌中并且可以与食物一起被吸收。维生素D3和维生素D2制剂是供给充足量的维生素D的另一个来源。
维生素D和其天然衍生物是极为疏水的分子。在血液中,进行以与维生素D结合蛋白(DBP)相复合的维生素D的运输。DBP属于白蛋白家族并且结合维生素D、维生素D代谢物和脂肪酸。
在肝脏中,维生素D通过细胞色素P450在C-25位置氧化。所得到的25OHD(25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2)是主要存在于循环中的维生素D代谢物。血清中25OHD的浓度充当评价人的维生素D状况的指示物。
在肾中和在其他组织中,进行25OHD至1,25(OH)2D即维生素D的生理活性形式的转化,后者在与维生素D受体(VDR)结合后,控制依赖维生素D而调控的(VDRE)基因活性。
充足的维生素D供给对于正常的骨形成和钙吸收和磷酸盐吸收的调节是基本的。VDR被1,25(OH)2D的活化提高了肠钙吸收的效率大约30%和磷酸盐吸收大约80%。如果25OHD的血清浓度下降到30ng/ml以下,那么这就与肠中钙吸收的明显减少和甲状旁腺激素浓度的上升相联系。维生素D缺乏被视为对于具有增加的骨折风险的骨质疏松症的主要因素并且与其他的健康风险相联系。血清中维生素D的浓度取决于食物吸收和阳光暴露而经受强烈的波动,而25OHD-血清浓度被视为确定维生素D供给状况的良好指示物。血清中25OHD浓度的测定因此在医学诊断中常规地进行。
血清中的25OHD-测定优选地通过竞争性结合试验来进行。在这种情况下,样品的25OHD浓度通过放射性或化学标记的维生素D衍生物被维生素D结合蛋白、例如25OHD特异的抗体的置换来测定。在竞争性结合试验中作为示踪物使用的标记维生素D衍生物在此不得不以较高的亲和力和特异性与在试验中使用的维生素D结合蛋白相结合。
DE 69713138(Immundiagnostic Systems Ltd.)描述了在C20-位放射性修饰的1,25-二羟基维生素D衍生物,其可以作为示踪物在免疫试验中使用。
US 5,116,573(Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha)描述了在C19-和C6-位氘或氚标记的维生素D衍生物。
备选地,可以使用维生素D3和维生素衍生物的3β-羟基基团以引进非放射性标记基团,其中羟基基团被修饰为酯桥或醚桥。然而,基于半抗原标记的酯衍生物的维生素D示踪物的可用性,例如由于在高于pH7的pH值情况下酯桥的不稳定性和其面对酯酶(其在生物液体和组织中经常存在)的无抵抗性而大受限制。为了解决该问题,发展了用于将羟基基团转化为3β-氨基丙基醚衍生物的方法(Roy,A.和Ray,R.,Steroids.1995,60:530-533,US6291693:Holick,M.F.和Ray,US6787660:Armbruster,M.P.等人,US20080317764:Huber,E.等人,US8003400:Kobold,U.)。
然而,该在现有技术中描述的用于制备维生素D衍生物的方法和其在竞争性结合试验中作为示踪物的用途具有一系列缺点。放射性标记的维生素D示踪物具有低的持久性和减小的稳定性。除了对于健康和环境的原则上的缺点外,在放射性试剂的情况下,对于存放、运输和清除的花费提高了。
在3β-羟基基团上经修饰的维生素D衍生物具有这样的缺点,即合成路径是极其费力的并且必须在严格厌氧的条件下使用高度易燃的和腐蚀性的试剂。此外出现,这些化合物在生理条件下大部分仅具有低的稳定性,这强烈地限制了其在生物来源的样品中的使用。
为测定维生素D而使用的示踪物应当是在合成上容易得到的,不包含潜在有害健康的用于检测的标记基团并且适合于在可自动化的测试方法中使用。
本发明的任务因此是,提供标记的维生素D化合物,其解决在标记维生素D衍生物的合成中迄今为止的问题并且适合于作为示踪物在用于定量测定维生素D的自动化方法中使用。
在现有技术中描述的标记维生素D化合物以及其制备的限制和缺点通过本发明至少部分地被消除。
本发明提供了标记的维生素D化合物,其适合于在用于测定维生素D的测试方法中作为示踪物并且是通过简单和短的途径合成可用的。
令人意外地,发现维生素D基体中的标记基团可以通过C-3原子上羟基基团的亲核取代被引入。在这种情况下,出现C-3原子上构型的反转。尽管如此,所得到的具有以在C-3上的α-构型的标记基团的化合物令人意外地出色地适合于作为竞争性维生素D测定方法中的示踪物。C3上的反转构象首先由于因此伴随而来的在生物液体例如血液中,例如面对酯酶的稳定性的提高,而是有利的。
通过本发明,提供了新的示踪物以及用于测定维生素D,特别是25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2的浓度的可靠和可自动化的方法。
本发明的第一个方面因此涉及具有按照式(I)的结构的维生素D化合物,
其中
R为C2-C10烷基残基或烯基残基,其如果需要地被羟基基团取代,
L为连接体,和
W为标记基团,其不是维生素D化合物。
表述“C2-C10烷基”表示具有2至10个碳原子的线性或支化的烷基基团。该术语包含基团例如乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、2-辛基、3-辛基、异辛基、正壬基、2-壬基、3-壬基、4-壬基、异壬基、正癸基、异癸基、2-癸基和3-癸基。每个氢原子也可以被氘原子替代。
表述“C2-C10烯基”表示具有2至10个碳原子的烯基基团。其可以是直链的或支化的并且以Z-型或E-型存在。此类基团包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、(Z)-2-戊烯基、(E)-2-戊烯基、(Z)-4-甲基-2-戊烯基、(E)-4-甲基-2-戊烯基、戊二烯基,例如1,3-或2,4-戊二烯基、(E)-5,6-二甲基庚-3-烯基和(Z)-5,6-二甲基庚-3-烯基。每个氢原子也可以被氘原子替代。
表述“标记基团”表示这样的基团,其是通过物理、化学和/或生物化学的方法可检测的,与所标记的分子的使用是相容的并且特别地是非放射性的。在此,它不是具有按照式(I)的结构的维生素D化合物。
表述“连接体”表示这样的分子间隔体,其使按照式(I)的维生素D基架与标记基团相连接。
在一个实施方案中,所述连接体以此为特征,即它具有选自C原子和如果需要地杂原子例如N、O和/或S的6至110个原子的链长。链长优选地为8-80、12-60或30-50个原子长。如果需要在连接体中包含的杂原子优选地为N和/或O。
在一个实施方案中,所述连接体由式(II)来代表:
其中
Q2:为-C(O)NR1-●,-C(O)O-●,-C(S)NR1-●,-C(S)O-●,C(O)S-●,-C(S)S-●,-O-●,-S-●,-NR1-●,-CH2O-●,-CH2S-●或-CH2NR1-●
Q1:为-C(O)-●,-NR2C(O)-●,-NR2C(S)-●,-OC(O)-●,-C(O)NR2-●,-C(S)NR2-●,-C(S)-●,-OC(S)-●,-SC(O)-●,-SC(S)-●,-O-●,-S-●或-NR2-●
Y:为-O-或-CH2-,
R1和R2相互独立地为H或C1-C6烷基,和
m为1-30,和
n为1-12,
其中Q1与W基团和Q2与按照式(I)的维生素D化合物的基体相连接并且(●)各自指示Q2与维生素D化合物的基体或Q1与W基团的连结位置。每个氢原子也可以被氘原子替代。
表述“C1-C6烷基”表示线性或支化的烷基基团,其具有1至6个碳原子,特别地1-3个碳原子。这些基团包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、1-乙基丙基、正己基和异己基。每个氢原子也可以被氘原子替代。
优选的实施方案以此为特征:
Q2:为-C(O)NR1-●,-C(O)O-●,-C(S)NR1-●,-C(S)O-●,-C(O)S-●,-C(S)S-●,
Q1:为
-C(O)-●,-NR2C(O)-●,-NR2C(S)-●,-OC(O)-●,-C(O)NR2-●,-C(S)NR2-●,-C(S)-●,-OC(S)-●,SC(O)-●,-SC(S)-●,-O-●,-S-●,-S-●或-NR2-●
Y:为-O-或-CH2-,
R1和R2相互独立地为H或C1-C6烷基,和
m为1-30,和
n为1-12,
或
Q2:为-C(O)NR1-●,-O-●,-S-●,-NR1-●,-CH2O-●,-CH2S-●或-CH2NR1-●
Q1:为
-C(O)-●,-NR2C(O)-●,-NR2C(S)-●,-OC(O)-●,-C(O)NR2-●,-C(S)NR2-●,-C(S)-●,-OC(S)-●,-SC(O)-●,-SC(S)-●,-O-●,-S-●或-NR2-●
Y:为-O-或-CH2-,
R1和R2相互独立地为H或C1-C6烷基,和
m为1-30,和
n为1-12,
另一个优选的实施方案以此为特征:
Q2:为-C(O)NR1-●,
Q1:为-C(O)-●,-NR2C(O)-●,-OC(O)-●,-C(O)NR2-●,-O-●,-S-●或-NR2-●,
Y:为-O-,
R1和R2相互独立地为H或C1-C6烷基,和特别是H,
m为1-30,和
n为1-12。
按照式(II)的连接体中的Y优选地为-O-。
在另一个优选的实施方案中,维生素D化合物具有按照式(Ia)的结构:
其中
R为C2-C10烷基残基或烯基残基,其如果需要地被羟基基团取代,
m为1-30,和
W为标记基团,其不是维生素D化合物。
在另外一个优选的实施方案中,维生素D化合物具有按照式(Ib)的结构:
或按照式(Ic)的结构:
标记基团W可以一方面是直接可检测的基团,或另一方面是间接可检测的基团,例如在与互补的、可检测的结合伙伴相结合后。
直接可检测的基团为例如染料、酶、电化学可检测的基团或发光基团例如荧光基团、磷光基团或化学发光基团,其可以例如用光学方法检测。
电化学可检测的基团理解为这样的基团,其可以与反应伙伴发生电子转移反应,其中电子从一个反应伙伴转移至另一个反应伙伴。要么可检测的基团被还原且反应伙伴被氧化,要么可检测基团被氧化且反应伙伴被还原。
荧光基团理解为这样的荧光染料,其在激发后自发地发射光,所述光比以前所吸收的光具有更少的能量。优选地,所述荧光基团是染料例如荧光素、罗丹明、1,2-二苯乙烯、荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP),香豆素、奎宁、别藻蓝蛋白、合成的荧光标记或更准确而言荧光标记物例如ATTO-染料(ATTO-TECGmbH,Siegen)、Alexa-Fluor(Molecular Probes,Invitrogen Corp.,Carlsbad)和花青例如Cy3、Cy5和Cy7以及其衍生物。
磷光基团理解为这样的化学基团,其在激发后在较长的时期内发射光,由此发生从几分之一秒至数小时的余光。
化学发光基团是这样的化学基团,其通过化学反应发射在可见光范围内或在红外范围内的电磁辐射。化学发光标记物包括鲁米诺、吖啶酯和多组氨酸标记物。
间接可检测的基团为例如生物素,其可以通过标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白来检测;抗原和半抗原,其可以通过标记的特异抗体来检测;碳水化合物结构,其可以通过凝集素来检测,或亲和性标签。
表述“生物素基”也包含生物素基的衍生物,如果其与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白结合。
在一个优选的实施方案中,所述W是生物素基、荧光基团或化学发光基团。
在另一个优选的实施方案中,所述W是生物素基。
基团R优选地为生物素D-侧链,特别是具有OH-基团的,例如按照式(III)的结构:
或按照式(IV)的结构:
特别优选地,R具有按照式(III)的结构。
第二个方面包括用于制备具有按照式(I)的结构的维生素D化合物的方法,其包括步骤:
(a)进行在具有按照式(V)的结构的化合物的C-3原子羟基基团上的亲核取代:
其中R为C2-C10烷基残基或烯基残基,其如果需要地被羟基基团取代,
其中羟基基团在C-3立体中心上构型的反转之下被X基团替代,以获得具有按照式(VI)的结构的化合物,
其中R为C2-C10烷基残基或烯基残基,其如果需要地被羟基基团取代,并且X为如果需要地经保护的羟基基团、硫醇基团或伯氨基或仲氨基团,和
(b)将不是维生素D化合物的标记基团W通过连接体偶联至具有按照式(VI)的结构的化合物的X基团,以获得具有按照式(I)的结构的化合物。
在步骤(a)中进行的亲核取代优选地包括醇(V)与烷基膦例如与三正丁基膦,或芳基膦例如三苯基膦或二苯基(2-吡啶基)膦,烷基偶氮二羧酸酯例如偶氮二羧酸二乙酯或偶氮二羧酸二异丙酯和亲核基团X优选地弱酸性亲核基团,在合适的溶剂例如四氢呋喃或二乙醚中的反应。
亲核基团X可以以保护的或游离的形式引入。优选地,基团X以经保护的形式引入。
“保护的”形式意味着它是前体基团,其例如视功能性而定具有合适的保护基团,其是专业人员熟知的,其中可以将该保护的形式通过现有技术中已知的方法转变为相应的未保护的基团。
用于引入基团X的化合物优选地选自包含酰亚胺、胺、叠氮酸、羧酸、醇类、硫醇、硫代羧酸或其盐的组。所述化合物优选地为酰亚胺、胺或叠氮酸,优选地为酰亚胺或叠氮酸,和最优选地,为邻苯二甲酰亚胺或其盐。这些基团可以,如果需要,通过专业人员已知的相应方法,去保护为相应的羟基基团、硫醇基团或伯氨基或仲氨基基团。例如,邻苯二甲酰亚胺可以通过伯胺例如甲胺或肼在合适的溶剂中转变为相应的伯胺。
基团R优选地为维生素D-侧链,优选地具有OH基团,例如按照式(III)或按照式(IV)的结构。
如上面所定义的标记基团W通过如上面所定义的连接体与具有按照式(VI)的结构的化合物中的X基团的在步骤(b)中的偶联按照专业人员已知的方法来进行。优选地,将已经与标记基团W连结的连接体,与基团X相偶联。优选地,所述连接体在此具有与X反应的基团,例如离去基团,例如N-羟基琥珀酰亚胺基,其可以被X基团取代,由此X基团与连接体相连结,以产生具有按照式(I)的结构的化合物。
本发明的第三个方面涉及用于通过使用具有按照式(I)的结构的化合物作为示踪物来定量测定样品中维生素D的体外方法。
表述“示踪物”表示具有这样的基团的化合物,其是直接可检测的或是间接可检测的,例如在与互补的可检测结合伙伴结合后。优选地,检测用化学、物理或生物化学的方法进行,优选地用物理的和生物化学的方法例如光谱方法或免疫学试验。
除非另外说明,表述“维生素D”包含所有天然存在的这样的化合物,其具有维生素D2-基架或维生素D3-基架或根据结构式(VII)或(VIII)的维生素D3-基架。
式(VII)
式(VIII)
结构式(VII)和(VIII)中碳原子的编号按照甾类化合物命名法给出。25-羟基维生素D表示在结构式(VII)或(VIII)的25位被羟基化的维生素D代谢物,即25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3。其他羟基维生素D化合物为例如1,25-二羟基维生素D或24,25-二羟基维生素D。
1,25-二羟基维生素D是指维生素D的活性形式(所谓的D激素),其在结构式(VII)和(VIII)的1位以及在25位被羟基化。
其他熟知的维生素D化合物为24,25-二羟基维生素D2、24,25-二羟基维生素D3和C3-表-25-羟基维生素D。
在一个实施方案中,所述体外方法包括步骤:
(a)使包含维生素D的样品与示踪物接触,
(b)在其中示踪物的所检测量使对样品中维生素D的总浓度的结论成为可能的条件下,定量地测定示踪物。
步骤(a)中的维生素D可以以游离形式存在。在另一个实施方案中,维生素D以结合的形式存在,并且步骤(a)还包括结合维生素D的释放。
表述“结合维生素D的释放”意味着维生素D从与蛋白质、特别是DBP的复合物的完全或部分脱离,维生素D与DBP在生物样品中可以结合。优选地,基本上所有在样品中存在的维生素D被释放。在该上下文中,“基本上”意味着至少90%、95%、98%和优选地至少99%的维生素D被释放。
合适的释放剂是专业人员熟知的并且包括有机物质例如扑酸(亚甲基双氢萘酸)或8-苯胺基-1-萘磺酸(8-ANS),无机物质例如与还原剂相组合的碱基或生物化学物质例如丝氨酸蛋白酶蛋白酶K。
特别合适的是这样的释放试剂,其包含至少一种助水溶性物质例如甲苯磺酸,至少一种过渡金属盐例如铁(III)盐例如氯化铁(III)或柠檬酸铁(III),和如果需要,一种络合剂例如柠檬酸盐、EDTA和/或其盐,例如在DE 10 2013 205 055.0中的描述。
根据步骤(b)的维生素D测定可以在时间上在步骤(a)之后或与步骤(a)一起进行。优选地,步骤(b)与步骤(a)同时地进行,由此提供用于测定样品中维生素D的一步法。
步骤(b)中维生素D总浓度的测定优选地通过免疫学方法中的示踪物测定来进行,其中示踪物与免疫伙伴结合,以形成免疫复合物。表述“免疫结合伙伴”包括抗体。
特别优选地,对于步骤(b)中维生素D浓度的测定,使用竞争性免疫学方法。
合适的竞争性测试形式是专业人员熟知的。在一个典型的竞争性结合试验中,使具有示踪物即维生素D的标记形式的受体或抗体与待研究的样品接触。所存在的与受体或抗体相结合的示踪物的量,就指示对于样品中未被标记的维生素D的份额。备选地,竞争性结合试验可以包含使与示踪物结合的受体或抗体与待研究的样品接触,和测量被置换的示踪物的量,其指示样品中维生素D的量。示踪物具有如上面所定义的标记基团,其特别地选自如上面所定义的生物素基、荧光基团或化学发光基团。
在最优选的实施方案中,使用用生物素标记的示踪物并且检测以氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白来进行。
特别地,在用于测定示踪物的步骤(b)中使用这样的抗体,其特异地识别具有按照式(I)的结构的化合物的侧链R并特异地识别在C-25原子上具有羟基基团的维生素D3侧链或维生素D2侧链。
给样品优选地以这样的量添加示踪物,以调节0.2-100ng/ml、特别是5-50ng/ml的示踪物最终浓度。
待研究的样品优选地为生物液体,其例如选自血液、血清、血浆或乳。样品通常来自肝组织,优选地来自哺乳动物,例如来自人。
用根据本发明的方法待测定的维生素D在C-25原子上具有羟基基团并且包含例如25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D2和其混合物。特别优选地,所述维生素D化合物是25-羟基维生素D3和/或25-羟基维生素D2。
本发明的第四个方面涉及包含按照式(I)的化合物的用于测定维生素D的试剂。
优选地,所述试剂还包含用于释放结合的维生素D的试剂和如果需要的稀释剂、载体、溶剂、辅剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂。
所述试剂优选地以干试剂或湿试剂存在。
本发明的第五个方面为上面所描述的试剂用于测定维生素D的用途,特别是在如上面所描述的根据本发明的体外方法中的用途。
本发明的第六个方面为具有按照式(VI)的结构的化合物:
其中R为C2-C10烷基残基或烯基残基,其如果需要地被羟基基团取代,
X为NHR3、OH或SH,和
R3为H或C1-C6烷基,
用于制备示踪物化合物,即具有按照式(I)、式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)的结构的化合物,特别是用于制备具有按照式(I)、式(Ib)或式(Ic)的结构的化合物的用途。
每个氢原子也可以被氘原子替代。
基团R优选地为维生素D侧链,优选地具有OH基团,例如按照式(III)或按照式(IV)的结构。
此外,将通过下面的附图和实施例,更详细地描述本发明。
图例:
图1:生物素25-OH-维生素D3示踪试剂的合成,通过将25-羟基维生素D3(1)转变为表3αN-邻苯二甲酰亚胺衍生物(2),去保护为氨基衍生物(3)和与NHS-PEG12-生物素反应为3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3(4)。
图2:确定的25OHD3浓度被生物素-25OHD3示踪试剂的竞争性置换的表征。对于特异性25OHD竞争的ELISA检测,给以0、5、10、20、20、50、100、200、300ng/ml浓度的在无维生素的D血清基质(SerCon,Seracare Inc.)中的25OHD3的稀释系列,在7.5ng/ml生物素-25OHD示踪试剂存在下掺入80μl维生素D释放剂并涂抹在用抗25OHD抗体涂覆的微量滴定板孔上。依赖于竞争性25OHD浓度的示踪物结合用过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白和四甲基联苯胺(TMB)-颜色反应通过测量OD 450nm来测定。
图3:具有确定的25OHD3和25OHD2浓度的血清(6PLUS1Multilevel SerumCalibrator Set 25-OH-Vitamin D3/D2,Chromsystems GmbH)与其在无维生素的D血清基质(SerCon,Seracare Inc.)中的稀释物的比较分析所显示的是,在HPLC和LC-MS/MS确定的25-OHD3/D2浓度与在自动AleriaTM系统(ORG270,ORGENTEC)中的直接25-OH维生素D3/D2测定方法之间的高度一致。
图4:在37℃下、在24小时孵育后在无维生素的D血清基质中的25-OH维生素D衍生物3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3(VD1)和3β-3’[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]酰氨基丙基醚-25-羟基维生素D3(VD2)的稀释物恢复的比较测定所显示的是,在C3-原子上以(R)-构型存在的衍生物VD1相对于在C3-原子上以(S)构型存在的衍生物VD2的高血清稳定性。
实施例1:3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3的合成(图1)
在具有溶剂CDCl3的Bruker AC300(Bruker,Karlsruhe,Bruker)上记录1NMR(在300MHz)谱。评价用四甲基硅烷作为内标准物以ppm来进行。质谱在Varian MAT 311光谱仪(70eV,EI)上测得。对于分析型薄层色谱法,使用F.256硅胶板(Merck Darmstadt,Germany)。色谱纯化在硅胶柱中于230-400网眼ASTM进行。所有试剂从Sigma Aldrich购进。
1.1:3α-邻苯二甲酰亚胺-25-羟基-去氧维生素D3的合成
在室温下搅拌在四氢呋喃(2.0ml)中的25-羟基-维生素D3(10.0mg,25μmol)、邻苯二甲酰亚胺(4.5mg,31.25μmol)、三苯基膦(8.2mg,31.25μmol)和偶氮二羧酸二乙酯(5.4mg,31.25μmol)的溶液24小时。在添加己烷(2.0ml)后,将化合物通过硅胶过滤器进行过滤。在除去溶剂后,将固体吸收在5ml 10%Na2CO3中并用每次10ml的二乙醚抽提2次。将合并的醚相通过MgSO4进行干燥并在真空下浓缩至无色油。将产物通过硅胶柱色谱法进行纯化。3α-邻苯二甲酰亚胺-25-羟基去氧维生素D3(图1式2)以无色油的形式分离出(7.3mg)。NMR:δ0.58(s,H-C(18),3H),0.85(d,J=6.4Hz,H-C(21),3H),1.21(s,H-C(26和27),6H),AB四重峰:4.84(d,J=2.4Hz,H-C(19)E,1H)和5.06(d,J=1.9Hz,H-C(19)Z,1H),AB四重峰:6.02(d,J=11.0Hz,H-C(7),1H)和6.26d,J=11.0Hz,H-C(6),1H),7.80(m,Ar,4H),MS:m/e(100)529.24(M+)。
1.2:3α-氨基-25-羟基-去氧维生素D3的合成
将3α-邻苯二甲酰亚胺-25-羟基-去氧维生素D3(2),(7.2mg,13.5mmol)在氮气下溶解在0.5ml 8M的甲胺乙醇溶液中。将混合物首先在室温下搅拌2小时,紧接着在4℃搅拌16小时。将溶剂在低压下蒸发掉并将残留物吸收在5ml 10%Na2CO3中并用每次10ml的二乙醚抽提3次。将合并的醚相通过MgSO4进行干燥并在真空下浓缩至无色油。将产物通过硅胶柱色谱法进行纯化。3α-邻苯二甲酰亚胺-25-羟基去氧维生素D3以无色油分离出(4),(5.2mg)。NMR:δ0.57(s,H-C(18),3H),0.85(d,J=6.4Hz,H-C(21),3H),1.21(s,H-C(26和27),6H),AB四重峰:4.83(d,J=2.4Hz,H-C(19)E,1H)和5.00(d,J=1.8Hz,H-C(19)Z,1H),AB四重峰:5.97(d,J=11.0Hz,H-C(7),1H)和6.27d,J=11.0Hz,H-C(6),1H),MS:m/e(100)400.37(M+)。
1.3:3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基去氧维生素D3的合成
将3α-氨基-25-羟基-去氧维生素D3(3),(5.2mg,12.9μmol)、三乙胺(0.02μl)、NHS-PEG12-生物素(9.4mg,10.0μmol,Thermo Scientific,产品编号:21312)溶解在0.2ml二乙基甲酰胺中,并在室温下搅拌过夜。将溶剂在低压下蒸发掉并将残留物通过硅胶柱色谱法进行纯化。在这种情况下,获得5.9mg无色蜡形式的3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3(4)。NMR:δ0.58(s,H-C(18),3H),0.85(d,J=6.4Hz,H-C(21),3H),1.21(s,H-C(26和27),6H),3.62(m,H-C(乙二醇),50H),AB四重峰:4.84(d,J=2.4Hz,H-C(19)E,1H)和5.06(d,J=1.9Hz,H-C(19)Z,1H),AB四重峰:6.02(d,J=11.0Hz,H-C(7),1H)和6.26d,J=11,0Hz,H-C(6),1H),MS:m/e(100)1247.80(M+Na+)。
实施例2:维生素D释放试剂的制备
将甲基苯磺酸钠溶解在水中并用1M柠檬酸钠和1M氯化铁(III)的母液调节至1M甲基苯磺酸钠、100mM柠檬酸钠和50mM氯化铁(III)的最终浓度。
实施例3:25-OHD抗体与固相的结合
将针对25-OH-维生素D3或25-OH-维生素D2的抗体在Tris盐缓冲液,pH8.0中稀释至1μg/ml的浓度。将微量滴定板(Maxisorb,Nunc)的孔用100μl的抗体稀释液涂覆,在37℃下干燥并在4℃下存放直至测试进行。
实施例4:竞争性结合分析
给无维生素D的血清基质(Seracon,Seracare Inc.)掺入确定浓度的25-OHD3。将各个80μl的浓度系列填充入放有作为示踪物的来自实施例1的3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3(25OHD-生物素-示踪试剂)的微量滴定板孔中并且为了使示踪试剂增溶,在室温(20-27℃)下孵育5分钟。随后,将80μl来自实施例2的释放试剂,其使样品的维生素D从与DBP的复合物解离,添加给样品批料并混合。将100μl用维生素D-释放试剂稀释的样品转移入25OHD-抗体涂覆的孔中并在室温下孵育30分钟。样品中包含的25OHD现在与25OHD生物素-示踪物竞争25OHD抗体上的结合位点。随后,除去样品批料并用每次200μl洗涤缓冲液冲洗孔3次。结合抗体的生物素25OHD示踪物的检测用过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白和四甲基联苯胺(TMB)-颜色反应来进行。在通过添加100μl 50mM磷酸终止反应后,进行在450nm下的光密度测量。为此,如在图2中显示的那样,在5ng/ml的25OHD3浓度下已经检测生物素-25OHD示踪物的特异性竞争。
实施例5:在自动化测试系统AlegriaTM 25-OH维生素D3/D2测试系统中测定血清或血浆中的25-羟基维生素D
为了研究基于HPLC+LC-MS/MS的25OHD3/D2测定方法与自动化AlegriaTM 25-OH维生素D3/D2测试系统(ORG270,Orgentec Diagnostika GmbH)之间的相关性,将其25OHD3/D2浓度通过基于HPLC+LC-MS/MS的方法表征(6PLUS1Multilevel Serum Calibrator Set 25-OH-Vitamin D3/D2,Chromsystems GmbH)的血清样品或血浆样品,以及其稀释阶梯以等份存放在-20℃下直至测定。
为了测定,在AlegriaTM-测试板条的孔A中放上每个80μl样品。测试板条的8个孔在这种情况下包含用于各个样品测定的来自实施例2的维生素D释放试剂、链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物、TMB-底物、25OHD校准溶液和25-OHD抗体涂覆的孔。测试处理自动地在AlegriaTM自动机中进行。在这种情况下,在测试板条内,总是将样品和测试板条内校准物与25OHD-生物素示踪物和维生素D释放试剂相混合,转移入25OHD抗体涂覆的孔中并在30分钟的孵育后进行洗涤。结合抗体的生物素-25OHD示踪物的检测用过氧物酶标记的链霉抗生物素蛋白和四甲基联苯胺(TMB)-颜色反应通过在650nm下的光密度测量来进行。
如在图3中所显示的,观察到在HPLC+LC-MS/MS确定的25OHD3/D2血清样品浓度和在自动化AlegriaTM系统中的直接25-OH维生素D3/D2测定方法之间高度的一致。
实施例6:25-OH维生素D衍生物的血清稳定性的测定
为了生物素-25-ΟΗ维生素D衍生物的血清稳定性的比较研究,将测试化合物吸收在无维生素D的血清基质(Seracon,Seracare Inc.)中。在第一个批料(VD1)中,将根据实施例1的在C3-原子上以非天然的(R)-构型存在的25-OH维生素D衍生物3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3调节至在无维生素D的血清基质中3ng/ml的浓度。在第二个批料(VD2)中,将根据US20080317764的在C3-原子上以非天然的(S)-构型存在的25-OH维生素D衍生物3β-3'[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3调节至在无维生素D的血清基质中3ng/ml的浓度。
将各个1ml的VD1和VD2批料的等份存放在-20℃下或在37℃下孵育24小时。随后将样品在室温(22℃)下平衡1小时。给每个500μl在-20℃下存放的参考样品和在37℃下孵育了24小时的样品掺入每个500μl根据实施例2的释放试剂并混合。将100μl用维生素D释放试剂稀释的样品转移入根据实施例3的25OHD-抗体涂覆的孔中并在室温下孵育30分钟,从而样品中存在的生物素-25-OH维生素D衍生物与25OHD抗体结合。
随后,除去样品批料并将孔用每次200μl洗涤缓冲液冲洗3次。结合抗体的生物素-25-ΟΗ维生素D衍生物的检测用过氧物酶标记的链霉抗生物素蛋白和四甲基联苯胺(TMB)-颜色反应来进行。在通过添加100μl 50mM磷酸终止底物反应后,在450nm下进行光密度测量。
在这种情况下表明,如在图4中所显示的那样,在VD1批料中用3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]-25-羟基-去氧维生素D3衍生物在37℃下在24小时孵育后相对于在-20℃下存放的参考样品95.2%的恢复。在VD2批料中存在的3β-3'[α-生物素酰氨基-ω-十二(乙二醇)-酰氨基]酰氨基丙基醚-25-羟基去氧维生素D3衍生物具有明显较低的血清稳定性。在此,检测到在37℃下在24小时孵育后相对于在-20℃下存放的参考样品仅71.5%的恢复。
Claims (24)
1.具有按照式(I)的结构的维生素D化合物
其中
R是按照式(III)的结构:
或按照式(IV)的结构:
L为连接体,其由按照式(II)的结构来表示:
其中
Q2:是-C(O)NR1-·,
Q1:是-C(O)-·,-NR2C(O)-·,-OC(O)-·,-C(O)NR2-·,-O-·,-S-·或-NR2-·
Y:是-O-
R1和R2相互独立地为H或C1-C6烷基,
m是1-30,和
n是1-12,
Q1与W基团和Q2与按照式(I)的维生素D化合物的基体相连接并且"·"各自指示Q2与维生素D化合物的基体或Q1与W基团的连结位置,和
W为生物素基、荧光基团或化学发光基团,
所述连接体具有选自C原子和如果需要的杂原子N、O和/或S的8-80个原子的链长。
2.根据权利要求1的化合物,其中所述链长为12-60个原子长。
3.根据权利要求1的化合物,其中所述链长为30-50个原子长。
4.根据权利要求1至3之一的化合物,具有按照式(Ib)的结构:
或按照式(Ic)的结构:
5.用于制备根据权利要求1至4之一的化合物的方法,其包括步骤:
(a)进行在具有按照式(V)结构的化合物的C-3原子羟基基团上的亲核取代:
其中R如在权利要求1至4之一中所定义,
其中羟基基团在C-3立体中心上构型的反转之下被X基团替代,以获得具有按照式(VI)的结构的化合物,
其中R如在权利要求1至4之一中所定义并且X为如果需要地保护的羟基基团、硫醇基团或伯氨基或仲氨基基团,和
(b)将不是维生素D化合物的标记基团W通过连接体偶联至具有按照式(VI)的化合物的X基团,以获得具有按照式(I)的结构的化合物。
6.用于定量测定样品中维生素D的体外方法,其通过使用根据权利要求1至4之一的化合物作为示踪物,其中所述方法并非为识别、研究和确定有生命的人体或动物体病因或病灶状态的过程。
7.根据权利要求6的体外方法,其包括步骤:
(a)使包含维生素D的样品与示踪物接触,
(b)在其中示踪物的所检测量使对样品中维生素D的总浓度的结论成为可能的条件下,定量地测定示踪物。
8.根据权利要求6的方法,其特征在于,所述示踪物测定通过免疫学方法来进行。
9.根据权利要求6的方法,其特征在于,所述示踪物测定通过竞争性免疫学方法来进行。
10.根据权利要求6的方法,其特征在于,为了测定示踪物而使用抗体,所述抗体特异地识别侧链R。
11.根据权利要求6的方法,其特征在于,为了测定示踪物而使用抗体,所述抗体特异地识别在C25上具有羟基基团的维生素D3或维生素D2侧链。
12.根据权利要求6的方法,其特征在于,给样品添加示踪物,所述示踪物的量调节从0.2至100ng/ml的该化合物的最终浓度。
13.根据权利要求6的方法,其特征在于,待研究的样品为生物液体。
14.根据权利要求13的方法,其中所述生物液体选自血液、血清、血浆或乳。
15.根据权利要求6的方法,其特征在于,待测定的维生素D在C-25上具有羟基基团并且选自包含25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D2和其混合物的组。
16.根据权利要求15的方法,其中所述维生素D为25-羟基维生素D3和/或25-羟基维生素D2。
17.用于测定维生素D的试剂,其包含根据权利要求1至4之一的化合物。
18.根据权利要求17的试剂,其进一步包含用于释放结合的维生素D的试剂和如果需要的稀释剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂。
19.根据权利要求17的试剂,其进一步包含用于释放结合的维生素D的试剂和如果需要的载体。
20.根据权利要求17的试剂,其进一步包含用于释放结合的维生素D的试剂和如果需要的溶剂。
21.根据权利要求17的试剂,其进一步包含用于释放结合的维生素D的试剂和如果需要的辅剂。
22.根据权利要求17至21中任一项的试剂,其特征在于,其作为干试剂或湿试剂存在。
23.根据权利要求1至4之一的化合物或根据权利要求17至22之一的试剂在根据权利要求6至16之一的方法中的用途。
24.具有按照式(VI)的结构的化合物用于制备具有按照如权利要求1定义的式(I)、如权利要求4定义的式(Ib)或式(Ic)的结构的化合物的用途
其中R为C2-C10烷基残基或烯基残基,其如果需要地被羟基基团取代,和
X为NHR3、OH或SH,
其中R3为H或C1-C6烷基。
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