CN105628808A - 预处理方法及阿莫西林、青霉素g和青霉素v的检测方法 - Google Patents

预处理方法及阿莫西林、青霉素g和青霉素v的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种预处理方法及阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测方法。预处理方法包括以下步骤：①将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液；待测样品为不含固体颗粒的乳制品；②将上清液上样至已经活化的Oasis？PRiME？HLB固相萃取小柱，收集流出液即得。本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测。在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于保护环境，节约了预处理步骤、时间和能耗，检测方法快速，简单，精密度高，准确性高，具有较强的应用价值。

Description

预处理方法及阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测方法
技术领域
本发明涉及一种预处理方法及阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测方法。
背景技术
阿莫西林、青霉素G和青霉素V是畜牧业最常用的兽药，都属于β-内酰胺类抗生素，是青霉素类广谱抗生素。阿莫西林，又名安莫西林或安默西林，其杀菌作用强，穿透细胞膜的能力强，是目前应用较为广泛的口服青霉素之一。青霉素G又被称为盘尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾或苄青霉素钾等。青霉素G是抗菌素的一种，是从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，对多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、个别革兰阴性杆菌(如嗜血杆菌属)、螺旋体和放线菌均有抗菌活性，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素V抗菌谱与青霉素G相同，但对产β内酰胺酶的菌株无抗菌作用，比如金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌等。青霉素V与青霉素G相比，对大多数敏感菌株的活性弱2～5倍。青霉素V的作用机制也是抑制细菌细胞壁的合成，使细菌迅速破裂而溶解。
牛奶是一种大众日常的消费品，随着人们对食品安全要求日益提高，牛奶的安全质量问题也越来越为人们重视。但从我国国内养殖环境来看，在我国大部分地区，特别是广大农村地区的养殖动物和生产饲料过程中，仍存在超量或超范围使用抗生素、不严格执行药物配伍禁忌或停药期规定的情况，甚至会存在使用违禁抗生素等现象。因食物链传递，牛奶中大量残留的抗生素会对人体造成危害。另外，从乳制品加工的角度来看，原料乳中残留的抗生素会严重影响干酪、黄油和发酵乳的起酵或后期风味的形成。
现有技术中，原料乳和/或液态乳制品中残留的阿莫西林、青霉素G和青霉素V含量的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)和酶联免疫方法等；其预处理多采用液液萃取和固相萃取等方法，国标方法预处理方法采用3步固相萃取法。目前现有的固相萃取预处理方法主要包括：活化、上样、淋洗和收集流出液，其中，淋洗和收集流出液所占时间占前处理所需时间的80％左右。故现有的固相萃取预处理方法存在的问题是操作步骤多、耗时长、有机溶剂使用量大以及不利于环保的缺陷。该现象亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术对原料乳和/或液态乳制品中残留的阿莫西林、青霉素G和青霉素V中的一种或多种的含量进行检测前，其固相萃取预处理方法操作步骤多、耗时长以及有机溶剂使用量大的缺陷，提供了一种预处理方法及阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测方法。本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测。而且在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于保护环境，节约了预处理步骤、时间和能耗，具有较强的应用价值。本发明的检测方法可用于检测阿莫西林、青霉素G和青霉素V中的一种或多种，且检测方法快速，简单，精密度高，准确性高。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种预处理方法，其包括以下步骤：
(1)将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液；所述的待测样品为不含固体颗粒的乳制品；
(2)将所述上清液上样至已经活化的OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，收集流出液，即得预处理后的待测样品。
步骤(1)中，所述的待测样品较佳地为原料乳和/或液态乳制品。
其中，所述的液态乳制品为本领域常规的液态乳制品，较佳地为高钙牛奶、高铁牛奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一种或多种，更佳地为高钙牛奶、低乳糖牛奶和高铁牛奶中的一种或多种。
其中，所述的原料乳为本领域常规的原料乳，较佳地为牛乳。除所述待测组分外，所述牛乳的成分及含量一般如表1所示：
表1
组分 平均组成 组成范围％
水 87.1％ 85.5～88.7％
非脂乳固体 8.9％ 7.9～10.0％
乳糖 4.6％ 3.8～5.3％
脂肪 4.0％ 2.4～5.5％
蛋白质 3.25％ 2.3～4.4％
有机酸 0.17％ 0.13～0.22％
微量物质 0.7％ 0.5～0.8％
杂质 0.18％ 0.13～0.22％
其中，百分比为各组分相对于牛乳的质量百分比。
步骤(1)中，所述的待测样品可能含有阿莫西林、青霉素G和青霉素V中的一种或多种。该些组分可能是由于养殖动物和生产饲料过程中，超量或超范围使用抗生素、不严格执行药物配伍禁忌或停药期规定或使用违禁抗生素等现象造成的。
步骤(1)中，所述的待测样品中，阿莫西林的含量较佳地为4～1000μg/Kg，更佳地为10～500μg/Kg，最佳地为10～50μg/Kg。所述的待测样品中，青霉素G的含量较佳地为4～1000μg/Kg，更佳地为10～500μg/Kg，最佳地为10～50μg/Kg。所述的待测样品中，青霉素V的含量较佳地为5～1000μg/Kg，更佳地为10～500μg/Kg，最佳地为10～50μg/Kg。
步骤(1)中，所述乙腈的添加量为本领域常规的添加量，较佳地为3～40mL/1～4g待测样品，更佳地为4～10mL/1g待测样品。
步骤(1)中，较佳地，在所述离心的操作之前，先将所述混合物进行漩涡震荡。所述旋涡震荡的方法和条件为本领域常规的方法和条件，所述的旋涡震荡的时间较佳地为1～10min，更佳地为5min。所述漩涡震荡的温度本领域常规，一般为室温。所述旋涡震荡是为了利于提取，使乙腈进一步提取所述待测成分。
步骤(1)中，较佳地，所述混合物中还包含酸。所述酸为本领域常规的酸，较佳地为甲酸和/或乙酸。所述酸的添加量为本领域常规，较佳地为0.1～2％，更佳地为0.8～1.2％，最佳地为1％；上述百分比为所述酸占所述乙腈的体积百分比。添加所述酸后，所述待测样品中所述阿莫西林、所述青霉素G或所述青霉素V的提取率至少能提高10％以上。
步骤(1)中，根据本领域常识，可使用乙腈和酸进行多次离心操作，较佳地使用乙腈和酸进行两次离心操作。所述酸的种类和用量如前所述。根据本领域常识，将多次离心后所得上清液进行合并。
步骤(1)中，所述的离心的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述的离心的转速较佳地为5000～15000rpm。所述的离心的时间较佳地为5～30min。
步骤(1)中，较佳地，将所述上清液先进行定容后再进行步骤(2)的操作。所述定容的操作过程中，较佳地使用水或乙腈进行定容，更佳地使用乙腈进行定容。所述定容的终点较佳地为10～25mL/g所述待测样品，更佳地为10mL/g所述待测样品。所述定容的目的是为了使后续进行测试时，用量基本相同。
步骤(2)中，所述OasisPRiMEHLB固相萃取小柱较佳地为沃特世科技(上海)有限公司市售产品。
步骤(2)中，所述活化的操作和条件为本领域常规的操作和条件。活化采用的溶剂种类较佳地为乙腈水溶液或甲醇水溶液。所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体积百分比较佳地为10～80％，更佳地为60％。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为10～80％，更佳地为60％。所述乙腈水溶液或所述甲醇水溶液的用量为本领域常规，较佳地为3～8mL，更佳地为4mL。
步骤(2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速为本领域常规的流速，较佳地为0.025～0.30mL/s，更佳地为0.05mL/s。
本发明还提供一种待测成分的检测方法，所述待测成分为阿莫西林、青霉素G和青霉素V中的一种或多种，其包括以下步骤：
(1)将所述预处理后的待测样品去除溶剂，再用溶剂A溶解，过滤，得进料样品；所述溶剂A为甲醇水溶液、乙腈水溶液或水；
(2)将步骤(1)中所述进料样品再进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测所述待测成分，即可。
步骤(1)中，所述去除溶剂的方法和条件为本领域常规，较佳地用20～50℃氮气吹干，更佳地为用25℃氮气吹干。
步骤(1)中，所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体积百分比较佳地为1～20％，更佳地为6％。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为1～20％，更佳地为6％。
步骤(1)中，所述溶剂A的用量较佳地为1～2mL/g所述待测样品，更佳地为1mL/g所述待测样品。
步骤(1)中，所述的过滤的方法为采用有机微孔滤膜进行过滤，较佳地采用孔径为0.22μm或0.45μm的有机微孔滤膜进行过滤。根据本领域常识，所述的过滤为微滤。
步骤(2)中，所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测的条件和方法为本领域常规的条件和方法。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的色谱柱较佳地为十八硅烷键合硅胶色谱柱(WaterXselectC18column)。所述的十八硅烷键合硅胶色谱柱的规格较佳地为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法较佳地使用梯度洗脱的方法，流动相A为乙腈和甲酸的混合液，流动相B为水和甲酸的混合液。所述流动相A中，所述甲酸的用量较佳地为流动相A总体积的0.05～0.1％，更佳地为流动相A总体积的0.1％。所述流动相B中，所述甲酸的用量较佳地为流动相B总体积的0.05～0.1％，更佳地为流动相B总体积的0.1％。
其中，较佳地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如表2所示：
表2
时间min 流动相A％ 流动相B％
0 20 80
10 50 50
12 95 5
15 95 5
其中，百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分比。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的柱温较佳地为25～35℃，更佳地为30℃。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述的高效液相色谱法检测的所述待测样品的流速较佳地为0.6～1.5mL/min，更佳地为1mL/min。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述阿莫西林的高效液相色谱法检测的检测波长较佳地为228nm。所述青霉素G的高效液相色谱法检测的检测波长较佳地为225nm。所述青霉素V的高效液相色谱法检测的检测波长较佳地为268nm。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的进样体积较佳地为15～25μL，更佳地为20μL。
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，质谱检测的条件较佳地为：
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压如表3所示：
表3
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正离子模式；
毛细管电压：3500伏；
离子源温度120℃；
去溶剂温度：550℃；
检测方式：多反应监测(MRM)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测。而且在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于环境保护，节约了预处理步骤、时间和能耗，具有较强的应用价值。
本发明的检测方法可用于检测阿莫西林、青霉素G和青霉素V中的一种或多种，且检测方法快速，简单，精密度高，准确性高。
附图说明
图1为实施例1中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测阿莫西林标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。
图2为实施例1中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测青霉素G标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。
图3为实施例1中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测青霉素V标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。
图4为实施例2中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测待测样品B的多反应监测(MRM)色谱图。
图5为实施例2中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测待测样品A的多反应监测(MRM)色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
标准曲线的制备：
称取阿莫西林、青霉素G和青霉素V标准物质各10mg(精确到0.1mg)，以乙腈配制成浓度1000.0mg/Kg的单标储备溶液，所有溶液于4℃避光储存。使用前移取适量标准溶液，以空白样品提取液逐级稀释成混合标准工作溶液，混合标准工作溶液中，阿莫西林、青霉素G和青霉素V的浓度分别均为4μg/Kg、5μg/Kg、10μg/Kg、30μg/Kg、20μg/Kg、40μg/Kg、100μg/Kg、140μg/Kg和200μg/Kg。进样进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测，制得标准曲线。
高效液相色谱法检测的条件为：
色谱柱：WaterxselectC18column(4.6mm×250mm)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相A：乙腈和甲酸的混合液，甲酸的用量为混合液总体积的0.1％；
流动相B：水和甲酸的混合液，甲酸的用量为混合液总体积的0.1％；
阿莫西林的检测波长：228nm；青霉素G的检测波长：225nm；青霉素V的检测波长：268nm；
梯度洗脱条件见表2：
表2
时间min 流动相A％ 流动相B％
0 20 80
10 50 50
12 95 5
15 95 5
其中，百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分比。
质谱检测的条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正离子模式；
毛细管电压：3500伏；
离子源温度：120℃；
去溶剂温度：550℃；
检测方式：多反应监测(MRM)；
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压如表3所示：
表3
检测结果：图1为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测阿莫西林标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。图2为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测青霉素G标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。图3为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测青霉素V标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。
测定图1、图2和图3的峰面积，以浓度X(μg/Kg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，分别绘制阿莫西林、青霉素G和青霉素V的混合标准溶液工作曲线，得标准曲线方程及其相关系数，如表4所示。
表4
待测组分 线性方程 相关系数R 线性范围
阿莫西林 Y＝154x-1610 0.998 4-200μg/Kg
青霉素G Y＝94x+1160 0.999 4-200μg/Kg
青霉素V Y＝181x+363 0.997 5-200μg/Kg
实施例2
1、待测样品的预处理
(1)分别称取1g(精确至0.01g)原料牛乳(此为空白样品，不含三种待测组分)作为样品A和样品B，置于10mL聚丙烯离心管中。样品A中加入实施例1的20μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B均进行如下处理：加入0.2％甲酸、4mL乙腈，旋涡震荡3min，以5000rpm的速度离心5min，移取上清液至10mL容量瓶中；再向待测样品中加入0.2％甲酸、4mL乙腈，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至10mL；上述百分比均为甲酸占乙腈添加量的体积百分比；
(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：
取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用3mL的80％(百分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中所得溶液上样到OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速0.02mL/s，收集全部流出液，即得预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B。
2、待测样品A、B中阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测
将预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分别进行下述操作：
(1)将预处理后的待测样品在20℃下用氮气吹干，1mL的1％(百分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液溶解，经0.22μm的有机微孔滤膜过滤，得进料样品；
(2)将步骤(1)中所得进料样品，进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。
高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
3、检测结果
图4为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测待测样品B的(即不含有任何的待测组分)多反应监测(MRM)色谱图。图5为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测待测样品A多反应监测(MRM)色谱图。分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中各组分含量如表5所述。
表5
实施例3
1、待测样品的预处理：
(1)分别称取1g(精确至0.01g)原料牛乳(此为空白样品，不含三种待测组分)作为样品A和样品B，置于10mL聚丙烯离心管中。样品A中加入实施例1的50μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B均进行如下处理：再加入0.1％甲酸、10mL乙腈，旋涡震荡1min，以5000rpm的速度离心5min，移取上清液至25mL容量瓶中，再向待测样品中加入0.1％甲酸、10mL乙腈，重复以上提取步骤，合并两次提取液，水定容至25mL；上述百分比均为甲酸占乙腈添加量的体积百分比；
(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：
取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用8mL的10％(百分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液进行活化。将步骤(1)中上清液上样到OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，保持每秒0.05毫升液体的流速，收集全部流出液，即得预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B。
2、待测样品A、B中阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测
将预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分别进行下述操作：
(1)将预处理后的待测样品在25℃下用氮气吹干，1mL的20％(百分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液溶解，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤，得进料样品；
(2)将步骤(1)所得进料样品，进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。
高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
3、检测结果
分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中各组分含量如表6所述。
表6
实施例4
待测样品的预处理：
(1)分别称取2g(精确至0.01g)高钙牛奶(市售产品，此为空白样品，不含三种待测组分)作为样品A和样品B，置于50mL聚丙烯离心管中。样品A中加入实施例1的10μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B均进行如下处理：加入2％甲酸、乙腈10mL，旋涡震荡3min，以10000rpm的速度离心30min，移取上清液至25mL容量瓶中；再向待测样品中加入2％甲酸、乙腈10mL，重复以上提取步骤，合并两次提取液，水定容至25mL；上述百分比均为甲酸占乙腈添加量的体积百分比；
(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：
取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用4mL的60％(百分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化。；将步骤(1)中所得溶液上样到OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速为0.3mL/s，收集全部流出液，即得预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B。
2、待测样品A、B中阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测
将预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分别进行下述操作：
(1)将预处理后的待测样品在50℃下用氮气吹干，用1mL水溶解，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤，得进料样品；
(2)将步骤(1)所得进料样品进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。
高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
3、检测结果
分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中各组分含量如表7所述。
表7
实施例5
1、待测样品的预处理
(1)分别称取1g(精确至0.01g)低乳糖牛奶(市售产品，此为空白样品，不含三种待测组分)作为样品A和样品B，置于10mL聚丙烯离心管中。样品A中加入实施例1的50μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B均进行如下处理：加入1％乙酸、10mL乙腈，旋涡震荡10min，以15000rpm的速度离心5min，移取上清液至25mL容量瓶中；再向待测样品中加入1％乙酸、乙腈10mL，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至25mL；上述百分比均为乙酸占乙腈添加量的体积百分比；
(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：
取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用5mL的80％(百分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中所得溶液上样到OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速为0.2mL/s，收集全部流出液，即得预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B。
2、待测样品A、B中阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测
将预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分别进行下述操作：
(1)将预处理后的待测样品在30℃下用氮气吹干，1mL的10％(百分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液，经0.22μm的有机微孔滤膜过滤，得进料样品；
(2)将步骤(1)所得进料样品，进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。
高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
3、检测结果
分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中各组分含量如表8所述。
表8
实施例6
1、待测样品的预处理
(1)分别称取2g(精确至0.01g)高铁牛奶(此为空白样品，不含三种待测组分)作为样品A和样品B，置于50mL聚丙烯离心管中。样品A中加入实施例1的50μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B均进行如下处理：加入1％乙酸、乙腈20mL，旋涡震荡10min，以15000rpm的速度离心5min，移取上清液至50mL容量瓶中；再向待测样品中加入1％乙酸、乙腈10mL，，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至50mL；上述百分比均为乙酸占乙腈添加量的体积百分比
(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：
取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用10mL的5％(百分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中所得溶液上样到OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速为0.2mL/s，收集全部流出液，即得预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B。
2、待测样品A、B中阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测
将预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分别进行下述操作：
(1)将预处理后的待测样品在35℃氮气吹干，1mL的6％(百分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液溶解，经0.22μm的有机微孔滤膜过滤，得进料样品；
(2)将步骤(1)中所得进料样品，进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。
高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。
3、检测结果
分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中各组分含量如表9所述。
表9
效果实施例1
检出限的测定
将实施例1中浓度为4μg/Kg混合标准工作溶液摇匀，进样10μL，按实施例1中LC-MS/MS条件进行分析。信噪比S/N＝3时，测得阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检出限，以及信噪比S/N＝10时，测得阿莫西林、青霉素G和青霉素V的定量限如表10所示。
表10
本发明阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测方法，其定量限和国家兽药最低残余量(农业部第235公告)相比，可以满足国家兽药最高限量定量的要求。
效果实施例2
精密度的测定
取6份实施例1中制备的30μg/Kg的混合标准工作溶液，作为样品液，每次进样10μL，重复进样8次，按实施例1中LC-MS/MS的条件进行分析。具体测量结果如表11所示。测定阿莫西林峰面积A，RSD为6.85％(6份样品)，表明精密度良好。
RSD为相对标准偏差(relativestandarddeviation)，指标准偏差与计算结果算术平均值的比值。
表11
效果实施例3
稳定性的测定
将实施例1中制备的浓度为100μg/Kg的混合标准工作溶液，连续进样8次，测定阿莫西林的峰面积，外标法定量，计算其浓度，其结果如表12所示，RSD值为3.99％，表明检测方法稳定性良好。
RSD为相对标准偏差(relativestandarddeviation)，指标准偏差与计算结果算术平均值的比值。
表12
效果实施例4
本效果实施例用于证明本发明预处理方法的准确性(测定其回收率)，其结果如表13所述。
取三组同样的普通原料牛乳，编号为1、2、3。其中，编号1为空白样品，不做任何处理；编号2中的牛奶分别加入40μg/Kg的阿莫西林标准溶液1mL、40μg/Kg的青霉素G标准溶液1mL和40μg/Kg的青霉素V标准溶液1mL；编号3中的牛奶分别加入200μg/Kg的阿莫西林标准溶液1mL、200μg/Kg的青霉素G标准溶液1mL和200μg/Kg的青霉素V标准溶液1mL。将上述3组分别进行如实施例2中的预处理，按照实施例1中LC-MS/MS条件进行分析，上述3组分别重复进样5次，取平均值。计算其回收率，得到结果如表13所示。
表13加标回收率实验结果
注明：N表示未检出。

Claims (10)

1.一种预处理方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液；所述的待测样品为不含固体颗粒的乳制品；
(2)将所述上清液上样至已经活化的OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，收集流出液，即得预处理后的待测样品。
2.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述的待测样品为原料乳和/或液态乳制品；
所述的液态乳制品较佳地为高钙牛奶、高铁牛奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一种或多种；
所述的原料乳较佳地为牛乳。
3.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的待测样品中，阿莫西林的含量为4～1000μg/Kg，较佳地为10～500μg/Kg，更佳地为10～50μg/Kg；所述的待测样品中，青霉素G的含量为4～1000μg/Kg，较佳地为10～500μg/Kg，更佳地为10～50μg/Kg；所述的待测样品中，青霉素V的含量为5～1000μg/Kg，较佳地为10～500μg/Kg，更佳地为10～50μg/Kg；
步骤(1)中，所述乙腈的添加量为3～40mL/1～4g待测样品，较佳地为4～10mL/1g待测样品；
步骤(1)中，在所述离心的操作之前，先将所述混合物进行漩涡震荡；所述的旋涡震荡的时间较佳地为1～10min；
步骤(1)中，所述混合物中还包含酸；所述酸较佳地为甲酸和/或乙酸；所述酸的添加量为0.1～2％，较佳地为0.8～1.2％；上述百分比为所述酸占所述乙腈的体积百分比；较佳地使用所述乙腈和酸进行两次离心操作；
步骤(1)中，所述的离心的转速为5000～15000rpm；所述的离心的时间为5～30min。
4.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述上清液先进行定容后再进行步骤(2)的操作；所述定容的操作过程中，较佳地使用水或乙腈进行定容；所述定容的终点较佳地为10～25mL/g所述待测样品；
步骤(2)中，活化采用的溶剂种类为乙腈水溶液或甲醇水溶液；所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体积百分比较佳地为10～80％；所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为10～80％；所述乙腈水溶液或所述甲醇水溶液的用量较佳地为3～8mL；
步骤(2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速为0.025～0.30mL/s。
5.一种待测成分的检测方法，所述待测成分为阿莫西林、青霉素G和青霉素V中的一种或多种，其特征在在于，其包括以下步骤：
(1)将如权利要求1～4任一项所述预处理后的待测样品去除溶剂，再用溶剂A溶解，过滤，得进料样品；所述溶剂A为甲醇水溶液、乙腈水溶液或水；
(2)将步骤(1)中所述进料样品再进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测所述待测成分，即可。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述去除溶剂的方法用20～50℃氮气吹干；
步骤(1)中，所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体积百分比为1～20％；所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比为1～20％；
步骤(1)中，所述溶剂A的用量为1～2mL/g所述待测样品；
步骤(1)中，所述的过滤采用孔径为0.22μm或0.45μm的有机微孔滤膜进行过滤。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的色谱柱为十八硅烷键合硅胶色谱柱；所述的十八硅烷键合硅胶色谱柱的规格较佳地为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm。
8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法使用梯度洗脱的方法，流动相A为乙腈和甲酸的混合液，流动相B为水和甲酸的混合液；所述流动相A中，所述甲酸的用量较佳地为流动相A总体积的0.05～0.1％；述流动相B中，所述甲酸的用量较佳地为流动相B总体积的0.05～0.1％；
其中，较佳地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如表2所示：
表2
时间min 流动相A％ 流动相B％ 0 20 80 10 50 50 12 95 5 15 95 5
其中，百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分比。
9.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的柱温为25～35℃；
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述的高效液相色谱法检测的所述待测样品的流速为0.6～1.5mL/min；
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述阿莫西林的高效液相色谱法检测的检测波长为228nm；所述青霉素G的高效液相色谱法检测的检测波长为225nm；所述青霉素V的高效液相色谱法检测的检测波长为268nm；
步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的进样体积为15～25μL。
10.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，质谱检测的条件为：
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压如表3所示：
表3
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正离子模式；
毛细管电压：3500伏；
离子源温度120℃；
去溶剂温度：550℃；
检测方式：多反应监测。
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