CN105624112A - 树突状细胞的培养方法和树突状细胞 - Google Patents

树突状细胞的培养方法和树突状细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，获得未成熟树突状细胞；然后，再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；其中，第一诱导剂包括：rhGM-CSF和rhIL-4；第二诱导剂包括rhTNF-α、番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。本发明进一步涉及由上述方法所获得的树突状细胞。与现有技术相比，本发明提供的方法提高树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈性。

Description

树突状细胞的培养方法和树突状细胞
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种树突状细胞的培养方法和树突状细胞。
背景技术
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段,也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。
细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前在临床中使用最多的细胞免疫治疗疗法主要是DC治疗、CIK治疗和DC-CIK联合免疫治疗。
DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC)，一方面，其能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答；另一方面，树突状细胞还能够呈递抗原给MHC-I类限制性CD8+和MHC-II类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为“天然免疫佐剂”，因此，树突状细胞在诱导免疫应答中具有独特的地位。
近年来，以树突状细胞(dendriticcell,DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前景。目前，从外周血单个核细胞(PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12，致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术培养出的树突状细胞体外诱导成熟率低，细胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一种能够提高树突状细胞成熟率及抗原提呈性能的树突状细胞的培养方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：
获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，每隔2～3天更换培养基，获得未成熟树突状细胞；
再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；
其中，第一诱导剂包括：rhGM-CSF和rhIL-4；
第二诱导剂包括rhTNF-α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为800～1200U/ml和rhIL-4的浓度为800～1200U/ml。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为1000U/ml和rhIL-4的浓度为1000U/ml。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为800～1200U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为5～15μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为5～15μg/ml。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为1000U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为10μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为10μg/ml。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，
所述番茄脂溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：
避光条件下，取新鲜番茄处理成浆状后，干燥至粉末状；取番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混匀，离心，收集上清液，向残留物中添加正丁烷混匀，离心，再次收集上清液，然后将收集的上清液混合，用蒸馏水和NaCl溶液清洗后，用氮气吹干即可。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，所述番茄水溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：避光条件下，取新鲜番茄处理成浆状后，干燥至粉末状；取番茄粉末，加入乙醇，加热至40～70℃、1～2小时，冷却后离心；于相同条件下加热冷却离心并提取残渣两次，合并上清液，过滤备用。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，
所述树突状细胞前体单个核细胞的获取过程，包括以下步骤：
抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10～20分钟后，分离获取外周血单个核细胞；用含有10％～15％的胎牛血清、50～150U/ml青霉素和50～150U/ml链霉素的完全培养基悬浮细胞浓度至(2～6)×106个/ml，孵育1～3小时，更换新的完全培养基，收集细胞悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。
在本发明提供的树突状细胞的培养方法中，还包括以下步骤：添加所述第一诱导剂之前，需调节所述树突状细胞前体单个核细胞浓度为(1～3)×106个/ml。
本发明还提供一种树突状细胞，是由上述树突状细胞的培养方法所获得的。
实施本发明提供的树突状细胞的培养方法，可以达到以下有益效果：与现有培养树突状细胞的方式相比，本发明通过第一诱导剂和第二诱导剂对树突状细胞进行两个阶段的诱导活化，并采用番茄脂溶性提取物或水溶性提取物作为第二诱导剂，能够促进提高树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈性。
具体实施方式
本发明提供的树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、获取树突状细胞前体单个核细胞；
S2、采用第一诱导剂将树突状前体细胞当个核细胞诱导分化成未成熟树突状细胞；
S3、采用第二诱导剂将未成熟树突状细胞诱导分化成成熟的树突状细胞。
具体地，步骤S1中，优选地，树突状细胞前体单个核细胞来源于新鲜外周血，相比经过冷库储存或者培养传代之后的树突状细胞，从新鲜血液中制备的树突状细胞前体单个核细胞离体时间较短，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持其免疫性能。在本发明中，树突状细胞前体单个核细胞的具体获取过程为：
抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10～20分钟后，分离获取外周血单个核细胞；
用含有10％～15％的胎牛血清、50～150U/ml青霉素和50～150U/ml链霉素的完全培养基悬浮细胞浓度至(2～6)×106个/ml，孵育1～3小时，更换新的完全培养基，收集细胞悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。
步骤S2的具体过程为：
取步骤S1获得的树突状细胞前体单个核细胞悬液，离心洗涤后计数，使细胞浓度达到(1～3)×106个/ml，用完全培养基培养，并与培养当天添加第一诱导剂，培养4～7天，每隔2～3天更换培养基。
其中，第一诱导剂包括rhGM-CSF(Recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，重组人粒-巨细胞集落刺激因子)和rhIL-4(Recombinanthumaninterleukin4，重组人白细胞介素4)；其中，rhGM-CSF的终浓度为800～1200U/ml和rhIL-4的终浓度为800～1200U/ml；更为优选地，rhGM-CSF的终浓度为1000U/ml，rhIL-4的终浓度为1000U/ml。
第一诱导剂所含成分能够诱导树突状细胞前体单个核细胞转化为未成熟的树突状细胞，增大细胞体积，并促进细胞的生长增殖和分化，促进细胞形成集落；同时，对已分化的未成熟树突状细胞进行预刺激，使未成熟树突状细胞能够快速成熟。
步骤S3的具体过程为：
向步骤S2a获得的未成熟树突状细胞中添加第二诱导剂培养2～4天至未成熟的树突状细胞全部成熟；其中，第二诱导剂包括rhTNF-α(Recombinanthumantumornecrosisfactor-α，重组人肿瘤坏死因子α)和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物；且rhTNF-α的终浓度为800～1200U/ml、番茄脂溶性提取物的终浓度为5～15μg/ml或番茄水溶性提取物的浓度为5～15μg/ml；更为优选地，rhTNF-α的终浓度为1000U/ml，番茄脂溶性提取物的终浓度为10μg/ml，番茄水溶性提取物的终浓度为10μg/ml。
其中，rhTNF-α能够刺激树突状细胞成熟，以提高树突状细胞抗原提呈能力。
番茄中有活性作用的主要脂溶性化合物为类胡萝卜素，类胡萝卜素及其他番茄脂溶性提取物能够促进未成熟的树突状细胞的生长和增殖，抑制细胞代谢过程中产生的H2O2对细胞膜的损伤，降低细胞ROS、LPO含量，增加SOD酶活性，减少DNA损伤，提高树突状细胞的活性及存活率并促进其成熟。番茄脂溶性提取物的提取方法为：取新鲜番茄处理成浆状后，干燥成粉末备用。取番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混匀，离心，收集上清液；向残留物中添加正丁烷混匀，离心，再次收集上清液；可重复该提取步骤2～3次，然后将收集的上清液混合，用蒸馏水和NaCl溶液清洗后，用氮气吹干，溶解在甲醇-甲基叔丁基醚-水溶液中，过滤备用；需要说明的是，该提取步骤全程均在避光条件下操作，以防止类胡萝卜素氧化。
番茄中有活性作用的主要水溶性化合物为酚类化合物，酚类化合物能够清除细胞代谢过程中产生的自由基，减少对细胞的损伤，提高树突状细胞的细胞活性，促进其增殖。番茄水溶性提取物的提取方法为：取番茄粉末，加入乙醇提取液，加热至40～70℃、1～2小时，冷却后离心；于相同条件下提取残渣两次，合并上清液，过滤备用。
基于本发明的上述树突状细胞的培养方法，本发明还提出一种由上述方法制备得到的树突状细胞。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供的树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1a、获取树突状细胞前体单个核细胞；
抽取外周静脉血3-5ml，生理盐水1：1稀释，然后沿管壁缓缓加入到3～5ml比重为1.077±0.001g/ml的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，1500r/min离心15分钟，分离获取外周血单个核细胞，用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI1640培养基(购自Gibco公司)悬浮细胞浓度为4×106/ml，移至六孔板中，2ml/孔，将六孔板放于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，去掉培养基及悬浮的细胞，在每孔中放入新鲜的RPMI1640培养基，轻轻吹打，吹起壁上细胞，收集细胞悬液，即树突状细胞前体单个核细胞。
S2a、将树突状细胞前体单个核细胞诱导分化成未成熟树突状细胞；
将步骤S1a中获得的细胞悬液转移到15ml离心管中，离心洗涤，计数细胞，使细胞浓度达到2×l06/ml，然后用完全培养基(含10％胎牛血清RPMI1640)培养，并于培养当天加入第一诱导剂，置于培养箱中培养6天，每隔3天更换新的培养基，并补充第一诱导剂，即可收获未成熟树突状细胞；
其中，第一诱导剂中包括1000U/ml的rhGM-CSF和1000U/ml的rhIL-4。
S3a、诱导未成熟树突状细胞成熟；
在树突状细胞前体单个核细胞培养的第6天加入第二诱导剂培养3天至树突状细胞成熟；
第二诱导剂中包括1000U/ml的rhTNF-α和10μg/ml的番茄脂溶性提取物。
其中，番茄脂溶性提取物的制备方法为：
取番茄原料洗净后切成小块，用搅拌器打成浆状。称取30g左右浆状物冷冻干燥后研磨成粉末，置于-80℃冰箱中备用。精确称取0.5g番茄粉末置于50mL聚乙烯试管中，加入10mL乙醇-正丁烷(乙醇与正丁烷的体积比为4：3)，混匀后先于150转/min振荡1h，然后在4000转/min的条件下离心3min，分离上清液，残渣中加入10mL正丁烷，并用上述相同方法重复提取两次。上清液合并后，用50mL蒸馏水和50mL10％NaCl溶液清洗，合并的上清液用氮气吹干后，溶解在10mL的methanol(甲醇)-MTBE(甲基叔丁基醚)-蒸馏水(90:5:5,v/v/v)溶液中，过0.2μm的PTFE(聚四氟乙烯)滤膜备用。所有过程均在避光操作下进行，防止类胡萝卜素氧化。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的第二诱导剂包括：1000U/ml的rhTNF-α和10μg/ml的番茄水溶性提取物。
其中，番茄水溶性提取物的制备方法为：
在100mL聚四氟乙稀微波提取管中准确称取0.5g番茄粉末，加入25mL乙醇提取液，将微波提取管固定在微波提取装置中，并接入温度感应器；根据实验设计设置升温程序，5min内加热到预定的提取温度55℃，样品提取1小时后，冷却l0min，然后于4000rpm下离心5min。相同条件下，重复提取残渣两次，合并后的上清液过0.2μm的PTFE滤膜备用。
为进一步验证本发明提供的树突状细胞的培养方法及其所获得的树突状细胞具有显著的有益效果，设置以下实验进行验证。
检测组1～2—分别对应本发明实施例1～2所提供的成熟的树突状细胞；
对照组—为采用现有方法获得的树突状细胞。
1.细胞表型的FACS分析
分别收集检测组和对照组3组树突状细胞，加入PBS溶液悬浮细胞，调整细胞浓度至为1×106/ml，取100μl加入离心管，然后分别加入荧光标记抗体(抗CD86、CD11b、CD11c及I-Ab单抗)调整终浓度为5μg/ml，置4℃冰箱中，避光反应15min，添加PBS溶液洗涤2遍，以荧光标记的同型Ig作为对照，上机(FACScalibur)检测细胞荧光强度，Cellquest软件分析。
采用流式细胞术检测两组树突状细胞免疫分子表型荧光强度的比较(x±s)，检测结果如下表1：
表1
分组 CD86 CD11c Ia
检测组1 231.80±61.22 39.19±14.81 52.08±15.72
检测组2 229.01±52.34 48.31±10.34 56.69±12.70
对照组 71.01±10.29 70.31±11.56 70.37±21.80
检测结果：CD86含量高于CD11c和Ia说明树突状细胞表面共刺激分子活化T细胞的第二信号CD86高表达，由表1数据可知，本发明提供的成熟的树突状细胞表面免疫分子活化T细胞的能力较强。
2.ELISA法测定细胞因子(IL-10和IL-12p70)的含量
分别收集检测组1～3和对照组促成熟后的树突状细胞的上清液惊醒ELISA检测，检测上清中IL-10与IL-12p70的分泌情况，检测数据见下表2，IL-10与IL-12p70的分泌水平(x±s)，(单位：pg/ml)
表2
检测结果：由表2数据可知，检测组1-3中，树突状细胞分泌的IL-12p70的水平远大于IL-10，而IL-12p70能够直接作用CD8+T细胞使其增殖，增强细胞免疫效应以及形成长久记性T淋巴细胞，能够分泌高水平的IL12是树突状细胞生物活性高的标志之一；由此可知，通过本发明所获得的树突状细胞生物活性优于对照组通过现有技术所获的树突状细胞的生物活性。
3.CCK-8法抗原肽特异性T细胞的增殖反应
分别对检测组1～3和对照组细胞执行以下操作：
将抗原肽负载并促成熟后的树突状细胞与T细胞以细胞数1:10的比率共培养5天后，用CCK法检测T细胞的增殖情况。
表3为检测组和对照组影响T细胞增殖反应的比较(％，x±s)
分组 T细胞增殖率
检测组1 277.82±30.05
检测组2 283.21±29.91
对照组 137.81±49.67
检测结果：树突状细胞作为抗原呈递细胞的一个重要的功能是刺激T细胞增殖，因此，树突状细胞能否激活细胞毒性T淋巴细胞是检验树突状细胞功能的关键问题。由表3中数据可知，通过本发明提供的树突状细胞的培养方法所获得的树突状细胞能够促进并提高T细胞的增值率，增强免疫反应能力。
以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种树突状细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，每隔2～3天更换培养基，获得未成熟树突状细胞；
再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；
其中，第一诱导剂包括：rhGM-CSF和rhIL-4；
第二诱导剂包括rhTNF-α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。
2.根据权利要求1所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为800～1200U/ml、和rhIL-4的浓度为800～1200U/ml。
3.根据权利要求2所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为1000U/ml和rhIL-4的浓度为1000U/ml。
4.根据权利要求1所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为800～1200U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为5～15μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为5～15μg/ml。
5.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为1000U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为10μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为10μg/ml。
6.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述番茄脂溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：
避光条件下，取新鲜番茄处理成浆状后，干燥至粉末状；取番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混匀，离心，收集上清液，向残留物中添加正丁烷混匀，离心，再次收集上清液，然后将收集的上清液混合，用蒸馏水和NaCl溶液清洗后，用氮气吹干即可。
7.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述番茄水溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：避光条件下，取新鲜番茄处理成浆状后，干燥至粉末状；取番茄粉末，加入乙醇，加热至40～70℃、1～2小时，冷却后离心；于相同条件下加热冷却离心并提取残渣两次，合并上清液，过滤备用。
8.根据权利要求1所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述树突状细胞前体单个核细胞的获取过程，包括以下步骤：
抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10～20分钟后，分离获取外周血单个核细胞；用含有10％～15％的胎牛血清、50～150U/ml青霉素和50～150U/ml链霉素的完全培养基悬浮细胞浓度至(2～6)×106个/ml，孵育1～3小时，更换新的完全培养基，收集细胞悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。
9.根据权利要求1所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，还包括以下步骤：添加所述第一诱导剂之前，需调节所述树突状细胞前体单个核细胞浓度为(1～3)×106个/ml。
10.一种树突状细胞，其特征在于，是由权利要求1～9任一项所述的树突状细胞的培养方法所获得的。
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