CN105622593B - 一种烟曲霉素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种烟曲霉素的提取方法，包括步骤：1)将烟曲霉素发酵液的pH值调节为1～6.0，用大孔树脂吸附；2)吸附后的树脂置于层析柱中，用质量浓度15～30％的乙醇水溶液清洗；3)用无水乙醇或质量浓度50～98％的乙醇水溶液洗脱树脂，洗脱液经浓缩和干燥，得到烟曲霉素粗提品。本发明提出的提取方法，避免了传统工艺中的多种溶剂萃取、反萃等工序，操作可靠性高且简便，生产过程安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护，是一种绿色环保的提取烟曲霉素的方法。

Description

一种烟曲霉素的提取方法

技术领域

本发明属于抗生素生产领域，具体涉及一种从发酵液中提取抗生素的方法。

背景技术

烟曲霉素(Fumagillin)由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的发酵培养液中分离得到具有多种活性的一种代谢产物。其结构式为：

这种物质具有抗生素活性，又有抑制血管生成作用，从而具有对肿瘤生长的治疗作用。此外，烟曲霉素的一系列衍生物还具有抗击疟原虫和孢子虫的作用。在养蜂业中烟曲霉素的是非常有效的治疗西方蜜蜂孢子虫病(Nosema apis)的药物，在美国和加拿大等国家已经使用有近60年的历史。近些年研究显示，烟曲霉素还是潜在减肥药物，是治疗肥胖的有效药物。作为一种具有多种活性的药物，烟曲霉素在未来的使用更加广泛。因此，建立简单有效的烟曲霉素的提取和净化方法，制备烟曲霉素纯品，对于该药物的深入研究和利用有着重要的意义。

由于烟曲霉素结构复杂，用有机合成的方法成本高，因此，目前烟曲霉素大多数从烟曲霉素的发酵液中提取和纯化获得。之前的专利和文献中主要使用液液萃取的方法来从发酵液中提取烟曲霉素，提取过程中大量使用二氯甲烷或氯仿，叔丁醇，丙酮和乙酸乙酯等有毒试剂，同时提取过程中大量的副产物比如高毒的胶霉毒素等需要经过重结晶等方法除去，步骤繁琐，不易控制。随着人们对环境保护和人体健康的认识，通过优化提取方法，使用低毒、低污染的方法来提取药物成为药物提纯的趋势。大孔树脂提取作为一种有效的提取方法，已经广泛的应用到活性物质和药物提取和纯化中。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单，宜于工业化生产的烟曲霉素提取方法。

实现本发明上述目的的技术方案为：

1、一种烟曲霉素的提取方法，包括步骤：

1)将烟曲霉素发酵液的pH值用盐酸、硫酸、磷酸中的一种调节为1～6.5，用非极性大孔树脂或弱极性大孔树脂吸附，所用大孔树脂的孔径为比表面积为100～1200m²/g，大孔树脂使用前用乙醇和水活化；

2)吸附后的树脂置于层析柱中，用质量浓度15～30％的乙醇水溶液清洗；

3)用无水乙醇或质量浓度50～98％的乙醇水溶液洗脱树脂，洗脱液经浓缩和干燥，得到烟曲霉素粗提品。

大孔树脂使用前的活化是用无水乙醇浸没树脂浸泡20～30h，再用3倍的水清洗。

作为本发明优选技术方案之一，所述步骤1)中，向烟曲霉素发酵液的pH值调节为1～6.0，加入大孔树脂，发酵液和大孔树脂的体积质量比为15～20mL：1g；；搅拌后过滤，过滤得到的树脂用水清洗。

或，所述步骤1)中，将烟曲霉素发酵液离心，分离出上清液，将上清液的pH值调节为1～6.0，活化后的树脂置于层析柱中，上清液以0.5～3倍床层体积/小时的速度流过层析柱。

其中，所述层析柱的高径比为1～10。

进一步地，所述大孔树脂的型号为D101，XAD-2，HP-20，SP825，SP850或SP700。

其中，所述步骤2)中乙醇水溶液流过层析柱的速度为0.5～3倍床层体积/小时。

其中，所述步骤3)中无水乙醇或乙醇水溶液洗脱树脂在层析柱中进行，无水乙醇或乙醇水溶液的体积为床层体积的2～4倍。

进一步地，所述的提取方法，还包括对烟曲霉素粗提品的二次纯化：烟曲霉素粗提品按照质量体积比40～50mg：1～2L用30％的乙醇水溶解，再次经过装填有大孔树脂的层析柱用无水乙醇或乙醇水溶液洗脱，洗脱液经避光浓缩和干燥，得到晶体；

晶体按照质量体积比40～50mg：0.1～0.5mL溶于丙酮，加入烟曲霉素粗提品质量的0.5～1倍的环己胺，反应10～15min后冷却，过滤、挥干丙酮。

其中，洗脱后的大孔树脂用90～100％乙醇清洗后重复使用。

本发明的技术方案具有如下优点：

本发明提出的提取方法，避免了传统工艺中的多种溶剂萃取、反萃等工序，操作可靠性高且简便，生产过程安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护，是一种绿色环保的提取烟曲霉素的方法。

附图说明

图1：实施例3产品的检测谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中，若无特别说明，所使用的方法均为本领域常规的方法。

实施例1弱极性和非极性大孔树脂的优化实验。

1)发酵和填充层析柱

烟曲霉(菌种购自中国科学院微生物研究所)接入50L发酵罐中发酵，在发酵42h后，通气12h，此时液体体积约30L。用盐酸调节pH至3.0，将发酵液在5000rpm离心10min后，得到上清液约28L。取SP850树脂(之前用无水乙醇活化24h)2kg，缓慢置于层析柱中(柱直径10cm，柱高50cm)，加完后，加入5L水平衡。

2)将样液通过带有滤纸的漏斗过滤到层析柱中，样液以2mL/min流过树脂，然后用分别用5L水和30％乙醇洗，流速控制在2～5mL/min，可以从流出液看出发酵液中的色素被清洗，当用30％乙醇水洗至4L时，已无明显有颜色液体流出，最后用5L 100％无水乙醇洗脱，

3)洗脱液避光浓缩，得到黄色固体，为粗提品。本实施例中，分别选择D101，XAD-2，HP-20，SP825，SP850，SP700来实验吸附和净化能力。

实验结果发现，这几类弱极性树脂对发酵液有脱色和吸附烟曲霉素的能力。但净化和获得的粗提品含量效果看，SP700(54.1mg)>SP825(52.8mg)>SP850(50.8mg)，这三种填料得到的粗提品都大于50mg，纯度大于81％，D101(41.2mg)，XAD-2(39.7mg)，HP-20(42.3mg)三种填料可以获得40mg左右，纯度为80.2％的粗提品。D101，XAD-2，HP-20三种树脂吸附和净化能力比SP树脂的差，但其价格相对便宜。如果生产成本允许可以选择比表面积大的SP系列树脂作为吸附和纯化的大孔树脂。为了降低成本一些普通的非极性的树脂，D101，XAD-2，HP-20也可以作为使用，为了提高产率和净化能力，其使用量应该略有增加。

根据本实施例结果，后续试验采用SP系列树脂进行。

实施例2树脂和发酵液体积比的选择：

选择SP 825树脂进行试验，以优化树脂和发酵液质量体积比。具体如下：分别取35mL发酵液于50mL离心管中，分别称取活化好的树脂10g，5g，4g，3g，2g，1g，0.5g，0g到离心管中，旋转震荡2h,进行静态吸附，静置，去除上层发酵液，用10mL 90％乙醇解析，用液相色谱测定。

原液中烟曲霉素的浓度为13.5mg/L，解析后通过液相色谱分析，折算成35mL体积，计算经不同量树脂吸附后的烟曲霉素浓度，10g为13.3mg/L，5g为13.4mg/L，4g为13.3mg/L，3g为13.1mg/L，2g为13.2mg/L，1g为11.2mg/L，0.5g为5.3mg/L。从结果比较来看当树脂(g)和发酵液(mL)质量体积比为1:17.5时，吸附已经达到最佳，也最经济。

实施例3

烟曲霉接入50L发酵罐中发酵，在发酵12h后，取SP825树脂(之前用无水乙醇和水活化好)2kg，边搅拌缓慢加入到发酵罐中，并用盐酸调节pH为3.5，树脂与发酵液形成悬浊液，搅拌通气吸附12h，体积约为35L，过滤得到树脂球。

用5L水洗后，将清洗后的树脂球装填到层析柱上，柱直径10cm，柱高100cm，用5L20％的乙醇水溶液以0.5倍/小时床层体积的流速清洗层析柱(在整个过程中不是匀速流过，以平均值计)然后用7.5L75％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，避光，在小于50度温度下，减压至小于50mL,置于玻璃表面皿中，避光自然挥干，得到浅黄色固体颗粒，称重约53mg,为烟曲霉素粗提品。

用标准品测定，其纯度为83.6％，经质谱检测，未检测到高毒副产物胶霉毒素。将得到的粗提品用甲醇溶解，经制备液相色谱进一步纯化，将得到的馏分冷冻干燥，得到黄色针状晶体，重量为41.3mg，经与标准品比对，其纯度为99.3％。与标准品纯度接近。满足标准品申报要求。所用树脂用95％乙醇清洗后，可以重复使用。典型的分析液相色谱和液相色谱飞行时间质谱图如图1。

图1烟曲霉素粗提品液相色谱-二极管阵列-飞行时间质谱分析色谱图。(A为粗提品液相色谱分析图，B为胶霉毒素准确质量数提取图，C为标样质谱分析图，D为标样液相色谱分析图,E为标样与样品的准确质量数二级质谱图)。

从图1可以看出，发酵过程中高毒的胶霉毒素在提取过程中有效的去除(在粗提品中未提取到胶霉毒素的准确质量数327.0468)。发酵得到的粗提品的保留时间，紫外光谱和二级质谱图与标样的质谱图高分匹配，说明得到黄色固体确认为烟曲霉素。

实施例4

烟曲霉接入50L发酵罐中发酵，在发酵42h后，通气12h，是液体体积将至约30L调节pH至3.0，将发酵液在5000rpm离心10min中，得到上清液约28L。取SP850树脂(之前用无水乙醇活化24h)2kg，缓慢置于层析柱中(柱直径10cm，柱高50cm)，加完后，加入5L水平衡。然后将样液通过带有滤纸的漏斗过滤到层析柱中，样液以0.5倍/小时床层体积的流速流过树脂，然后用分别用5L水和30％乙醇洗，流速控制在0.5～1倍床层体积/小时，可以从流出液看出发酵液中的色素被清洗，当用30％乙醇水洗至4L时，以无明显有颜色液体流出，最后用5L100％无水乙醇洗脱，洗脱液避光浓缩，得到黄色固体，称重约54mg。液相色谱测定纯度为81.2％。

将得到固体用1.5L 30％的乙醇水溶解，再次经过重新装填同等规格的层析柱，用5L水洗，流速控制在1.0倍床层体积/小时，2L 10％乙醇水洗，流速控制在1.0倍床层体积/小时，然后用6L 70％的无水乙醇洗脱，洗脱液减压蒸至1.0L，经冷冻干燥得到黄色针状晶体。称重为45mg,液相色谱测定其纯度为95.2％。

将上述45mg晶体溶于0.25mL的热丙酮中，然后缓慢加入32mg的环己胺，反应十分钟后冷却，过滤得到晶体，挥干丙酮，将得到50mg固体，溶于2L的蔗糖糖浆中，用于治疗蜜蜂孢子虫疾病。蜂场实验显示，得到的药物可以有效治疗蜂群孢子虫病。

所用树脂用95％乙醇清洗后，可以重复使用。

实施例5

烟曲霉接入500L发酵罐中发酵，在发酵12h后，取SP700树脂(之前用无水乙醇和水活化好)20kg，边搅拌缓慢加入到发酵罐中，并用盐酸调节pH为4.5，与发酵液形成悬浊液，搅拌通气吸附12h，此时总体积约为200L，过滤得到树脂球。

用50L水洗后，将清洗后的树脂球装填到层析柱上，柱直径20cm，柱高100cm，用50L30％的乙醇水溶液以2.0倍床层体积/小时的流速清洗层析柱，然后用75L 85％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，避光，在小于50℃下，减压至小于50mL，冷冻干燥，得到浅黄色固体颗粒，称重约5.7g,为烟曲霉素粗提品。用标准品测定，其纯度为84.3％，经质谱检测，未检测到高毒副产物胶霉毒素。检测到有烟曲霉素其他衍生物烟曲霉醇约占4.2％。

所用树脂用95％乙醇清洗后，可以重复使用。

虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种烟曲霉素的提取方法，包括步骤：

1)将烟曲霉素发酵液的pH值用盐酸、磷酸、硫酸中的一种调节为1～6.0，用弱极性或非极性大孔树脂吸附，所用大孔树脂的孔径为比表面积为100～1200m²/g，大孔树脂使用前用乙醇和水活化；所述大孔树脂的型号为D101，XAD-2，HP-20，SP825，SP850或SP700；

2)吸附后的树脂置于层析柱中，用质量浓度15～30％的乙醇水溶液清洗；

3)用无水乙醇或质量浓度50～98％的乙醇水溶液洗脱树脂，洗脱液经浓缩和干燥，得到烟曲霉素粗提品，无水乙醇或乙醇水溶液洗脱树脂在层析柱中进行，无水乙醇或乙醇水溶液的体积为床层体积的2～4倍。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中，将烟曲霉素发酵液的pH值调节为1～6.0，加入大孔树脂，发酵液和大孔树脂的体积质量比为15～20mL：1g；搅拌后过滤，过滤得到的树脂用水清洗。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中，将烟曲霉素发酵液离心，分离出上清液，将上清液的pH值调节为1～6.0，活化后的树脂置于层析柱中，上清液以0.5～3倍床层体积/小时的速度流过层析柱。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述层析柱的高径比为1～10。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中乙醇水溶液以0.5～3倍床层体积/小时的速度流过层析柱。

6.根据权利要求1～5任一所述的提取方法，其特征在于，还包括对烟曲霉素粗提品的通过复溶后，经重新装填的层析柱进行二次纯化：烟曲霉素粗提品按照质量体积比40～50mg：1～2L，用30％的乙醇水溶液溶解，再次经过装填有大孔树脂的层析柱用无水乙醇或乙醇水溶液洗脱，洗脱液经避光浓缩和干燥，得到晶体；

晶体按照质量体积比40～50mg：0.1～0.5mL溶于丙酮，加入烟曲霉素粗提品质量的0.5～1倍的环己胺，反应10～15min后冷却，过滤、挥干丙酮。