CN105611946A - 适用于细胞培养物的聚合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制造低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：i)使-用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第一共聚单体和-未接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第二共聚单体共聚，其中第一共聚单体与第二共聚单体之间的摩尔比为1∶500-1∶30，和ii)向通过步骤i)得到的共聚物中加入细胞粘附因子和间隔单元的反应物，其中所述间隔单元由通式A-L-B代表，其中所述联结基团和基团A被选择以反应且形成第一偶联，并且所述细胞粘附因子和基团B被选择以反应且形成第二偶联，其中第一偶联和第二偶联独立地选自由炔烃-叠氮化物偶联、二苯并环辛炔-叠氮化物偶联、氧杂降冰片二烯基-叠氮化物偶联、乙烯基砜-硫醇偶联、马来酰亚胺-硫醇偶联、甲基丙烯酸甲酯-硫醇偶联、醚偶联、硫醚偶联、生物素-链霉亲和素偶联、产生酰胺键的胺-羧酸偶联、产生酯键的醇-羧酸偶联和NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)-胺偶联组成的组，且其中基团L是线性链段，其主链中具有10-60个选自C、N、O和S的原子之间的键。

Description

适用于细胞培养物的聚合物
本发明涉及制备适用于细胞培养物的聚合物的方法。本发明还涉及细胞培养物用于制造前血管(prevascular)系统的用途。
迄今为止，细胞培养物凝胶材料可从天然来源中分离或者完全合成。凝胶例如胶原固有地产生片层结构，其不能单独形成复杂的3D网络。凝胶例如来源于EHS小鼠肉瘤细胞的那些凝胶比纯胶原更类似于在组织中发现的细胞外环境，并且还提供细胞可在其中生长和组装成复杂体系结构的三维环境。天然来源的凝胶剂难以充分表征并且需要密集的批次间分析以实现这种表征，生物来源的凝胶遭受固有的变异性、污染和病原体传递的风险以及过度的溢价。对于许多研究小组，额外的痕量污染例如固有地存在于生物来源材料中的不想要的生长因子是不能接受的实验干扰且对于体内使用而言是不能接受的。另一方面，合成来源的凝胶例如衍生自聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物的那些凝胶展示出低的细胞存活率和细胞分化能力，这需要额外的生物活性物例如糖皮质激素和转化生长因子β(TGF-β)的混合物。合成凝胶剂的使用在很大程度上除去了在生物凝胶剂中发现的自然变异，但同时也消除了天然凝胶的固有生物活性。消除生物变异性同时保留生物活性的能力是尚未完全实现的挑战。
收获在这些凝胶中形成的复杂生物系统的能力也仍然是一个挑战。传统上，必须通过使用胰蛋白酶从生物表面释放细胞或者将凝胶机械溶解或手动从结构表面除去。
上文展示的可凝胶化的(gelatable)结构在自然界中并不普遍且不能在体内以微创方式简单应用。存在能够通过冷却导管以微创方式应用的热响应性材料的一些实例，例如US2010/0215731A1中公开的那些。然而，这些材料遭受与上文所述相同的缺点，从而导致差的细胞存活率。
机械地，所有生物来源凝胶的性质由肽亚基的非共价相互作用决定。结果是孔径和机械强度相对固定。在合成得到的凝胶的情况下，机械性质和交联属性甚至更加固定。
WO2011/007012公开了一种水凝胶，其包含低聚(亚烷基二醇)官能化的聚异氰肽。聚异氰肽(polyisocyanopeptides)是通过利用低聚(亚烷基二醇)侧链使异氰肽官能化并随后使低聚-亚烷基二醇-官能化的异氰肽聚合来制备的。WO2011/007012建议使用水凝胶用于组织工程或神经元再生。
虽然已知的细胞培养物对于一些应用是令人满意的，但本领域中对可被用于大范围情景的细胞培养物的需求仍在增加。
本发明的一个目标是提供细胞培养物和用于细胞培养物的聚合物，其中上文提到的和/或本领域中的其它需求被满足。
根据一个方面，本发明提供了制造低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)使
-用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第一共聚单体和
-未接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第二共聚单体
共聚，
其中第一共聚单体与第二共聚单体之间的摩尔比为1∶500-1∶30，和
ii)向通过步骤i)得到的共聚物中加入细胞粘附因子和间隔单元的反应物，其中间隔单元由通式A-L-B代表，其中联结基团和基团A被选择以反应和形成第一偶联，并且细胞粘附因子和基团B被选择以反应和形成第二偶联，其中第一偶联和第二偶联独立地选自由炔烃-叠氮化物偶联、二苯并环辛炔-叠氮化物偶联、氧杂降冰片二烯基-叠氮化物偶联、乙烯基砜-硫醇偶联、马来酰亚胺-硫醇偶联、甲基丙烯酸甲酯-硫醇偶联、醚偶联、硫醚偶联、生物素-链霉亲和素(strepavidin)偶联、产生酰胺键的胺-羧酸、产生酯键的醇-羧酸偶联和NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)-胺偶联组成的组，且
其中基团L是线性链段，其主链中具有10-60个选自C、N、O和S的原子之间的键。
联结基团和基团A被选择以反应和形成第一偶联，所述第一偶联可以是以上列表中提到的任何偶联。例如，为了获得炔烃-叠氮化物偶联，联结基团可以是炔烃且基团A可以是叠氮化物，或者联结基团可以是叠氮化物且基团A可以是炔烃。以上列表中提到的偶联是本领域技术人员公知的且偶联的形成可在教科书中找到。例如，NH2-COOH偶联可通过EDC介导。
优选地，第一偶联是炔烃-叠氮化物偶联。
类似地，细胞粘附因子和基团B被选择以反应和形成第二偶联，所述第二偶联可以是以上列表中提到的任何偶联。优选地，第二偶联是NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)-胺偶联或者马来酰亚胺-硫醇偶联。这可以是NHS-酯与细胞粘附因子(多肽)的N端的偶联或者马来酰亚胺与细胞粘附因子(多肽)的末端硫醇的偶联。
基团L是具有连接反应基团A和B的线性链的区段。该区段由一系列选自C、N、O和S的原子形成。连接到基团A和B的主链中原子之间的键的数目为至少10个且至多60个。术语“主链”被理解为表示以最短距离连接基团A和B的链。连接到末端基团A和B的主链中原子之间的键的数目优选地为至少12个，更优选地至少15个。连接到末端基团A和B的主链中原子之间的键的数目优选地为至少50个，更优选地至少40个。
已发现：共聚物骨架和细胞粘附因子之间一定的最小距离是培养附着于细胞粘附因子的细胞所必需的。已发现所给出的至少10个键的距离是必要的，这通过存在根据本发明的间隔单元来提供。已发现低于10个键的长度不允许充分的细胞生长。
基团L的优选实例如下：
其中p为1-10，优选地为2-5，
其中q为1-9，优选地为2-5，
其中r为1-10，优选地为2-5。
当间隔单元包含这些类型的基团L时，能够保证特别稳定的细胞生长而不依赖于联结基团、细胞粘附因子、和基团A和B的类型和大小。
根据另一方面，本发明提供通过根据本发明的方法能够得到的低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽。
根据另一方面，本发明提供包含水凝胶的细胞培养物，所述水凝胶包含浓度为1.2-3.0mg/mL的低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽，其中通过以下步骤来制造所述共聚异氰肽：
i)使
-用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第一共聚单体和
-未接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第二共聚单体
共聚，
其中第一共聚单体与第二共聚单体之间的摩尔比为1∶500-1∶30，和
ii)向通过步骤i)得到的共聚物中加入细胞粘附因子和间隔单元的反应物，其中间隔单元由通式A-L-B代表，其中联结基团和基团A被选择以反应和形成第一偶联，且细胞粘附因子和基团B被选择以反应和形成第二偶联，其中第一偶联和第二偶联独立地选自由炔烃-叠氮化物偶联、二苯并环辛炔-叠氮化物偶联、氧杂降冰片二烯基-叠氮化物偶联、乙烯基砜-硫醇偶联、马来酰亚胺-硫醇偶联、甲基丙烯酸甲酯-硫醇偶联、醚偶联、硫醚偶联、生物素-链霉亲和素偶联、产生酰胺键的胺-羧酸、产生酯键的醇-羧酸偶联和NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)-胺偶联组成的组，且
其中基团L是线性链段，其主链中具有10-60个选自C、N、O和S的原子之间的键。
发明人已出乎意料地发现：仅在特定浓度的细胞粘附因子下能实现最佳的细胞生长，其中所述细胞粘附因子被置于距离构建水凝胶的三维结构的聚合物骨架有一定距离。
如果细胞粘附因子的浓度过低，则细胞不会充分粘附于水凝胶，这反过来不允许细胞被培养。如果细胞粘附因子的浓度过高，则细胞在凝胶中不生长。
第一共聚单体是用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽。联结基团的优选实例包括叠氮化物(例如，氧杂降冰片二烯基-叠氮化物)、炔烃(例如，二苯并环辛炔)、硫醇、乙烯基砜、马来酰亚胺、甲基丙烯酸甲酯、醚、生物素、链霉亲和素、NH2、COOH、OH、NHS-酯。特别优选的是叠氮化物。
式(I)中显示了第一共聚单体的一个实例，其中联结基团是叠氮化物。
第二共聚单体是未用联结基团或其它基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽，即异氰肽的侧链由低聚(亚烷基二醇)组成。式(II)中显示了第二共聚单体的一个实例。
第一共聚单体和第二共聚单体在步骤(i)中共聚。获得了低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽，其包含以第一共聚单体和第二共聚单体的比例包含该聚合物的联结基团。
细胞粘附因子通过间隔单元粘附于共聚物。首先制造细胞粘附因子和间隔单元的反应物。式(III)中显示了间隔单元的一个实例
其中p为1-10。
在这个实例中，基团A是
基团B是
基团L是
式(IV)中显示了细胞粘附因子的一个实例，其是由甘氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸和丝氨酸组成的五肽(GRGDS)。
式(V)中显示了式(III)的间隔单元和式(IV)的细胞粘附因子的反应物。
在本发明的步骤ii)中，使间隔单元和细胞粘附因子的反应物(例如，式(V))与通过步骤i)获得的共聚物反应。联结基团与对应于间隔单元的那部分反应物反应。因此，最终的共聚异氰肽包含以第一共聚单体和第二共聚单体的比例沿着该聚合物的细胞粘附单元。最终的共聚异氰肽的一个实例由式(VI)代表：
其中m：n是第一共聚单体和第二共聚单体的配比。
通过使用间隔单元，细胞粘附单元被置于距离异氰肽聚合物骨架一定距离。
水凝胶由通过利用合适的细胞培养基胶凝得到的共聚物制成。水凝胶是三维水凝胶。水凝胶中的聚合物浓度为1.2-3.0mg/mL。如果水凝胶中的聚合物浓度过低，则细胞不会粘附于水凝胶。如果水凝胶中的聚合物浓度过高，则水凝胶变得太过坚硬从而使细胞不能在凝胶中移动和生长。
优选地，水凝胶在35℃下通过板-板流变学实验测量的弹性模量为10-5000Pa、优选地100-1000Pa。这允许细胞移动和生长以形成细胞网络和3D结构，如例如前血管系统。
本发明提供了水凝胶细胞培养物，所述水凝胶具有选择性的刚度和温度响应性以及可控的空间分布和细胞粘附点的密度。共聚导致细胞粘附基团以第一共聚单体和第二共聚单体的比例沿着聚合物统计分布。第一共聚单体和第二共聚单体的配比可被调节以控制沿着聚异氰肽的聚合物骨架的细胞粘附因子之间的距离。沿着聚合物骨架的细胞粘附因子之间的平均距离可以例如为1.1-60nm。细胞粘附因子之间的这种距离范围适合将待被培养的细胞锚固到细胞培养物上。更优选地，细胞粘附因子之间的平均距离为8-30nm。
水凝胶可包含各种细胞培养基，且细胞培养物已显示出介导复杂生物支架的形成。
根据本发明的细胞培养物极其有益，因为培养的细胞易于收集。细胞培养物中所使用的水凝胶具有热响应特征，即，它通过被冷却至低于胶凝温度的温度而变成液体。因此，通过仅冷却细胞培养物即可收集培养的细胞。水凝胶变成液体之后，可从液体中收集细胞而不损害培养的细胞。
人们认为细胞粘附因子不能直接粘附于低聚-亚烷基二醇官能化的异氰肽以保持充分的结合。这通过使用根据本发明的间隔物而被解决。根据本发明所使用的间隔单元将细胞粘附因子与异氰肽的聚合物骨架分开以消除空间粘连(blocking)。间隔物使细胞粘附因子的移动与聚合物骨架解偶联，使移动解偶联允许细胞粘附因子有效进入整合素结合囊(pocket)。间隔物应该有极性、水溶性、生物相容性且不与整合素的活性位点结合，但可辅助结合。第一单体可通过首先制备第二单体，然后用联结基团接枝来制造。或者，可通过不同的途径来制造第一单体和第二单体。
第一共聚单体和第二共聚单体之间的摩尔比在1∶500和1∶30之间。优选地，第一共聚单体和第二共聚单体之间的摩尔比在1∶400-1∶35、1∶300-1∶40或1∶200-1∶45之间。第一共聚单体和第二共聚单体之间的这种配比范围导致沿着聚合物骨架的细胞粘附单元之间8-30nm的平均距离。
优选地，低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽的胶凝温度为18-40℃。胶凝温度不依赖于水凝胶中的聚合物浓度。相反，它取决于聚合物侧链中低聚亚烷基二醇单元的数目。
以下给出本发明进一步的细节。
共聚单体
用低聚(亚烷基二醇)单元使异氰肽官能化
单体优选地基于在C端被期望的低聚(亚烷基二醇)链取代的二-、三-、四-或更多肽基序。所述链可以基于线性、支化或树枝化的低聚(亚烷基氧化物)。优选地，所述链是线性的且由乙二醇组成。
肽段可具有不同的组成，这是通过天然或非天然和扩展的氨基酸或其混合物的序列确定的。
单体衍生自适当的低聚(亚烷基二醇)片段。使用多步骤肽偶联策略来相继引入期望的氨基酸。引入期望的肽序列之后，利用适当的甲酰化方法使肽段的N端甲酰化。这种甲酰化可包括用甲酰基盐、甲酸或其它甲酰化剂处理产物。
甲酰化策略的一些实例利用甲酸盐(例如，甲酸钠或甲酸钾)、烷基甲酸酯(例如，甲酸甲酯、甲酸乙酯或甲酸丙酯)、甲酸、三氯乙醛和衍生物。然后，通过用合适的脱水剂处理甲酰胺来形成异腈。脱水策略的实例使用双光气。还可以使用的脱水剂的一些实例是光气和衍生物(双光气、三光气)、碳化二酰亚胺、甲苯磺酰氯、三氯氧磷、三苯基膦/四氯化碳[M.B.Smith和J.March″March′sadvancedorganicchemistry″第五版，Wiley&Son编，2001，NewYork，美国，第1350-1351页和其中的参考文献]。
侧链(亚烷基二醇)
合适的亚烷基二醇的实例是亚乙基-、亚丙基-、亚丁基-或亚戊基二醇。优选地，亚烷基二醇是乙二醇。
有益的低聚乙二醇单元如下文所示。一般而言，术语“低聚”是指数目＜10。
优选地，聚合之后，用至少3个乙二醇单元使异氰肽官能化以产生水溶性材料。
本发明的第二共聚单体是如上所述的低聚(亚烷基二醇)异氰肽，未进一步接枝。
第一共聚单体可由具有相同数目的亚烷基二醇单元的异氰肽组成或者可以是具有不同数目的亚烷基二醇单元的异氰肽的混合物。类似地，第二共聚单体可由具有相同数目的亚烷基二醇单元的异氰肽组成或者可以是具有不同数目的亚烷基二醇单元的异氰肽的混合物。
第一共聚单体和第二共聚单体是低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽，即，异氰肽上亚烷基二醇单元的数目为1-10。优选地，第一共聚单体和第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值最小为3且最大为4。
第一共聚单体和第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值通常通过使用具有不同数目的亚烷基二醇单元的异氰肽的混合物作为第二共聚单体来调节。在优选的实施方式中，第一共聚单体是具有3个亚烷基二醇单元的异氰肽且第二共聚单体是具有3个亚烷基二醇单元的异氰肽和具有4个亚烷基二醇单元的异氰肽的混合物。
第一共聚单体和第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值可以为3。通常获得15-25℃的胶凝温度。第一共聚单体和第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值可以大于3且最大为3.5。通常获得18-35℃的胶凝温度。第一共聚单体和第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值可以大于3.5且最大为5。通常获得25-50℃的胶凝温度。
优选地，低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽在35℃的温度下通过流变学实验测量的弹性模量为10-5000Pa、优选地100-1000Pa。当第一共聚单体和第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值最小为3且最大为5时，水凝胶具有这样的刚度。
聚合
将用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)异氰肽单体(第一共聚单体)和未用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)异氰肽单体(第二共聚单体)混合，随后使其共聚。
共聚优选地在非极性溶剂的存在下进行。合适的非极性溶剂可选自由饱和烃溶剂和芳族烃溶剂或其混合物组成的组。非极性溶剂的实例是戊烷、己烷、2-甲基丁烷、2-甲基己烷、环己烷和甲苯、苯、二甲苯或其混合物。优选地，在聚合中使用甲苯。对于低聚(亚烷基二醇)部分包含至少3个乙二醇单元的低聚(亚烷基二醇)异氰肽的聚合方法，优选甲苯。
优选地，聚合在催化剂的存在下进行。催化剂优选地是镍(II)盐。Ni(II)盐的实例是卤化镍(II)(例如，氯化镍(II))、高氯酸镍(II)或四-(叔丁基异腈)高氯酸镍(II)。可以使用其它复合物和镍盐，条件是：它们可溶于聚合介质中或最初溶解在可与聚合介质混溶的恰当溶剂中。描述了可被用于使低聚(亚烷基二醇)异氰肽聚合的一些催化体系的一般参考可在SuginomeM.；ltoY；AdvPolymSC12004，171，77-136；NolteR.J.M.；Chem.Soc.Rev.1994，23(1)，11-19)]中找到。
优选地，单体浓度被选择为高于30mmol/L且催化剂/单体比例被选择为1/100-1/10000。降低镍(II)的量(催化剂/单体比例低于1/1000)允许制备展示出高度聚合的材料[平均DP＞500]，这对于随后应用聚合物作为大-水凝胶因子是期望的。
在典型实施例中，将单体在非极性有机溶剂或溶剂混合物中的毫摩溶液加入到溶解在极性溶剂中的镍(II)催化剂中，其中催化剂与单体的摩尔比为1∶50至1∶100000。在密闭环境中剧烈搅拌混合物2-24小时。完成之后，蒸发反应混合物并使粗产物溶解在有机溶剂中并在二乙醚或相似的不相容有机溶剂中沉淀，从而产生期望的产物。
将间隔单元和细胞粘附因子的反应物接枝到联结基团
间隔单元
末端基团A和B被优选地选择以至于无需去保护或激活步骤即可合成随后的化合物。
间隔单元的基团A的优选实例包括叠氮化物(例如，氧杂降冰片二烯基-叠氮化物)、炔烃(例如，二苯并环辛炔)、硫醇、乙烯基砜、马来酰亚胺、甲基丙烯酸甲酯、醚、生物素、链霉亲和素、NH2、COOH、OH、NHS-酯。特别优选的是炔烃。
间隔单元的基团B的优选实例包括叠氮化物(例如，氧杂降冰片二烯基-叠氮化物)、炔烃(例如，二苯并环辛炔)、硫醇、乙烯基砜、马来酰亚胺、甲基丙烯酸甲酯、醚、生物素、链霉亲和素、NH2、COOH、OH、NHS-酯。特别优选的是NHS-酯或马来酰亚胺。
优选地，间隔单元的基团A由式(VII)代表：
其中：
n为0-8；
R3选自由[(L)p-Q]、氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组，烷基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基独立地任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和硅烷基组成的组，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组，其中硅烷基由式(R4)3Si-代表，其中R4独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷氧基组成的组，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组；
R1独立地选自由氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组；且
R2独立地选自由卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷芳基和C1-C12芳烷基组成的组，其中R6如上文所限定，且其中烷基、芳基、烷芳基和芳烷基任选地被取代。
优选地，n＝0。
优选地，R1是氢。
优选地，R3是氢。
优选地，间隔单元的基团B由式(VIII)代表：
优选地，间隔单元包含式(VII)的基团A和式(VIII)的基团B。
合适的间隔单元的实例包括式(IX)所代表的化合物：
其中R1、R2、R3和n如上文所限定，且
L优选地选自式(X-1)、(X-2)、(X-3)所代表的基团：
其中p为1-10，优选地为2-5，
其中q为1-9，优选地为2-5，
其中r为1-10，优选地为2-5。
优选地，间隔单元由式(XI)代表，
其中p为1-10，优选地为2-5，更优选地为2。
合适间隔单元的其它实例包括WO2011/136645中所述的稠环辛炔化合物，其通过引用并入本文。因此，可能的间隔单元选自式(IIa)、(IIb)或(IIc)的化合物：
其中：
n为0-8；
p为0或1；
R3选自由[(L)p-Q]、氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组，烷基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基独立地任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和硅烷基组成的组，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组，其中硅烷基由式(R4)3Si-代表，其中R4独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷氧基组成的组，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组；
L是联结基团，其选自线性或支化的C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C2-C24亚炔基、C3-C24环亚烷基、C5-C24环亚烯基、C8-C24环亚炔基、C7-C24烷基(杂)亚芳基、C7-C24(杂)芳基亚烷基、C8-C24(杂)芳基亚烯基、C9-C24(杂)芳基亚炔基，亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、(杂)芳基亚烯基和(杂)芳基亚炔基任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C8-C12环炔基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和硅烷基组成的组，其中甲硅烷基可由式(R4)3Si-代表，其中R4如上文所限定；
Q是选自由氢、卤素、R6、-CH＝C(R6)2、-C≡CR6、-[C(R6)2C(R6)2O]q-R6(其中q为1-200)、-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-S(O)R6、-S(O)2R6、-S(O)OR6、-S(O)2OR6、-S(O)N(R6)2、-S(O)2N(R6)2、-OS(O)R6、-OS(O)2R6、-OS(O)OR6、-OS(O)2OR6、-P(O)(R6)(OR6)、-P(O)(OR6)2、-OP(O)(OR6)2、-Si(R6)3、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2组成的组的官能团，其中X是氧或硫且其中R6独立地选自由氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组；且
R1独立地选自由氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组；且
R2独立地选自由卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷芳基和C1-C12芳烷基组成的组，其中R6如上文所限定，且其中烷基、芳基、烷芳基和芳烷基任选地被取代。
细胞粘附因子
细胞粘附因子支持细胞与凝胶结合。细胞粘附因子优选地是氨基酸序列。可被有益地用于本发明中的氨基酸的实例是N-受保护的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。合适的氨基酸序列包括肽例如RGD、GRGDS、IKVAV、KQAGDV和GRGDSP。细胞粘附因子也可以是生长因子例如VGEF和BFGF。细胞粘附因子也可以是糖蛋白或黏蛋白。
间隔单元和细胞粘附因子发生反应。反应物可通过无铜SPAAC反应被接枝到共聚物的联结基团。
聚合物的一般性质
本发明中使用的聚异氰肽展示出轮廓分明的结构，例如完美的低聚(亚烷基二醇)包被的β-片层螺旋结构，根据图1。这种结构包含螺旋的多(亚胺)核，其中实质上每个氮被肽悬挂物取代。由于多(亚胺)骨架的伪41螺旋对称，所以每个接枝到第n个氮上的悬挂物和接枝到第n+4位的对应悬挂物一起参与分子内β-片层状包装。肽段进一步用形成结构外壳的低聚(亚烷基二醇)取代基装饰。所产生材料的水溶性与适当低聚(亚烷基二醇)取代基的选择有直接关系。最后，聚合物链的螺旋感官由与亚胺基团相连的氨基酸的手性决定。
在获得的聚合物中，本发明中使用的聚异氰肽具有最少或者没有结构缺陷。术语“最少”应为解释为：多于96％的合适侧链被正确地连接在聚合物骨架上，例如97％、98％、99％、99.5％或甚至100％。
换言之，由于官能化单体的直接聚合，所以在所产生材料中关于侧链的接枝密度的结构缺陷的出现最少。
本发明中使用的聚异氰肽可以是均一、稳定、水溶性的螺旋聚合物，其高度聚合([DP]＞500)和高持续长度。
本发明提供均匀凝胶，其包含低聚亚烷基官能化的聚异氰肽；本发明还提供不均匀凝胶，其包含具有不同数目的乙二醇单元的低聚亚烷基官能化的聚异氰肽的混合物。
获得的低聚亚烷基官能化的聚异氰肽能够形成具有可调的胶凝温度的强热可逆性凝胶。为了物理地使水凝胶化，根据本发明的多低聚(亚烷基二醇)异氰肽的聚合程度[DP]优选地＞500。
水凝胶由通过利用合适的细胞培养基胶凝得到的共聚物制成。水凝胶是三维水凝胶。水凝胶中的聚合物浓度为1.2-3.0mg/mL。如果水凝胶中的聚合物浓度过低，则水凝胶太过脆弱而不能支持细胞3D网络的生长。如果水凝胶中的聚合物浓度过高，则水凝胶变得太过坚硬从而使细胞不能在凝胶中移动和生长。
优选地，水凝胶在35℃下通过流变学实验测量的弹性模量为10-5000Pa。这允许细胞移动和生长以形成细胞网络和3D结构，如例如前血管系统。
由本发明中使用的低聚(亚烷基二醇)聚异氰肽获得的水凝胶与大部分以前报道的聚合物基凝胶的差异在于：胶凝后形成的网络的高度结构化属性。网络由横向聚集的聚合物链的扭曲束组成。这种排列类似于低分子量水凝胶因子胶凝后形成的纤维状网络结构。人们推测这种现象与聚异氰肽的高持久长度有关，从而有助于原始模式的结合。这种结合由低聚(亚烷基二醇)侧链亲水性的温度诱导调节(其是完美的可逆现象)引起，从而导致低聚(亚烷基二醇)官能化的聚异氰肽的完全热可逆聚集/溶解。
物理聚合物水凝胶的经典描述包括：在浓缩溶液中形成缠结网络链，由于旋节线分离而形成渗透网络、形成微晶、和形成胶束网络或看起来与低聚(亚烷基二醇)聚异氰肽的假定结合模式不同的层状结构。
由低聚(亚烷基二醇)聚异氰肽产生的水凝胶源自直径约5nm的聚合物纤维横向结合为形成聚合物水凝胶网络的基础的较大扭曲束。这产生高孔隙度的结构，其孔径可一直到直径为50nm。
由于乙二醇侧链的热敏性，本发明中使用的聚合物展示出清楚的LCST转变。对于给定的低聚(亚烷基二醇)聚异氰肽，可通过改变溶液的离子强度(盐效应)或更常通过加入能够改变聚合物的整体溶解状态的任何化合物来改变该温度。材料的LCST可通过作用于低聚(亚烷基二醇)骨架(即，其构象)来进一步调节，其中使用酸或能够导致骨架螺旋构象变化的任何化合物。
调节聚合物的LCST的另一种方法是使带有不同低聚(亚烷基二醇)侧链的单体共聚。例如，不同比例的三-和四(乙二醇)异氰二丙氨酸的混合物的聚合允许将所产生共聚物在mQ水中的胶凝温度调节为22℃-60℃。
已发现：聚合物链长影响胶凝。聚合度较低的链强烈倾向于沉淀而非形成凝胶。人们预计这是对坚硬或半柔性聚合物的一般影响，其中亲水性可发生变化而不改变链的一般结构(即，在刚性结构中，链不会瓦解，反而与其它链横向聚集以形成扩展纤维)。
已观察到聚合物长度的另一个影响与所产生凝胶的光学性质有关。已发现：由聚合度较低的链制成的水凝胶倾向于混浊或不透明。增加平均聚合度导致水凝胶的不透明度降低，从而最终产生完全光学透明的材料。
可在一定程度上调节胶凝温度，其中在25℃下可能形成结构稳定的凝胶，从而产生新的仿生基质，其可被用于封装酶或细胞并在体外保护它们的活性。
本发明中使用的聚合物显示出具有一些有趣和有益的性质。由于聚合物的长度和刚度，在一些情况下，凝胶由99.00-99.98％的水组成。这表示：产生大体积仅需要极少的材料。单根聚合物线显示出直径为约4nm且分子量为2500000Da。多分散指数(PDI)为1.6且平均链长在500nm-2μm之间变化。聚合物显示出相当坚硬，其持续长度为70-90nm。根据肽段手性，还可以获得左手和右手螺旋(光学活性材料)。我们还能够产生轮廓分明的纤维网络，其孔径由聚合物浓度控制，甚至达到100-250nm。还可以在链中引入高效反应性的侧基。因此，聚合物可被用作生物分子的支架。我们发现，孔隙度尺寸由浓度控制。
生物分子的实例有生物制品、蛋白质、糖蛋白、肽、糖、碳水化合物、脂蛋白、脂质、糖脂、二氧化硅、药物、核酸、DNA、RNA、微生物、营养物、水解物、多糖、单糖、重组肽、黏蛋白、酶、生物有机化合物、重组生物分子、抗体、激素、生长因子、受体、造影剂、细胞因子、及其片段和修饰。
细胞培养物
根据本发明的细胞培养物包含如上所述的水凝胶。细胞培养物是三维多孔支架。
本发明还提供制造根据本发明的细胞培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽，
b)将低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽与细胞培养基混合以获得水凝胶。
原则上，可利用适合培养(动物)细胞的任何类型的细胞培养基来制造细胞培养物。合适的细胞培养基支持本发明的方法中使用的细胞的生长和分化。
选择细胞培养基和细胞培养条件的指南众所周知，例如在Freshney，R.I.Cultureofanimalcells(基本技术手册)，2000第4版，Wiley-Liss的第8章和第9章以及Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&Tissueculture：LaboratoryProcedures1993，JohnWiley&Sons.中提供。
一般而言，(哺乳动物)细胞的细胞培养基包含溶解在缓冲生理盐水溶液中的盐、氨基酸、维生素、脂质、清洁剂、缓冲剂、生长因子、激素、细胞因子、微量元素、碳水化合物和其它有机营养物。盐的实例包括镁盐，例如MgCl2.6H2O、MgSO4和MgSO4.7H2O；铁盐，例如FeSO4.7H2O；钾盐，例如KH2PO4，KCl；钠盐，例如NaH2PO4、Na2HPO4；和钙盐，例如CaCl2.2H2O。氨基酸的实例是所有20种已知的蛋白氨基酸，例如组氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸。维生素的实例包括：抗坏血酸、生物素、氯化胆碱、肌醇、D-泛酸盐(酯)、核黄素。脂质的实例包括：脂肪酸，例如亚油酸和油酸；大豆蛋白胨和乙醇胺。清洁剂的实例包括Tween80和PluronicF68。缓冲剂的实例是HEPES。生长因子/激素/细胞因子的实例包括IGF、皮质醇和(重组)胰岛素。微量元素的实例是本领域技术人员已知的，其包括Zn、Mg和Se。碳水化合物的实例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和丙酮酸盐(酯)。
可用生长因子、代谢物等补充培养基。
合适培养基的实例包括充分补充Getal牛血清、皮质醇、hFGF-B、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸hEGF和GA-1000的内皮生长培养基(EGM-2，Lonza，Walkersville，美国)以及含有包括胎牛血清、平滑肌细胞生长补充物和青霉素/链霉素的补充物的平滑肌细胞培养基(SMCM，ScienCell，Carlsbad，美国)。
培养细胞的最佳条件可由本领域技术人员容易地确定。例如，原则上，细胞培养基的pH、温度、溶氧浓度和渗透性并不关键，其取决于所选细胞的类型。优选地，pH、温度、溶氧浓度和渗透性被选择为使得这些条件对于细胞的生长和生产力是最佳的。本领域技术人员知道如何找到最佳的pH、温度、溶氧浓度和渗透性。通常，最佳pH为6.6-7.6，最佳温度为30-39℃，例如36-38℃，优选地约37℃；最佳渗透性为260-400mOsm/kg。
本发明还提供培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供根据本发明的细胞培养物，
b)在低于水凝胶的胶凝温度的温度下向细胞培养物中加入细胞，和
c)培养细胞。
根据一个方面，本发明提供一种细胞培养物，其包含含有低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽的水凝胶，以及内皮细胞和平滑肌细胞中的至少一种。
细胞优选地是共同培养的内皮细胞和平滑肌细胞。细胞浓度可以是例如2000个细胞/mL至1000000个细胞/mL。从而可以获得3D结构，如例如血管系统。
本发明还提供根据本发明的细胞培养物用于制造前血管系统的用途。
虽然为了阐释的目的已详细地描述了本发明，但应该理解，这种细节仅用于该目的且本领域技术人员可在对其进行改变而不会脱离权利要求中所限定的本发明的精神和范围。
还注意到，本发明涉及本文所述特征的所有可能组合，特别优选的是权利要求中出现的那些特征组合。
还注意到，术语“包含”、“包括”不排除其它要素的存在。然而，还应该理解，对包含某些组分的产品的描述也公开了由这些组分组成的产品。类似地，还应该理解，对包含某些步骤的方法的描述也公开了由这些步骤组成的方法。
图1阐释了基于二丙氨酸单元(上部中间)的螺旋形低聚-亚烷基官能化的聚异氰肽的示意图。通过在螺旋内发展的位于侧链的堆叠酰胺键之间的氢键网络(下部中间)使骨架折叠稳定化。如通过AFM所显示(右侧)，这种二级结构产生非常坚硬的链。
图2是显示第一单体的一种实例的制备途径的一种实例的方案。
图3是显示第二单体的一种实例的制备途径的一种实例的方案。
实验
材料：通过钠蒸馏甲苯。通过五氧化二磷蒸馏二氯甲烷。使用N-甲基吗啉之前，新近通过钠对其进行蒸馏。利用MiliporeMiliQ系统纯化水(mQ水，18.2MΩ)。所有其它化学品被原样使用。使用由Baker提供的硅胶(0.060-0.200mm)进行柱色谱法。在获自Merck的涂有二氧化硅60F254的玻璃上进行薄层色谱(TLC)分析并利用茚三酮或碱性KMnO4水溶液使化合物显现。使用之前，将所有玻璃器具浸在0.5MNaOH中。
实施例1
(1)制备共聚物
(1.1)制备第一共聚单体
根据图2的方案合成用联结基团接枝的第一共聚单体。
1.1.1合成2-(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基4-甲苯磺酸酯(S1)
将四乙二醇(28.5mL，164.3mmol)溶解在50mL吡啶中。随后将溶液冷却至0℃同时搅拌。向溶液中鼓入氩气持续15分钟。向搅拌的溶液中分批加入甲苯磺酰氯(21.93g，115mmol)。在室温下进一步搅拌混合物12小时。用50mL10％的柠檬酸稀释反应混合物。在250mL氯仿中萃取混合物3次。通过无水Na2SO4干燥合并的有机层、然后过滤并在真空下蒸馏。利用柱色谱法(SiO2，0.060-0.200mm；乙酸乙酯作为洗脱液)纯化产生的黄色油，从而产生了作为浅黄色油的S1(11.69g，33.6mmol，29％)；Rf＝0.4(乙酸乙酯)。FT-IR(cm-1，ATR)3442(O-H)，2870(C-H)，1597(N-H)，1453(C-H)，1352(S＝O)，1175(S＝O)，1096(C-O)；1HNMRδH(300MHz；CDCl3；Me4Si)7.80(dd，J＝7.81Hz，2H，-CH Ar-)，7.33(d，J＝7.35Hz，2H，-CH Ar-S)，4.17(m，2H，O-CH 2-CH2-)，3.65(m，16H，-CH 2-)，2.45(s，3H，-CH 3)；13CNMRδC(75MHz；CDCl3；Me4Si)21.16(1C，CCH3)，61.0(1C，COH)，68.13(1C，COS)，69.0(1C，OCH2)，70.0，70.1，70.1，70.2(4C，OCH2)，70.8，72.0(2C，OCH2)，127.5(2C，CHCCH)，129.5(2C，CHCCH)，139.7(1C，CCH3)，144.5(1C，CHCS)。
1.1.2合成(R)-2-(2-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸酯(S2)
将化合物S1(5.23g，15.01mmol)、N-Boc-(L)-丙氨酸(2.86g，15.01mmol)和DMAP(0.198g，1.65mmol)溶解在25mL新近蒸馏的CH2Cl2中并冷却至0℃同时搅拌。分批加入DCC(3.12g，15.01mmol)。混合物变黄并在0℃下搅拌1小时，随后在室温下搅拌3小时。通过过滤除去沉淀的二环己基脲并用乙酸乙酯(3x20mL)洗涤。在真空下浓缩有机层。利用柱色谱法(SiO2，0.060-0.200mm；1％MeOH/CH2Cl2作为洗脱液)纯化粗产物，从而产生了作为浅橙色油的S2(5.49g，11.4mmol，76％)；Rf＝0.4(10％MeOH/CH2Cl2)。FT-IR(cm-1，ATR)2924(C-H)，1745(C＝O酯)，1712(C＝O酰胺)，1597(N-H)，1452(C-H)，1352(S＝O)，1173(S＝O)，1120(C-O)；1HNMRδH(300MHz；CDCl3；Me4Si)7.79(d，J＝8.4Hz，2H，-CH Ar-)，7.33(d，J＝8.1Hz，2H，-CH Ar-)，5.02(s，1H，-NH-)，4.28(m，3H，-CH(CH3)-，COOCH 2-)，4.15(m，2H，O-CH 2-CH2-)，3.69(m，14H，O-CH 2-CH2-)，2.44(s，3H，-CH 3)，1.44(s，9H，-OC(CH 3)3)，1.37(d，J＝7.2Hz，3H，-CH(CH 3)-)；13CNMRδC(75MHz；CDCl3；Me4Si)18.8(1C，CHCH3)，21.7(1C，CCH3)，28.4(3C，C(CH3)3)，49.4(1C，O(C＝O)CHNH)，64.5(1C，Boc-OCH2)，68.9(2C，OCH2)，69.4(1C，OCH2)，70.7(4C，OCH2)，80.3(1C，C(CH3)3)，128.2(2C，CHCCH)，130.0(2C，CHCCH)，145.0(1C，CCH3)，155.4(1C，CHCS)，173.6(1C，CH(C＝O)NH)，176.7(1C，CH(C＝O)O)；MS(ESI)m/z[M+Na]+计算出为542.2；发现为542.2。
1.1.3合成(R)-2-(2-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酰胺基)丙酸酯(S3)
将化合物S2(5.94g，11.4mmol)溶解在60mLHCl饱和的乙酸乙酯中并在室温下搅拌2小时。在真空下蒸发溶剂并通过加入30mLCH2Cl2和1mL正-BuOH以及随后蒸发来除去过量HCl。通过利用3×30mLCH2Cl2共沸蒸馏来除去残余的正-BuOH。将产生的S2的HCl盐、N-叔丁氧羰基-(D)-丙氨酸(2.14g，11.4mmol)和N-羟基苯并三唑一水化物(1.74g，11.4mmol)溶解在40mL新近蒸馏的CH2Cl2中。逐滴加入DIPEA(2mL，11.4mmol)并在室温下搅拌混合物直至所有物质均溶解。将溶液冷却至0℃并分部分加入DCC(2.35g，11.4mmol)。形成了白色沉淀物，在0℃下搅拌混合物1小时随后在室温下搅拌混合物3小时。滤出沉淀物，然后用乙酸乙酯(3x30mL)洗涤并在真空下蒸发溶剂。利用柱色谱法(SiO2，0.060-0.200mm；2％MeOH/CH2Cl2作为洗脱液)纯化粗产物，从而产生了作为浅黄色油的S3(3.37g，5.7mmol，52％)；Rf＝0.3(10％MeOH/CH2Cl2)。FT-IR(cm-1，ATR)2876(C-H)，1740(C＝O酯)，1718(C＝O酰胺)，1667(N-H)，1522(N-H)，1452(C-H)，1365(S＝O)，1161(S＝O)，1105(C-O)；1HNMRδH(300MHz；CDCl3；Me4Si)7.80(d，J＝8.4，2H，-CH Ar-C-S)，7.36(d，J＝8.1，2H，-CH Ar-)，6.91(s，1H，-NH)，5.00(s，1H，-NH)，4.58(m，1H，-NHCH(CH3)-)，4.28(m，2H，-COOCH 2-)，4.14(m，2H，O-CH 2-CH2-)，3.61(m，12H，-C(O)OCH2CH 2O(CH 2CH2O)3-)，2.45(s，3H，-CH 3)，1.45(s，9H，-OC(CH 3)3)，1.40(d，J＝7.2，3H，-CH(CH 3)-)，1.35(d，J＝7.2，3H，-CH(CH 3)-)；13CNMRδC(75MHz；CDCl3；Me4Si)18.2(2C，CHCH3)，21.7(1C，CCH3)，28.4(3C，C(CH3)3)，47.2(1C，NCH)，50.0(1C，NCH)，64.5(1C，Boc-OCH2)，68.7(2C，OCH2)，69.3(1C，OCH2)，70.6(4C，OCH2)，80.2(1C，C(CH3)3)，128.0(2C，CHCCH)，129.9(2C，CHCCH)，133.1(1CCCH3)，144.9(1C，CHCS)，172.7(2C，C＝O)；MS(ESI)m/z[M+Na]+计算出为613.2；发现为613.1。
1.1.4合成(R)-2-(2-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-((S)-2-甲酰胺丙酰胺基)丙酸酯(S4)
遵循与关于化合物S2所述相同的程序使化合物S3(1.70g，2.85mmol)去保护，然后不进一步纯化便使用。将粗产物溶解在25mL甲酸乙酯中。加入甲酸钠(0.97g，14.25mmol)并在66℃下加热混合物8小时。将混合物冷却至室温并滤出固体。在真空下蒸发溶剂。利用柱色谱法(SiO2，0.060-0.200mm；4％MeOH/CH2Cl2作为洗脱液)纯化粗产物，从而产生了作为浅黄色油的S4(0.79g，1.52mmol，54％)；Rf＝0.3(10％MeOH/CH2Cl2)。FT-IR(cm-1，ATR)2873(C-H)，1738(C＝O)，1653(N-H)，1532(N-H)，1452(C-H)，1352(S＝O)，1174(S＝O)，1097(C-O)；1HNMRδH(300MHz；CDCl3；Me4Si)8.18(s，1H，HC(O)NH-)，7.79(d，J＝8.4，2H，-CH Ar-C-S)，7.35(d，J＝8.7，2H，-CH Ar-)，6.78(s，1H，-NH)，6.55(s，1H，-NH)，4.55(m，2H，-NHCH(CH3)-)，4.30(m，2H，-COOCH 2-)，4.13(m，2H，O-CH 2-CH2-)，3.61(m，12H，-(CH 2CH 2O)3-)，2.44(s，3H，-CH 3)，1.42(m，6H，-CH(CH 3)-)；13CNMRδC(75MHz；CDCl3；Me4Si)17.9(1C，CHCH3)，18.2(1C，CHCH3)，21.7(1C，CCH3)，47.2(1C，O(C＝O)HNCH)，48.1(1C，HNHC(C＝O))，64.5(1C，OCH2)，68.7(2C，OCH2)，69.3(1C，OCH2)，70.6(4C，OCH2)，128.0(2C，CHCCH)，129.9(2C，CHCCH)，133.1(1C，CCH3)，144.9(1C，CHCCH)，161.0(1C，H(C＝O)NH))，172.6(1C，CH(C＝O)NH)，173.2(1C，CH(C＝O)O)；MS(ESI)m/z[M+Na]+计算出为541.2；发现为541.2。
1.1.5合成(R)-2-(2-(2-(2-(叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-((S)-2-甲酰胺丙酰胺基)丙酸酯(S5)
将化合物S4(0.550g，1.06mmol)溶解在40mL无水EtOH中。加入叠氮化钠(0.38g，5.9mmol)并使混合物回流过夜。冷却至室温之后，通过过滤除去固体并在真空下干燥滤液。利用柱色谱法(SiO2，0.060-0.200mm；4％MeOH/CH2Cl2作为洗脱液)纯化粗产物，从而产生了作为浅橙色油的S5(0.32g，0.82mmol，78％)；Rf＝0.4(10％MeOH/CH2Cl2)。FT-IR(cm-1，ATR)3309(N-H)，2875(C-H)，2105(N3)，1737(C＝O)，1651(N-H)，1529(N-H)，1453(C-H)，1133(C-O)；1HNMRδH(300MHz；CDCl3；Me4Si)8.20(s，1H，HC(O)NH-)，6.84(s，1H，-NH)，6.60(s，1H，-NH)，4.60(m，2H，NHCH(CH3))，4.26(m，2H，-C(O)OCH 2-)，3.68(m，12H，-(CH 2CH 2O)3-)，3.40(m，2H，N3CH 2-)，1.42(m，6H，-CH(CH 3)-)；13CNMRδC(75MHz；CDCl3；Me4Si)17.9(1C，CH3)，18.2(1C，CH3)，47.4(1C，CH2N3)，48.4(1C，H(C＝O)HNCH)，50.7(1C，HNC(CH3)C＝O)，69.0(1C，CH2CH2O)，70.1(1C，OCH2CH2)，70.6(2C，OCH2)，70.7(2C，OCH2)，161.4(1C，H(C＝O)NH)，172.7(1C，CH(C＝O)NH)，172.9(1C，CH(C＝O)O)；MS(ESI)m/z[M+Na]+计算出为412.2；发现为412.2。
1.1.6合成(R)-2-(2-(2-(2-(叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-((S)-2-异氰丙酰胺基)丙酸酯(1)
将化合物S5(221mg，0.57mmol)和N-甲基吗啉(0.24mL，2.27mmol)溶解在150mL新近蒸馏的CH2Cl2中并在氩气氛下冷却至-40℃(干丙酮浴)。在氩气氛下经1小时逐滴加入在10mL新近蒸馏的CH2Cl2中的双光气溶液(0.048mL，0.398mmol)。在滴加双光气时，搅拌混合物并严格保持在-40℃下。一旦混合物开始变黄，便用过量碳酸氢钠(5g)快速淬灭反应。在-40℃下搅拌淬灭的混合物5分钟。使反应混合物通过短硅胶柱塞(SiO2，0.060-0.200mm)。塞子填充有CH2Cl2但用CH2Cl2/乙腈(3∶1)稀释期望的化合物，从而产生了作为浅黄色油的1(48.1mg，0.48mmol，27％)；Rf＝0.5(10％MeOH/CH2Cl2)。FT-IR(cm-1，ATR)3318(N-H)，2875(C-H)，2142(C≡N)，2105(N3)，1744(C＝O)，1540(N-H)，1453(C-H)，1123(C-O)；1HNMRδH(300MHz；CDCl3；Me4Si)7.00(bd，1H，-NH-)，4.59(m，1H，-NHCH(CH3)C(O)O-)，4.32(m，3H，(-C(O)OCH 2CH2O-)，-C≡NCH(CH3)C(O)NH-)，3.67(m，12H，-(OCH 2CH 2)3)，3.39(m，2H，N3CH 2-)，1.65(d，J＝7.2，3H，C≡NCH(CH 3)C(O)-)，1.48(d，J＝7.2，3H，C≡NCH(CH 3)C(O)-)；13CNMRδC(75MHz；CDCl3；Me4Si)170.69(1C，CH(CH3)C(O)OCH2)，165.72(1C，CH(CH3)C(O)NH)，70.69，70.65，70.61，70.56，70.02，68.81(1C，CH2CH2O)，50.66(1C，CH2N3)，48.56(C≡NCH)，19.66，18.04(1C，CH(CH3)CO)；MS(ESI)m/z[M+Na]+(C15H25N5O6Na)，计算出为394.17；发现为394.1。
(2.1)制备第二共聚单体
根据图3的方案合成未用联结基团接枝的第二共聚单体。
2.1.1合成2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基2-氨基丙酸酯(S6)
将三乙二醇甲醚(25ml，156.21mmol)、L-丙氨酸(21.85g，245.25mmol)、对甲苯磺酸(32.69g，171.83mmol)和250ml甲苯加入圆底烧瓶中。使反应混合物在126℃下回流4小时。滤出固体沉淀物，并在减压下蒸发溶剂。然后用300ml氯仿溶解产物，并用(饱和的)NaHCO3萃取有机层3次。之后，用氯仿萃取水层2次。用Na2SO4，干燥有机层，并在减压下蒸发溶剂，从而以62％的产率获得了22.69gS6。
2.1.2合成2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸酯(S7)
将Boc-D-Ala-OH(18.25g，96.44mmol)、DMAP(0.1g，0.8mmol)、DiPEA(1.7ml，9.64mmol)、HoBt(14.77g，96.44mmol)、DCC(21.89g，106.08mmol)、S6(22.69g，96.44mmol)和250mlCH2Cl2混合在一起，然后在冰浴中冷却至0℃并搅拌3小时。之后，允许混合物达到室温并搅拌15小时。滤出固体，然后用200ml氯仿溶解产物，并用柠檬酸萃取溶液3次。用氯仿(1x200ml)洗涤水层。用饱和NaHCO3溶液洗涤有机层2次，并再次用氯仿萃取水层2次。合并有机层并用Na2SO4干燥，在减压下蒸发溶剂。利用柱色谱法(CH2Cl2中的2％MeOH)纯化粗产物，从而以52％的产率获得了20.4gS7。Rf＝0.53(10％MeOH/CH2Cl2))1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ＝6.77(s，1H，-NHCH-)；5.09(s，1H，-NHCH)-；4.60(q，1H，-NHCH(CH3)-)；4.31-4.28(m，3H，-C(O)OCH 2CH2O-，-CH(CH3)COO-)；3.70-3.56(m，10H，-C(O)OCH2CH 2O(CH 2CH 2O)2-)；3.38(s，1H，-OCH 3)；1.46(s，9H，-OC(CH 3)3)；1.41(d，3H，-NHCH(CH 3)-；1.38(d，3H，-NHCH(CH 3)-)
将S7(13.15g，32.35mmol)溶解在20ml乙酸乙酯中并用20ml在二恶烷中的4MHCl处理。在室温下搅拌混合物1小时。在利用起始化合物通过TLC检验之后，加入另外20ml在二恶烷中的4MHCl并在室温下进一步搅拌溶液1小时。在减压下和通过加入20mLDCM来除去残余的叔丁醇。重复该程序3次。
2.1.3合成2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基2-甲酰胺丙酸酯(S8)
将S7的HCl盐(13.15g，32.33mmol)和甲酸钠(8.76g，129.33mmol)溶解在250ml甲酸乙酯中。使反应混合物在66℃下沸腾14小时。滤出沉淀物，并在减压下蒸发溶剂。利用柱色谱法(CH2Cl2中的4％MeOH)纯化粗产物，从而以56％的产率获得了6.04gS8。Rf＝0.54(10％MeOH/CH2Cl2)1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ＝8.23(s，1H，HC(O)NH-)；6.94(d，1H，-NHCH-)；6.79(d，1H，-NHCH-；4.57(m，2H，NHCH(CH3)-，-NHCH(CH3)-)；4.26(m，2H，-C(O)OCH 2-)；3.67-3.54(m，10H，-C(O)OCH2CH 2O(CH 2CH 2O)3-)；3.43(s，3H，-OCH 3)；1.45(t，6H，-NHCH(CH 3)-，-NHCH(CH 3)-
2.1.4合成2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基2-异氰丙酸酯(2)
利用N2使S8(6.04g，18.06mmol)脱气1小时。然后利用新近蒸馏的CH2Cl2(50ml)溶解NMM(5ml，45.15mmol)，并加入溶液中。将反应混合物冷却至-40℃(干冰/异丙醇)。经2小时逐滴加入CH2Cl2(50ml)中的双光气溶液(1.52ml，12.64mmol)。搅拌反应混合物直至它变成黄-橙色，然后用NaHCO3(3g)淬灭。利用柱色谱法(1∶2ACN/CH2Cl2)纯化粗产物，从而以51％的产率获得了3.34g的2。Rf＝0.50(10％MeOH/CH2Cl2)1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.00(d，1H，-NH-)；4.58(m，1H，C≡NCH(CH3)C(O)NH-)；4.28(m，2H，-C(O)OCH 2CH2O-)；4.26(m，1H，-NHCH(CH3)C(O)O-)；3.74-3.53(m，10H，-OCH2CH 2(OCH 2CH 2)3OCH3)；3.41(s，3H，-OCH 3)；1.67(d，3H，C≡NCH(CH 3)C(O)-)；1.49(d，3H，-NHCH(CH 3)C(O)O-)
(3)聚合
将化合物2(例如，100当量)和化合物1(1当量)溶解在2mL蒸馏的甲苯中。通过将39mgNi(Cl2O4)2·6H2O溶解在10mL无水乙醇和90mL甲苯中来制备1mM的催化剂储液。用移液器吸取等于总单体摩尔数×10-4的体积加入单体中。用蒸馏的甲苯稀释混合物以获得单体的终浓度为25mg/mL。在配备有CaCl2干燥管的烧瓶中在室温下搅拌混合物72小时。通过在二异丙基醚中沉淀来分离聚合物。重复这种沉淀循环3次以获得44-92％的产率。通过测量固有粘度、流变学(G’)和圆二色性来分析聚合物并通过AFM经由将溶液滴涂在云母上来显示聚合物。
(4)将间隔单元/细胞粘附单元接枝到共聚物
将肽(GRGDS)溶解在pH＝8.4的硼酸盐缓冲液中至终浓度为2mg/mL。将式(III)所代表的间隔单元(BCN-NHS)以1∶1的摩尔比加入肽溶液中并在18℃、300rpm下混合1小时，然后以100μL的份冻结。获得了式(V)所代表的BCN-GRGDS。MS计算出的[C39H62N10O15]为910.4，获得的为911.5。
将在之前步骤中得到的聚异腈(PIC)以2mg/mL溶解在ACN中。基于聚异腈骨架中叠氮化物共聚单体的摩尔当量，向这种PIC溶液中加入适当体积的BCN-GRGDS。在4℃下搅拌混合物72小时。通过从二异丙基醚中析出来纯化PIC-肽。倒出沉淀剂，然后再次溶解聚异腈-肽，并从二氯甲烷中析出到二异丙基醚。
(5)由共聚物制备水凝胶
此后，必须要注意确保聚异腈-肽保持无菌。所有仪器在使用之前均用乙醇喷洒。称量PIC-肽缀合物直接加入无菌离心管中。通过将所述管暴露于UV辐射持续5分钟来进一步灭菌。用无菌细胞培养基覆盖PIC-肽以在培养基中将聚合物最终稀释为3.2mg/mL并允许在4℃下膨胀24小时。24小时后，在离心管底部获得了膨胀的凝胶状物质。在4℃下搅拌膨胀的PIC-肽缀合物72小时，之后获得了均匀的溶液。溶液在高于临界温度时展示出粘度剧变。
培养基中的PIC-肽缀合物在4-7℃下维持稳定长达20个月或者在冻结时维持稳定更长时间。
为了制备具有恰当刚度和浓度的前血管化构造，用合适量的培养基稀释3.2mg/mL的凝胶储液以达到聚合物的期望最终浓度，即2.0mg/mL。
(6)制备包含细胞的水凝胶
(6-1)制备包含细胞的细胞培养基
在充分补充Getal牛血清、皮质醇、hFGF-B、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸hEGF和GA-1000的内皮生长培养基(EGM-2，Lonza，Walkersville，美国)中扩大培养HUVECs(ACTT，PCS-100-010，美国)。在含有包括胎牛血清、平滑肌细胞生长补充物和青霉素/链霉素的补充物的平滑肌细胞培养基(SMCM，ScienCell，Carlsbad，美国)中扩大培养HbSMCs(ScienCell，4310，Carlsbad，美国)。在T75烧瓶(ComingIncorporated，Coming，美国)中在5％CO2、37℃下扩大培养这两种细胞类型。每周更换3次培养基并利用胰蛋白酶处理来收获细胞。所有实验均使用第8段的HbSMCs和第9段的HUVECs。
(6-2)混合水凝胶和包含细胞的细胞培养基
为了生产前血管化构造，将在步骤(B)中获得的热响应性PIC-肽缀合物溶液的温度降低至0℃以诱导凝胶向液体的转变。随后，将一份液化的凝胶与在步骤(6-1)中获得的含HUVECs和HbSMCs二者的细胞悬浮物混合，以产生500000个细胞/ml的期望细胞浓度。随后将每份200μl的这些凝胶-细胞悬浮物传递到24孔插入物(insert)(膜孔径为0.2μm)并置于37℃下30分钟以确保凝胶固化。
(7)培养细胞以形成前血管系统
在3天内观察到了细胞粘附于水凝胶且在7天内观察到了血管化。
在合适的培养基混合物中在5％CO2、37℃下培养所产生的前血管化构造14天。随后是血管化构造的发展。
对比实验2(低聚合物浓度)
重复实施例1，例外是：步骤(5)中的聚合物浓度为1.0mg/mL而非2.0mg/mL。
在步骤(7)中，凝胶固化之后，细胞逐渐沉到24孔插入物的底部。观察到了某种程度上聚集的出芽细胞，但形成的结构质量较差。3天后终止实验。未形成前血管系统。
对比实验3(高聚合物浓度)
重复实施例1，例外是：步骤(5)中的聚合物浓度为3.2mg/mL而非2.0mg/mL。
在步骤(7)中，观察到了前血管化构造的发展但非常缓慢。细胞保持悬浮在24孔插入物中。在第1-7天，细胞保持为球形，之后观察到开始出芽。14天后终止实验。形成的细胞结构显示出质量较差且没有形成前血管系统。水凝胶显示出过于坚硬从而使这些特定细胞不能在凝胶内有效移动/生长。
由实施例1与对比实验2和3的对比可以推断出，水凝胶中的共聚物浓度对血管化构造的形成很重要。合适的浓度范围为1.2-3.0mg/mL。
对比实验4(太少GRGDS)
重复实施例1，例外是：步骤(3)中化合物1和化合物2的比例为1∶550而被1∶100。
在步骤(7)中，凝胶固化之后，细胞保持为球形持续延长的时期，观察到了有限的出芽，21天后前血管化并不完全。未形成前血管系统。
对比实验5(太多GRGDS)
重复实施例1，例外是：步骤(3)中化合物2和化合物1的比例为1∶25而被1∶100。
在步骤(7)中，凝胶固化之后，观察到了不受控制和无方向性的细胞生长，形成的结构不代表前血管系统。
对比实验6(太多GRGDS)
重复实施例1，例外是：步骤(3)中化合物2和化合物1的比例为1∶10而非1∶100。
在步骤(5)中，用无菌细胞培养基覆盖PIC-肽，没有得到凝胶状物质并终止实验。
由实施例1与对比实验4和5的对比可以推断出，用GRGDS接枝的共聚单体的比例对血管化构造的形成很重要。合适的比例为1∶550-1∶50。
实施例7
如下所述测量在实施例1的步骤5中得到的水凝胶的弹性模量：
仪器.使用≈20mLCouette配置的TAInstrumentsAresG2流变仪进行流变学测量并利用珀尔帖(peltier)元件控制温度。通过如下来制备样品：在除盐水(20mL)中混合适当量的聚合物并定期涡旋混合物持续一定时间(至少24小时)直至获得均匀的溶液。在冷冻(4℃)条件下制备PIC溶液以避免凝胶提早形成。在4％张力下以0.5-5Hz之间的不同频率以线性响应方案进行测量。手稿中所述的数据是在1Hz下记录的。温度扫描是在2°分钟-1的加热速率下记录的。在生物相关培养基中的测量在TAInstrumentsDiscoveryHR-140mm平行铝板上进行，设置为750um间隙和1mL样品。利用珀尔帖元件和蒸发防护装置控制温度。通过如下来制备PIC样品：在DMEM中混合适当量的聚合物并在4℃下定期连续搅拌(至少48小时)直至获得均匀的溶液。直接使用PIC溶液或冷冻PIC溶液直至可进行测量以避免样品记忆效应。照原样使用来自供应商的基质胶并通过将纤维蛋白原溶解在含FBS的DMEM中来制备纤维蛋白凝胶，在测量之前允许凝胶在37℃下胶凝2小时。在2％张力下以1Hz之间的不同频率以线性响应方案进行测量。温度扫描是在2°分钟-1的加热或冷却速率下记录的。
弹性模量在5-15℃的温度范围内实质上恒定，其被测量为约1Pa。23℃，弹性模量增加至约100Pa。35℃，弹性模量增加至约500Pa。

Claims (15)

1.制造低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)使
-用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第一共聚单体和
-未接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氰肽的第二共聚单体共聚，
其中所述第一共聚单体与所述第二共聚单体之间的摩尔比为1∶500-1∶30，以及
ii)向通过步骤i)得到的共聚物中加入细胞粘附因子和间隔单元的反应物，其中所述间隔单元由通式A-L-B代表，
其中所述联结基团和基团A被选择以反应且形成第一偶联，并且所述细胞粘附因子和基团B被选择以反应且形成第二偶联，
其中所述第一偶联和所述第二偶联独立地选自由炔烃-叠氮化物偶联、二苯并环辛炔-叠氮化物偶联、氧杂降冰片二烯基-叠氮化物偶联、乙烯基砜-硫醇偶联、马来酰亚胺-硫醇偶联、甲基丙烯酸甲酯-硫醇偶联、醚偶联、硫醚偶联、生物素-链霉亲和素(strepavidin)偶联、产生酰胺键的胺-羧酸、产生酯键的醇-羧酸偶联和NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)-胺偶联组成的组，且
其中基团L是线性链段，其主链中具有10-60个选自C、N、O和S的原子之间的键。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基团L选自：
其中p为1-10，优选地为2-5，
其中q为1-9，优选地为2-5，
其中r为1-10，优选地为2-5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一偶联是炔烃-叠氮化物偶联。
4.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二偶联是NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)-胺偶联或马来酰亚胺-胺偶联。
5.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述基团A由式(VII)代表：
其中：
n为0-8；
R3选自由[(L)p-Q]、氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组，所述烷基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基独立地任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和硅烷基组成的组，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组，其中硅烷基由式(R4)3Si-代表，其中R4独立地选自由C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷氧基组成的组，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被多个杂原子中的一个中断，所述杂原子选自由O、N和S组成的组；
R1独立地选自由氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳烷基组成的组；且
R2独立地选自由卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷芳基和C1-C12芳烷基组成的组，其中R6如上文所限定，且其中所述烷基、芳基、烷芳基和芳烷基任选地被取代。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述间隔单元由式(IX)代表：
其中R1、R2、R3和n如上文所限定，且
L选自式(X)所代表的基团：
其中p为2-5。
7.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述间隔单元由式(XI)代表：
其中p为2-5。
8.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞粘附因子选自由氨基酸序列组成的组例如RGD和GRGDS。
9.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一共聚单体和所述第二共聚单体上亚烷基二醇单元的数目的平均值最小为3且最大为4。
10.通过根据在前权利要求中任一项所述的方法能够得到的低聚(亚烷基二醇)官能化的共聚异氰肽。
11.包含水凝胶的细胞培养物，所述水凝胶包含浓度为1.2-3.0mg/mL的权利要求10所述的共聚异氰肽，且其中所述共聚异氰肽的胶凝温度为18-40℃。
12.根据权利要求11所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含内皮细胞和平滑肌细胞中的至少一种。
13.培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供根据权利要求11所述的细胞培养物；
b)在低于所述水凝胶的胶凝温度的温度下向所述细胞培养物中加入细胞；和
c)培养所述细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞是内皮细胞和肌肉细胞。
15.根据权利要求12所述的细胞培养物用于制造前血管系统的用途。
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