JP5132936B2 - 電子流発生用懸濁液並びに該懸濁液の使用及び製法 - Google Patents
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Description
本発明は、電子流を発生させるために使用できる懸濁液、及び電池（特に、マイクロチップ（microchip）と併用するためのナノ電池（nano-battery））を製造するための該懸濁液の使用に関する。さらに本発明は、 i）該懸濁液を用いるバッテリー、 ii）負極を有する負極室、正極を有する正極室、及び該懸濁液を具有する燃料電池であって、該負極室若しくは該正極室の内部又は該負極室と該正極室との間に該懸濁液を存在させた該燃料電池、 iii）該懸濁液を用いる溶質検出用装置（特に、グルコース検出用装置）、 iv）該懸濁液を使用することを含む電力発生方法、及び v）該懸濁液の製造方法に関する。
既知のエネルギー発生系は、生体適合性膜中に埋設された酵素を使用しており、該酵素は電気エネルギーを発生させるのに利用できる電子を発生させることができる（国際公開公報ＷＯ２００３／０５０８９６参照）。このような用途に必要な膜は、膜タンパク質の活性を保証するためには生体適合性がなければならない。該膜は多くの溶質に対して透過性がない。何故ならば、酵素はこのような状況下では活性がないからである。このような要求は、膜及びベシクル（vesicle）の選択を制限し、又、この系においては膜タンパク質のみが使用できる。
本発明は、電子流を発生させるために使用できるポリペプチド含有懸濁液（suspension）を提供するためになされたものである。
即ち、本発明は、電子流を発生させるために使用できるポリペプチド含有懸濁液であって、該ポリペプチドが中空粒子（hollow particle）内に封入された（entrapped）ことを特徴とする該懸濁液に関する。
ポリペプチドは中空粒子の外殻（shell）中に埋設されないで、該中空粒子の内部に封入されるために、該中空粒子は、特有の性質（例えば、選択的な透過性、強靱性及び導電性等）を有する外殻を具有する。ポリペプチドは、水溶液中で活性を示すいずれのポリペプチドであってもよい。
好ましくは、懸濁液は、好ましくは少なくとも１種のポリペプチドが封入された複数の中空粒子を含有する。好ましくは、懸濁液中の中空粒子の密度は、大多数の中空粒子が相互に密接することによって電子流のより効率的な発生をもたらすような密度にする。中空粒子は、懸濁液中においてはポリペプチドを一定の分布状態で保有するので、ポリペプチドの活性も良好に分布され、しかもこのような分布状態は良好に維持される。好ましくは、中空粒子はポリペプチドに対して透過性を示さない。
本発明の好ましい態様においては、中空粒子はベシクルである。ベシクルは、外側の殻を形成する両親媒性分子から成る特殊な中空粒子である。ポリペプチドを封入するベシクルは、両親媒性分子をポリペプチド中へ添加することによって調製することができる。
本発明の別の態様においては、中空粒子はポリマーソーム（polymersome）である。ポリマーソームは、ポリマー性の両親媒性構成単位から構成されるベシクルであって、特有の性質（例えば、剛性及び電子透過能等）を有する。
本発明のさらに別の態様においては、中空粒子の外殻は導電性である。この導電性に起因して、中空領域内で発生する電子は中空粒子の外側の導電性殻を経由して輸送され、該電子は負極まで輸送させることができる。好ましくは、電子は中空粒子の内部には蓄積されず、外側の殻を経由して輸送される。
本発明の特定の態様においては、中空粒子は導電性ポリマーから形成される。特定のタイプのポリマーは、電子を容易に輸送し、又、容易に合成することができる。
本発明のさらに別の態様においては、中空粒子はブロックコポリマーから形成される。このポリマーはベシクルを容易に形成し、外側の導電性殻を容易に形成する。
本発明の他の態様においては、中空粒子は螺旋状の硬質ポリイソシアニド頭基と軟質ポリスチレン尾基を有するポリマーから構成される。好ましいこの種のポリマーはポリスチレン−ｂ−ポリ（Ｌ−イソシアノアラニン（２−チオフェン−３−イル−エチル）アミド）（ＰＳ−ＰＩＡＴ）である。ＰＳ−ＰＩＡＴは、水中において非常に安定で、輪郭の明瞭なポリマーソームを形成する（図３参照）。
上記のポリマーを水溶液中へ分散させることによって形成されるベシクルは非常に強靱であるが、グルコースのような物質を依然として透過させる。この両親媒性ポリマー分子はロッド−コイル（rod-coil）型のブロックコポリマーである。走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）によれば、膜厚は３０＋／−１０ｎｍであった。
本発明のさらに他の態様においては、ＰＳ−ＰＩＡＴの側鎖に存在するチオフェン側基は重合化され、これによって、より導電性の高いポリマー製の内殻と外殻を有するベシクルが得られる。この重合化は電気化学的若しくは化学的酸化によっておこなわれる。この重合化によって、ポリマーソーム膜の架橋がもたらされる。研究の結果によれば、ＰＳ−ＰＩＡＴポリマーソームの電子伝導性は、架橋後に改良されることが判明している。
ＰＳ−ＰＩＡＴから成るベシクルの水性内部室内へ種々の酵素を組み込むことができること、及びベシクル殻の重合後には酵素はベシクルから漏出しないためにプロテアーゼ分解から保護されるということがすでに立証されている。別の酵素を用いる触媒実験によれば、ベシクル膜によるプロテアーゼからのポリペプチドの保護に起因して、内包された化学種の酵素活性が保持されることが確認されている。
本発明の別の観点においては、ポリペプチドは化学反応に関与するか、又はこの種の反応を促進する分子構造の形成に関与することができる。この化学反応は電子の放出をもたらし、該電子は中空粒子の殻（好ましくは、ベシクルの導電性の外殻）を経由して輸送される。このようなポリペプチドは、潜在的には、長時間にわたって非常に安定な遺伝的に変性されたポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、例えば、酵素に結合した親油性尾部を介してベシクルの内部と結合することができる。
好ましくは、ポリペプチドは酵素であり、本発明の好ましい態様においては、中空粒子は該酵素の基質に対して透過性を示す。電子を放出する化学反応を触媒する多数の酵素が知られている。このような酵素は、本発明による懸濁液において使用することができる。好ましくは、化学反応はレドックス（redox）反応である。レドックス反応においては、電子が放出され、該電子は中空粒子の殻の方へ拡散し、該殻を経由して特定の方向へ輸送される。
より好ましくは、化学反応は酸化反応である。実際上、多数の酵素が酸化反応を触媒し、又、このような酵素に対する基質は容易にしかも比較的安価に入手しうる物質である。好ましい実施態様においては、ポリペプチドはグルコースオキシダーゼである。この態様においては、化学反応はβ−Ｄ−グルコースのＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの転化反応である。この反応中においては、２個の電子が放出される（次式参照）。放出される電子は、中空粒子の導電性殻によって容易に受容され、該中空粒子は有機電極としても機能する。グルコースオキシダーゼは比較的安定な周知酵素である。
別の好ましい観点においては、本発明は、中空粒子がゲル様（gel-like）構造中に埋設された懸濁液に関する。ゲル様構造中においては、中空粒子はゆっくりと拡散し、又、基質もゆっくりと拡散する。好ましくは、中空粒子はグルコース溶液中に埋設する。グルコースはグルコースオキシダーゼに対する良好な基質であり、しかも高価な物質ではない。本発明のこの観点においては、グルコースは電子を発生させる燃料であって、容易に入手でき、しかも比較的安価である。
グルコースとグルコースオキシダーゼの組合せは良好な態様であって、酵素と基質の組合せとして使用される場合が多い。さらに、グルコースは安定な物質であって、しかも非常に純粋な形態で得ることができる。
大部分の中空粒子が相互に接触する条件下では、発生する電子は、中空粒子の導電性の外部殻を経由する経路において見出される（図２参照）。この電子的伝達が効率的でない場合、本発明の好ましい実施態様においては、電子輸送のために少なくとも１個の中空粒子を接触させるマトリックス、例えば、ベシクルを接触させる導電性ポリマー（例えば、ポリチオフェン等）を含有させる（図２参照）。
本発明のさらに別の観点においては、マトリックスは、少なくとも１個の中空粒子を別の中空粒子と架橋させる。マトリックスは、例えば、一部の中空粒子の殻中に部分的に埋設させることができる。好ましい実施態様においては、電子の輸送を促進させるために、懸濁液に既知の電子キャリヤー、例えば、フェロセン誘導体及びビオロゲン誘導体等を含有させる。
本発明は、電池を製造のための前記懸濁液の使用にも関する。好ましくは、前記懸濁液は、マイクロチップと併用するためのナノ電池を製造するために使用される。
さらに本発明は、前記懸濁液を用いた電池に関する。この種の電池においては、グルコースのような比較的安価な燃料を使用することができ、又、該電池からは一定の電流が供給される。このような電池の構成部材としては非毒性のものを選択できるので、該電池はヒトのペースメーカー（pace maker）のために安全に利用することができる。ビオロゲン誘導体以外は、既知の毒性の化合物は含まれないので、毒性に関する危険性はない。さらに、このような電池は環境に対しても有害ではない。
さらにまた本発明は、負極を有する負極室、正極を有する正極室、及び前記の懸濁液を具有する燃料電池であって、該負極室若しくは該正極室の内部又は該負極室と該正極室との間に該懸濁液を存在させた該燃料電池にも関する。電子は、中空粒子の導電性外殻を経由する負極方向への該電子の経路に見出される（図１参照）。
本発明は、前記の懸濁液を用いて溶質を検出するための装置（device）にも関する。好ましくは、懸濁液は、溶質を転化させる酵素を含有する。このような転化（conversion）に伴って電子が放出される。この観点における本発明の特定の実施態様は、前記懸濁液を用いるグルコースセンサーに関する。好ましくは、この実施態様においては、ポリペプチッドはグルコースオキシダーゼである。グルコースが検知されると、グルコースオキシダーゼはグルコースを基質として利用し、電子が放出される。これらの電子は中空粒子の外側の殻を経由して負極まで移動し、電子流が検出される。
本発明の別の観点においては、上記の懸濁液を使用することを含む電力の発生方法が提供される。この種の電力は天然のエネルギー源であるために、環境に対して有害ではない。このような電力は、例えば、自動車において利用することができる。
さらに、本発明は、下記の工程（a）及び（b）を含む、前記の懸濁液の製造方法にも関する：
（a）ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（II）ビス（ピラゾリル）の水溶液を調製し、次いで
（b）ポリスチレン−ｂ−ポリ（Ｌ−イソシアノアラミン（２−チオフェン−３−イル−エチル）アミド）を含有するＴＨＦ溶液を、工程（a）で調製した水溶液中へ注入する。
この方法に関しては、後述の実施例１においてさらに詳述する。
（a）ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（II）ビス（ピラゾリル）の水溶液を調製し、次いで
（b）ポリスチレン−ｂ−ポリ（Ｌ−イソシアノアラミン（２−チオフェン−３−イル−エチル）アミド）を含有するＴＨＦ溶液を、工程（a）で調製した水溶液中へ注入する。
この方法に関しては、後述の実施例１においてさらに詳述する。
好ましくは、上記の懸濁液調製方法は下記の工程（c）〜（e）をさらに含む：
（c）工程（b）で調製した分散液を６０℃の温度条件下に置き、
（d）該分散液を室温まで冷却し、次いで
（e）工程（d）で調製した分散液を、１００ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターを用いる濾過処理に付す。
この態様に関しても、後述の実施例１において詳述する。
（c）工程（b）で調製した分散液を６０℃の温度条件下に置き、
（d）該分散液を室温まで冷却し、次いで
（e）工程（d）で調製した分散液を、１００ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターを用いる濾過処理に付す。
この態様に関しても、後述の実施例１において詳述する。
以下、本願明細書に添付した図面について簡単に説明する。
図１は、設計された電池の模式図である。２枚のプレートは電極を示し、上側のプレートは陰極を示し、下側のプレートは陽極を示す。中空粒子は複数の円で表示し、その内の１つを図１の右側に部分的破断拡大図で示す。左側の大きな矢印はグルコースの流れを示し、右側の大きな矢印はグルコノラクトンを示し、又、これらは基質及びグルコースオキシダーゼ酵素の生成物をそれぞれ示す。なお、該生成物は、中空粒子内に封入された円で示す。中空粒子の殻は、両親媒性分子から成る殻で示す。小さな矢印は電子の流れを示す。
図１は、設計された電池の模式図である。２枚のプレートは電極を示し、上側のプレートは陰極を示し、下側のプレートは陽極を示す。中空粒子は複数の円で表示し、その内の１つを図１の右側に部分的破断拡大図で示す。左側の大きな矢印はグルコースの流れを示し、右側の大きな矢印はグルコノラクトンを示し、又、これらは基質及びグルコースオキシダーゼ酵素の生成物をそれぞれ示す。なお、該生成物は、中空粒子内に封入された円で示す。中空粒子の殻は、両親媒性分子から成る殻で示す。小さな矢印は電子の流れを示す。
図２は、２種の電子輸送経路を示す模式図である：
（a）中空粒子は相互に接触し、電子の輸送経路は、中空粒子の外側の導電性殻を経由して形成される。
（b）ベシクルは導電性ポリマーのマトリックス中に封入され、電子は導電性ポリマーによって輸送される。
（a）中空粒子は相互に接触し、電子の輸送経路は、中空粒子の外側の導電性殻を経由して形成される。
（b）ベシクルは導電性ポリマーのマトリックス中に封入され、電子は導電性ポリマーによって輸送される。
図３において、左側の図はＰＳ−ＰＩＡＴの構造式を示し、中央の図は、水溶液中で形成されたＰＳ−ＰＬＡＴポリマーソームの走査電子顕微鏡写真を示し、又、右側の図は、該ポリマーソームの模式的な部分破断拡大図（膜厚：３０ｎｍ）を示す。
図４は、ＰＳ−ＰＩＡＴポリマーソーム内でのＧＯｘの区画化によって形成された凝集体のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。
図５は、ポリスチレン及びチオフェン官能化ポリイソシアノペプチドとのコポリマーの構造式及び該コポリマーを水中へ分散させたときに形成されるμｍサイズのベシクルを示す。
実施例１
１．グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）の封入
ＧＯｘ酵素のカプセル化は、ＧＯｘをリン酸塩緩衝液（２０ｍＭ；ｐＨ７．０）中へ溶解させることによって該酵素の溶液（４８ｍｇ／ｌ）を調製することによっておこなった。この溶液中へＰＳ−ＰＩＡＴのＴＨＦ溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を注入した（最終的な緩衝液：ＴＨＦ＝６：１（ｖ／ｖ））。遊離の酵素は、セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した（この場合、溶離液としては、水性リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した）。得られた凝集体のＴＥＭ顕微鏡写真を図４に示す。
１．グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）の封入
ＧＯｘ酵素のカプセル化は、ＧＯｘをリン酸塩緩衝液（２０ｍＭ；ｐＨ７．０）中へ溶解させることによって該酵素の溶液（４８ｍｇ／ｌ）を調製することによっておこなった。この溶液中へＰＳ−ＰＩＡＴのＴＨＦ溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を注入した（最終的な緩衝液：ＴＨＦ＝６：１（ｖ／ｖ））。遊離の酵素は、セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した（この場合、溶離液としては、水性リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した）。得られた凝集体のＴＥＭ顕微鏡写真を図４に示す。
２．ポリマーソーム膜の架橋
ＰＳ−ＰＩＡＴポリマーソーム膜の架橋は、３０ｍｇ／ｌのＣＡＬ Ｂ水溶液０．２０ｍｌ及び１．３μＭのＢＲＰ水溶液１．０ｍｌを調製することによっておこなった（この場合、ＰＳ−ＰＩＡＴを０．５０ｇ／ｌの濃度で含有するＴＨＦ溶液を注入し、又、最終的な水／ＴＨＦ比は１２：１（ｖ／ｖ）であった）。ＢＲＰの濃度は、存在するチオフェンの量（２×１０−７Ｍ）に匹敵するように選択した。次いで、得られた分散液は６０℃の水浴中に所定時間保持した。室温まで冷却後、分散液０．５ｍｌを、１００ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターユニット具有エッペンドルフ内へ移した。この分散液を乾燥するまで遠心処理に付した後、純水０．５０ｍｌを添加して得られた分散液を再び乾燥するまで遠心処理に付した。この操作を反復した後、水０．５０ｍｌを添加して架橋凝集体を再分散させた（図５参照）。
ＰＳ−ＰＩＡＴポリマーソーム膜の架橋は、３０ｍｇ／ｌのＣＡＬ Ｂ水溶液０．２０ｍｌ及び１．３μＭのＢＲＰ水溶液１．０ｍｌを調製することによっておこなった（この場合、ＰＳ−ＰＩＡＴを０．５０ｇ／ｌの濃度で含有するＴＨＦ溶液を注入し、又、最終的な水／ＴＨＦ比は１２：１（ｖ／ｖ）であった）。ＢＲＰの濃度は、存在するチオフェンの量（２×１０−７Ｍ）に匹敵するように選択した。次いで、得られた分散液は６０℃の水浴中に所定時間保持した。室温まで冷却後、分散液０．５ｍｌを、１００ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターユニット具有エッペンドルフ内へ移した。この分散液を乾燥するまで遠心処理に付した後、純水０．５０ｍｌを添加して得られた分散液を再び乾燥するまで遠心処理に付した。この操作を反復した後、水０．５０ｍｌを添加して架橋凝集体を再分散させた（図５参照）。
３．反応室
限定反応室（約１〜２ｃｍ３）にグルコースオキシダーゼ含有ベシクルの水性分散液を充填した。「燃料」グルコースをこの分散液に比較的高濃度で溶解させた。反応室の上部と底部に２個の電極［例えば、インジウム錫オキシド（ＩＴＯ）等から構成される電極］を設置した。電圧を印加すると、電池内で発生する電子は外部コンデンサーへ輸送され、該コンデンサーから、電流が供給されるべき装置に対して一定の電流が供給される。
限定反応室（約１〜２ｃｍ３）にグルコースオキシダーゼ含有ベシクルの水性分散液を充填した。「燃料」グルコースをこの分散液に比較的高濃度で溶解させた。反応室の上部と底部に２個の電極［例えば、インジウム錫オキシド（ＩＴＯ）等から構成される電極］を設置した。電圧を印加すると、電池内で発生する電子は外部コンデンサーへ輸送され、該コンデンサーから、電流が供給されるべき装置に対して一定の電流が供給される。
４．性能の予想
望ましいナノ電池に対しては、約２００ｍＡの平均電流が要求される。このことは１秒間あたり１．２５×１０１８個の電子が必要なことを意味する。以下の計算は、１ｃｍ３の電池の最大性能を仮定しておこなった。必要な電流は、１秒間あたり６．２５×１０１７個の酵素反応に相当する。このことは、報告されているグルコースオキシダーゼの代謝回転数（２２８００／ｓ）を考慮すると、２．７×１０１３個の酵素が必要なことを意味する（約４μｇに相当する）。同時に、１秒間あたり２．７×１０１３個のグルコース分子が転化される（約８ｎｇに相当する）。
望ましいナノ電池に対しては、約２００ｍＡの平均電流が要求される。このことは１秒間あたり１．２５×１０１８個の電子が必要なことを意味する。以下の計算は、１ｃｍ３の電池の最大性能を仮定しておこなった。必要な電流は、１秒間あたり６．２５×１０１７個の酵素反応に相当する。このことは、報告されているグルコースオキシダーゼの代謝回転数（２２８００／ｓ）を考慮すると、２．７×１０１３個の酵素が必要なことを意味する（約４μｇに相当する）。同時に、１秒間あたり２．７×１０１３個のグルコース分子が転化される（約８ｎｇに相当する）。
１個のベシクル中に約５０００個のグルコースオキシダーゼ酵素が含まれていると仮定すると（この仮定は別のベシクル−酵素系に基づく）、５．４×１０９個のベシクル（平均直径：１μｍ）が必要となる。このことは、１ｃｍ３の室内に２０容量％のベシクルを含有する溶液若しくはゲルによって満たされているとすると、２×１０１３個のベシクルが存在することを意味する（この量は、必要量の３７００倍の過剰量に相当する）。このことは、この種の系の最大性能によって７４０Ａの電流の発生がもたらされることを意味する。平均操作電流が２００ｍＡのとき、グルコース「燃料」が２５０ｍｇ／ｃｍ３であると仮定すると、電池は約８７００時間（１年間）連続的に作動することができる。
この点に関する性能制限因子は、グルコースの存在量と副生成物であるグルコースラクトンとプロトンの蓄積である。しかしながら、この系は、その性能に悪影響を及ぼす別の因子によっても影響を受ける。特に系が長時間にわたって作動するときには、酵素の分解が考えられる。さらに、性能を決定する重要な因子は、電池から負極への電子の輸送効率である。しかしならが、電池のいくつかのパラメータ（例えば、ベシクル若しくはグルコースの量及びマトリックスの特性等）は容易に変化させることができる。
Claims (16)
- 電子流を発生させるのに使用できる電池用懸濁液であって、
１）該懸濁液が、導電的に相互に接触する複数の中空粒子を含有し、
２）該中空粒子が、基質に対して透過性がある導電性外殻を具有し、
３）レドックス反応を触媒する酵素であって、該中空粒子内での該基質の酵素的転化を触媒することによって電子を放出させる該酵素が該中空粒子中に封入された
該懸濁液。 - 基質に対して透過性がある導電性外殻がポリマーから形成される請求項１記載の懸濁液
。 - ポリマーがブロックコポリマーである請求項２記載の懸濁液。
- ブロックコポリマーが疎水性ポリスチレンブロック及び親水性ポリイソシアノペプチド
を含有する請求項３記載の懸濁液。 - ブロックコポリマーがポリスチレン−ｂ−ポリ（Ｌ−イソシアノアラニン（２−チオフ
ェン−３−イル−エチル）アミド）（ＰＳ−ＰＩＡＴ）を含有する請求項３又は４記載の懸濁液。 - ブロックコポリマー中に存在する側基が重合化された請求項５記載の懸濁液。
- ポリスチレン−ｂ−ポリ（Ｌ−イソシアノアラニン（２−チオフェン−３−イル−エチ
ル）アミド）の側鎖中に存在するチオフェン側基が重合化された請求項６記載の懸濁液。 - 酵素が中空粒子の内側に結合された請求項１から７いずれかに記載の懸濁液。
- 酵素がグルコースオキシダーゼであり、基質がグルコースである請求項１から８いずれ
かに記載の懸濁液。 - 中空粒子が導電性マトリックス中に埋設された請求項１から９いずれかに記載の懸濁液
。 - さらにフェロセン誘導体及び/又はビオロゲン誘導体を含有する請求項１０記載の懸濁液。
- 電池を製造するための請求項１から１１いずれかに記載の懸濁液の使用。
- 負極を有する負極室、正極を有する正極室、及び請求項１から１１いずれかに記載の懸
濁液を具有する燃料電池であって、該負極室若しくは該正極室の内部又は該負極室と該正極室との間に該懸濁液を存在させた該燃料電池。 - 請求項１から１１いずれかに記載の懸濁液を使用することを含む電力の発生方法。
- 下記の工程（a）及び（b）を含む、請求項１から１１いずれかに記載の懸濁液の製造方
法：
（a）ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（II）ビス（ピラゾリル）の水溶液を調製し、次いで
（b）ポリスチレン−ｂ−ポリ（Ｌ−イソシアノアラミン（２−チオフェン−３−イル−エチル）アミド）を含有するＴＨＦ溶液を、工程（a）で調製した水溶液中へ注入する。 - 下記の工程（c）〜（e）をさらに含む請求項１５記載の方法：
（c）工程（b）で調製した分散液を６０℃まで加温し、
（d）該分散液を室温まで冷却し、次いで
（e）工程（d）で調製した分散液を、１００ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターを用いる濾過処理に付す。
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