ES2637724T3 - Polímero adecuado para su uso en cultivo celular - Google Patents

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Christopher Wilson
Petrus Johannes Geutjes
Wouter F.j. FEITZ
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Abstract

Un proceso de fabricación de un copoliisocianopéptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol), proceso que comprende las etapas de: i) copolimerizar - un primer comonómero de un isocianopéptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) injertado con un grupo enlazador y - un segundo comonómero de un isocianopéptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) no injertado, en el que la proporción molar entre el primer comonómero y el segundo comonómero es de 1:500 y 1:30 y ii) añadir un reactante de una unidad espaciadora y un factor de adhesión celular al copolímero obtenido en la etapa i), en el que la unidad espaciadora se representa por la fórmula general A-L-B, en el que el grupo enlazador y el grupo A se seleccionan para que reaccionen y formen un primer acoplamiento, y el factor de adhesión celular y el grupo B se seleccionan para que reaccionan y formen un segundo acoplamiento, en el que el primer acoplamiento y el segundo acoplamiento se seleccionan independientemente del grupo que consiste en acoplamiento de alquino-azida, acoplamiento de dibenzociclooctina-azida, acoplamientos de azida a base de oxanorbornadieno, acoplamiento de vinilsulfona-tiol, acoplamiento de maleimida-tiol, acoplamiento de metilmetacrilato- tiol, acoplamiento de éter, acoplamiento de tioéter, acoplamiento de biotina-estrepavidina, amina-ácido carboxílico que da lugar a enlaces amida, acoplamiento de alcohol-ácido carboxílico que da lugar a enlaces éster y acoplamiento de éster de NHS (éster de N-hidroxisuccinimida)-amina y en el que el grupo L es un segmento de cadena lineal que tiene 10-60 enlaces entre los átomos seleccionados de C, N, O y S en la cadena principal.

Description

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DESCRIPCION
PoKmero adecuado para su uso en cultivo celular
La presente invencion se refiere a un proceso de preparacion de un poKmero adecuado para su uso en un cultivo celular. La invencion se refiere ademas a un uso del cultivo celular para fabricar un sistema prevascular.
Hasta la fecha, los materiales de gel de cultivo celular pueden aislarse de fuentes naturales o completamente sinteticas. Los geles tales como el colageno, que producen estructuras inherentemente laminares, son incapaces de formar redes 3D complejas aisladas. Los geles tales como los derivados de celulas de sarcoma de raton EHS se asemejan al ambiente extracelular que se encuentra en los tejidos mucho mejor que el colageno puro, y tambien proporcionan un entorno tridimensional dentro del cual las celulas pueden crecer y ensamblarse en arquitecturas complejas. Los gelificantes derivados de manera natural son diffciles de caracterizar por completo, y requieren un analisis intensivo de lote a lote para lograr dicha caracterizacion. Los geles derivados biologicamente sufren de variabilidad inherente, riesgo de contaminacion y transferencia de patogenos junto con primas economicas excesivas. Para muchos grupos de investigacion, la contaminacion por trazas adicional, tal como los factores de crecimiento no deseados inherentemente presentes en materiales obtenidos biologicamente, son interferencias experimentales inaceptables, y son inaceptables para su uso in vivo. En el otro extremo del espectro, los geles derivados sinteticamente tales como los derivados de copolfmeros de poli(N-isopropilacrilamida) presentan una viabilidad celular y una capacidad de diferenciacion celular bajas, lo que requiere mezclas adicionales de agentes bioactivos tales como glucocorticoides y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p). El uso de gelificantes sinteticos elimina en gran medida la variacion natural encontrada en los gelificantes biologicos, pero elimina concomitantemente la actividad biologica inherente de los geles naturales. La capacidad de eliminar la variabilidad biologica mientras se conserva la actividad biologica es un reto que todavfa no se ha hecho del todo realidad.
La capacidad de cosechar sistemas biologicos complejos formados en estos geles tambien sigue siendo un desaffo.
Tradicionalmente, las celulas deben ser liberadas de superficies biologicas mediante el uso de tripsina o para que el gel se disuelva mecanicamente o se elimine manualmente de la superficie de la estructura.
Las estructuras gelificables demostradas anteriormente no son de naturaleza universal, y no pueden aplicarse facilmente de una manera mmimamente invasiva in vivo. Existen algunos ejemplos de materiales termosensibles que pueden aplicarse de una manera mmimamente invasiva a traves de un cateter enfriado, tales como los desvelados en el documento US 2010/0215731 A1. Sin embargo, estos materiales padecen de los mismos inconvenientes que se han descrito anteriormente, generando una baja viabilidad celular.
Desde un punto de vista mecanico, las propiedades de todos los geles derivados biologicamente estan dictadas por las interacciones no covalentes de las subunidades peptfdicas. El resultado es que el tamano de poro y la resistencia mecanica son relativamente fijos. Las propiedades mecanicas y la naturaleza de las reticulaciones son aun mas fijas en el caso de los geles derivados sinteticamente.
El documento WO2011/007012 desvela un hidrogel que comprende poliisocianopeptidos con funcionalidad de oligo(alquilenglicol). Los poliisocianopeptidos se preparan funcionalizando un isocianopeptido con cadenas laterales de oligo(alquilenglicol) y polimerizando a continuacion los isocianopeptidos con funcionalidad de oligoalquilenglicol.
El documento WO2011/007012 sugiere el uso de los hidrogeles para la ingeniena de tejidos o la regeneracion de neuronas. Los polfmeros de poliisocianopeptido tambien se describen en otras publicaciones. Por ejemplo, el documento EP2404618 A1 se refiere a polfmeros de poliisocianopeptido helicoidal. Estos polfmeros se usan como construcciones proteicas que se pueden administrar al cuerpo de un ser humano o de un animal. Ademas, en Kouwer et al.; “Responsive biomimetic networks from polyisocyanopeptide hydrogels”; Nature, Vol. 493, n.° 7434, pag. 651-655; y en Koepf et al.; “Preparation and characterization of non-linear polyethylene glycol analogs from oligoethylene glycol functionalized polyisocyanopeptides”; European Polymer Journal, Vol. 49, n.° 6, pag. 1510-1522, se describen poliisocianopeptidos injertados con cadenas laterales de oligo(etilenglicol). Estos poliisocianopeptidos pueden formar hidrogeles a bajas concentraciones. Las publicaciones que se refieren a materiales de gel para el cultivo celular son los documentos WO2012/158235 A2 y WO2010/064251 A1.
El documento WO2012/158235 A2 se refiere a un metodo de recubrimiento de la superficie de un artmulo de cultivo celular con un polfmero que tiene un polipeptido unido covalentemente. El polfmero se puede unir a la superficie del artmulo de cultivo celular sometiendo el polfmero al calor o a radiacion electromagnetica. El documento WO2010/064251 A1 se refiere a una esponja de hidrogel macroporosa. La esponja de hidrogel puede funcionar como una construccion tisular tridimensional (3D).
Aunque los cultivos de celulas conocidos son satisfactorios para algunas aplicaciones, existe una necesidad creciente en la tecnica de cultivos celulares que se puedan usar en una amplia variedad de situaciones. Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un cultivo celular y un polfmero para su uso en el cultivo celular, donde se cubran las necesidades mencionadas anteriormente y/o otras necesidades de la tecnica. De acuerdo con un
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aspecto, la presente invention proporciona un proceso de fabrication de un copoliisocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol), en el que el proceso comprende las etapas de:
i) copolimerizar:
- un primer comonomero de un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) injertado con un grupo enlazador y
- un segundo comonomero de un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) no injertado;
en el que la proportion molar entre el primer comonomero y el segundo comonomero es de 1:500 y 1:30; y
ii) anadir un reactante de una unidad espaciadora y un factor de adhesion celular al copolimero obtenido en la etapa i), en el que la unidad espaciadora se representa por la formula general A-L-B,
en el que el grupo enlazador y el grupo A se seleccionan para que reaccionen y formen un primer acoplamiento, y el factor de adhesion celular y el grupo B se seleccionan para que reaccionan y formen un segundo acoplamiento, en el que el primer acoplamiento y el segundo acoplamiento se seleccionan independientemente del grupo que consiste en acoplamiento de alquino-azida, acoplamiento de dibenzociclooctina-azida, acoplamientos de azida a base de oxanorbornadieno, acoplamiento de vinilsulfona-tiol, acoplamiento de maleimida-tiol, acoplamiento de metil- metacrilato-tiol, acoplamiento de eter, acoplamiento de tioeter, acoplamiento de biotina-estrepavidina, amina-acido carboxflico que da lugar a enlaces amida, acoplamiento de alcohol-acido carboxflico que da lugar a enlaces ester y acoplamiento de ester de NHS(ester de N-hidroxisuccinimida)-amina y
en el que el grupo L es un segmento de cadena lineal que tiene de 10 a 60 enlaces entre los atomos seleccionados de C, N, O y S en la cadena principal.
El grupo enlazador y el grupo A se seleccionan para que reaccionen y formen un primer acoplamiento que puede ser cualquier acoplamiento mencionado en la lista anterior. Por ejemplo, con el fin de obtener un acoplamiento de alquino-azida, el grupo enlazador puede ser alquino, y el grupo A puede ser azida, o el grupo enlazador puede ser azida, y el grupo A puede ser alquino. Los acoplamientos mencionados en la lista anterior son bien conocidos por el experto en la materia, y la formation de los acoplamientos se encuentra en los libros de texto. Por ejemplo, el acoplamiento de NH2-cOoH se puede mediar a traves de EDC.
Preferentemente, el primer acoplamiento es un acoplamiento de alquino-azida.
De igual forma, el factor de adhesion celular y el grupo B se seleccionan para que reaccionen y formen un segundo acoplamiento que puede ser cualquier acoplamiento mencionado en la lista anterior. Preferentemente, el segundo acoplamiento es acoplamiento de ester de NhS (ester de N-hidroxisuccinimida)-amina o acoplamiento de maleimida- tiol. Este puede ser un acoplamiento de ester de NHS en el extremo N-terminal de un factor de adhesion celular que sea un peptido o un acoplamiento de maleimida en un extremo tiol-terminal del factor de adhesion celular que sea un peptido.
El grupo L es un segmento que tiene una cadena lineal que conecta los grupos reactivos A y B. El segmento esta formado por una secuencia de atomos seleccionados entre C, N, O y S. El numero de enlaces entre los atomos de la cadena principal conectada a los grupos A y B es de al menos 10 y como maximo de 60. La expresion “cadena principal” significa la cadena que conecta los grupos A y B con la distancia mas corta. El numero de enlaces entre los atomos de la cadena principal conectada a los grupos terminales A y B es preferentemente de al menos 12, mas preferentemente de al menos 15. El numero de enlaces entre los atomos de la cadena principal conectada a los grupos terminales A y B es preferentemente de al menos 50, mas preferentemente de al menos 40. Se encontro que se requiere una cierta distancia minima entre la cadena principal del copolimero y el factor de adhesion celular para que las celulas unidas al factor de adhesion celular se cultiven. Se comprobo que se necesitaba la distancia dada por al menos 10 enlaces, que se proporciona por la presencia de la unidad espaciadora de acuerdo con la invencion. Se encontro que la longitud por debajo de 10 enlaces no permitia un crecimiento celular suficiente.
Los ejemplos preferidos del grupo L son los siguientes:
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en el que p es de 1 a 10, preferentemente de 2 a 5,
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en el que q es de 1 a 9, preferentemente de 2 a 5,
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en el que r es de 1 a 10, preferentemente de 2 a 5.
Cuando la unidad espaciadora contiene estos tipos de grupo L, se garantiza un crecimiento celular particularmente estable independientemente del tipo y del tamano de los grupos A y B, del grupo enlazador y del factor de adhesion celular.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invention proporciona el copoliisocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) obtenible mediante el proceso de acuerdo con la presente invencion.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un cultivo celular que comprende un hidrogel que comprende un copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol) a una concentration de 1,2 a 3,0 mg/ml, en el que el copoliisocianopeptido se fabrica mediante:
i) copolimerizacion de:
- un primer comonomero de un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) injertado con un grupo enlazador y
- un segundo comonomero de un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) no injertado;
en el que la proportion molar entre el primer comonomero y el segundo comonomero es de 1:500 y 1:30; e
ii) la adicion de un reactante de una unidad espaciadora y un factor de adhesion celular al copolimero obtenido mediante la etapa i), en el que la unidad espaciadora se representa por la formula general A-L-B, en el que el grupo enlazador y el grupo A se seleccionan para que reaccionen y formen un primer acoplamiento, y el factor de adhesion celular y el grupo B se seleccionan para que reaccionan y formen un segundo acoplamiento, en el que el primer acoplamiento y el segundo acoplamiento se seleccionan independientemente del grupo que consiste en acoplamiento alquino-azida, acoplamiento de dibenzociclooctina-azida, acoplamientos de azida a base de oxanorbornadieno, acoplamiento de vinil-sulfona-tiol, acoplamiento maleimida-tiol, acoplamiento metil- metacrilato-tiol, acoplamiento eter, acoplamiento tioeter, acoplamiento biotina-estrepavidina, acido aminocarboxflico dando como resultado enlaces amidas, acoplamiento alcohol-acido carboxflico que da lugar a enlaces ester y acoplamiento de ester de N-hidroxisuccinimida (NHS-ester)-amina y
en el que el grupo L es un segmento de cadena lineal que tiene de 10 a 60 enlaces entre los atomos seleccionados de C, N, O y S en la cadena principal.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que se logra un crecimiento celular optimo solo a concentraciones espetificas de los factores de adhesion celular que estan situados a cierta distancia de la cadena principal del polimero que construye la estructura tridimensional del hidrogel.
Si la concentracion del factor de adhesion celular es demasiado baja, las celulas no se adhieren lo suficiente al hidrogel, lo que, a su vez, no permite que las celulas se cultiven. Si la concentracion del factor de adhesion celular es demasiado alta, las celulas no crecen en el gel.
El primer comonomero es un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) injertado con un grupo enlazador. Los ejemplos preferidos del grupo enlazador incluyen azida (por ejemplo, azida de oxanorbornadieno), alquino (por ejemplo, dibenzociclooctina), tiol, vinilsulfona, maleimida, metacrilato de metilo, eter, biotina, estreptavidina, Nh2, COOH, OH, ester de NHS. En particular, se prefiere la azida.
En la Formula (I), se muestra un ejemplo del primer comonomero, en la que el grupo enlazador es una azida.
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El segundo comonomero es un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) que no esta injertado con un grupo enlazador ni otros grupos, es decir, la cadena lateral del isocianopeptido consiste en un oligo(alquilenglicol). Un ejemplo del segundo comonomero se muestra en la Formula (II):
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El primer comonomero y el segundo comonomero se copolimerizan en la etapa (i). Se obtiene un copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol) que comprende grupos enlazadores a lo largo del polimero en la proportion del primer comonomero con respecto al segundo comonomero.
Un factor de adhesion celular se une al copolimero a traves de una unidad espaciadora. En primer lugar, se prepara un reactante de una unidad espaciadora y un factor de adhesion celular. Un ejemplo de la unidad espaciadora se muestra en la Formula (III).
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en la que p es de 1 a 10.
En el presente ejemplo, el grupo A es:
el grupo B es:
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el grupo L es:
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En la Formula (IV), se muestra un ejemplo del factor de adhesion celular, que es un pentapeptido compuesto de glicina, L-arginina, glicina, acido L-aspartico y (GRGDS).
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El reactante de la unidad espaciadora de (III) y el factor de adhesion celular de (IV) se muestran en la Formula (V).
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En la etapa ii) de la invention, el reactante (por ejemplo, la formula (V)) de una unidad espaciadora y un factor de adhesion celular se hacen reaccionar con el copoKmero obtenido en la etapa i). El grupo enlazador reacciona con la parte del reactante correspondiente a la unidad espaciadora. Por consiguiente, el copoliisocianopeptido final comprende unidades de adhesion celular a lo largo del polimero en la proportion del primer comonomero con respecto al segundo comonomero. Un ejemplo del copoliisocianopeptido final se representa por la formula (VI):
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en la que m:n es la proporcion del primer comonomero con respecto al segundo comonomero.
La unidad de adhesion celular se situa a una distancia de la cadena principal del polimero de isocianopeptido mediante el uso de la unidad espaciadora.
Se prepara un hidrogel a partir del copolimero obtenido por gelificacion con un medio de cultivo celular adecuado. El hidrogel es un hidrogel tridimensional. La concentration de polimero en el hidrogel es 1,2-3,0 mg/ml. Si la concentration de polimero en el hidrogel es demasiado baja, las celulas no se adhieren al hidrogel. Si la concentracion de polimero en el hidrogel es demasiado alta, el hidrogel se vuelve demasiado rigido para que las celulas se muevan y crezcan dentro del gel.
Preferentemente, el hidrogel tiene un modulo elastico en el intervalo de 10 a 5.000 Pa, preferentemente de 100 a
1.000 Pa a 35 °C como se determino mediante experimentos de reologia de placa-placa. Esto permite que las celulas se muevan y crezcan para formar redes celulares y estructuras 3D, como, por ejemplo, un sistema prevascular.
La presente invencion proporciona un cultivo celular de un hidrogel que tiene una rigidez selectiva y respuesta a la temperatura, asi como una distribution espacial controlada y una densidad de puntos de adhesion celular. La copolimerizacion da lugar a una distribucion estadistica del grupo de adhesion celular a lo largo del copolimero en la proporcion del primer comonomero con respecto al segundo comonomero. Se puede ajustar la proporcion del primer comonomero con respecto al segundo comonomero para controlar la distancia entre los factores de adhesion celular a lo largo de la cadena principal de polimero del poliisocianopeptido. La distancia media entre los factores de adhesion celular a lo largo de la cadena principal de polimero puede ser, por ejemplo, de 1,1 a 60 nm. Este intervalo de la distancia entre los factores de adhesion celular es adecuado para anclar las celulas que se van a cultivar en el cultivo celular. Mas preferentemente, la distancia media entre los factores de adhesion celular es de 8 a 30 nm.
El hidrogel puede comprender una variedad de medios de cultivo celular, y se ha demostrado que el cultivo celular media la formation de un armazon biologico complejo.
El cultivo celular de acuerdo con la invencion es sumamente ventajoso, porque la recogida de las celulas cultivadas es facil. El hidrogel usado en el cultivo celular tiene un caracter termosensible, es decir, se convierte en Kquido mediante su enfriamiento hasta una temperatura por debajo de la temperatura de gelificacion. Por lo tanto, la recogida de las celulas cultivadas se puede realizar solo mediante el enfriamiento del cultivo celular. Una vez que el hidrogel se ha convertido en Kquido, se pueden recoger las celulas del Kquido sin danar las celulas cultivadas.
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Se determino que el factor de adhesion celular no se puede unir directamente a los isocianopeptidos con funcionalidad oligoalquilenglicol para conservar una union suficiente. Esto se resolvio mediante el uso de un espaciador de acuerdo con la presente invention. La unidad espaciadora usada de acuerdo con la invention separa el factor de adhesion celular de la cadena principal polimerica de los isocianopeptidos para eliminar el bloqueo esterico. El espaciador desacopla los movimientos del factor de adhesion celular de la cadena principal polimerica, y el desacoplamiento de los movimientos permite que el factor de adhesion celular se acople eficazmente en el bolsillo de union a la integrina. El espaciador debe ser polar, hidrosoluble, biocompatible y no unirse al sitio activo de la integrina, pero que pueda ayudar en la union auxiliar. El primer monomero se puede preparar preparando primero un segundo monomero e injertandolo con un grupo enlazador. Como alternativa, el primer monomero y el segundo monomero pueden prepararse a traves de diferentes rutas.
La proportion molar entre el primer comonomero y el segundo comonomero esta entre 1:500 y 1:30. Preferentemente, la relation molar entre el primer comonomero y el segundo comonomero esta entre 1:400-1:35, 1:300-1:40 o 1:200-1:45. Este intervalo de la relacion entre el primer comonomero y el segundo comonomero da una distancia media de 8 a 30 nm entre las unidades de adhesion celular a lo largo de la cadena principal polimerica.
Preferentemente, el copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol) tiene una temperatura de gelificacion de 18 a 40 °C. La temperatura de gelificacion es independiente de la concentration de polimero en el hidrogel. Mas bien, depende del numero de unidades de oligoalquilenglicol de la cadena lateral del polimero.
A continuation, se dan detalles adicionales de la presente invencion.
Comonomeros
Funcionalizacion del isocianopeptido con unidades de oligo(alquilenglicol)
Los monomeros se basan preferentemente en un motivo di-, tri-, tetra- o mas -peptidico sustituido en el extremo C- terminal con las cadenas de oligo(alquilenglicol) deseadas. Las cadenas pueden estar basadas en oligo(alquilenoxido) lineal, ramificado o dendronizado. Preferentemente, la cadena es lineal y se compone de etilenglicol.
El segmento peptidico puede ser de diferentes composiciones determinadas por la secuencia de aminoacidos naturales o no naturales y expandidos o una mezcla de los mismos.
Los monomeros se derivan de fragmentos de oligo(alquilenglicol) adecuados. Se usa una estrategia de acoplamiento peptidico de multiples etapas para introducir sucesivamente los aminoacidos deseados. Despues de la introduction de la secuencia peptidica deseada, el extremo N-terminal del segmento peptidico se formila con un metodo de formilacion adecuado. Esta formilacion puede incluir el tratamiento del producto con sales de formilo, acido formico u otros agentes formilantes.
Algunos ejemplos de estrategias de formilacion hacen uso de sales de formiato (tales como formiato de sodio o potasio), formiatos de alquilo (tales como formiato de metilo, etilo o propilo), acido formico, cloral y derivados. El isocianuro se forma luego tratando la formamida con un agente de deshidratacion apropiado: Un ejemplo de estrategia de deshidratacion usa difosgeno. Varios ejemplos de agentes de deshidratacion que tambien pueden usarse son fosgeno y derivados (di-, trifosgeno), carbodiimidas, cloruro de tosilo, oxacloruro de fosforo, trifenilfosfina/tetraclorocarbono, [M. B. Smith y J. March "March's advanced organic chemistry" 5a edition, Wiley & Son eds., 2001, Nueva York, EE.UU., pag. 1350-1351 y referencias del presente documento].
Cadenas laterales (alquilenglicol)
Los ejemplos de alquilenglicoles adecuados son etilen-, propilen-, butilen- o pentilenglicol. Preferentemente, el alquilenglicol es etilenglicol.
A continuacion, se representan las unidades de oligoetilenglicol ventajosas. En general, el termino oligo se refiere a un numero < 10.
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Preferentemente, los isocianopeptidos estan funcionalizados con al menos 3 unidades de etilenglicol para conducir a materiales hidrosolubles despues de la polimerizacion.
El segundo comonomero de la presente invention es un isocianopeptido de oligo(alquilenglicol) como se ha descrito anteriormente, sin injerto adicional.
El primer comonomero puede consistir en un isocianopeptido que tenga el mismo numero de unidades de alquilenglicol o puede ser una mezcla de isocianopeptidos que tengan un numero diferente de unidades de alquilenglicol. De manera similar, el segundo comonomero puede consistir en un isocianopeptido que tenga el mismo numero de unidades de alquilenglicol o puede ser una mezcla de isocianopeptidos que tengan diferente numero de unidades de alquilenglicol.
El primer comonomero y el segundo comonomero son isocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol), es decir, el numero de unidades de alquilenglicol en el isocianopeptido es de 1 a 10. Preferentemente, la media del numero de unidades de alquilenglicol en el primer comonomero y el segundo comonomero es de al menos 3 y, como maximo, de 4.
La media de las unidades de alquilenglicol del primer comonomero y del segundo comonomero normalmente se ajusta usando una mezcla de isocianopeptidos que tienen numeros diferentes de unidades de alquilenglicol como el segundo comonomero. En realizaciones preferidas, el primer comonomero es un isocianopeptido que tiene tres unidades de alquilenglicol y el segundo comonomero es una mezcla de un isocianopeptido que tiene tres unidades de alquilenglicol y un isocianopeptido que tiene cuatro unidades de alquilenglicol.
La media del numero de unidades de alquilenglicol del primer comonomero y el segundo comonomero puede ser 3.
Por lo general, se obtiene la temperatura de gelificacion de 15-25 °C. La media del numero de unidades de alquilenglicol en el primer y el segundo comonomero puede ser superior a 3 y, como maximo, de 3,5. Normalmente, se obtiene la temperatura de gelificacion de 18 a 35 °C. La media del numero de unidades de alquilenglicol en el primer comonomero y en el segundo comonomero puede ser superior a 3,5 y, como maximo, de 5. Por lo general, se obtiene la temperatura de gelificacion de 25 a 50 °C.
Preferentemente, el copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol) tiene un modulo elastico de 10 a
5.000 Pa, preferentemente de 100 a 1.000 Pa a una temperatura de 35 °C como se determina mediante mediciones de reologia. Cuando la media del numero de unidades de alquilenglicol en el primer comonomero y el segundo comonomero es de al menos 3 y como maximo 5, el hidrogel tiene dicha rigidez.
Polimerizacion
El monomero de isocianopeptido de oligo(alquilenglicol) injertado con el monomero enlazador (primer comonomero) y los monomeros de isocianopeptido de oligo(alquilenglicol) no injertados con el grupo enlazador (segundo comonomero) se mezclan y, posteriormente, se copolimerizan.
La copolimerizacion se realiza preferentemente en presencia de un disolvente apolar. Los disolventes apolares adecuados se pueden seleccionar del grupo que consiste en disolventes de hidrocarburos saturados y disolventes de hidrocarburos aromaticos o mezclas de los mismos. Los ejemplos de disolventes apolares son pentano, hexano, heptano, 2-metilbutano, 2-metilhexano, ciclohexano y tolueno, bencenoxilenos o mezclas de los mismos.
Preferentemente, se usa tolueno en la polimerizacion. Preferentemente, el tolueno se selecciona para el proceso de polimerizacion de isocianopeptidos de oligo(etilenglicol) en los que la parte de oligo(etilenglicol) contiene al menos tres unidades de etilenglicol.
Preferentemente, la polimerizacion se lleva a cabo en presencia de un catalizador. El catalizador es preferentemente una sal de mquel (ll). El ejemplo de sales de Ni (II) son haluros de mquel (II) (por ejemplo, cloruro de mquel (ll), perclorato de mquel (II) o perclorato de tetraquis-(ferc-butilisocianuro) de mquel (II).
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Se pueden usar otros complejos y sales de mquel siempre que sean solubles en el medio de polimerizacion o se disuelvan inicialmente en un disolvente adecuado que sea miscible en el medio de polimerizacion. Las referencias generales que describen algunos sistemas catalrticos que pueden usarse para polimerizar los isocianopeptidos de oligo(alquilenglicol) se encuentran en Suginome M.; Ito Y.; AdvPolym SC1 2004, 171,77-136; Nolte R. J. M.; Chem. Soc. Rev. 1994, 23(1), 11-19)].
Preferentemente, la concentracion de monomero se selecciona por encima de 30 mmol/l y la proportion de catalizador/monomero se selecciona entre 1/100 y 1/10.000. La reduction de la cantidad de mquel (ll) (proporcion de catalizador/monomero por debajo de 1/1.000) permite la preparation de materiales que presentan un grado sustancial de polimerizacion [GP medio > 500], que se desea para la posterior aplicacion de los polimeros como macrohidrogelificantes.
En un ejemplo representativo, se anade una solution milimolar de monomero en un disolvente organico no polar o una mezcla de disolventes a un catalizador de mquel (II) disuelto en un disolvente polar en una proporcion molar de 1:50 a 1:100.000 del catalizador con respecto al monomero. En un ambiente cerrado hermeticamente, se agita la mezcla vigorosamente durante 2 a 24 horas. Una vez completado, se evapora la mezcla de reaction y se disuelve el producto en bruto en disolventes organicos y se precipitan en eter dietflico o disolventes organicos no compatibles similares, dando el producto deseado.
Injerto del reactante de la unidad espaciadora y el factor de adhesion celular a la unidad espaciadora del grupo enlazador
Los grupos terminales A y B se seleccionan preferentemente de manera que la smtesis del compuesto subsiguiente sea posible sin necesidad de etapas de desproteccion o activation.
Los ejemplos preferidos del grupo A de la unidad espaciadora incluyen azida (por ejemplo, azida a base de oxanorbornadieno), alquino (por ejemplo, dibenzociclooctina), tiol, vinilsulfona, maleimida, metacrilato de metilo, eter, biotina, estreptavidina, NH2, COOH, OH, ester de NHS. En particular, se prefiere el alquino.
Los ejemplos preferidos del grupo B de la unidad espaciadora incluyen azida (por ejemplo, azida a base de oxanorbornadieno), alquino (por ejemplo, dibenzociclooctina), tiol, vinilsulfona, maleimida, metacrilato de metilo, eter, biotina, estreptavidina, NH2, COOH, OH, ester de NHS. En particular, se prefiere ester de NHS o malemida.
Preferentemente, el grupo A de la unidad espaciadora esta representado por la formula (VII):
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en la que:
n es de 0 a 8;
R3 se selecciona del grupo que consiste en [(L)p-Q], hidrogeno, halogeno, grupos alquilo Ci-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24, estando los grupos alquilo opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, en el que los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo estan opcionalmente sustituidos independientemente con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2-C12, grupos cicloalquiloxi C3-C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, en el que los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi estan opcionalmente sustituidos; los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi estan opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, estando los grupos sililo representados por la formula (R4)3Si-, en la que R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2-C12 y grupos cicloalquiloxi C3-C12, en el que los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi estan opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi estan opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
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R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, grupos alquilo Ci-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24; y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en halogeno, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, grupos alquilo C1-C12, grupos arilo C1-C12, grupos alquilarilo C1-C12 y grupos arilalquilo C1-C12, en los que R6 es como se ha definido anteriormente, y en los que los grupos alquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo y grupos arilalquilo estan opcionalmente sustituidos.
Preferentemente, n = 0.
Preferentemente, R1 es hidrogeno.
Preferentemente, R3 es hidrogeno.
Preferentemente, el grupo B de la unidad espaciadora se representa por la formula (VIII):
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Preferentemente, la unidad espaciadora comprende el grupo A de formula (VII) y el grupo B de formula (VIII). Los ejemplos de la unidad espaciadora adecuada incluyen los compuestos representados por la formula (IX):
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en la que R1, R2, R3 y n son como se han definido anteriormente y L se selecciona preferentemente del grupo representado por la formula (X-1), (X-2, (X-3):
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en la que r es de 1 a 10, preferentemente de 2 a 5.
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Preferentemente, la unidad espaciadora se representa por la formula (XI).
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en la que p es de 1 a 10, preferentemente de 2 a 5, mas preferentemente 2.
Otros ejemplos de la unidad espaciadora adecuada incluyen compuestos de ciclooctilo fusionados descritos en el documento WO2011/136645, que se incorpora en el presente documento por referencia. Por consiguiente, una posible unidad espaciadora se selecciona del compuesto de Formula (IIa), (IIb) o (IIc):
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en las que:
n es de 0 a 8; p es 0 o 1;
R3 se selecciona del grupo que consiste en [(L)p-Q], hidrogeno, halogeno, grupos alquilo Ci-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24, estando los grupos alquilo opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, estando los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo opcionalmente sustituidos independientemente con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2-C12, grupos cicloalquiloxi C3-C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, en el que los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi estan opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi estan opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, en el que los grupos sililo estan representados por la formula (R4)3Si-, en la que R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2- C12 y grupos cicloalquiloxi C3-C12, en el que los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi estan opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi estan opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
L es un grupo enlazador seleccionado entre grupos lineales o ramificados alquileno C1-C24, grupos alquenileno C2-C24, grupos alquinileno C2-C24, grupos cicloalquileno C3-C24, grupos cicloalquenileno C5-C24, grupos cicloalquinileno C8-C24, grupos alquil (hetero)arileno C7-C24, grupos (hetero)arilalquileno C7-C24, grupos (hetero)arilalquenileno C8-C24, grupos (hetero)arilalquinileno C9-C24, los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno y grupos (hetero)arilalquinileno opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos cicloalquenilo C5-C12, grupos cicloalquinilo C8-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2-C12, grupos cicloalquiloxi C3-C1, halogenos, grupos amino, oxo y grupos sililo, pudiendo estar los grupos sililo representados por la formula (R4)3Si-, en la que R4 se ha definido anteriormente;
Q es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, R6, -CH=C(R6)2, -C=CR6, -[C(R6)2C(R6)2O]q-R6, en la que q esta en el intervalo de 1 a 200, -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR6, -N(R6)2, -+N(R6)3, -C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X)XR6, -S(O)R6, -S(O)2R6, -S(O)OR6, -S(O)2OR6, -S(O)N(R6)2, -S(O)2N(R6)2, -OS(O)R6,-OS(O)2R6, -OS(O)OR6, -OS(O)2OR6, -P(O)(R6)(OR6), -P(O)(OR6)2, -OP(O)(OR6)2, -Si(R6)3, -XC(X)R6, -XC(X)XR6, -XC(X)N(R6)2, -N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6 y -N(R6)C(X)N(R6)2, en los que X es oxigeno o azufre, y en los que R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno,
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halogeno, grupos alquilo C1-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24;
R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, grupos alquilo C1-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24; y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en halogeno, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, grupos alquilo C1-C12, grupos arilo C1-C12, grupos alquilarilo C1-C12y grupos arilalquilo C1-C12, en los que R6 es como se ha definido anteriormente, y en el que los grupos alquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo y grupos arilalquilo estan opcionalmente sustituidos.
Factor de adhesion celular
El factor de adhesion celular apoya la union de las celulas al gel. El factor de adhesion celular es preferentemente una secuencia de aminoacidos. Los ejemplos de aminoacidos que se pueden usar ventajosamente en la presente invencion son alanina N-protegida, arginina, asparaginas, acido aspartico, cisterna, acido glutamico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina. Las secuencias adecuadas de aminoacidos incluyen peptidos tales como RGD, GRGDS, IKVAV, KQAGDV y GRGDSP. El factor de adhesion celular tambien puede ser un factor de crecimiento tal como VGEF y BFGF. El factor de adhesion celular tambien puede ser glicoproternas o mucinas.
Se hacen reaccionar la unidad espaciadora y el factor de adhesion celular. El reactante puede injertarse en el grupo enlazador del copolfmero mediante una reaccion de SPAAC libre de cobre.
Propiedades generales del polimero
Los poliisocianopeptidos usados en la presente invencion presentan una estructura bien definida, tal como una estructura helicoidal de lamina beta recubierta de oligo(alquilenglicol) perfecta, de acuerdo con la Figura 1. Esta estructura comprende un nucleo de poli(imina) helicoidal en el que practicamente cada nitrogeno esta sustituido con un colgante peptfdico. Debido a la simetria pseudo-helicoidal 41 de la cadena principal de poli(imina), cada uno de los colgantes injertados sobre el nitrogeno enesimo participa en un empaquetamiento de tipo lamina beta intramolecular con el correspondiente colgante injertado sobre la posicion n + 4. Los segmentos peptfdicos se decoran adicionalmente con sustituyentes oligo(alquilenglicol) que forman la cubierta exterior de la estructura. La hidrosolubilidad de los materiales resultantes esta directamente relacionada con la eleccion de sustituyentes adecuados de oligo(etilenglicol). Finalmente, el sentido helicoidal de la cadena polimerica esta dictado por la quiralidad de los aminoacidos conectados a los grupos imina.
Los poliisocianopeptidos usados en la presente invencion tienen defectos estructurales mrnimos o nulos en los polfmeros obtenidos. El termino mrnimo se debe interpretar como que mas del 96 % de las cadenas laterales correctas estan correctamente unidas a la cadena principal polimerica, tal como el 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o incluso 100 %.
En otras palabras, debido a la polimerizacion directa de los monomeros funcionalizados, la aparicion de defectos estructurales con respecto a la densidad del injerto de las cadenas laterales es minima en los materiales resultantes.
Los poliisocianopeptidos usados en la presente invencion pueden ser polfmeros helicoidales homogeneos, estables, hidrosolubles de alto grado de polimerizacion [GP] > 500 y un largo periodo de persistencia.
La invencion proporciona hidrogeles homogeneos que comprenden los poliisocianopeptidos con funcionalidad oligoalquileno y tambien hidrogeles heterogeneos que comprenden mezclas de poliisocianopeptidos con funcionalidad oligoalquileno con un numero diferente de unidades de etilenglicol.
Los poliisocianopeptidos con funcionalidad oligoalquileno obtenidos son capaces de formar hidrogeles termorreversibles fuertes con temperatura de gelificacion ajustable. Para gelificar ffsicamente el agua, los isocianopeptidos de poli[oligo(etilenglicol)] de acuerdo con la invencion tienen preferentemente un grado de polimerizacion [GP] > 500.
Se prepara un hidrogel a partir del copolfmero obtenido por gelificacion con un medio de cultivo celular adecuado. El hidrogel es un hidrogel tridimensional. La concentracion de polfmero en el hidrogel es 1,2-3,0 mg/ml. Si la concentracion de polfmero en el hidrogel es demasiado baja, el hidrogel es demasiado debil para apoyar el crecimiento de la red 3D celular. Si la concentracion de polfmero en el hidrogel es demasiado alta, el hidrogel se vuelve demasiado rigido para que las celulas se muevan y crezcan dentro del gel.
Preferentemente, el hidrogel tiene un modulo elastico de 10 a 5.000 Pa a 35 °C como se determino mediante experimentos de reologfa. Esto permite que las celulas se muevan y crezcan para formar una estructura de celulas 3D como, por ejemplo, un sistema prevascular.
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Los hidrogeles obtenidos a partir de los poliisocianopeptidos de oligo(alquilenglicol) usados en la invencion difieren de la mayona de los hidrogeles basados en polfmeros anteriormente descritos en la naturaleza altamente estructurada de la red formada tras la gelificacion. La red consiste en manojos retorcidos de cadenas polimericas agregadas lateralmente. Esta disposicion es similar a la estructura de las redes fibrilares que se forman sobre la gelificacion de hidrogelificantes de bajo peso molecular. Se supone que este fenomeno esta relacionado con el largo penodo de persistencia de los poliisocianopeptidos que favorecen un modo original de asociacion. La asociacion es desencadenada por la modulacion inducida por la temperatura de la hidrofilia de las cadenas laterales de oligo(alquilenglicol), que es un fenomeno perfectamente reversible, dando como resultado una agregacion/disolucion completamente termorreversible de los poliisocianopeptidos con funcionalidad oligo(alquilenglicol).
La descripcion clasica de hidrogeles polimericos ffsicos comprende la formacion de cadenas de una red de enmaranamiento en soluciones concentradas, la formacion de una red de percolacion debido a la separacion espinodal, la formacion de microcristales y la formacion de redes de micelas o estructuras laminares que aparentemente difieren del modo de asociacion postulado del poliisocianopeptido de oligo(alquilenglicol).
Los hidrogeles resultantes del poliisocianopeptido de oligo(alquilenglicol) resultan de la asociacion lateral de fibras de polfmeros de aproximadamente 5 nm de diametro en manojos retorcidos de mayor tamano que forman la base de la red polimerica de hidrogel. Esto da como resultado una estructura altamente porosa con un tamano de poro que puede bajar a 50 nm de diametro.
Debido al comportamiento termosensible de las cadenas laterales de etilenglicol, los polfmeros usados en la presente invencion presentan transiciones de LCST claras. Para un poliisocianopeptido de oligo(alquilenglicol) dado, esta temperatura se puede modificar variando la fuerza ionica de la solucion (efecto de la sal) o, mas generalmente, mediante la adicion de cualquier compuesto capaz de modificar el estado general de solvatacion de los polfmeros.
La LCST de los materiales puede modularse adicionalmente actuando sobre la cadena principal de poli(isocianuro) y, en concreto, sobre su configuracion, con el uso de acidos o cualquier compuesto que pueda conducir a cambios configuracionales de la helice de la cadena principal.
Otra forma de modular la LCST de los polfmeros consiste en copolimerizar monomeros que porten diferentes cadenas laterales de oligo(alquilenglicol). Por ejemplo, se permite la polimerizacion de mezclas de isocianodialanina de tri- y tetra(etilenglicol) en diferentes proporciones para ajustar la temperatura de gelificacion de los copolfmeros resultantes entre 22 °C y 60 °C en agua mQ.
Se ha encontrado que la longitud de la cadena polimerica influye en la gelificacion. Las cadenas con menor grado de polimerizacion teman una fuerte tendencia a precipitar en lugar de formar geles. Se espera que este sea un efecto general para los polfmeros ngidos o semiflexibles, cuya hidrofilia puede variarse sin modificar la estructura general de las cadenas (es decir, en las estructuras ngidas, la cadena no se derrumba, sino que se agrega lateralmente con otras cadenas para formar fibras extendidas).
Se ha observado una influencia adicional de la longitud de los polfmeros en relacion con las propiedades opticas de los geles resultantes. Se encontro que los hidrogeles preparados a partir de cadenas con un menor grado de polimerizacion eran propensos a ser turbios u opacos. Aumentando el grado medio de polimerizacion se obtuvo una disminucion de la opacidad de los hidrogeles que, finalmente, condujo a materiales completamente transparentes opticamente.
La temperatura del gel se puede ajustar hasta cierto punto, con la posibilidad de formar geles estructurados estables a 25 °C, conduciendo, por lo tanto, a una nueva matriz biomimetica que se puede usar para encapsular enzimas o celulas y preservar su actividad in vitro.
Los polfmeros usados en la invencion paredan tener algunas propiedades ventajosas e interesantes. Debido a la longitud y a la rigidez del polfmero, los geles, en algunos casos, se compoman del 99,00 al 99,98 % de agua. Esto significa que solo se requiere muy poco material para generar un gran volumen. Un unico filamento del polfmero pareda tener un diametro de aproximadamente 4 nanometros y un peso molecular de 2.500.000 Da. El mdice de polidispersidad (PDI) fue de 1,6 y una longitud de cadena media vario entre 500 nm y 2 micrometres. Los polfmeros paredan ser bastante ngidos, con un penodo de persistencia de 70 a 90 nm. Tambien fue posible obtener helices de izquierda y derecha de acuerdo con la quiralidad del fragmento peptfdico (materiales opticamente activos). Los presentes inventores tambien fueron capaces de producir una red de fibrillas bien definida con un tamano de poro controlado por la concentracion de polfmero, incluso a 100-250 nm. Tambien fue posible introducir grupos laterales reactivos de forma eficaz en las cadenas. Por lo tanto, los polfmeros pueden usarse como un armazon para biomoleculas. Se encontro que el tamano de la porosidad esta controlado por la concentracion.
Los ejemplos de biomoleculas son: agentes biologicos, proternas, glicoprotemas, peptidos, azucares, hidratos de carbono, lipoproternas, lfpidos, glicolfpidos, sflices, farmacos, acidos nucleicos, aDn, ARN, vitaminas, nutrientes, hidrolizados, polisacaridos, monosacaridos, peptidos recombinantes, mucinas, compuestos bioorganicos,
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biomoleculas recombinantes, anticuerpos, hormonas, factores de crecimiento, receptores, agentes de contraste, citocinas, y fragmentos y modificaciones de los mismos.
Cultivo celular
El cultivo celular de acuerdo con la invencion comprende el hidrogel como se ha descrito anteriormente. El cultivo celular es un armazon poroso tridimensional.
La invencion proporciona ademas un proceso de preparacion del cultivo celular de acuerdo con la presente invencion, que comprende las etapas de:
a) proporcionar el copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol);
b) mezclar el copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol) con un medio de cultivo celular para obtenerse el hidrogel.
En principio, el cultivo celular puede prepararse con cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de celulas (animales). Los medios de cultivo celular adecuados apoyan el crecimiento y la diferenciacion de las celulas usadas en el metodo de la invencion.
Las directrices para la eleccion de un medio de cultivo celular y las condiciones de cultivo celular son bien conocidas y se proporcionan, por ejemplo, en los capftulos 8 y 9 de Freshney, R. I. “Culture of animal cells (a manual of basic techniques)”, 4a edicion 20O0, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. “Cell & Tissue culture: Laboratory Procedures”, 1993, John Wiley & Sons. En general, un medio de cultivo celular para celulas (de mairnfero) comprende sales, aminoacidos, vitaminas, lfpidos, detergentes, tampones, factores de crecimiento, hormonas, citocinas, oligoelementos, hidratos de carbono y otros nutrientes organicos disueltos en una solucion salina fisiologica tamponada. Los ejemplos de sales incluyen sales de magnesio, por ejemplo, sales de hierro de MgCl2^6H2O, MgSO4 y MgSOW^O, por ejemplo, FeSOWH2O, sales de potasio, por ejemplo, KH2PO4, KCI; sales de sodio, por ejemplo, NaH2PO4, Na2HpO4 y sales de calcio, por ejemplo, CaC^2H2O. Los ejemplos de aminoacidos son los 20 aminoacidos proteinogenicos conocidos, por ejemplo, histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Los ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina. CI, mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina.
Los ejemplos de lfpidos incluyen: acidos grasos, por ejemplo, acido linoleico y acido oleico; peptona de soja y etanolamina. Los ejemplos de detergentes incluyen Tween 80 y Pluronic F68. Un ejemplo de un tampon es HEPES.
Los ejemplos de factores de crecimiento/hormonas/citocinas incluyen IGF, hidrocortisona e insulina (recombinante).
Los ejemplos de elementos traza son conocidos por el experto en la materia, e incluyen Zn, Mg y Se. Los ejemplos de hidratos de carbono incluyen glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa y piruvato.
El medio de cultivo puede complementarse con factores de crecimiento, metabolitos, etc.
Los ejemplos de medio de cultivo adecuado incluyen el medio de crecimiento endotelial (EGM-2, Lonza, Walkersville, EE.UU.), completamente suplementado con suero bovino getal, hidrocortisona, hFGF-B, VEGF, R3- IGF-1, hEGF de acido ascorbico y GA-1000 y medio de celulas del musculo liso (SMCM, ScienCell, Carlsbad, EE.UU.) con los suplementos que incluyen suero bovino fetal, suplemento de crecimiento de celulas del musculo liso y penicilina/estreptomicina.
Las condiciones optimas en las que las celulas se cultivan pueden ser facilmente determinadas por el experto en la materia. Por ejemplo, el pH, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad del medio de cultivo celular no son, en principio, de importancia fundamental, y dependen del tipo de celula escogida.
Preferentemente, el pH, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad se seleccionan de manera que estas condiciones sean optimas para el crecimiento y la productividad de las celulas. El experto en la materia sabe como encontrar el pH optimo, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad.
Normalmente, el pH optimo esta entre 6,6 y 7,6, la temperatura optima esta entre 30 y 39 °C, por ejemplo, una temperatura de 36 a 38 °C, preferentemente una temperatura de aproximadamente 37 °C; la osmolaridad optima esta entre 260 y 400 mOsm/kg.
La invencion proporciona ademas un proceso de cultivo de celulas, comprendiendo el proceso las etapas de:
a) proporcionar el cultivo celular de acuerdo con la invencion;
b) anadir las celulas al cultivo celular a una temperatura por debajo de la temperatura de gelificacion del hidrogel;
y
c) cultivar las celulas.
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De acuerdo con un aspecto, la presente invencion proporciona un cultivo celular que comprende un hidrogel que comprende el copoliisocianopeptido con funcionalidad oligo(alquilenglicol), y al menos una de celulas endoteliales y celulas del musculo liso. Las celulas son preferentemente celulas endoteliales cocultivadas y celulas del musculo liso. La concentracion de las celulas puede ser, por ejemplo, de 2.000 celulas/ml a 1.000.000 celulas/ml. Se puede obtener de este modo una estructura tridimensional como, por ejemplo, un sistema vascular. La invencion proporciona ademas el uso del cultivo celular de acuerdo con la invencion para fabricar un sistema prevascular.
Se observa ademas que la invencion se refiere a todas las posibles combinaciones de caractensticas descritas en el presente documento, prefiriendose, en particular, aquellas combinaciones de caractensticas que estan presentes en las reivindicaciones. Se observa ademas que la expresion "que comprende" no excluye la presencia de otros elementos. Sin embargo, tambien debe entenderse que una descripcion de un producto que comprende ciertos componentes tambien desvela un producto que consiste en estos componentes. De forma similar, tambien debe entenderse que una descripcion de un proceso que comprende ciertas etapas tambien desvela un proceso que consiste en estas etapas.
La Figura 1 ilustra una representacion esquematica de los poliisocianopeptidos con funcionalidad oligoalquileno helicoidales basados en una unidad de dialano (centro superior). El plegamiento de la cadena principal se estabiliza mediante una red de union al hidrogeno que se desarrolla dentro de la helice, entre los lfmites airndicos apilados de las cadenas laterales (centro inferior). Esta estructura secundaria conduce a cadenas muy ngidas que se visualizan mediante AFM (derecha).
La Figura 2 es un esquema que muestra un ejemplo de la ruta de preparacion de un ejemplo del primer monomero.
La Figura 3 es un esquema que muestra un ejemplo de la ruta de preparacion de un ejemplo del segundo monomero.
Parte experimental
Materiales: Se destilo tolueno sobre sodio. El diclorometano se destilo sobre pentoxido de fosforo. La N- metilmorfolina se destilo nuevamente sobre sodio antes de su uso. El agua se purifico con un sistema MiliporeMiliQ, (agua mQ 18,2 MQ). Todos los demas productos qmmicos se usaron como se recibieron. La cromatograffa en columna se realizo usando gel de sflice (0,060-0,200 mm) proporcionado por Baker. Los analisis de cromatograffa de capa fina (TLC) se llevaron a cabo sobre vidrio recubierto de sflice 60 f254 obtenido en Merck, y los compuestos se visualizaron usando ninhidrina o soluciones acuosas basicas de KMnO4. Todos los cristales se remojaron en NaOH 0,5 M antes de su uso.
Ejemplo 1
(1) Preparacion del copolfmero
(1.1) Preparacion del primer comonomero
El primer comonomero injertado con un grupo enlazador se sintetizo de acuerdo con el esquema de la Figura 2.
1.1.1. Sintesis de sulfonato de 2-(2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)etoxi)etil 4-metilbenceno (S1)
Se disolvio tetraetilenglicol (28,5 ml, 164,3 mmol) en 50 ml de piridina. Seguidamente, se enfrio la solucion hasta 0 °C mientras se agitaba. Se burbujeo argon a traves de la solucion durante 15 minutos. Se anadio cloruro de tosilo (21,93 g, 115 mmol) en porciones a la solucion en agitacion. Se agito la mezcla mas a temperatura ambiente durante 12 horas. Se diluyo la mezcla de reaccion con 50 ml de acido cftrico al 10 %. Se extrajo la mezcla tres veces en 250 ml de cloroformo. Se secaron las capas organicas combinadas sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se evaporaron a vacfo. Se purifico el aceite amarillo resultante usando cromatograffa en columna (SiO2, 0,060-0,200 mm; acetato de etilo como eluyente), proporcionando S1 en forma de un aceite amarillo palido (11,69 g, 33,6 mmol, 29 %); Rf = 0,4 (acetato de etilo).
FT-IR (cm'1, ATR) 3442 (O-H), 2870 (C-H), 1597 (N-H), 1453 (C-H), 1352 (S=O), 1175 (S=O), 1096 (C-O); 1H RMN 5h(300 MHz; CDCl3; Me4Si) 7,80 (dd, J = 7,81 Hz,
2H, -CHAr-), 7,33 (d, J = 7,35 Hz, 2H, -CHAr-S), 4,17 (m, 2H, O-CH2-CH2-), 3,65 (m, 16H, -CH2-), 2,45 (s, 3H, -CH3); 13C RMN 5C(75 MHz; CDCla; Me4Si) 21,16 (1C,
[0099]CCH3), 61,0 (1C, COH), 68,13(1C, COS), 69,0 (1C, OCH2), 70,0, 70,1, 70,1, 70,2 (4C, OCH2), 70,8, 72,0 (2C, OCH2), 127,5 (2C, CHCCH), 129,5 (2C, CHCCH), 139,7 (1C, CCH3), 144,5 (1C, CHCS).
1.1.2. Sintesis de (R)-2-(2-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil-2-((terc-butoxicarbonil)amino)propanoato (S2)
Se disolvieron el compuesto S1 (5,23 g, 15,01 mmol), N-Boc-(L)-alanina (2,86 g, 15,01 mmol) y DMAP (0,988 g, 1,65 mmol) en 25 ml de CH2Cl2 recien destilado y se enfrio hasta 0 °C mientras se agitaba. Se anadio DCC (3,12 g, 15,01 mmol) en porciones. La mezcla se volvio amarilla y se agito durante 1 hora a 0 °C, y por tanto, se agito durante 3 h a temperatura ambiente. Se retiro la diciclohexilurea precipitada por filtracion y se lavo con acetato de etilo (3 x 20 ml).
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Se concentro la capa organica al vado. Se purifico el producto en bruto usando cromatograffa en columna (SiO2, 0,060-0,200 mm; MeOH al 1 %/CH2Cl2 como eluyente), proporcionando S2 en forma de un aceite naranja claro (5,49 g, 11,4 mmol, 76 %); Rf = 0,4 (MeOH al 10 %/CH2Cl2).
FT-IR (cm-1, ATR) 2,924 (C-H), 1,745 (C=O ester), 1712 (C=O amida), 1,597 (N-H), 1,452 (C-H), 1,352 (S=O), 1,173 (S=O), 1,120 (C-O); 1H RMN 5h(300 MHz; CDCI3; Me4Si) 7,79 (d, J = 8,4 Hz, 2H, -CHap-), 7,33 (d, J = 8,1 Hz, 2H, - CHap-), 5,02 (s, 1 H, -NH-), 4,28 (m, 3H, -CH(CHs)-, COOC-2-), 4,15 (m, 2H, O-CH2-CH2-), 3,69 (m, 14H, O-CH2- CH2-), 2,44 (s, 3H, -CH3), 1,44 (s, 9H, -OC(CHs)3), 1,37 (d, J = 7,2 Hz, 3H, -CH(CHs)-); 13C RMN 5C(75 MHz; CDCla; Me4Si) 18,8 (1C, CHCH3), 21,7 (1C, CCH3), 28,4 (3C, C(CH3)3), 49,4 (1C, O(C=O)CHNH), 64,5 (1C, Boc-OCH2), 68,9 (2C, OCH2), 69,4 (1C, OCH2), 70,7 (4C, OCH2), 80,3 (1C, C(CH3)3), 128,2 (2C, CHCCH), 130,0 (2C, CHCCH),
145,0 (1C, CCH3), 155,4 (1C, CHCS), 173,6 (1C, CH(C=O)NH), 176,7 (1C, CH(C=O)O); MS (ESI) m/z [M+Na]+calc 542,2; obtenida 542,2.
1.1.3. __________Sintesis___________de___________(R)-2-(2-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil-2-((S)-2-((terc-
butoxicarbonil)amino)propanamido)propanoato (S3)
Se disolvio el compuesto S2 (5,94 g, 1,14 mmol) en 60 ml de acetato de etilo saturado con HCl, y se agito durante 2 h a temperatura ambiente. Se evaporo el disolvente al vado y se retiro el HCl en exceso anadiendo 30 ml de CH2Cl2 y 1 ml de n-BuOH seguido de la evaporacion. Se retiro el n-BuOH residual mediante destilacion azeotropica con 3 x 30 ml de CH2Cl2. Se disolvieron la sal de HCl resultante de S2, N-Boc-(D)-alanina (2,14 g, 1,14 mmol) y monohidrato de N-hidroxibenzotriazol (1,74 g, 1,14 mmol) en 40 ml de CH2Cl2 reden destilado. Se anadio gota a gota DIPEA (2 ml, 1,14 mmol) y se agito la mezcla a temperatura ambiente hasta que todo se disolvio. Se enfrio la solucion hasta 0 °C y se anadio DCC (2,35 g, 11,4 mmol) en porciones. Se formo un precipitado blanco y la mezcla se agito durante 1 h a 0 °C seguido de 3 h de agitacion a temperatura ambiente. Se separo el precipitado por filtracion, se lavo con acetato de etilo (3 x 30 ml) y se evaporo el disolvente al vado. Se purifico el producto en bruto usando cromatograffa en columna (SiO2, 0,060-0,200 mm;
MeOH al 2 %/CH2Cl2 en forma de eluyente), proporcionando S3 en forma de un aceite amarillo palido (3,37 g, 5,7 mmol, 52 %); Rf = 0,3 (MeOH al 10 %/CH2Cl2).
FT-IR (cm'1, ATR) 2,876 (C-H), 1,740 (C=O ester), 1,718 (C=O amida), 1667 (N-H), 1522 (N-H), 1452 (C-H), 1365 (S=O), 1161 (S=O), 1105 (C-O); 1H RMN 5H(300 MHz; CDCl3; Me4Si) 7,80 (d, J = 8,4, 2H, -CHap- C-S), 7,36 (d, J = 8,1, 2H, -CHap-), 6,91 (s, 1 H, -NH), 5,00 (s, 1 H, -NH), 4,58 (m, 1 H, -NHCH(CH3)-), 4,28 (m, 2H, -COOCH2-), 4,14 (m, 2H, O-CH2-CH2-), 3,61 (m, 12H, -C(O)OCH2CH2O(CH2CH2O)3-), 2,45 (s, 3H,-CH3), 1,45 (s, 9H, -OC(CH3)3), 1,40 (d, J = 7,2, 3H, -CH(CH3)-), 1,35 (d, J = 7,2, 3H,-CH(CH3)-); 13C RMN 5C(75 MHz; CDCI3; Me4Si) 18,2 (2C, CHCH3),
21.7 (1C, CCH3), 28,4 (3C, C(CH3)3), 47,2 (1C, NCH), 50,0 (1C, NCH), 64,5 (1C, Boc-OO-y, 68,7 (2C, OCH2), 69,3 (1C, OCH2), 70,6 (4C, OCH2), 80,2 (1C, C(CH3)3), 128,0 (2C, CHCCH), 129,9 (2C, CHCCH), 133,1 (1C CCH3), 144,9 (1C, CHCS), 172,7 (2C, C=O); MS (ESI) m/z [M+Na]+calc 613,2; obtenida 613,1.
1.1.4. Sintesis de (R)-2-(2-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil-2-((S)-2-formamidopropanamido)propanoato (S4)
Se desprotegio el compuesto S3 (1,70 g, 2,85 mmol) siguiendo el mismo procedimiento descrito para el compuesto S2 y se uso sin purificacion adicional. Se disolvio el producto en bruto en 25 ml de formiato de etilo. Se anadio formiato sodico (0,97 g, 14,25 mmol), y se calento la mezcla durante 8 horas a 66 °C. Se enfrio la mezcla hasta la temperatura ambiente y se separo el solido por filtracion. Se evaporo el disolvente al vado. Se purifico el producto en bruto usando cromatograffa en columna (SiO2, 0,060-0,200 mm; MeOH al 4 %/CH2Cl2 como eluyente), proporcionando S4 en forma de un aceite amarillo claro (0,79 g, 1,52 mmol, 54 %); Rf = 0,3 (MeOH al 10 %/CH2Cl2). FT-IR (cm'1, ATR) 2873 (C-H), 1738 (C=O), 1653 (N-H), 1532 (N-H), 1452 (C-H), 1352 (S=O), 1174 (S=O), 1097 (CO); 1H RMN 5h(300 MHz; CDCl3; Me4Si) 8,18 (s, 1 H, HC(O)NH-), 7,79 (d, J = 8,4, 2H, -CHap- C-S), 7,35 (d, J = 8,7, 2H, -CHap-), 6,78 (s, 1 H, -NH), 6,55 (s, 1 H, -NH), 4,55 (m, 2H, -NHCH(CH3)-), 4,30 (m, 2H, -COOCH2-), 4,13 (m, 2H, O-CH2-CH2-), 3,61 (m, 12H, -(CH2CH2O)3-), 2,44 (s, 3H, -CH3), 1,42 (m, 6H,-CH(CH3)-); 13C RMN 5C(75 MHz; CDCI3; Me4Si) 17,9 (1C, CHCH3), 18,2 (1C, CHCH3), 21,7 (1C, CCH3), 47,2 (1C, O(C=O)HNCH), 48,1 (1C, HNHC(C=O)), 64,5 (1C, OCH2), 68,7 (2C, OCH2), 69,3 (1C, OCH2), 70,6 (4C, OCH2), 128,0 (2C, CHCCH), 129,9 (2C, CHCCH), 133,1 (1C, CCH3), 144,9 (1C, CHCCH), 161,0 (1C, H(C=O)NH)), 172,6 (1C, CH(C=O)NH), 173,2 (1C, CH(C=O)O); MS (ESI) m/z [M+Na]+calc 541,2; obtenida 541,2.
1.1.5. Sintesis de (R)-2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil-2-((S)-2-formamido-propanamido)propanoato (S5)
Se disolvio el compuesto S4 (5,550 g, 1,06 mmol) en 40 ml de EtOH absoluto. Se anadio azida de sodio (0,38 g, 5,9 mmol), y se calento la mezcla a reflujo durante la noche. Una vez enfriados hasta la temperatura ambiente, se separaron los solidos por filtracion y se seco el filtrado al vado. Se purifico el producto en bruto usando cromatograffa en columna (SiO2, 0,060-0,200 mm; MeOH al 4 %/CH2Cl2 como eluyente), proporcionando S5 en forma de un aceite naranja palido (0,32 g, 0,82 mmol, 78 %); Rf = 0,4 (MeOH al 10 %/Ch2CI2).
FT-IR (cm'1, ATR)3309 (N-H), 2875 (C-H), 2105 (N3), 1737 (C=O), 1651 (N-H), 1529 (N-H), 1453 (C-H), 1133 (C-O); 1H RMN 5h(300 MHz; CDCI3; Me4Si) 8,20 (s, 1 H, HC(O)NH-), 6,84 (s, 1 H, -NH), 6,60 (s, 1 H, -NH), 4,60 (m, 2H, NHCH(CH3)), 4,26 (m, 2H, -C(O)OCH2-), 3,68 (m, 12H, -(CH2CH2O)3-), 3,40 (m, 2H, N3CH2-), 1,42 (m, 6H,-CH(CH3)- ); 13C RMN 5C(75 MHz ; CDCI3; Me4Si) 17,9 (1C, CH3), 18,2 (1C, CH3), 47,4 (1C, CH2N3), 48,4 (1C, H(C=O)HNCH),
50.7 (1C, HNC(CH3)C=O), 69,0 (1C, CH2CH2O), 70,1 (1C, OCH2CH2), 70,6 (2C, OCH2), 70,7 (2C, OCH2), 161,4 (1C, H(C=O)NH), 172,7 (1C, CH(C=O)NH), 172,9 (1C, CH(C=O)O); MS (ESI) m/z [M+Na]+calc 412,2; obtenida 412,2.
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1.1.6. Sintesis de fR)-2-f2-f2-f2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil-2-f(S)-2-isocvanopropanamido)propanoato (1)
Se disolvieron el compuesto S5 (221 mg, 0,57 mmol) y W-metilmorfolina (0,24 ml, 2,27 mmol) en 150 ml CH2CI2 recien destilado y se enfrio hasta -40 °C (bano de acetona seco) bajo una atmosfera de argon. Se anadio una solucion de difosgeno (0,048 ml, 0,398 mmol) en 10 ml de CH2Cl2 recien destilado gota a gota bajo argon durante 1 h. Mientras se anadfa el difosgeno, la mezcla se agito y se mantuvo estrictamente a -40 °C. Una vez que la mezcla comenzo a ponerse amarilla, se inactivo la reaccion rapidamente con un exceso de bicarbonato de sodio (5 g). Se agito la mezcla inactivada durante 5 minutos a -40 °C. Se paso la mezcla de reaccion a traves de un lecho corto de columna de sflice (SiO2, 0,060-0,200 mm). Se lleno el lecho corto con CH2Ch, pero el compuesto deseado se eluyo con CH2Cl2/acetonitrilo (3:1), proporcionando 1 en forma de un aceite amarillo palido (48,1 mg, 0,48 mmol, 27 %); Rf = 0,5 (MeOH al 10 %/CH2Cl2).
FT-IR (cm'1, ATR)3318 (N-H), 2875 (C-H), 2142 (CeN), 2105 (N3), 1744 (C=O), 1540 (N-H), 1453 (C-H), 1123 (C-O); 1H RMN 5h(300 MHz; CDCh; Me4Si) 7,00 (bd, 1H,-NH-), 4,59 (m, 1 H, -NHCH(CHa)C(O)O-), 4,32 (m, 3H, (- C(O)OCH2CH2O-), -CeNCH(CH3)C(0)NH-), 3,67 (m, 12H, -(OC^C^b), 3,39 (m, 2H, N3CH2-), 1,65 (d, J = 7,2, 3H, CeNCH(CH3)C(0)-), 1,48 (d, J = 7,2, 3H, CeNCH(CH3)C(O)-); 13C RMN 5C(75 MHz; CDCl3; Me4Si) 170,69 (1C, CH(CH3)C(O)OCH2), 165,72 (1C, CH(CH3)C(O)NH), 70,69, 70,65, 70,61, 70,56, 70,02, 68,81 (1C, CH2CH2O), 50,66 (1C, CH2N3), 48,56 (CENCH), 19,66, 18,04 (1C, CH(CH3)CO); MS (ESI) m/z [M+Na]+
(C15H25N3O6Na), calc 394,17; obtenida 394,1.
(2.1) Preparacion del segundo comonomero
El segundo comonomero, que no esta injertado con un grupo enlazador, se sintetizo de acuerdo con el esquema de la Figura 3.
2.1.1 Sintesis de 2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil-2-aminopropanoato (S6)
Se anadieron trietilenglicolmetoxi (25 ml, 156,21 mmol), L-alanina (21,85 g, 245,25 mmol), acido p-toluenosulfonico (32,69 g, 171,83 mmol) y 250 ml de tolueno en un matraz de fondo redondo. Se calento la mezcla de reaccion a reflujo a 126 °C durante 4 h. Se separo por filtracion un precipitado solido y se evaporo el disolvente a presion reducida. A continuacion, se disolvio el producto con 300 ml de cloroformo, y se extrajo la capa organica tres veces con NaHCO3 (saturado). A continuacion, se extrajo la capa acuosa dos veces con cloroformo. Se secaron las capas organicas con Na2SO4, y se evaporo el disolvente a presion reducida, obteniendose 22,69 g de S6 con un rendimiento del 62 %.
2.1.2 Sintesis de 2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil-2-((terc-butoxicarbonil)amino)propanoato (S7)
Se mezclaron entre sf Boc-D-Ala-OH (18,25 g, 96,44 mmol), DMAP (0,1 g, 0,8 mmol), DiPEA (1,7 ml, 9,64 mmol), HoBt (14,77 g, 96,44 mmol), DCC (21,89 g, 106,08 mmol), S6 (22,69 g, 96,44 mmol) y 250 ml de CH2Cl2, se enfrio en un bano de hielo hasta 0 °C y se agito durante 3 horas. Tras ello, se dejo que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 15 h. Se separo el solido por filtracion, se disolvio el producto con 200 ml de cloroformo y se extrajo la solucion tres veces con acido cffrico. Se lavo la capa de agua con cloroformo (1 x 200 ml). Se lavo la capa organica dos veces con solucion saturada de NaHCO3, y se extrajo la capa acuosa con cloroformo dos veces mas. Se combinaron las capas organicas, se secaron con Na2SO4, y se evaporo el disolvente a presion reducida. Se uso cromatograffa en columna (MeOH al 2 % en CH2Ch) para purificar el producto en bruto, obteniendose 20,4 g de S7 con un rendimiento del 52 %. Rf = 0,53 (MeOH al 10 %/CH2Cl2)) 1H RMN (CDCh, 400 MHz): 6 = 6,77 (s, 1 H, - NHCH-); 5,09 (s, 1H,-NHCH) -; 4,60 (q, 1 H, -NHCH(CH3)-); 4,31-4,28 (m, 3H,-C(O)OCH2CH2O-, -CH(CH3)COO-); 3,70-3,56 (m, 10H, -C(O)OCH2CH2O(CH2CH2O)2-); 3,38 (s, 1 H, -OCH3); 1,46 (s, 9H, -OC(CH3)3); 1,41 (d, 3H, - NHCH(CH3)-; 1,38 (d, 3H,-NHCH(CH3)-)
Se disolvio S7 (13,15 g, 32,35 mmol) en 20 ml de acetato de etilo y se trato con 20 ml de HCl 4 M en dioxano. Se agito la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras comprobar mediante TLC con el compuesto de partida, se anadieron otros 20 ml de HCl 4 M en dioxano, y se agito adicionalmente la solucion durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiro el f-BuOH residual mediante la adicion de 20 ml de DCM y se elimino a presion reducida. Este procedimiento se repitio tres veces.
2.1.3 Sintesis de 2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil-2-formamidopropanoato (S8)
Se disolvieron la sal de HCl de S7 (13,15 g, 32,33 mmol) y formiato de sodio (8,76 g, 129,33 mmol) en 250 ml de Etilformiato. Se hirvio la mezcla de reaccion durante 14 h a 66 °C. Se separo por filtracion un precipitado y se evaporo el disolvente a presion reducida. Se uso cromatograffa en columna (MeOH al 4 % en CH2Ch) para purificar el producto en bruto, obteniendose 6,04 g de S8 con un rendimiento del 56 %.
Rf = 0,54 (MeOH al 10 %/CH2Cl2) 1H RMN (CDCh, 400 MHz): 6 = 8,23 (s, 1 H, HC(O)NH-); 6,94 (d, 1 H, -NHCH-); 6,79 (d, 1 H, -NHCH-; 4,57 (m, 2 H, NHCH(CH3)-, -NHCH(CH3)-); 4,26 (m, 2H, -C(O)OCH2-); 3,67-3,54 (m, 10H, - C(O)OCH2CH2O(CH2CH2O)3-); 3,43 (s, 3H, -OCH3); 1,45 (t, 6H, -NHCH(CH3)-, -NHCH(CH3)-
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2.1.4 Sintesis de 2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil-2-isocianopropanoato (2)
Se desgasifico S8 (6,04 g, 18,06 mmol) durante 1 hora con N2. A continuacion, se disolvio NMM (5 ml, 45,15 mmol) con CH2Cl2 recien destilado (50 ml) y se anadio a la solucion. Se enfrio la mezcla de reaccion hasta -40 °C (hielo seco/isopropanol). Se anadio gota a gota durante 2 h una solucion de difosgeno (1,52 ml, 12,64 mmol) en CH2Cl2 (50 ml) Se agito la mezcla de reaccion hasta que se volvio de color naranja amarillento, y se inactivo con NaHCO3 (3 g). Se uso cromatograffa en columna (ACN/CH2O21:2) para purificar el producto en bruto, obteniendose 3,34 g de 2 con un rendimiento del 51 %.
Rf = 0,50 (MeOH al 10 %/CH2Cl2). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 6 = 7,00 (d, 1 H, -NH-); 4,58 (m, 1 H, CENCH(CH3)C(O)NH-); 4,28 (m, 2H, -C(O)OCH2CH2O-); 4,26 (m, 1H,-NHCH(CH3)C(O)O-); 3,74-3,53 (m, 10H, - OCH2CH2(OCH2CH2)3OCH3); 3,41 (s, 3H,-OCH3); 1,67 (d, 3H, CENCH(CH3)C(O)-); 1,49 (d, 3H, -NHCH(CH3)C(O)O- ).
(3) Polimerizacion
Se disolvieron el Compuesto 2 (por ejemplo, 100 eq) y el Compuesto 1 (1 eq) en 2 ml de tolueno destilado. La solucion madre del catalizador de 1 mM se preparo disolviendo 39 mg de Ni(C^O4)2 • 6 H2O en 10 ml de etanol absoluto y 90 ml de tolueno. Se pipeteo a los monomeros un volumen igual a un mol de monomero total x 10-4. La mezcla se diluyo con tolueno destilado, obteniendose una concentracion final de 25 mg/ml de monomero. Se agito la mezcla durante 72 h a temperatura ambiente en un matraz dotado de un tubo de secado de CaCl2. El polfmero se aislo por precipitacion en diisopropileter. Se repitio este ciclo de precipitacion tres veces, obteniendose rendimientos que vanan de un rendimiento del 44 al 92 %. Los polfmeros se analizaron midiendo la viscosidad intrmseca, la reologfa (G') y el dicrofsmo circular, y se visualizaron por precipitacion gota a gota desde la solucion sobre mica mediante AFM.
(4) Injerto de unidad espaciadora/unidad de adhesion celular en el copolfmero
Se disolvio un peptido (GRGDS) en tampon de borato a pH 8,4 hasta una concentracion final de 2 mg/ml. Se anadio una unidad espaciadora representada por la formula (III) (BCN-NHS) en una proporcion molar de 1:1 a la solucion de peptido y se mezclo a 300 rpm a 18 °C durante una hora antes de congelarse en alfcuotas de 100 ul. Se obtuvo BCN-GRGDS representado por la formula (V). MS calc. [C39H62N10O15]: 910,4; obtenida: 911,5.
Se disolvio el poliisocianuro (PIC) obtenido en la etapa anterior en ACN a 2 mg/ml. A esta solucion de PIC, se anadio el volumen apropiado de BCN-GRGDS basado en el equivalente molar de comonomero de azida en la cadena principal de poliisocianuro. Se dejo agitar la mezcla durante 72 horas a 4 °C. Se purifico el peptido PIC por precipitacion en eter diisopropflico. Se decanto el precipitante y se volvio a disolver el peptido de poliisocianuro y precipito de DCM en eter diisopropflico.
(5) Preparacion del hidrogel del copolfmero
A partir de este punto, se tomaron precauciones para garantizar que el poliisocianopeptido permaneciera esteril. Se pulverizo todo el equipo con etanol antes de su uso. Se peso el conjugado de PIC-peptido directamente en un tubo de centrifugacion esteril. Se esterilizaron mas los tubos exponiendolos a radiacion UV durante un penodo de 5 minutos. Se cubrio el PIC-peptido con medio de cultivo celular esteril para obtener la dilucion final del polfmero en medio de 3,2 mg/ml y se dejo hinchar durante 24 horas a 4 °C. Despues de 24 horas, se obtuvo una sustancia similar a un gel hinchado en la parte inferior del tubo de centrifugacion. Se agito el conjugado de PIC-peptido hinchado durante 72 horas a 4 °C, tras lo que se obtuvo una solucion uniforme. La solucion mostro una transicion mtida en la viscosidad por encima de la temperatura cntica.
Los conjugados de PIC-peptido en medio permanecieron estables hasta 20 meses a 4-7 °C o durante penodos mas largos cuando se congelaron.
Para la preparacion de construcciones de prevascularizacion de rigidez y concentracion apropiadas, se diluyo la solucion madre de gel a 3,2 mg/ml con una cantidad apropiada de medio para alcanzar la concentracion final deseada de polfmero, que fue de 2,0 mg/ml.
(6) Preparacion del hidrogel que comprende las celulas
(6-1) Preparacion del medio celular que comprende las celulas
Se expandieron HUVEC (ACTT, PCS-100-010, EE.UU.) en medio de crecimiento endotelial (EGM-2, Lonza, Walkersville, EE.UU.), completamente suplementado con suero bovino getal, hidrocortisona, hFGF-B, VEGF, R3- IGF-1, hEGF de acido ascorbico y GA-1000. Se expandieron HbSMC (ScienCell, 4310, Carlsbad, EE.UU.) en medio de celulas del musculo liso (SMCM, ScienCell, Carlsbad, EE.UU.) con los suplementos incluyendo suero bovino fetal, suplemento de crecimiento de celulas del musculo liso y penicilina/estreptomicina. Estos dos tipos de celulas se expandieron en matraz T75 (Corning Incorporated, Corning, EE.UU.) en CO2 al 5 % a 37 °C. El medio se cambio
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tres veces a la semana y las celulas se cosecharon con tratamiento con tripsina. Se usaron las HbSMC del paso 8 y las HUVEC del paso 9 en todos los experimented.
(6-2) Mezcla del hidrogel y del medio celular que comprende las celulas
Para la produccion de las construcciones de prevascularizacion, se bajo la temperatura de la solucion del conjugado de PIC-peptido termorreactivado obtenido en la etapa (b) a 0 °C para inducir una transicion de gel a lfquido. Posteriormente, se mezclo una alteuota del gel licuado con la suspension de celulas que contema HUVEC y HbSMC como se obtuvo en la etapa (6-1) para crear la concentracion deseada de celulas de 500.000 celulas/ml. Seguidamente, se transmitieron alteuotas de 200 pl de estas suspensiones de celulas de gel a inserciones de 24 pocillos (tamano de poro de la membrana de 0,2 pm) y se colocaron durante 30 minutos a 37 °C para garantizar la solidificacion del gel.
(7) Cultivo de las celulas para formar un sistema prevascular
Se observo que las celulas se unieron al hidrogel en el plazo de 3 dfas y se observo la vascularizacion en el plazo de 7 dfas.
Se cultivaron las construcciones de prevascularizacion producidas en una mezcla adecuada de medio en CO2 al 5 % a 37 °C durante 14 dfas. Se siguio el progreso de las construcciones de vascularizacion.
Experimento comparativo 2 (baja concentracion de polimero)
Se repitio el Ejemplo 1 a excepcion de que la concentracion de polfmero en la etapa (5) fue de 1,0 mg/ml en lugar de
2.0 mg/ml.
En la etapa (7), tras la solidificacion del gel, se hundieron las celulas gradualmente hasta el fondo de las inserciones de 24 pocillos. Se observaron algunas agrupaciones de brotes de las celulas; sin embargo, las estructuras formadas eran de mala calidad. Los experimentos se terminaron despues de 3 dfas. No se formo ningun sistema prevascular.
Experimento comparativo 3 (alta concentracion de polimero)
Se repitio el Ejemplo 1 a excepcion de que la concentracion de polimero en la etapa (5) fue de 3,2 mg/ml en lugar de
2.0 mg/ml.
En la etapa (7), se observo el progreso de las construcciones de vascularizacion, aunque muy lentamente. Las celulas permanecieron suspendidas en las inserciones de 24 pocillos. Las celulas permanedan de forma esferica desde el dfa 1 al 7 tras lo que se observo el inicio del brote. El experimento se termino despues de 14 dfas. Las estructuras celulares formadas paredan ser de mala calidad y no se formo ningun sistema prevascular. Pareda que el hidrogel era demasiado ngido para que estas celulas en particular se movieran/crecieran dentro del gel de manera eficaz.
A partir de la comparacion del Ejemplo 1 y los experimentos comparativos 2 y 3, se puede concluir que la concentracion del copolfmero en el hidrogel es importante para la formacion de las construcciones de vascularizacion. Un intervalo de concentracion adecuado es de 1,2-3,0 mg/ml.
Experimento comparativo 4 (demasiado poco GRGDS)
Se repitio el Ejemplo 1 excepto que la proporcion entre el compuesto 1 y el compuesto 2 y en la etapa (3) fue de 1:550 en lugar de 1:100.
En la etapa (7), tras la solidificacion del gel, las celulas permanecieron esfericas durante un pertedo prolongado, se observo un brote limitado y la prevascularizacion no se complete despues de 21 dfas. No se formo ningun sistema prevascular.
Experimento comparativo 5 (demasiado GRGDS)
Se repitio el Ejemplo 1 excepto que la proporcion entre el compuesto 2 y el compuesto 1 y en la etapa (3) fue de 1:25 en lugar de 1:100.
En la etapa (7), tras la solidificacion del gel, se observo un crecimiento celular no controlado y no dirigido, y las estructuras formadas no representaron un sistema prevascular.
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Experimento comparativo 6 (demasiado GRGDS)
Se repitio el Ejemplo 1 excepto que la proporcion entre el compuesto 2 y el compuesto 1 en la etapa (3) fue de 1:10 en lugar de 1:100.
En la etapa (5), tras cubrirse el PIC-peptido con medio de cultivo celular esteril, no se obtuvo ninguna sustancia similar a un gel, y se termino el experimento. A partir de la comparacion del Ejemplo 1 y los experimentos comparativos 4 y 5, puede concluirse que la proporcion del comonomero injertado con GRGDS es importante para la formacion de las construcciones de vascularizacion. La proporcion adecuada es de 1:550-1:50.
Experimento 7
Se midio el modulo elastico del hidrogel obtenido en la etapa 5 del Ejemplo 1 de la siguiente manera:
Parte instrumental: Las mediciones reologicas se realizaron usando un reometro Ares G2 de TA Instruments en una configuracion de Couette de ~20 ml con control de temperatura usando un elemento peltier. Las muestras se prepararon mezclando la cantidad apropiada de polfmero en agua desmineralizada (20 ml) y agitando con formacion de vortice la mezcla a lo largo del tiempo (al menos 24 horas) hasta que se obtuvo una solucion homogenea. Se prepararon soluciones de PIC en condiciones refrigeradas (4 °C) para evitar la formacion temprana del gel. Las mediciones en la pauta de respuesta lineal se llevaron a cabo al 4 % de tension a diferentes frecuencias entre 0,5 y 5 Hz. Los datos representados en el manuscrito se registraron a 1 Hz. Las exploraciones de temperatura se registraron a una velocidad de calentamiento de 2 °C min-1. Las mediciones en medios biologicamente relevantes se realizaron en una placa paralela de aluminio de 40 mm Discovery HR-1 de TA Instruments, ajustada a un espacio de 750 um y 1 ml de muestra. La temperatura se controlo usando un elemento peltier y protector de evaporacion. Las muestras de PIC se prepararon mezclando la cantidad apropiada de polfmero en DMEM y agitando continuamente de manera regular a 4 °C (al menos 48 horas) hasta que se obtuvo una solucion homogenea. Las soluciones de PIC se usaron directamente o se congelaron hasta que se pudieron realizar mediciones para evitar los efectos de memoria de las muestras. El matrigel se uso tal como vino del proveedor, y los geles de fibrina se prepararon disolviendo fibrinogeno en DMEM, que contema FBS, y se dejo gelificar durante 2 horas a 37 °C antes de la medicion. Las mediciones en la pauta de respuesta lineal se realizaron a una tension del 2 % a diferentes frecuencias entre 1 Hz. Las exploraciones de temperatura se registraron a una velocidad de calentamiento o enfriamiento de 2 °C min-1.
El modulo elastico resulto ser esencialmente constante en el intervalo de temperaturas de 5 a 15 °C, y se midio en torno a 1 Pa. El modulo elastico aumento hasta aproximadamente 100 Pa a 23 °C. El modulo elastico aumento a aproximadamente 500 Pa a 35 °C.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso de fabrication de un copoliisocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol), proceso que comprende las etapas de:
    i) copolimerizar
    - un primer comonomero de un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) injertado con un grupo enlazador y
    - un segundo comonomero de un isocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) no injertado,
    en el que la proportion molar entre el primer comonomero y el segundo comonomero es de 1:500 y 1:30 y
    ii) anadir un reactante de una unidad espaciadora y un factor de adhesion celular al copolimero obtenido en la etapa i), en el que la unidad espaciadora se representa por la formula general A-L-B,
    en el que el grupo enlazador y el grupo A se seleccionan para que reaccionen y formen un primer acoplamiento, y el factor de adhesion celular y el grupo B se seleccionan para que reaccionan y formen un segundo acoplamiento, en el que el primer acoplamiento y el segundo acoplamiento se seleccionan independientemente del grupo que consiste en acoplamiento de alquino-azida, acoplamiento de dibenzociclooctina-azida, acoplamientos de azida a base de oxanorbornadieno, acoplamiento de vinilsulfona-tiol, acoplamiento de maleimida-tiol, acoplamiento de metil- metacrilato-tiol, acoplamiento de eter, acoplamiento de tioeter, acoplamiento de biotina-estrepavidina, amina-acido carboxflico que da lugar a enlaces amida, acoplamiento de alcohol-acido carboxflico que da lugar a enlaces ester y acoplamiento de ester de NHS (ester de N-hidroxisuccinimida)-amina y
    en el que el grupo L es un segmento de cadena lineal que tiene 10-60 enlaces entre los atomos seleccionados de C, N, O y S en la cadena principal.
  2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el grupo L se selecciona de:
    imagen1
    imagen2
  3. 3. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el primer acoplamiento es acoplamiento de alquino- azida.
  4. 4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo acoplamiento es acoplamiento de ester de NHS (ester de N-hidroxisuccinimida)-amina o acoplamiento de maleimida-amina.
  5. 5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo A se representa por la formula (VII):
    imagen3
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    en la que:
    n es de 0 a 8;
    R3 se selecciona del grupo que consiste en [(L)p-Q], hidrogeno, halogeno, grupos alquilo Ci-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24, estando los grupos alquilo opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, en el que los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo estan opcionalmente sustituidos independientemente con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2-C12, grupos cicloalquiloxi C3-C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, en el que los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi estan opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi estan opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, estando los grupos sililo representados por la formula (R4)3Si-, en la que R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo C1-C12, grupos alquenilo C2-C12, grupos alquinilo C2-C12, grupos cicloalquilo C3-C12, grupos alcoxi C1-C12, grupos alqueniloxi C2-C12, grupos alquiniloxi C2-C12 y grupos cicloalquiloxi C3-C12, en el que los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi estan opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi estan opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
    R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, grupos alquilo C1-C24, grupos (hetero)arilo C6-C24, grupos alquil(hetero)arilo C7-C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7-C24; y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en halogeno, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, grupos alquilo C1-C12, grupos arilo C1-C12, grupos alquilarilo C1-C12 y grupos arilalquilo C1-C12, en los que R6 es como se ha definido anteriormente, y en los que los grupos alquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo y grupos arilalquilo estan opcionalmente sustituidos.
  6. 6. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la unidad espaciadora se representa por la formula (IX):
    imagen4
    en la que R1, R2, R3 y n son como se han definido anteriormente y L se selecciona del grupo representado por la formula (X):
    en la que p es de 2 a 5.
    imagen5
  7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad espaciadora se representa por la formula (XI):
    imagen6
    en la que p es de 2 a 5.
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  8. 8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el factor de adhesion celular se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoacidos tales como RGD y GRGDS.
  9. 9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la media del numero de las unidades de alquilenglicol del primer comonomero y del segundo comonomero es de al menos 3 y, como maximo, de 4.
  10. 10. El copoliisocianopeptido con funcionalidad de oligo(alquilenglicol) que se puede obtener mediante el proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  11. 11. Un cultivo celular que comprende un hidrogel, que comprende el copoliisocianopeptido de la reivindicacion 10 a una concentracion de 1,2-3,0 mg/ml, y en el que el copoliisocianopeptido tiene una temperatura de gelificacion de 18 a 40 °C.
  12. 12. El cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el cultivo celular comprende al menos una de entre celulas endoteliales y celulas del musculo liso.
  13. 13. Un proceso de cultivo de celulas que comprende las etapas de:
    a) proporcionar el cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 11;
    b) anadir las celulas al cultivo celular a una temperatura por debajo de la temperatura de gelificacion del hidrogel;
    y
    c) cultivar las celulas.
  14. 14. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que las celulas son celulas endoteliales y celulas musculares.
  15. 15. Uso del cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 12 para fabricar un sistema prevascular.
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