KR20160034350A - 세포 배양액에 사용하기에 적합한 중합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은
i) 하기 공단량체:
- 연결 기와 그래프트된 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제1 공단량체; 및
- 그래프트되지 않은 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제2 공단량체
를 공중합시키는 단계, 및
ii) 스페이서 단위 및 세포 접착 인자의 반응물을 상기 단계 i)에서 수득된 공중합체에 가하는 단계
를 포함하는 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드의 제조 방법에 관한 것으로서, 이때
상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 몰 비는 1:500 내지 1:30이고,
상기 스페이서 단위는 일반 화학식 A-L-B로 나타내지고,
상기 연결 기 및 기 A는 반응하여 제1 커플링을 형성하도록 선택되고, 상기 세포 접착 인자 및 기 B는 반응하여 제2 커플링을 형성하도록 선택되고,
상기 제1 커플링 및 제2 커플링은 독립적으로, 알킨-아자이드 커플링, 다이벤조사이클로옥틴-아자이드 커플링, 옥사노르보나다이엔-계-아자이드 커플링, 비닐설폰-티올 커플링, 말레이미드-티올 커플링, 메틸 메타크릴레이트-티올 커플링, 에터 커플링, 티오에터 커플링, 바이오틴-스트레파비딘 커플링, 아미드 연결을 유도하는 아민-카복실산 커플링, 에스터 결합을 유도하는 알콜-카복실산 커플링, 및 NHS-에스터(N-하이드록시석신이미드 에스터)-아민 커플링으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
기 L은, 주쇄에서 C, N, O 및 S로부터 선택된 원자들 사이에 10 내지 60개의 결합을 갖는 선형 쇄 분절이다.

Description

세포 배양액에 사용하기에 적합한 중합체{POLYMER SUITABLE FOR USE IN CELL CULTURE}
본 발명은 세포 배양액에 사용하기에 적합한 중합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 전구혈관(prevascular) 시스템을 제조하기 위한 세포 배양액의 용도에 관한 것이다.
현재까지, 세포 배양액 겔 물질은 천연 재료로부터 단리되거나 완전히 합성 물질일 수 있다. 본질적으로 층상 구조를 생성하는 콜라겐과 같은 겔은 단리시 복잡한 3차원 네트워크를 형성할 수 없다. EHS 마우스 육종 세포로부터 유도된 것과 같은 겔은 순수 콜라겐보다 조직 내에서 발견되는 세포외 환경과 더 유사하고, 또한 세포가 자라고 복잡한 모양으로 조립될 수 있는 3차원 환경을 제공한다. 천연적으로 유도된 겔화제는 충분히 특징분석되기 어렵고, 이러한 특징분석을 달성하기 위해 강도 높은 배치별 분석을 필요로하고, 생물학적으로 유도된 겔은 고유의 가변성, 오염의 위험, 및 과도한 가격 프리미엄이 수반되는 병원균 전파를 겪는다. 다수의 연구 그룹의 경우, 예컨대 생물학적인 원료 물질에 고유하게 존재하는 원치않는 성장 인자와 같은 추가의 미세 오염은 허용되지 않는 실험 방해요소이고, 체내에 사용하기에 허용되지 않는다. 스펙트럼의 다른 말단에서, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 공중합체로부터 유도된 것들과 같은 합성적으로 유도된 겔은 낮은 세포 생존성 및 세포 분화 능력을 보여주고, 이는 글루코코르티코이드와 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)와 같은 추가의 생리활성 성분들의 혼합물을 필요로한다. 합성 겔화제의 사용은 주로 생물학적 겔화제에서 발견되는 천연 변이를 배제하지만, 동시에 천연 겔 고유의 생물학적 활성도 제거한다. 생물학적 활성을 보유하면서도 생물학적 가변성을 배제하는 능력은 아직 충분히 실현되지 않은 도전 과제이다.
이들 겔 내에서 형성된 복잡한 생물학적 시스템을 수득하는 능력 또한 도전 과제로 남아있다. 전통적으로, 세포는 트립신의 사용에 의해 생물학적인 표면으로부터 제거되어야 하거나, 겔의 경우, 기계적으로 용해되거나 구조의 표면으로부터 수동으로 제거되어야 한다.
상기 증명된 겔화가능한 구조는 특성면에서 보편적이지 않고, 체내에서 최소한의 침입성 방법으로 용이하게 적용될 수 없다. 냉각된 카테터(catheter)를 통해 최소한의 침입성 방법으로 적용될 수 있는 열응답성 물질의 일부 예, 예컨대 US 2010/0215731 A1에 기술된 것들이 있다. 하지만, 이들 물질은 상기 기술된 동일한 바와 단점이 있고, 불량한 세포 생존성을 야기한다.
기계적으로, 모든 생물학적으로 유도된 겔의 특성은 펩타이드 서브유닛의 비공유 상호작용에 의해 좌우된다. 그 결과, 기공 크기 및 기계적 강도가 상대적으로 고정된다. 가교 결합의 기계적 특징 및 특성은 합성적으로 유도된 겔의 경우 더욱 더 그렇게 고정된다.
WO 2011/007012는 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 폴리이소시아노펩타이드를 포함하는 하이드로겔을 기술한다. 상기 폴리이소시아노펩타이드는 이소시아노펩타이드를 올리고-(알킬렌 글리콜) 측쇄로 작용성화하고, 이어서 상기 올리고-알킬렌 글리콜 작용성화된 이소시아노펩타이드를 중합시킴으로써 제조된다. WO2011/007012는 조직 공학 또는 뉴런 재생을 위한 하이드로겔의 용도를 제안한다.
상기 공지된 세포 배양액은 일부 용도는 만족스럽지만, 다양한 상황에 사용될 수 있는 세포 배양액에 대한 필요성이 당업계에서 증가되고 있다.
본 발명의 목적은, 당업계에 상기 언급된 및/또는 다른 필요성이 충족되는 세포 배양액 및 세포 배양액에 사용하기 위한 중합체를 제공하는 것이다.
하나의 양태에 따르면, 본 발명은 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드의 제조 방법을 제공하고, 이때 상기 방법은
i) 하기 공단량체:
- 연결 기와 그래프트된(grafted) 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제1 공단량체; 및
- 그래프트되지 않은 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제2 공단량체
를 공중합시키는 단계, 및
ii) 스페이서 단위 및 세포 접착 인자(cell adhesion factor)의 반응물을 상기 단계 i)에서 수득된 공중합체에 가하는 단계
를 포함하고,
상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 몰 비는 1:500 내지 1:30이고,
상기 스페이서 단위는 일반 화학식 A-L-B로 나타내지고,
상기 연결 기 및 기 A는 반응하여 제1 커플링을 형성하도록 선택되고, 상기 세포 접착 인자 및 기 B는 반응하여 제2 커플링을 형성하도록 선택되고,
상기 제1 커플링 및 제2 커플링은 독립적으로, 알킨-아자이드 커플링, 다이벤조사이클로옥틴-아자이드 커플링, 옥사노르보나다이엔-계-아자이드 커플링, 비닐설폰-티올 커플링, 말레이미드-티올 커플링, 메틸 메타크릴레이트-티올 커플링, 에터 커플링, 티오에터 커플링, 바이오틴-스트레파비딘 커플링, 아미드 연결을 유도하는 아민-카복실산 커플링, 에스터 결합을 유도하는 알콜-카복실산 커플링, 및 NHS-에스터(N-하이드록시석신이미드 에스터)-아민 커플링으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
기 L은, 주쇄에서 C, N, O 및 S로부터 선택된 원자들 사이에 10 내지 60개의 결합을 갖는 선형 쇄 분절이다.
상기 연결 기 및 기 A는, 반응하여 상기 목록에 언급된 임의의 커플링일 수 있는 제1 커플링을 형성하도록 선택된다. 예를 들어, 알킨-아자이드 커플링을 수득하기 위해, 상기 연결 기는 알킨이고 기 A는 아자이드이거나, 연결 기가 아자이드이고 기 A가 알킨일 수 있다. 상기 목록에 언급된 커플링은 당업계 숙련자에게 널리 공지되어 있고, 상기 커플링의 형성은 문헌에서 확인된다. 예를 들어, NH2-COOH 커플링은 EDC를 통해 매개될 수 있다.
바람직하게는, 상기 제1 커플링은 알킨-아자이드 커플링이다.
유사하게, 세포 접착 인자 및 기 B는, 반응하여 상기 목록에 언급된 임의의 커플링일 수 있는 제2 커플링을 형성하도록 선택된다. 바람직하게는, 제2 커플링은 NHS-에스터(N-하이드록시석신이미드 에스터)-아민 커플링 또는 말레이미드-티올 커플링이다. 이는, 펩타이드인 세포 접착 인자의 N 말단에 대한 NHS-에스터의 커플링이거나, 펩타이드인 세포 접착 인자의 말단 티올에 대한 말레이미드의 커플링일 수 있다.
기 L은 반응성 기 A 및 B를 연결하는 선형 쇄를 갖는 분절이다. 상기 분절은 C, N, O 및 S로부터 선택된 원자의 서열에 의해 형성된다. 기 A 및 B에 연결된 주쇄에서의 원자들 사이의 결합의 수는 10 이상 60 이하이다. 용어 "주쇄"는 최단 거리로 기 A 및 B를 연결하는 쇄를 의미하도록 이해된다. 말단 기 A 및 B에 연결된 상기 주쇄 내의 원자들 사이의 결합의 수는 바람직하게는 12 이상, 더욱 바람직하게는 15 이상이다. 말단 기 A 및 B에 연결된 상기 주쇄 내의 원자들 사이의 결합의 수는 바람직하게는 50 이상, 더욱 바람직하게는 40 이상이다.
세포 접착 인자에 부착된 세포가 배양되는데 상기 공중합체 주쇄 및 상기 세포 접착 인자 사이의 특정한 최소 거리가 요구되는 것이 확인되었다. 10개 이상의 결합에 의해 제공된 거리가 필요한 것으로 확인되었고, 이는 본 발명에 따른 스페이서 단위의 존재에 의해 제공된다. 10개 미만의 결합의 길이는 충분한 세포 성장을 허용하지 않는 것으로 확인되었다.
기 L의 바람직한 예는 하기와 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 식에서,
p는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5이고,
q는 1 내지 9, 바람직하게는 2 내지 5이고,
r은 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5이다.
상기 스페이서 단위가 이러한 유형의 기 L을 포함하는 경우, 기 A 및 B, 및 연결 기 및 세포 접착 인자의 유형 및 크기에 독립적인 특히 안정한 세포 성장이 보장된다.
추가에 양태에 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드를 제공한다.
추가의 양태에 따라서, 본 발명은 1.2 내지 3.0 mg/mL의 농도로 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 세포 배양액을 제공하고, 이때 상기 코-폴리이소시아노펩타이드는
i) 하기 공단량체:
- 연결 기와 그래프트된 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제1 공단량체; 및
- 그래프트되지 않은 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제2 공단량체
를 공중합시키는 단계, 및
ii) 스페이서 단위 및 세포 접착 인자의 반응물을 상기 단계 i)에서 수득된 공중합체에 가하는 단계
에 의해 제조되고,
상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 몰 비는 1:500 내지 1:30이고,
상기 스페이서 단위는 일반 화학식 A-L-B로 나타내지고,
상기 연결 기 및 기 A는 반응하여 제1 커플링을 형성하도록 선택되고, 상기 세포 접착 인자 및 기 B는 반응하여 제2 커플링을 형성하도록 선택되고,
상기 제1 커플링 및 제2 커플링은 독립적으로, 알킨-아자이드 커플링, 다이벤조사이클로옥틴-아자이드 커플링, 옥사노르보나다이엔-계-아자이드 커플링, 비닐설폰-티올 커플링, 말레이미드-티올 커플링, 메틸 메타크릴레이트-티올 커플링, 에터 커플링, 티오에터 커플링, 바이오틴-스트레파비딘 커플링, 아미드 연결을 유도하는 아민-카복실산 커플링, 에스터 결합을 유도하는 알콜-카복실산 커플링, 및 NHS-에스터(N-하이드록시석신이미드 에스터)-아민 커플링으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
기 L은, 주쇄에서 C, N, O 및 S로부터 선택된 원자들 사이에 10 내지 60개의 결합을 갖는 선형 쇄 분절이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 최적의 세포 성장이 하이드로겔의 3차원 구조를 구성하는 중합체 주쇄로부터 특정 간격으로 위치된 세포 접착 인자의 특정 농도 하에서만 달성된다는 것을 확인하였다.
상기 세포 접착 인자의 농도가 너무 낮은 경우, 상기 세포는 하이드로겔에 충분히 접착되지 않고, 결국 세포가 배양되지 않는다. 상기 세포 접착 인자의 농도가 너무 높은 경우는, 세포가 상기 겔 내에서 성장하지 않는다.
상기 제1 공단량체는, 연결 기와 그래프트된 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드이다. 상기 연결 기의 바람직한 예는 아자이드(예컨대 옥사노르보나다이엔-계-아자이드), 알킨(예컨대 다이벤조사이클로옥틴), 티올, 비닐설폰, 말레이미드, 메틸 메타크릴레이트, 에터, 바이오틴, 스트레파비딘, NH2, COOH, OH, NHS-에스터를 포함한다. 특히 바람직한 것은 아자이드이다.
상기 제1 공단량체의 예는 하기 화학식 (I)에 도시되어 있고, 이때 연결 기는 아자이드이다:
Figure pct00004
.
상기 제2 공단량체는, 연결 기 또는 다른 기와 그래프트되지 않은 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드이다(즉, 상기 이소시아노펩타이드의 측쇄가 올리고(알킬렌 글리콜)로 이루어져 있다). 상기 제2 공단량체의 예는 하기 화학식 (II)에 도시되어 있다:
Figure pct00005
.
상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체는 단계 (i)에서 공중합된다. 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드는 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체의 비율로 중합체를 따라 연결 기를 포함하도록 수득된다.
세포 접착 인자는 스페이서 단위를 통해 공중합체에 부착된다. 먼저, 스페이서 단위 및 세포 접착 인자의 반응물이 제조된다. 상기 스페이서 단위의 예는 하기 화학식 (III)에 도시되어 있다:
Figure pct00006
상기 식에서, p는 1 내지 10이다.
이 예에서, 기 A는
Figure pct00007
이고,
기 B는
Figure pct00008
이고,
기 L은
Figure pct00009
이다.
상기 세포 접착 인자의 예는 하기 화학식 (IV)에 도시되어 있고, 이는 글리신, L-아르기닌, 글리신, L-아스파르트산, 및 세린(GRGDS)으로 이루어진 펜타펩타이드이다:
Figure pct00010
.
화학식 (III)의 스페이서 단위 및 하기 화학식 (IV)의 세포 접착 인자의 반응물은 하기 화학식 (V)에 도시되어 있다:
Figure pct00011
.
본 발명의 단계 ii)에서, 스페이서 단위 및 세포 접착 인자의 반응물(예컨대 화학식 (V))을 단계 i)에 의해 수득된 공중합체와 반응시킨다. 상기 연결 기는 스페이서 단위에 상응하는 반응물 부분과 반응한다. 따라서, 상기 최종 코-폴리이소시아노펩타이드는 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체의 비율로 중합체를 따라 세포 접착 단위를 포함한다. 최종 코-폴리이소시아노펩타이드의 예는 하기 화학식 (VI)으로 나타내어진다:
Figure pct00012
상기 식에서, m:n은 상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 비율이다.
상기 세포 접착 단위는 스페이서 단위를 사용함으로써 이소시아노펩타이드 중합체 주쇄로부터 일정 간격으로 떨어져 위치된다.
적합한 세포 배양 배지와 함께 겔화시킴으로써 수득되는 공중합체로부터 하이드로겔이 제조된다. 상기 하이드로겔은 3차원 하이드로겔이다. 상기 하이드로겔 내의 중합체 농도는 1.2 내지 3.0 mg/mL이다. 하이드로겔 내의 중합체 농도가 너무 낮으면, 세포가 상기 하이드로겔에 부착되지 않는다. 상기 하이드로겔 내의 중합체 농도가 너무 높으면, 상기 하이드로겔이 너무 강성이어서 상기 겔 내에서 세포가 이동하고 성장하기가 어렵다.
바람직하게는, 상기 하이드로겔은, 판과 판 사이의 유변학적 실험으로 측정시, 35℃에서 10 내지 5000 Pa, 바람직하게는 100 내지 1000 Pa의 범위의, 탄성 모듈러스를 갖는다. 이는, 상기 세포가 이동하고 성장하여 세포 네트워크 및 3차원 구조, 예컨대 전구혈관 시스템을 형성하도록 한다.
본 발명은, 선택적인 강성도 및 온도 응답성뿐만 아니라 세포 접착점의 조절된 공간적 분포 및 밀도를 갖는 하이드로겔의 세포 배양액을 제공한다. 상기 공중합은 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체의 비율에서 공중합체를 따라 상기 세포 접착 기의 통계적인 분포를 제공한다. 상기 제1 공단량체와 상기 제2 공단량체 간의 비율은, 폴리이소시아노펩타이드의 중합체 주쇄를 따라 상기 세포 접착 인자들 사이의 거리를 조절하도록 조정될 수 있다. 상기 중합체 주쇄를 따른 상기 세포 접착 인자들 간의 평균 거리는 예컨대 1.1 내지 60 nm일 수 있다. 상기 세포 접착 인자들 사이의 거리의 범위는, 배양할 세포를 세포 배양액에 정착시키는데 적합하다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포 접착 인자 사이의 평균 거리는 8 내지 30 nm이다.
상기 하이드로겔은 다양한 세포 배양 배지를 포함할 수 있고, 상기 세포 배양액은 복합 생물학적 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 것을 중재하는 것으로 보여진다.
본 발명에 따른 세포 배양액은 배양된 세포의 수집이 용이하게 하는데 매우 유리하다. 상기 세포 배양액에 사용된 하이드로겔은 열-응답성 특성을 갖는다(이는 겔화 온도 미만의 온도로 냉각시킴으로써 액체로 변한다). 따라서, 상기 배양된 세포의 수집은 상기 세포 배양액을 단지 냉각시킴으로써 수행될 수 있다. 하이드로겔이 액체로 변한 후, 상기 세포는 상기 배양된 세포를 손상시킴이 없이 액체로부터 수집될 수 있다.
충분한 결합을 보유하기 위해 상기 세포 접착 인자는 상기 올리고-알킬렌 글리콜 작용성화된 이소시아노펩타이드에 직접 부착될 수 없다고 결정되었다. 이는 본 발명에 따른 스페이서의 사용에 의해 해결되었다. 본 발명에 사용된 스페이서 단위는 이소시아노펩타이드의 중합체 주쇄로부터 세포 접착 인자를 분리하여 입체적 차단을 제거한다. 상기 스페이서는 상기 세포 접착 인자를 상기 중합체 주쇄로부터 탈커플링시키고, 이는 상기 세포 접착 인자가 상기 인테그린(integrin) 결합 포켓 내로 효율적으로 고정되게 한다. 상기 스페이서는, 극성이고, 수용성이고, 생체 적합하고, 상기 인테그린의 활성 부위에 대해 비-결합성이지만 보조 결합을 도울 수 있어야 한다. 상기 제1 단량체는, 먼저 제2 단량체를 제조하고 이를 연결 기와 그래프팅시킴으로써 제조될 수 있다. 달리, 상기 제1 단량체 및 제2 단량체는 상이한 루트를 통해 제조될 수 있다.
상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 몰 비는 1:500 내지 1:30이다. 바람직하게는, 상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 몰 비는 1:400 내지 1:35, 1:300 내지 1:40, 또는 1:200 내지 1:45이다. 상기 제1 공단량체와 상기 제2 공단량체 간의 비율의 범위는 상기 중합체 주쇄를 따른 세포 접착 단위들 사이에 8 내지 30 nm의 평균 거리를 제공한다.
바람직하게는, 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드는 18 내지 40℃의 겔화 온도를 갖는다. 겔화 온도는 하이드로겔 내의 중합체 농도에 의존하지 않는다. 오히려, 이는 상기 중합체의 측쇄 내의 올리고알킬렌 글리콜 단위의 수에 의존한다.
본 발명의 추가의 세부 내용은 하기에 주어져 있다.
공단량체
올리고( 알킬렌 글리콜) 단위에 의한 이소시아노펩타이드의 작용성화
상기 단량체는 바람직하게는, C 말단에서 원하는 올리고(알킬렌 글리콜) 쇄로 치환된 다이-, 트라이-, 테트라- 또는 더 큰 펩타이드 모티프(motif)를 기초로 한다. 상기 쇄는 선형, 분지형 또는 수지상(dendronized) 올리고(알킬렌 옥사이드)에 기초할 수 있다. 바람직하게는, 상기 쇄는 선형이고, 에틸렌 글리콜로 이루어진다.
펩타이드 분절은, 천연 또는 비천연 및 확장된 아미노-산 서열 또는 이의 혼합물에 의해 결정된 상이한 조성의 것일 수 있다.　
상기 단량체는 적합한 올리고(알킬렌 글리콜) 단편들로부터 유도된다. 목적하는 아미노산을 연속적으로 도입하기 위해 다단계 펩타이드 커플링 전략이 사용된다. 원하는 바람직한 펩타이드　서열의 도입 이후, 상기 펩타이드 분절의 N-말단은 적합한 포르밀화 방법으로 포르밀화된다. 이러한 포르밀화는, 상기 생성물을 포르밀 염, 포름산, 또는 다른 포르밀화제로 처리하는 것을 포함할 수 있다.
포르밀화 전략의 일부 예는 포르메이트 염(예컨대 나트륨 또는 칼륨 포르메이트), 알킬 포르메이트(예컨대 메틸-, 에틸-, 또는 프로필-포르메이트), 포름산, 클로랄 및 이들의 유도체를 사용한다. 이어서 상기 포름아미드를 적합한 탈수제로 처리함으로써 이소시아나이드가 형성된다. 탈수 전략의 하나의 예는 다이포겐을 사용한다. 또한 사용될 수 있는 탈수제의 몇가지 예는 포스겐 및 이의 유도체(다이-, 트라이포스겐), 카보다이이미드, 토실 클로라이드, 인 옥사클로라이드, 트라이페닐포스핀/테트라클로로카본이다(문헌[M. B. Smith and J. March "March's advanced organic chemistry" 5th edition, Wiley & Son eds., 2001, New York, USA, pp1350-1351] 및 여기에 인용된 문헌]　참조).
측쇄 ( 알킬렌 글리콜)
적합한 알킬렌 글리콜의 예는 에틸렌-, 프로필렌-, 부틸렌- 또는 펜틸렌 글리콜이다. 바람직하게는, 상기 알킬렌 글리콜은 에틸렌 글리콜이다.
유리한 올리고에틸렌글리콜 단위는 하기에 묘사되어 있다. 일반적으로, 용어 "올리고"는 10 미만의 수를 나타낸다.
Figure pct00013
바람직하게는, 상기 이소시아노펩타이드는 3개 이상의 에틸렌 글리콜 단위로 작용성화되어 중합 후 수용성 물질을 제공한다.
본 발명의 제2 공단량체는, 추가로 그래프트되지 않는 상기 기술된 바와 같은 올리고(알킬렌 글리콜) 이소시아노펩타이드이다.
상기 제1 공단량체는, 동일한 수의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드로 이루어지거나, 상이한 수의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드들의 혼합물일 수 있다. 유사하게, 상기 제2 공단량체는 동일한 수의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드로 이루어지거나, 상이한 수의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드들의 혼합물일 수 있다.
상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체는 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드이다(즉 이소시아노펩타이드 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수가 1 내지 10이다). 바람직하게는, 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수의 평균은 3 이상 4 이하이다.
상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 평균은 전형적으로, 상이한 수의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드들의 혼합물을 상기 제2 공단량체로서 사용하여 조정된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 제1 공단량체는 3개의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드이고, 상기 제2 공단량체는 3개의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드와 4개의 알킬렌 글리콜 단위를 갖는 이소시아노펩타이드의 혼합물이다.
상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수의 평균은 3일 수 있다. 15 내지 25℃의 겔화 온도가 전형적으로 수득된다. 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수의 평균은 3 초과 3.5 이하이다. 18 내지 35℃의 겔화 온도가 전형적으로 수득된다. 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수의 평균은 3.5 초과 5 이하일 수 있다. 25 내지 50℃의 겔화 온도가 전형적으로 수득된다.
바람직하게는, 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드는, 유변학적 측정에 의해 결정시, 35℃의 온도에서 10 내지 5000 Pa, 바람직하게는 100 내지 1000 Pa의 탄성 모듈러스를 갖는다. 상기 제1 공단량체 및 상기 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수의 평균이 3 이상 5 이하인 경우, 하이드로겔은 이러한 강성도를 가진다.
중합
상기 연결 기와 그래프트된 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 이소시아노펩타이드 단량체(제1 공단량체) 및 상기 연결 기와 그래프트되지 않은 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 이소시아노펩타이드 단량체(제2 공단량체)는 혼합되고, 이어서 공중합된다.　
상기 공중합은 바람직하게는 비극성 용매의 존재 하에서 수행된다. 적합한 비극성 용매는 포화 탄화수소 용매 및 방향족 탄화수소 용매 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 극성 용매의 예는 펜탄, 헥산, 헵탄, 2-메틸부탄, 2-메틸헥산, 사이클로헥산, 및 톨루엔, 벤젠, 자일렌 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 톨루엔이 상기 중합에 사용된다. 바람직하게는 톨루엔은 상기 올리고(에틸렌 글리콜) 부분이 3개 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 올리고(에틸렌 글리콜) 이소시아노펩타이드의 중합 공정을 위해 선택된다.
바람직하게는, 상기 중합은 촉매의 존재 하에서 수행된다. 상기 촉매는 바람직하게는 니켈(II) 염이다.　 Ni(II) 염의 예는 니켈(II) 할라이드(예컨대 니켈(II) 클로라이드), 니켈(II) 퍼클로레이트 또는 테트라키스-(3급부틸이소시아나이드)니켈(II) 퍼클로레이트이다.
중합 매질에 가용성이거나, 중합 매질에 혼화성인 적합한 용매에 초기에 용해된다면, 다른 착물 및 니켈 염이 사용될 수 있다. 상기 올리고(알킬렌 글리콜)이소시아노펩타이드를 중합시키는데 사용될 수 있는 몇몇 촉매 시스템을 기술하는 일반적인 참조문헌은 문헌[Suginome M.; lto Y; Adv Polym SC1 2004, 171, 77-136]; 및 [Nolte R. J. M.; Chem. Soc. Rev. 1994, 23(1), 11-19)]에서 확인할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단량체 농도는 30mmol/L 초과로 선택되고, 상기 촉매/단량체 비율은 1/100 내지 1/10000로 선택된다. 니켈(II)의 양을 낮추는 것(1/1000 미만의 촉매/단량체 비율)은, 중합체를 거대-하이드로겔화제로서 후속적으로 적용하는데 필요한 상당한 중합도[평균 DP > 500]를 보이는 물질의 제조를 허용한다.
대표적인 예에서, 비극성 유기 용매 또는 용매들의 혼합물 중의 단량체의 밀리몰 용액을, 극성 용매 중에 용해된 니켈 (II) 촉매에 1:50 내지 1:100,000의 촉매 대 단량체의 몰 비율로 가한다. 밀폐된 환경에서, 혼합물을 2 내지 24시간 동안 격렬히 교반시킨다. 완료되면, 반응 혼합물을 증발시키고, 조질 생성물을 유기 용매에 용해시키고, 다이에틸에터 또는 유사한 비-상용성 유기 용매에서 침전시켜 목적 생성물을 제공한다.
스페이서 단위 및 세포 접착 인자의 반응물의 연결 기 스페이서 단위에의 그래프팅
상기 말단 기 A 및 B는 바람직하게는, 후속적인 화합물이 탈보호 또는 활성 단계의 필요 없이 합성가능하도록 선택된다.
상기 스페이서 단위의 기 A의 바람직한 예는 아자이드(예컨대 옥사노르보나다이엔-계-아자이드), 알킨(예컨대 다이벤조사이클로옥틴), 티올, 비닐설폰, 말레이미드, 메틸 메타크릴레이트, 에터, 바이오틴, 스트레파비딘, NH2, COOH, OH, NHS-에스터를 포함한다. 특히 바람직한 것은 알킨이다.
상기 스페이서 단위의 기 B의 바람직한 예는 아자이드(예컨대 옥사노르보나다이엔-계-아자이드), 알킨(예컨대 다이벤조사이클로옥틴), 티올, 비닐설폰, 말레이미드, 메틸 메타크릴레이트, 에터, 바이오틴, 스트레파비딘, NH2, COOH, OH, NHS-에스터를 포함한다. 특히 바람직한 것은 NHS-에스터 또는 말레이미드이다.
바람직하게는, 상기 스페이서 단위의 기 A는 하기 화학식 (VII)로 나타내어진다:
Figure pct00014
n은 0 내지 8이고;
R3은 [(L)p-Q], 수소, 할로겐, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고, 상기 알킬 기, (헤테로)아릴 기, 알킬(헤테로)아릴 기 및 (헤테로)아릴알킬 기는 독립적으로, 임의적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기, C3 - C12 사이클로알킬옥시 기, 할로겐, 아미노 기, 옥소 기 및 실릴 기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고, 이때 상기 알킬 기, 알켄일 기, 알킨일 기, 사이클로알킬 기, 알콕시 기, 알켄일옥시 기, 알킨일옥시 기 및 사이클로알킬옥시 기는 임의적으로 치환되고, 상기 알킬 기, 알콕시 기, 사이클로알킬 기 및 사이클로알콕시 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고, 상기 실릴 기는 화학식 (R4)3Si-로 나타내지고, 이때 R4은 독립적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기 및 C3 - C12 사이클로알킬옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 기, 알켄일 기, 알킨일 기, 사이클로알킬 기, 알콕시 기, 알켄일옥시 기, 알킨일옥시 기 및 사이클로알킬옥시 기는 임의적으로 치환되고, 상기 알킬 기, 알콕시 기, 사이클로알킬 기 및 사이클로알콕시 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고;
R1은 독립적으로, 수소, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2은 독립적으로, 할로겐, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, C1 - C12 알킬 기, C1 - C12 아릴 기, C1 - C12 알킬아릴 기 및 C1 - C12 아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 R6은 상기 정의된 바와 같고, 상기 알킬 기, 아릴 기, 알킬아릴 기 및 아릴알킬 기는 임의적으로 치환된다.
바람직하게는, n은 0이다.
바람직하게는, R1은 수소이다.
바람직하게는, R3은 수소이다.
바람직하게는, 상기 스페이서 단위의 기 B는 하기 화학식 (VIII)로 나타내어진다:
Figure pct00015
바람직하게는, 상기 스페이서 단위는 하기 화학식 (VII)의 기 A 및 하기 화학식 (VIII)의 기 B를 포함한다.
적합한 스페이서 단위의 예는 하기 화학식 (IX)로 나타내지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00016
.
상기 식에서, R1, R2, R3 및 n은 상기 정의된 바와 같고,
L은 바람직하게는 하기 화학식 (X-1), (X-2), (X-3)로 나타내지는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
상기 식에서,
p는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5이고,
q는 1 내지 9, 바람직하게는 2 내지 5이고,
r은 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5이다.
바람직하게는, 상기 스페이서 단위는 하기 화학식 (XI)로 나타내진다:
Figure pct00020
상기 식에서, p는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5, 더욱 바람직하게는 2이다.
상기 적합한 스페이서 단위의 다른 예는 WO2011/136645에 기술된 융합된 사이클로옥틴 화합물을 포함하고, 이 특허를 본원에 참조로 인용한다. 따라서, 가능한 스페이서 단위는 하기 화학식 (IIa), (IIb) 또는 (IIc)의 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00021
상기 식에서,
n은 0 내지 8이고;
p는 0 또는 1이고;
R3은 [(L)p-Q], 수소, 할로겐, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고, 상기 알킬 기, (헤테로)아릴 기, 알킬(헤테로)아릴 기 및 (헤테로)아릴알킬 기는 독립적으로, 임의적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기, C3 - C12 사이클로알킬옥시 기, 할로겐, 아미노 기, 옥소 기 및 실릴 기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고, 이때 상기 알킬 기, 알켄일 기, 알킨일 기, 사이클로알킬 기, 알콕시 기, 알켄일옥시 기, 알킨일옥시 기 및 사이클로알킬옥시 기는 임의적으로 치환되고, 상기 알킬 기, 알콕시 기, 사이클로알킬 기 및 사이클로알콕시 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고, 상기 실릴 기는 화학식 (R4)3Si-로 나타내지고, 이때 R4은 독립적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기 및 C3 - C12 사이클로알킬옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 기, 알켄일 기, 알킨일 기, 사이클로알킬 기, 알콕시 기, 알켄일옥시 기, 알킨일옥시 기 및 사이클로알킬옥시 기는 임의적으로 치환되고, 상기 알킬 기, 알콕시 기, 사이클로알킬 기 및 사이클로알콕시 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고;
L은 선형 또는 분지형 C1 - C24 알킬렌 기, C2 - C24 알켄일렌 기, C2 - C24 알킨일렌 기, C3 - C24 사이클로알킬렌 기, C5 - C24 사이클로알켄일렌 기, C8 - C24 사이클로알킨일렌 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴렌 기, C7 - C24 (헤테로)아릴알킬렌 기, C8 - C24 (헤테로)아릴알켄일렌 기, C9 - C24 (헤테로)아릴알킨일렌 기로부터 선택되는 연결 기이고, 이때 상기 알킬렌 기, 알켄일렌 기, 알킨일렌 기, 사이클로알킬렌 기, 사이클로알켄일렌 기, 사이클로알킨일렌 기, 알킬(헤테로)아릴렌 기, (헤테로)아릴알킬렌 기, (헤테로)아릴알켄일렌 기 및 (헤테로)아릴알킨일렌 기는 임의적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C5 - C12 사이클로알켄일 기, C8 - C12 사이클로알킨일 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기, C3 - C12 사이클로알킬옥시 기, 할로겐, 아미노 기, 옥소 및 실릴 기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되고, 이때 실릴 기는, R4가 상기 정의된 바와 같은 화학식 (R4)3Si-로 나타내질 수 있고;
Q는 수소, 할로겐, R6, -CH=C(R6)2, -C=CR6, -[C(R6)2C(R6)2O]q-R6(이때 q는 1 내지 200의 범위임), -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR6, -N(R6)2, -N(R6)3, -C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X)XR6, -S(O)R6, -S(O)2R6, -S(O)OR6, -S(O)2OR6, -S(O)N(R6)2, -S(O)2N(R6)2, -OS(O)R6, -OS(O)2R6, -OS(O)OR6, -OS(O)2OR6, -P(O)(R6)(OR6), -P(O)(OR6)2, -OP(O)(OR6)2, -Si(R6)3, -XC(X)R6, -XC(X)XR6, -XC(X)N(R6)2, -N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6 및 -N(R6)C(X)N(R6)2로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기이고, 이때 X는 산소 또는 황이고, R6은 독립적으로, 수소, 할로겐, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1은 독립적으로, 수소, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2은 독립적으로, 할로겐, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, C1 - C12 알킬 기, C1 - C12 아릴 기, C1 - C12 알킬아릴 기 및 C1 - C12 아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 R6은 상기 정의된 바와 같고, 상기 알킬 기, 아릴 기, 알킬아릴 기 및 아릴알킬 기는 임의적으로 치환된다.
세포 접착 인자
상기 세포 접착 인자는 상기 겔에의 세포의 결합을 지지한다. 상기 세포 접착 인자는 바람직하게는 아미노 산의 서열이다. 본 발명에 유리하게 사용될 수 있는 아미노 산의 예는 N-보호된 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 클루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린이다.　 적합한 아미노 산의 서열은 펩타이드, 예컨대 RGD, GRGDS, IKVAV, KQAGDV 및 GRGDSP를 포함한다. 상기 세포 접착 인자는 또한, 성장 인자 예컨대 VGEF 및 BFGF일 수 있다. 상기 세포 접착 인자는 또한, 글리코단백질 또는 뮤신일 수 있다.
상기 스페이서 단위 및 상기 세포 접착 인자가 반응된다. 반응물은 구리-부재(copper-free) SPAAC 반응에 의해 상기 공중합체의 연결 기에 그래프트될 수 있다.
상기 중합체의 일반적인 특성
본 발명에 사용된 폴리이소시아노펩타이드는, 도 1에 따르는, 잘 정의된 구조, 예컨대 완전한 올리고(알킬렌 글리콜) 코팅된 베타-시트 나선형 구조를 나타낸다. 상기 구조는, 사실상 각각의 질소가 펩타이드 측쇄로 치환된 나선형 폴리(이민) 중심을 포함한다. 상기 폴리(이민) 주쇄의 슈도(pseudo) 41 나선형 대칭 때문에, n번째 질소 상에 그래프트된 모든 측쇄는 상기 n+4번째의 위치 상에 그래프트된 상응하는 측쇄와 함께 분자내 베타-시트형 패킹 내에 포함된다. 상기 펩타이드 분절은 추가로, 상기 구조의 외부 쉘(shell)을 형성하는 올리고(알킬렌 글리콜) 치환체로 장식된다. 수득된 물질의 수 용해도는 적합한 올리고(에틸렌 글리콜) 치환체의 선택과 직접적으로 관련된다. 마지막으로, 상기 중합체 쇄의 나선형 구조는 이민 기에 연결된 아미노-산의 키랄도에 좌우된다.
본 발명에서 사용된 폴리이소시아노펩타이드는 수득된 중합체 내의 구조적인 결함을 최소로 갖거나 또는 전혀 갖지 않는다. 용어 "최소"는 올바른 측쇄의 96% 초과, 예컨대 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 심지어 100%가 상기 중합체 주쇄에 올바르게 부착되어 있는 것으로 해석하여야 한다.
다시 말하면, 작용성화된 단량체의 직접적인 중합으로 인해, 수득된 물질 내에서, 상기 측쇄의 그래프팅 밀도와 관련한 구조적인 결함의 발생이 최소화된다.
본 발명에 사용된 폴리이소시아노펩타이드는 높은 중합도 [DP]>500 및 높은 지속 길이를 갖는 균질하고 안정하고 수용성인 나선형 중합체일 수 있다.
본 발명은, 상기 올리고알킬렌 작용성화된 폴리이소시아노펩타이드를 포함하는 균질한 하이드로겔, 및 또한 올리고알킬렌 작용성화된 폴리이소시아노펩타이드와 다양한 개수의 에틸렌 글리콜 단위의 혼합물을 포함하는 비균질한 하이드로겔을 제공한다.
수득된 올리고알킬렌 작용성화된 폴리이소시아노펩타이드는 조정가능한 겔화 온도를 갖는 강한 온도-가역적 하이드로겔을 형성할 수 있다. 물을 물리적으로 겔화시키기 위해, 본 발명에 따른 폴리[올리고(에틸렌 글리콜)] 이소시아노펩타이드는 바람직하게는 [DP] > 500의 중합도를 갖는다.　
하이드로겔은, 수득된 공중합체로부터 적합한 세포 배양액 배지로 겔화시킴으로써 제조된다. 상기 하이드로겔은 3차원 하이드로겔이다. 상기 하이드로겔 내의 중합체 농도는 1.2 내지 3.0 mg/mL이다. 상기 하이드로겔 내의 중합체 농도가 너무 낮은 경우, 상기 하이드로겔은 너무 약하여 세포 3차원 네트워크의 성장을 지지할 수 없다. 상기 하이드로겔 내의 중합체 농도가 너무 높은 경우, 상기 하이드로겔은 상기 세포에 대해 너무 강성이어서 상기 겔 내에서 이동하고 성장할 수 없다.
바람직하게는, 상기 하이드로겔은 유변학적 측정에 의해 결정시, 35℃의 온도에서 10 내지 5000 Pa의 탄성 모듈러스를 갖는다. 이는 상기 세포가 이동하고 성장하여 예컨대 전구혈관 시스템과 같은 3차원 세포 구조를 형성하게 한다.
본 발명에 사용된 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 폴리이소시아노펩타이드로부터 수득된 상기 하이드로겔은, 겔화시에 형성된 네트워크의 고도로 구조화된 특성에 있어서, 이전에 보고된 중합체-기반의 대부분의 하이드로겔과 상이하다. 상기 네트워크는 측방향으로 응집된 중합체 쇄의 꼬인 묶음으로 이루어져 있다. 이 배열은, 낮은 분자량의 하이드로겔화제의 겔화시에 형성되는 섬유의 네트워크의 구조와 유사하다. 이 현상은 본래의 회합 모드를 선호하는 폴리이소시아노펩타이드의 긴 지속 길이와 관련된 것으로 예상된다. 상기 회합은 완전 가역 현상인 올리고(알킬렌 글리콜) 측쇄 친수성의 온도 유도된 조절에 의해 촉발되고, 이는 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 폴리이소시아노펩타이드의 완전 열가역적인 응집/용해를 유발한다.
물리적인 중합체 하이드로겔의 고전적인 설명은, 올리고(알킬렌 글리콜) 폴리이소시아노펩타이드의 가상 회합 모드와 외견상으로 상이한, 농축된 용액 내의 얽힘 네트워크 쇄의 형성, 스피노달 분리로 인한 퍼콜레이션 네트워크의 형성, 마이크로 결정 형성, 및 마이셀 네트워크 또는 층상 구조의 형성을 포함한다.
상기 올리고(알킬렌 글리콜) 폴리이소시아노펩타이드로부터 유도된 하이드로겔은, 지름 약 5nm의 중합체 섬유의 거대 꼬임 묶음으로의 측방향 회합으로부터 수득되며, 이는 중합체 하이드로겔 네트워크의 베이스를 형성한다. 이는, 지름 50nm로 낮아질 수 있는 공동 크기를 갖는 매우 다공성인 구조를 제공한다.
에틸렌 글리콜 측쇄의 온도 민감성 거동 때문에, 본 발명에 사용된 중합체는 분명한 LCST 전환을 제공한다. 주어진 올리고(알킬렌 글리콜) 폴리이소시아노펩타이드의 경우, 이 온도는 용액의 이온 강도를 다양하게 함으로써 조절되거나(염 효과), 더욱 일반적으로는 상기 중합체의 전반적인 용매화 상태를 조절할 수 있는 임의의 화합물을 첨가함으로써 조절될 수 있다. 상기 물질의 LCST는, 주쇄 나선의 입체형태 변화를 유도할 수 있는 산 또는 임의의 화합물을 사용하여, 폴리(이소시아나이드) 주쇄 및 즉 이의 입체 형태(conformation) 상에 작용시킴으로써 추가로 조절될 수 있다.
상기 중합체의 LCST를 조절하는 또 다른 방법은 상이한 올리고(알킬렌 글리콜) 측쇄를 갖는 단량체를 공중합시키는 것이다. 예를 들어, 상이한 비율의 트라이- 및 테트라(에틸렌 글리콜)이소시아노다이알라닌의 혼합물의 중합은 mQ 물 중에서 수득된 공중합체의 겔화 온도가 22℃ 내지 60℃로 조절되도록 한다.　
상기 중합체 쇄 길이가 겔화에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 낮은 중합도를 갖는 쇄는 겔을 형성하기보다 침전되는 경향이 더 크다. 이는 쇄의 일반적인 구조를 변경하지 않고 친수성이 변화할 수 있는 강성 또는 반 유연성 중합체의 일반적인 영향으로 기대된다(즉, 강성 구조 내에서 상기 쇄는 붕괴되지 않고, 다른 쇄와 측방향으로 응집하여 확장된 섬유를 형성함).　
중합체 길이의 추가의 영향은 생성된 겔의 광학 특성과 관련하여 관찰되었다. 더 낮은 중합도를 갖는 쇄로부터 제조된 하이드로겔은 탁하거나 불투명한 경향이 있는 것으로 확인되었다. 평균 중합도가 증가할수록 하이드로겔의 불투명도를 감소시킬 수 있고, 이는 결국 완전히 광학적으로 투명한 물질을 유도한다.
상기 겔 온도는, 25℃에서 안정한 구조화된 겔을 형성할 수 있는 가능성을 갖고 다소 조절될 수 있으며, 이로써, 효소 또는 세포를 캡슐화하고 생체 내에서 이들의 활성을 보존하는데 사용될 수 있는 새로운 생체모방(biomimetic) 매트릭스가 유도된다.
본 발명에 사용된 중합체는 몇몇의 흥미롭고 유익한 특성을 갖는 것으로 보인다. 중합체의 길이 및 강성도 때문에, 상기 겔은 일부의 경우 99.00 내지 99.98% 물로 이루어진다. 이는 큰 부피를 생성하는데 단지 매우 적은 물질이 필요함을 의미한다. 중합체의 단일 와이어(wire)는 대략 4 나노미터의 지름 및 2,500,000 Da의 분자량을 갖는 것으로 보여진다. 다분산성 지수(PDI)는 1.6이고, 평균 쇄 길이는 500 nm 내지 2 마이크로미터로 다양하다. 상기 중합체는 보다 강성이고, 70 내지 90 nm의 지속 길이를 갖는 것으로 보인다. 이는 또한 펩타이드 분절 키랄성에 따라서 좌선성 및 우선성 나선을 갖는 것(광학적으로 활성 물질)이 가능하다. 또한, 본 발명자들은, 중합체 농도에 의해 조절된 기공 크기가 심지어 100 내지 250 nm인 잘 정의된 섬유질 네트워크를 제조할 수 있었다. 또한, 쇄 내에서 효율적으로 반응성인 측쇄 기를 도입하는 것이 가능하였다. 따라서 중합체는 생체 분자를 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 본 발명자들은 기공 크기가 농도에 의해 조절되는 것을 확인하였다.
생체 분자의 예는 생물학적 물질, 단백질, 글리코단백질, 펩타이드, 당, 탄수화물, 지단백질, 지질, 당지질, 실리카, 약물, 핵산, DNA, RNA, 비타민, 영양분, 가수분해물, 다당류, 단당류, 재조합 펩타이드, 뮤신, 효소, 생물 유기 화합물, 재조합 생체 분자, 항체, 호르몬, 성장 인자, 수용체, 조영제, 사이토카인, 및 이의 분절 및 변형체이다.
세포 배양액
본 발명에 따른 세포 배양액은 상기 기술된 하이드로겔을 포함한다. 상기 세포 배양액은 3차원 다공성 스캐폴드이다.
본 발명은 추가로, 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 배양액의 제조 방법을 제공한다:
a) 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드를 제공하는 단계, 및
b) 상기 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드를 세포 배양 배지과 반응시켜 하이드로겔을 수득하는 단계.
상기 세포 배양액은 원칙적으로, (동물) 세포의 배양에 적합한 임의의 유형의 세포 배양 배지로 제조될 수 있다. 적합한 세포 배양 배지는 본 발명의 방법에서 사용된 세포의 성장 및 분화를 지지한다.
세포 배양 배지 및 세포 배양 조건을 선택하는 지침은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss]의 챕터 8 및 9, 및 문헌 [Doyle, A. , Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell & Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.]에 제공되어 있다.
일반적으로, (포유류) 세포를 위한 세포 배양 배지는, 완충된 생리적인 염수 중에 용해된, 염, 아미노 산, 비타민, 지질, 세정제, 완충액, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 미량 성분, 탄수화물 및 다른 유기 영양분을 포함한다. 염의 예는 마그네슘 염, 예컨대 MgCl2.6H2O, MgSO4 및 MgSO4.7H2O, 철 염, 예컨대 FeSO4.7H2O, 칼륨 염, 예컨대 KH2PO4, KCl, 나트륨 염, 예컨대 NaH2PO4, Na2HPO4 및 칼슘 염, 예컨대 CaCl2.2H2O를 포함한다. 아미노 산의 예는 모든 20개의 공지된 단백질생성 아미노산, 예컨대 히스티딘, 글루타민, 트레오닌, 세린, 메티오닌을 포함한다. 비타민의 예는 아스코르브산, 바이오틴, 클로린.Cl, 미오-이노시톨, D-판토테네이트, 리보플라빈을 포함한다. 지질의 예는 지방산, 예컨대 리놀레산 및 올레산; 소이 펩톤 및 에탄올 아민을 포함할 수 있다. 세정제의 예는 트윈(Tween) 80 및 플루로닉 F68을 포함한다. 완충제의 예는 헤페스(HEPES)이다. 성장 인자/호르몬/사이토카인의 예는 IGF, 하이드로코르티손 및 (재결합) 인슐린을 포함한다. 미량 원소의 예는 당업계 숙련자에게 공지되어 있고, Zn, Mg 및 Se를 포함한다. 탄수화물의 예는 글루코스, 프룩토오스, 갈락토오스, 수크로스 및 피루베이트를 포함한다.
상기 배양 배지는 성장 인자, 대사물질 등으로 보충될 수 있다.
적합한 배양 배지의 예는, 소태아혈청, 하이드로코르티손, hFGF-B, VEGF, R3-IGF-1, 아스코르브산 hEGF 및 GA-1000으로 충분히 보충된 내피 배양 배지(EGM-2, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자(Lonza)), 및 소태아혈청, 평활근 세포 성장 보충물 및 페니실린/스트렙토마이신을 비롯한 보충물을 갖는 평활근 세포 배지(SMCM, 미국 칼즈배드 소재의 사이언셀(ScienCell))을 포함한다.
상기 세포가 배양되는 최적의 조건은 당업계 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 배양 배지의 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압은 원칙적으로 중요하지 않고, 선택된 세포의 유형에 따라 달라진다. 바람직하게는, pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압은 이들 조건이 세포의 성장 및 생산성에 최적화되도록 선택된다. 당업계 숙련자는 어떻게 최적의 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압을 확인할 수 있는지 알고 있다. 보통, 최적의 pH는 6.6 내지 7.6이고, 최적의 온도는 30 내지 39℃, 예컨대 36 내지 38℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도이고; 최적의 삼투압은 260 내지 400 mOsm/kg이다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는 세포의 배양 방법을 제공한다:
a) 본 발명에 따른 세포 배양액을 제공하는 단계,
b) 상기 하이드로겔의 겔화 온도 미만의 온도에서, 세포를 상기 세포 배양액에 가하는 단계, 및
c) 상기 세포를 배양하는 단계.
하나의 양태에 따라서, 본 발명은, 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드를 포함하는 하이드로겔, 및 내피 세포 및 평활근 중 하나 이상을 포함하는 세포 배양액을 제공한다.
상기 세포는 바람직하게는 동시-배양된 내피세포 및 평활근 세포이다. 상기 세포의 농도는 예컨대 2,000 개의 세포/mL 내지 1,000,000 개의 세포/mL일 수 있다. 이로써 3차원 구조, 예컨대 혈관 시스템이 수득될 수 있다.
본 발명은 또한, 전구혈관 시스템을 제조하기 위한 본 발명에 따른 세포 배양액의 용도를 제공한다.
본 발명이 설명의 목적을 위해 자세히 기술되었지만, 이러한 설명은 단지 상기 목적을 위한 것이고, 청구항에 정의된 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않고 당업계 숙련자에 의해 변형될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특징들의 모든 가능한 조합에 관한 것이고 청구항에 제시된 특징의 조합은 특히 바람직한 것임을 추가로 주지하여야 한다.
용어 "포함하는"은 다른 원소의 존재를 배제하지 않는 것임을 추가로 주지하여야 한다. 하지만, 특정 성분을 포함하는 생성물에 대한 묘사는 이들 성분으로 이루어진 생성물을 또한 기술하는 것임을 또한 이해하여야 한다. 유사하게, 특정 단계를 포함하는 공정에 대한 기술은 이들 단계로 이루어진 공정을 또한 기술하는 것임을 또한 이해하여야 한다.
도 1은 다이알란 단위(상부 중앙)를 기초로 하는 나선형의 올리고-알킬렌 작용성화된 폴리이소시아노-펩타이드의 개략적인 묘사를 예시한다. 주쇄 폴딩(folding)은, 측쇄들의 적층된 아미드 결합들 사이에서 나선 내에서 발달되는 수소 결합 네트워크(하부 중앙)에 의해 안정화된다. 이 2차 구조물은, AFM(우측)에 의해 가시화되는, 매우 강성인 쇄를 유도한다.
도 2는 제1 단량체의 예의 제조 루트의 예를 나타내는 반응도이다.
도 3은 제2 단량체의 예의 제조 루트의 예를 나타내는 반응도이다.
실험
물질: 톨루엔은 나트륨 상에서 증류시켰다. 다이클로로메탄은 인 펜트옥사이드 상에서 증류시켰다. 사용 전에 N-메틸모폴린은 나트륨 상에서 새로 증류시켰다. 물은 밀리포어 밀리큐 시스템(Milipore MiliQ system)(mQ 물 18.2 MΩ)으로 정제하였다. 다른 모든 화학물질은 입수된 그대로 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피는 베이커(Baker)에 의해 제공된 실리카 겔(0.060 내지 0.200 mm)을 사용하여 수행하였다. 박막 크로마토그래피(TLC) 분석은 메르크(Merck)로부터 수득된 실리카 60 F254 코팅된 유리 상에서 수행하고, 화합물을 닌하이드린(Ninhydrine) 또는 염기성 수성 KMnO4 용액으로 가시화하였다. 모든 유리류는 사용 전에 0.5 M NaOH에 담갔다.
실시예 1
(1) 공중합체의 제조
(1.1) 제1 공단량체의 제조
연결 기와 그래프트된 제1 공단량체를 도 2의 반응식에 따라 합성하였다.
1.1.1. 2-(2-(2-(2-하이드록시에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠 설포네이트의 합성(S1)
테트라에틸렌 글리콜(28.5 mL, 164.3 mmol)을 50 mL 피리딘 중에 용해시켰다. 이어서 상기 용액을 교반하면서 0℃로 냉각시켰다. 아르곤을 15분 동안 용액을 통해 버블링시켰다. 토실클로라이드(21.93 g, 115 mmol)를 상기 교반 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 추가로 실온에서 12시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 50 mL의 10 % 시트르산으로 희석시켰다. 혼합물을 250 mL의 클로로포름 내로 3회 추출하였다. 합친 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 증발시켰다. 수득된 황색 오일을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 0.060 - 0.200 mm; 용리제로서 에틸 아세테이트)를 사용하여 정제하여 S1을 연한 황색 오일(11.69 g, 33.6 mmol, 29 %)로서 수득하였다; Rf = 0.4 (에틸 아세테이트).
FT - IR ( cm -1 , ATR ) 3442 (O-H), 2870 (C-H), 1597 (N-H), 1453 (C-H), 1352 (S=O), 1175 (S=O), 1096 (C-O); 1 H NMR δ H (300　 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 7.80 (dd, J = 7.81 Hz, 2H, -CH Ar-), 7.33 (d, J = 7.35 Hz, 2H, -CH Ar-S), 4.17 (m, 2H, O-CH 2-CH2-), 3.65 (m, 16H, -CH 2-), 2.45 (s, 3H, -CH 3); 13 C NMR δ C (75 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si) 21.16 (1C, CCH3), 61.0 (1C, COH), 68.13(1C, COS), 69.0 (1C, OCH2), 70.0, 70.1, 70.1, 70.2 (4C, OCH2), 70.8, 72.0 (2C, OCH2), 127.5 (2C, CHCCH), 129.5 (2C, CHCCH), 139.7 (1C, CCH3), 144.5 (1C, CHCS).
1.1.2. (R)-2-(2-(2-(2-(토실옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸 2-((3급-부톡시카보닐)아미노)프로파노에이트의 합성(S2)
화합물 S1(5.23 g, 15.01 mmol), N-Boc-(L)-알라닌(2.86 g, 15.01 mmol) 및 DMAP(0.198 g, 1.65 mmol)를 25 mL의 갓 증류된 CH2Cl2 중에 용해시키고, 교반시키면서 0℃로 냉각시켰다. DCC(3.12 g, 15.01 mmol)를 나누어 가하였다. 혼합물이 황색으로 변하고, 0℃에서 1시간 동안 교반시키고, 따라서 이를 실온에서 3시간 동안 냉각시켰다. 침전된 다이사이클로헥실 우레아를 여과하여 제거하고, 에틸 아세테이트(3 x 20 mL)로 세척하였다. 유기 층을 진공 하에 건조시켰다. 조질 생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 0.060 - 0.200 mm; 1　%　MeOH/CH2Cl2을 용리제로 사용함)를 사용하여 정제하여 S2를 밝은 오렌지색 오일(5.49 g, 11.4 mmol, 76　%)로서 수득하였다; Rf = 0.4 (10　% MeOH/CH2Cl2).
FT-IR (cm -1 , ATR) 2924 (C-H), 1745 (C=O 에스터), 1712 (C=O 아미드), 1597 (N-H), 1452 (C-H), 1352 (S=O), 1173 (S=O), 1120 (C-O); 1 H NMR δ H (300　MHz; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 7.79 (d, J = 8.4　Hz, 2H, -CH Ar-), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H, -CH Ar-), 5.02 (s, 1H, -NH-), 4.28 (m, 3H, -CH(CH3)-, COOCH 2-), 4.15 (m, 2H, O-CH 2-CH2-), 3.69 (m, 14H, O-CH 2-CH2-), 2.44 (s, 3H, -CH 3), 1.44 (s, 9H, -OC(C H 3)3), 1.37 (d, J = 7.2 Hz, 3H, -CH(C H 3)-); 13 C NMR δ C (75 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si) 18.8 (1C, CHCH3), 21.7 (1C, CCH3), 28.4 (3C, C(CH3)3), 49.4 (1C, O(C=O)CHNH), 64.5 (1C, Boc-OCH2), 68.9 (2C, OCH2), 69.4 (1C, OCH2), 70.7 (4C, OCH2), 80.3 (1C, C(CH3)3), 128.2 (2C, CHCCH), 130.0 (2C, CHCCH), 145.0 (1C, CCH3), 155.4 (1C, CHCS), 173.6 (1C, CH(C=O)NH), 176.7 (1C, CH(C=O)O); MS ( ESI ) m/z [M+ Na ] + 측정치: 542.2; 관측치: 542.2.
1.1.3. (R)-2-(2-(2-(2-(토실옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸 2-((S)-2-((3급-부톡시카보닐)아미노)프로판아미도)프로파노에이트의 합성(S3)
화합물 S2(5.94 g, 11.4 mmol)를 60 mL의 HCl 포화 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 용매를 진공 하에 증발시키고, 과량의 HCl을, 30 mL의 CH2Cl2 및 1 mL의 n-BuOH를 가하고 이어서 증발시킴으로써 제거하였다. 잔여의 n-BuOH를 3x 30 mL CH2Cl2로 공비 증류를 통해 제거하였다. S2의 수득된 HCl 염, N-Boc-(D)-알라닌(2.14 g, 11.4 mmol) 및 N-하이드록시벤조트라이아졸 모노하이드레이트(1.74 g, 11.4 mmol)를 40 mL의 갓 증류된 CH2Cl2 중에 용해시켰다. DIPEA(2 mL, 11.4 mmol)를 적가하고, 모든 물질이 용해될 때까지 혼합물을 실온에서 교반시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고, DCC(2.35 g, 11.4 mmol)를 나누어 가하였다. 백색 침전물이 형성되고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반시키고, 이어서 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과해내고, 에틸 아세테이트(3 x 30 mL)로 세척하고, 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조질 생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 0.060 - 0.200 mm; 2　%　MeOH/CH2Cl2를 용리제로 사용함)를 사용하여 정제하여 S3을 연한 황색 오일(3.37 g, 5.7 mmol, 52 %)로서 수득하였다; Rf = 0.3 (10　% MeOH/CH2Cl2).
FT - IR ( cm -1 , ATR ) 2876 (C-H), 1740 (C=O 에스터), 1718 (C=O 아미드), 1667 (N-H), 1522 (N-H), 1452 (C-H), 1365 (S=O), 1161 (S=O), 1105 (C-O); 1 H NMR δ H (300　 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 7.80 (d, J = 8.4, 2H, -CH Ar- C-S), 7.36 (d, J = 8.1, 2H, -CH Ar-), 6.91 (s, 1H, -NH), 5.00 (s, 1H, -NH), 4.58 (m, 1H, -NHC H (CH3)-), 4.28 (m, 2H, -COOCH 2-), 4.14 (m, 2H, O-CH 2-CH2-), 3.61 (m, 12H, -C(O)OCH2C H 2O(C H 2CH2O)3-), 2.45 (s, 3H, -CH 3), 1.45 (s, 9H, -OC(C H 3)3), 1.40 (d, J = 7.2, 3H, -CH(C H 3)-), 1.35 (d, J = 7.2, 3H, -CH(C H 3)-); 13 C NMR δ C (75　 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 18.2 (2C, CHCH3), 21.7 (1C, CCH3), 28.4 (3C, C(CH3)3), 47.2 (1C, NCH), 50.0 (1C, NCH), 64.5 (1C, Boc-OCH2), 68.7 (2C, OCH2), 69.3 (1C, OCH2), 70.6 (4C, OCH2), 80.2 (1C, C(CH3)3), 128.0 (2C, CHCCH), 129.9 (2C, CHCCH), 133.1 (1C CCH3), 144.9 (1C, CHCS), 172.7 (2C, C=O); MS ( ESI ) m/z [M+Na] + 측정치: 613.2; 관측치: 613.1.
1.1.4. (R)-2-(2-(2-(2-(토실옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸 2-((S)-2-포름아미도프로판아미도)프로파노에이트의 합성(S4)
화합물 S3(1.70 g, 2.85 mmol)을 화합물 S2에 대해 기술된 동일한 절차를 따라 탈보호하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 조질 생성물을 25 mL 에틸 포르메이트 중에 용해시켰다. 나트륨 포르메이트(0.97 g, 14.25 mmol)를 가하고, 혼합물을 66℃에서 8시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과해냈다. 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조질 생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 0.060 - 0.200 mm; 4　% MeOH/CH2Cl2를 용리제로 사용함)를 사용하여 정제하여 S4를 연한 황색 오일(0.79 g, 1.52 mmol, 54　%)로서 수득하였다; Rf = 0.3 (10　% MeOH/CH2Cl2).
FT - IR ( cm -1 , ATR ) 2873 (C-H), 1738 (C=O), 1653 (N-H), 1532 (N-H), 1452 (C-H), 1352 (S=O), 1174 (S=O), 1097 (C-O); 1 H NMR δ H (300　MHz; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 8.18 (s, 1H, H C(O)NH-), 7.79 (d, J = 8.4, 2H, -CH Ar- C-S), 7.35 (d, J = 8.7, 2H, -CH Ar-), 6.78 (s, 1H, -NH), 6.55 (s, 1H, -NH), 4.55 (m, 2H, -NHC H (CH3)-), 4.30 (m, 2H, -COOCH 2-), 4.13 (m, 2H, O-CH 2-CH2-), 3.61 (m, 12H, -(C H 2C H 2O)3-), 2.44 (s, 3H, -CH 3), 1.42 (m, 6H, -CH(C H 3)-); 13 C　NMR δ C ( 75 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 17.9 (1C, CHCH3), 18.2 (1C, CHCH3), 21.7 (1C, CCH3), 47.2 (1C, O(C=O)HNCH), 48.1 (1C, HNHC(C=O)), 64.5 (1C, OCH2), 68.7 (2C, OCH2), 69.3 (1C, OCH2), 70.6 (4C, OCH2), 128.0 (2C, CHCCH), 129.9 (2C, CHCCH), 133.1 (1C, CCH3), 144.9 (1C, CHCCH), 161.0 (1C, H(C=O)NH)), 172.6 (1C, CH(C=O)NH), 173.2 (1C, CH(C=O)O); MS ( ESI ) m/z [M+ Na ] + 측정치: 541.2; 관측치: 541.2.
1.1.5. (R)-2-(2-(2-(2-아자이도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 2-((S)-2-포름아미도 프로판아미도)프로파노에이트의 합성(S5)
화합물 S4(0.550 g, 1.06 mmol)를 40 mL의 절대 EtOH 중에 용해시켰다. 나트륨 아자이드(0.38 g, 5.9 mmol)를 가하고, 혼합물을 밤새 환류시켰다. 실온으로 냉각시키자마자, 고체를 여과로 제거하고, 여액을 진공 하에 건조시켰다. 조질 생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 0.060 - 0.200 mm; 4　% MeOH/CH2Cl2를 용리제로 사용함)를 사용하여 정제하여 S5를 연한 오렌지색 오일(0.32 g, 0.82 mmol, 78　%)로서 수득하였다; Rf = 0.4 (10　% MeOH/CH2Cl2).
FT - IR ( cm -1 , ATR ) 3309 (N-H), 2875 (C-H), 2105 (N3), 1737 (C=O), 1651 (N-H), 1529 (N-H), 1453 (C-H), 1133 (C-O); 1 H NMR δ H (300　 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 8.20 (s, 1H, H C(O)NH-), 6.84 (s, 1H, -NH), 6.60 (s, 1H, -NH), 4.60 (m, 2H, NHC H (CH3)), 4.26 (m, 2H, -C(O)OC H 2-), 3.68 (m, 12H, -(C H 2CH 2O)3-), 3.40 (m, 2H, N3CH 2-), 1.42 (m, 6H, -CH(C H 3)-); 13 C NMR δ C (75 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 17.9 (1C, CH3), 18.2 (1C, CH3), 47.4 (1C, CH2N3), 48.4 (1C, H(C=O)HNCH), 50.7 (1C, HNC(CH3)C=O), 69.0 (1C, CH2 CH2O), 70.1 (1C, OCH2CH2), 70.6 (2C, OCH2), 70.7 (2C, OCH2), 161.4 (1C, H(C=O)NH), 172.7 (1C, CH(C=O)NH), 172.9 (1C, CH(C=O)O); MS (ESI) m/z [M+ Na ] + 측정치: 412.2; 관측치: 412.2.
1.1.6. (R)-2-(2-(2-(2-아자이도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 2-((S)-2-이소시아노프로판아미도)프로파노에이트(1)의 합성
화합물 S5(221 mg, 0.57 mmol) 및 N-메틸모폴린(0.24 mL, 2.27 mmol)을 150 mL의 갓 증류된 CH2Cl2 중에 용해시키고, 질소 분위기 하에 -40℃(건조 아세톤 배쓰)로 냉각시켰다. 10 mL의 갓 증류된 CH2Cl2 중의 다이포스겐의 용액(0.048 mL, 0.398　mmol)을 1 시간에 걸쳐 아르곤 하에 적가하였다. 다이포스겐을 가하면서, 혼합물을 교반시키고, -40℃에서 두었다. 혼합물이 황색으로 변하자마자, 반응물을 빠르게 과량의 나트륨 바이카보네이트(5 g)로 켄칭하였다. 상기 켄칭된 혼합물을 5분 동안 -40℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 짧은 실리카 컬럼플러그(SiO2, 0.060 내지 0.200 mm) 위로 통과시켰다. 상기 플러그를 CH2Cl2로 패킹하였지만, 바람직한 화합물을 CH2Cl2/아세토니트릴(3:1)로 용리하여 1을 연한 황색 오일(48.1 mg, 0.48 mmol, 27　%)로서 수득하였다; Rf = 0.5 (10　% MeOH/CH2Cl2).
FT - IR ( cm -1 , ATR ) 3318 (N-H), 2875 (C-H), 2142 (C=N), 2105 (N3), 1744 (C=O), 1540 (N-H), 1453 (C-H), 1123 (C-O); 1 H NMR δ H (300　 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 7.00 (bd, 1H, -N H -), 4.59 (m, 1H, -NHC H (CH3)C(O)O-), 4.32 (m, 3H, (-C(O)OC H 2CH2O-), -C=NC H (CH3)C(O)NH-), 3.67 (m, 12H, -(OC H 2C H 2)3), 3.39 (m, 2H, N3CH 2-), 1.65 (d, J = 7.2, 3H, C=NCH(C H 3)C(O)-), 1.48 (d, J = 7.2, 3H, C=NCH(C H 3)C(O)-); 13 C NMR δ C (75 MHz ; CDCl 3 ; Me 4 Si ) 170.69 (1C, CH(CH3)C(O)OCH2), 165.72 (1C, CH(CH3)C(O)NH), 70.69, 70.65, 70.61, 70.56, 70.02, 68.81 (1 C, CH2 CH2O), 50.66 (1C, CH2N3), 48.56 (C=NCH), 19.66, 18.04 (1C, CH(CH3)CO); MS (ESI) m/z [M+ Na ] + (C15H25N5O6Na), 측정치: 394.17; 관측치: 394.1.
(2.1) 제2 공단량체의 제조
연결 기와 그래프트되지 않은 제2 공단량체를 도 3의 반응식에 따라 합성하였다.
2.1.1 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)에틸 2-아미노프로파노에이트의 합성(S6)
트라이에틸렌글리콜 메톡시(25 ml, 156.21 mmol), L-알라닌(21.85 g, 245.25 mmol), p-톨루엔 설폰산(32.69 g, 171.83 mmol) 및 250 ml의 톨루엔을 환저 플라스크에 가하였다. 반응 혼합물을 126℃에서 4시간 동안 환류시켰다. 고체 침전물을 여과해내고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 이어서 생성물을 300 ml의 클로로포름으로 용해시키고, 유기 층을 NaHCO3(포화)로 3회 추출하였다. 이후, 물 층을 클로로포름으로 2회 추출하였다. 상기 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켜서, 22.69 g의 S6을 62% 수율로 수득하였다.
2.1.2 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)에틸 2-((3급-부톡시카보닐)아미노)프로파노에이트의 합성(S7)
Boc-D-Ala-OH(18.25 g, 96.44 mmol), DMAP(0.1 g, 0.8 mmol), DiPEA(1.7 ml, 9.64 mmol), HoBt(14.77 g, 96.44 mmol), DCC(21.89 g, 106.08 mmol), S6(22.69 g, 96.44 mmol) 및 250ml의 CH2Cl2를 함께 혼합시키고, 얼음 배쓰 내에서 0℃에서 냉각시키고, 3시간 동안 교반시켰다. 이후, 혼합물을 실온으로 가온시키고, 15시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과해내고, 생성물을 200 ml의 클로로포름 중에 용해시키고, 용액을 시트르산으로 3회 추출하였다. 물 층을 클로로포름(1 x 200 ml)으로 세척하였다. 유기 층을 포화 NaHCO3 용액으로 2회 세척하고, 물 층을 클로로포름으로 2회 더 추출하였다. 상기 유기 층을 합치고, Na2SO4로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 중의 2% MeOH)를 사용하여 조질 생성물을 정제하고, 20.4 g의 S7을 52% 수율로 수득하였다.
R f = 0.53 (10% MeOH/CH2Cl2) ) 1 H NMR ( CDCl 3 , 400 MHz ): δ= 6.77 (s, 1H, -N H CH-); 5.09 (s, 1H, - N H CH) -; 4.60 (q, 1H, -NHC H (CH3)-); 4.31-4.28 (m, 3H, -C(O)OC H 2CH2O-, -C H (CH3)COO-); 3.70-3.56 (m, 10H, -C(O)OCH2C H 2O(C H 2C H 2O)2-); 3.38 (s, 1H, -OC H 3); 1.46 (s, 9H, -OC(C H 3)3); 1.41 (d, 3H, -NHCH(C H 3)-; 1.38 (d, 3H, -NHCH(C H 3)-)
S7(13.15 g, 32.35 mmol)을 20 ml의 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 20 ml의 다이옥산 중의 4 M HCl로 처리하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반시켰다. TLC를 통해 출발 화합물을 확인한 후, 또 다른 20 ml의 다이옥산 중의 4 M HCl을 가하고, 용액을 실온에서 추가의 1시간 동안 교반시켰다. 잔여의 t-BuOH를 20 mL의 DCM을 가하여 제거하고, 감압 하에 제거하였다. 이 절차를 3회 반복하였다.
2.1.3 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)에틸 2-포름아미도프로파노에이트의 합성(S8)
S7의 HCl 염(13.15g, 32.33 mmol) 및 나트륨포르메이트(8.76 g, 129.33 mmol)를 250 ml의 에틸포르메이트 중에서 용해시켰다. 반응 혼합물을 14시간 동안 66℃에서 끓였다. 침전물을 여과해내고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 중의 4% MeOH)를 사용하여 조질 생성물을 정제하고, 6.04 g의 S8을 56% 수율로 수득하였다.
R f = 0.54 (10% MeOH/CH2Cl2) 1 H NMR ( CDCl 3 , 400 MHz ): δ= 8.23 (s, 1H, H C(O)NH-); 6.94 (d, 1H, -N H CH-); 6.79 (d, 1H, -N H CH-; 4.57 (m, 2 H, NHC H (CH3)-, -NHC H (CH3)-); 4.26 (m, 2H, -C(O)OC H 2-); 3.67-3.54 (m, 10H, -C(O)OCH2C H 2O(C H 2C H 2O)3-); 3.43 (s, 3H, -OCH 3); 1.45 (t, 6H, -NHCH(C H 3)-, -NHCH(C H 3)-
2.1.4 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)에틸 2-이소시아노프로파노에이트(2)의 합성
S8(6.04 g, 18.06 mmol)을 1시간 동안 N2로 탈기시켰다. 이어서, NMM(5 ml, 45.15 mmol)을 갓 증류된 CH2Cl2(50 ml)로 용해시키고, 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 -40℃(드라이아이스/이소프로판올)로 냉각시켰다. CH2Cl2(50 ml) 중의 다이포스겐(1.52 ml, 12.64 mmol)의 용액을 2시간 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 황색-오렌지 색상으로 전환될 때까지 교반시키고, NaHCO3(3g)로 켄칭하였다. 컬럼 크로마토그래피(1:2 ACN/CH2Cl2)를 사용하여 조질 생성물을 정제하고, 3.34 g의 2를 51% 수율로 수득하였다.
R f = 0.50 (10% MeOH/CH2Cl2) 1 H NMR ( CDCl 3 , 400 MHz ): δ= 7.00 (d, 1H, -N H -); 4.58 (m, 1H, C≡NC H (CH3)C(O)NH-); 4.28 (m, 2H, -C(O)OC H 2CH2O-); 4.26 (m, 1H, -NHC H (CH3)C(O)O-); 3.74-3.53 (m, 10H, -OCH2C H 2(OC H 2C H 2)3OCH3); 3.41 (s, 3H, -OCH 3); 1.67 (d, 3H, C≡NCH(C H 3)C(O)-); 1.49 (d, 3H, -NHCH(C H 3)C(O)O-)
(3) 중합
화합물 2(예컨대 100 당량) 및 화합물 1(1 당량)을 2 mL의 증류된 톨루엔 중에 용해시켰다. 1 mM의 촉매 스톡 용액을 10 mL의 무수 에탄올 및 90 mL의 톨루엔 중의 39 mg의 Ni(Cl2O4)2·6 H2O에 용해시킴으로써 제조하였다. 총 단량체 몰 x 10-4에 해당되는 부피를 단량체에 피펫으로 가하였다. 혼합물을 증류된 톨루엔으로 희석시켜 25 mg/mL의 최종 농도의 단량체를 수득하였다. 혼합물을 CaCl2 건조 튜브가 장착된 플라스크 내에서 72시간 동안 실온에서 교반시켰다. 중합체를 다이이소프로필에터 내로 침전을 통해 단리시켰다. 침전 주기를 3회 반복하여 44 내지 92 %의 수율을 수득하였다. 중합체를 고유 점도, 유변상수(G') 및 원 이색성(circular dichroism)을 측정함으로써 분석하였고, 이들은 용액으로부터 마이카 상에 드롭캐스팅(dropcasting)함으로써 AFM을 통해 가시화되었다.
(4) 공중합체에 대한 스페이서 단위/세포 접착 단위의 그래프팅
펩타이드(GRGDS)를 pH 8.4의 보레이트 완충액 중에 용해시켜 2 mg/mL의 최종 농도가 되게하였다. 화학식 (III)으로 나타내지는 스페이서 단위(BCN-NHS)를 1:1 몰 비율로 펩타이드 용액에 가하고, 300 rpm 18℃에서 1시간 동안 혼합시킨 후, 100 uL 분취액 내에서 동결시켰다. 화학식 (V)로 나타내지는 BCN-GRGDS가 수득되었다. MS 측정치[C39H62N10O15]: 910.4, 관측치: 911.5
이전 단계에서 수득된 폴리이소시아나이드(PIC)를 2 mg/mL에서 ACN 중에 용해시켰다. 이 PIC 용액에, 폴리이소시아나이드 주쇄 내의 아자이드 공단량체의 몰 당량에 기초한 적합한 부피의 BCN-GRGDS을 가하였다. 혼합물을 4℃에서 72시간 동안 교반시켰다. PIC-펩타이드를 다이이소프로필 에터로부터 침전시켜서 정제하였다. 침전물을 붓고, 폴리이소시아나이드-펩타이드를 재용해시키고, 다이이소프로필 에터 내로 DCM으로부터 침전시켰다.
(5) 상기 공중합체로부터의 하이드로겔의 제조
여기서부터, 폴리이소시아노-펩타이드를 살균상태로 유지하기 위해 조치하였다. 모든 장치는 사용 전에 에탄올로 분무처리하였다. PIC-펩타이드 결합체를 살균된 원심 분리관 내로 직접 가하였다. 튜브를 UV 조사에 5분 동안 노출시킴으로써 추가로 멸균시켰다. 상기 PIC-펩타이드를 살균된 세포 배지로 피복하여 3.2 mg/mL의 배지 중 중합체의 최종 희석액을 수득하고, 4℃에서 24시간 동안 팽윤시켰다. 24 시간 후, 팽윤된 겔-형상 물질을 상기 원심 분리관의 바닥에서 수득하였다. 상기 팽윤된 PIC-펩타이드 결합체를 4℃에서 72시간 동안 교반시킨 후, 균일한 용액을 수득하였다. 이 용액은 임계 온도 위에서 점도의 급격한 전이를 나타내었다.
배지 내의 상기 PIC-펩타이드 결합체는 4 내지 7℃에서 20개월까지 또는 동결시 더 긴 기간 동안 안정하게 유지되었다.
적합한 강성도 및 농도의 전구혈관화 구성물의 제조를 위해, 3.2mg/mL의 겔의 스톡 용액을 적합한 양의 배지로 희석시켜서 2.0 mg/mL의 중합체의 바람직한 최종 농도에 도달하게 하였다.
(6) 세포를 포함하는 하이드로겔의 제조
(6-1) 세포를 포함하는 세포 배지의 제조
HUVEC(ACTT, PCS-100-010, USA)를 소태아혈청, 하이드로코르티손, hFGF-B, VEGF, R3-IGF-1, 아스코르브산 hEGF 및 GA-1000으로 충분히 보충된 내피 배양 배지(Endothelial Growth Medium)(EGM-2, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자)에서 배양시켰다. HbSMC(미국 칼즈배드 4310 소재의 사이언셀)를 평활근 세포 배지(Smooth Muscle Cell Medium)(SMCM, 미국 칼즈배드 소재의 사이언셀)에서 소태아혈청, 평활근 세포 성장 보충 및 페니실린/스트렙토마이신을 비롯한 보충물과 함께 배양시켰다. 이들 2개의 세포 유형을 T75 플라스크(미국 코닝 주의 코닝사(Corning Incorporated)) 내에서 5% CO2에서 37℃에서 배양시켰다. 배지를 주 당 3회 바꾸고, 세포를 트립신 처리하여 수확하였다. 계대배양(passage) 8회째의 HbSMC 및 계대배양 9회째의 HUVEC를 모든 실험에서 사용하였다.
(6-2) 세포를 포함하는 세포 배지와 하이드로겔의 혼합
전구혈관화 구성물의 제조를 위해, 단계 (B)에서 수득된 열응답성 PIC-펩타이드 결합체의 용액의 온도를 0℃로 낮추어 겔-액체 전이를 유도하였다. 이어서, 액화된 겔의 분취액을 단계 (6-1)에서 수득된 HUVEC 및 HbSMC를 모두 함유하는 세포-현탁액과 혼합시켜서 500,000 개의 세포/ml의 바람직한 세포 농도를 얻었다. 이들 겔-세포 현탁액의 200 μl의 분취액을 이어서 24-웰 인써트(0.2 μm의 막 기공 크기)로 이동시키고, 37℃에서 30분 동안 두어서 상기 겔을 고화시켰다.
(7) 전구혈관 시스템 형성을 위한 세포 배양
3일 내에 상기 세포가 상기 하이드로겔에 부착되고, 7일 내에 혈관화가 관찰되는 것을 확인하였다.
상기 제조된 전구혈관화 구성물을 14일 동안 37℃에서 5% CO2에서 적합한 배지의 혼합물 중에서 배양하였다. 혈관화 구성물의 진행(progress)이 이어졌다.
비교 실험 2(낮은 중합체 농도)
단계 (5)에서의 중합체 농도가 2.0 mg/mL 대신 1.0 mg/mL인 것을 제외하고 실시예 1을 반복하였다.
단계 (7)에서, 상기 겔을 고화시킨 후에, 상기 세포가 24-웰 인써트의 바닥으로 서서히 가라앉았다. 세포들의 스프라우팅(sprouting)의 일부 집단화가 관찰되었으나 형성된 구조물이 열등한 품질이었다. 실험을 3일 후에 끝냈다. 어떠한 전구혈관 시스템도 형성되지 않았다.
비교 실시예 3(높은 중합체 농도)
단계 (5)에서의 중합체 농도가 2.0 mg/mL 대신에 3.2 mg/mL인 것을 제외하고 실시예 1을 반복하였다.
단계 (7)에서, 전구혈관화 구성물의 진행이 관찰되었으나 매우 느렸다. 세포는 24-웰 인써트 내에 현탁된 채로 남아있었다. 스프라우팅의 시작이 관찰된 후 세포는 1 내지 7일 동안 구형으로 남아있었다. 실험을 14일 후 종결하였다. 형성된 세포 구조물은 열등한 품질을 나타내었고, 아무런 전구혈관 시스템이 형성되지 않았다. 하이드로겔이 너무 강성이어서 이들 특정 세포가 상기 겔 내에서 효율적으로 이동하고/성장하는 것이 어려운 것으로 보였다.
실시예 1과 비교 실험 2 및 3의 비교로부터, 상기 하이드로겔 내의 공중합체의 농도가 전구혈관화 구성물의 형성에 중요한 것으로 결론지을 수 있다. 적합한 농도 범위는 1.2 내지 3.0 mg/mL이다.
비교 실험 4(너무 적은 GRGDS )
단계 (3)에서의 화합물 1 대 화합물 2의 비율이 1:100 대신에 1:550인 것을 제외하고, 실시예 1을 반복하였다.
단계 (7)에서, 상기 겔을 고화시킨 후, 한정된 스프라우팅이 관찰되는 긴 기간 동안 세포가 구형으로 남아있고, 전구혈관화가 후속 21일 동안 완료되지 않았다. 어떠한 전구혈관 시스템도 형성되지 않았다.
비교 실험 5(너무 많은 GRGDS )
단계 (3)에서의 화합물 2 대 화합물 1의 비율이 1:100 대신에 1:25인 것을 제외하고 실시예 1을 반복하였다.
단계 (7)에서, 상기 겔을 고화시킨 후, 비조절성 무방향성 세포 성장이 관찰되고, 형성된 구성물은 전구혈관 시스템을 나타내지 않았다.
비교 실험 6(너무 많은 GRGDS )
단계 (3)에서의 화합물 2 대 화합물 1의 비율이 1:100 대신에 1:10인 것을 제외하고 실시예 1을 반복하였다.
단계 (5)에서, PIC-펩타이드를 살균된 배양 배지로 피복한 후, 겔-유사 물질이 수득되지 않았고, 실험이 종결되었다.
실시예 1과 비교 실험 4 및 5의 비교로부터, GRGDS와 그래프트된 공단량체의 비율이 전구혈관화 구성물의 형성에 중요한 것으로 결론지을 수 있다. 적합한 비율은 1:550 내지 1:50이다.
실험 7
실시예 1의 단계 5에서 수득된 하이드로겔의 탄성 모듈러스는 하기와 같이 측정되었다:
실험. TA 인스트루먼츠(Instruments) 아레스(Ares) G2 유동계를 사용하여 약 20 mL의 쿠에트(Couette) 구조에서 펠티에 소자(peltier element)로 온도 조절하면서 유변학적 측정을 수행하였다. 샘플은, 적합한 양의 중합체를 순수물(demi water)(20 mL)에서 혼합시키고, 균질한 용액이 수득될 때까지 혼합물을 밤새(24 시간 동안) 규칙적으로 와류 혼합시켜서 제조하였다. PIC의 용액은, 초기의 겔 형성을 막기 위해 선형 응답 체제에서의 측정을 냉장(4℃) 조건에서 제조하였다. 0.5 내지 5 Hz의 상이한 진동수에서 4% 변형율로 선형 응답 체제에서의 측정을 수행하였다. 데이터는 1 Hz에서 기록되었다. 온도 스캔은 2℃ min-1의 가열 속도로 기록되었다. 생물학적으로 연관된 배지에서의 측정은, 750 um의 갭으로 설정된 TA 인스트루먼츠 디스커버리(Discovery) HR-1 40 mm 알루미늄 평행 플레이트 상에서 1 mL의 샘플로 수행하였다. 온도는 펠티에 소자 및 증발 가드(guard)를 사용하여 조절하였다. DMEM 중에 적합한 양의 중합체를 혼합시키고, 균질한 용액이 수득될 때까지 4℃에서 계속(48 시간 이상) 규칙적으로 교반시킴으로써 PIC 샘플을 제조하였다. PIC의 용액을 바로 사용하거나, 측정이 수행될 수 있을 때까지 샘플 메모리 효과를 피하기 위해 냉동시켰다. 매트리젤(matrigel)은 공급자로부터 입수한 그대로 사용되고, FBS를 함유하는 DMEM 중에 피브리노겐을 용해시킴으로써 피브린 겔이 제조되고, 측정 전에 37℃에서 2시간 동안 겔화시켰다. 1 Hz 사이의 상이한 진동수에서 2% 변형율로 선형 응답 체제로 측정을 수행하였다. 2℃ min-1의 가열 또는 냉각 속도에서 온도 스캔을 기록하였다.
탄성 모듈러스는 5 내지 15℃ 범위의 온도에서 실질적으로 일정하고, 약 1 Pa으로 측정되었다. 탄성 모듈러스는 23℃에서 약 100 Pa로 증가하였다. 탄성 모듈러스는 35℃에서 약 500 Pa로 증가하였다.

Claims (15)

  1. i) 하기 공단량체:
    - 연결 기와 그래프트된(grafted) 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제1 공단량체; 및
    - 그래프트되지 않은 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 이소시아노펩타이드의 제2 공단량체
    를 공중합시키는 단계, 및
    ii) 스페이서 단위 및 세포 접착 인자(cell adhesion factor)의 반응물을 상기 단계 i)에서 수득된 공중합체에 가하는 단계
    를 포함하는 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드의 제조 방법으로서,
    상기 제1 공단량체 대 상기 제2 공단량체의 몰 비는 1:500 내지 1:30이고,
    상기 스페이서 단위는 일반 화학식 A-L-B로 나타내지고,
    상기 연결 기 및 기 A는 반응하여 제1 커플링을 형성하도록 선택되고, 상기 세포 접착 인자 및 기 B는 반응하여 제2 커플링을 형성하도록 선택되고,
    상기 제1 커플링 및 제2 커플링은 독립적으로, 알킨-아자이드 커플링, 다이벤조사이클로옥틴-아자이드 커플링, 옥사노르보나다이엔-계-아자이드 커플링, 비닐설폰-티올 커플링, 말레이미드-티올 커플링, 메틸 메타크릴레이트-티올 커플링, 에터 커플링, 티오에터 커플링, 바이오틴-스트레파비딘 커플링, 아미드 연결을 유도하는 아민-카복실산 커플링, 에스터 결합을 유도하는 알콜-카복실산 커플링, 및 NHS-에스터(N-하이드록시석신이미드 에스터)-아민 커플링으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    기 L은, 주쇄에서 C, N, O 및 S로부터 선택된 원자들 사이에 10 내지 60개의 결합을 갖는 선형 쇄 분절인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    기 L이 하기로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00022

    Figure pct00023

    Figure pct00024

    상기 식에서,
    p는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5이고,
    q는 1 내지 9, 바람직하게는 2 내지 5이고,
    r은 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5이다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제1 커플링이 알킨-아자이드 커플링인, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 커플링이 NHS-에스터(N-하이드록시석신이미드 에스터)-아민 커플링 또는 말레이미드-아민 커플링인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기 A가 하기 화학식 (VII)으로 나타내지는, 방법:
    Figure pct00025

    상기 식에서,
    n은 0 내지 8이고;
    R3은 [(L)p-Q], 수소, 할로겐, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고, 상기 알킬 기, (헤테로)아릴 기, 알킬(헤테로)아릴 기 및 (헤테로)아릴알킬 기는 독립적으로, 임의적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기, C3 - C12 사이클로알킬옥시 기, 할로겐, 아미노 기, 옥소 기 및 실릴 기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고, 이때 상기 알킬 기, 알켄일 기, 알킨일 기, 사이클로알킬 기, 알콕시 기, 알켄일옥시 기, 알킨일옥시 기 및 사이클로알킬옥시 기는 임의적으로 치환되고, 상기 알킬 기, 알콕시 기, 사이클로알킬 기 및 사이클로알콕시 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고, 상기 실릴 기는 화학식 (R4)3Si-로 나타내지고, 이때 R4은 독립적으로, C1 - C12 알킬 기, C2 - C12 알켄일 기, C2 - C12 알킨일 기, C3 - C12 사이클로알킬 기, C1 - C12 알콕시 기, C2 - C12 알켄일옥시 기, C2 - C12 알킨일옥시 기 및 C3 - C12 사이클로알킬옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 기, 알켄일 기, 알킨일 기, 사이클로알킬 기, 알콕시 기, 알켄일옥시 기, 알킨일옥시 기 및 사이클로알킬옥시 기는 임의적으로 치환되고, 상기 알킬 기, 알콕시 기, 사이클로알킬 기 및 사이클로알콕시 기에는 임의적으로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로-원자가 개재되고;
    R1은 독립적으로, 수소, C1 - C24 알킬 기, C6 - C24 (헤테로)아릴 기, C7 - C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C7 - C24 (헤테로)아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2은 독립적으로, 할로겐, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, C1 - C12 알킬 기, C1 - C12 아릴 기, C1 - C12 알킬아릴 기 및 C1 - C12 아릴알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 R6은 상기 정의된 바와 같고, 상기 알킬 기, 아릴 기, 알킬아릴 기 및 아릴알킬 기는 임의적으로 치환된다.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 스페이서 단위가 하기 화학식 (IX)로 나타내지는, 방법:
    Figure pct00026

    상기 식에서, R1, R2, R3 및 n은 상기 정의된 바와 같고,
    L은 하기 화학식 (X)로 나타내지는 군으로부터 선택된다:
    Figure pct00027

    [상기 식에서, p는 2 내지 5임].
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서 단위가 하기 화학식 (XI)로 나타내지는, 방법:
    Figure pct00028

    상기 식에서, p는 2 내지 5이다.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 접착 인자가 아미노산의 서열, 예컨대 RGD 및 GRGDS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 공단량체 및 제2 공단량체 상의 알킬렌 글리콜 단위의 수의 평균이 3 이상 4 이하인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 올리고(알킬렌 글리콜) 작용성화된 코-폴리이소시아노펩타이드.
  11. 제 10 항의 코-폴리이소시아노펩타이드를 1.2 내지 3.0 mg/mL의 농도로 포함하고, 이때 상기 코-폴리이소시아노펩타이드는 18 내지 40℃의 겔화(gelation) 온도를 갖는, 하이드로겔을 포함하는 세포 배양액(cell culture).
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 세포 배양액이 내피(endothelial) 세포 및 평활근(smooth muscle) 세포 중 하나 이상을 포함하는, 세포 배양액.
  13. 하기 단계를 포함하는 세포 배양 방법:
    a) 제 11 항에 따른 세포 배양액을 제공하는 단계;
    b) 하이드로겔의 겔화 온도 미만의 온도에서 상기 세포 배양액에 세포를 가하는 단계; 및
    c) 상기 세포를 배양하는 단계.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포가 내피 세포 및 근(muscle) 세포인, 방법.
  15. 전구혈관(prevascular) 시스템을 제조하기 위한, 제 12 항에 따른 세포 배양액의 용도.
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