JP2016525106A - 細胞培養用に適したポリマー - Google Patents
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Abstract
Description
これらのゲルで形成される複雑な生物系を回収することも依然として課題である。伝統的な方法では、トリプシンを利用して細胞を生物表面から剥離したり、ゲルを機械的に分解したり、構造体の表面から手作業で剥離する必要がある。
上記のゲル化性構造体は自然界に遍在せず、侵襲を最小限にした方法で容易に生体内に利用することができない。冷却したカテーテルにより侵襲を最小限にした方法で利用することができる温度応答性材料はUS2010/0215731A1に開示されているもの等の数例が存在する。しかし、これらの材料には上記と同じ欠点があるため、細胞生存率が不良である。
機械的な観点では、全ての生物由来ゲルの性質はペプチドサブユニットの非共有的相互作用により決定される。その結果、細孔寸法と機械的強度は比較的一定となる。合成由来ゲルの場合には架橋の機械的性質と種類は更に一定となる。
WO2011/007012はオリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたポリイソシアノペプチドを含むハイドロゲルを開示している。これらのポリイソシアノペプチドはイソシアノペプチドをオリゴ(アルキレングリコール)側鎖で官能基化した後に、こうしてオリゴアルキレングリコールで官能基化されたイソシアノペプチドを重合することにより製造される。WO2011/007012は組織工学又はニューロン再生用としてこれらのハイドロゲルを使用することを提案している。
公知細胞培養液は用途によっては満足できるが、広範な状況で使用できる細胞培養液が当分野で益々必要とされている。
i)オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドの第1のコモノマーと、
オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化され、グラフトしていないイソシアノペプチドの第2のコモノマーを、
前記第1のコモノマーと前記第2のコモノマーのモル比が1:500〜1:30となるように共重合する工程と、
ii)工程i)により得られたコポリマーにスペーサー単位と細胞接着因子の反応体を加える工程を含み、前記スペーサー単位は一般式A−L−Bにより表され、
前記式中、前記連結基とA基は相互に反応して第1のカップリングを形成するように選択され、前記細胞接着因子とB基は相互に反応して第2のカップリングを形成するように選択され、
前記第1のカップリング及び前記第2のカップリングは独立してアルキン−アジドカップリング、ジベンゾシクロオクチン−アジドカップリング、オキサノルボルナジエン系アジドカップリング、ビニルスルホン−チオールカップリング、マレイミド−チオールカップリング、メタクリル酸メチル−チオールカップリング、エーテルカップリング、チオエーテルカップリング、ビオチン−ストレプトアビジンカップリング、アミン−カルボン酸カップリングによるアミド結合、アルコール−カルボン酸カップリングによるエステル結合、及びNHSエステル(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)−アミンカップリングから構成される群から選択され、
L基は主鎖におけるC、N、O及びSから選択される原子間の結合数が10〜60である直鎖セグメントである。
同様に、前記細胞接着因子とB基は相互に反応して上記に挙げた、いずれのカップリングでもよい第2のカップリングを形成するように選択される。好ましくは、前記第2のカップリングはNHSエステル(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)−アミンカップリング又はマレイミド−チオールカップリングである。これはペプチドである前記細胞接着因子のN末端とNHSエステルとのカップリング又はペプチドである前記細胞接着因子の末端チオールとマレイミドとのカップリングとすることができる。
L基は反応性のA基とB基を連結する直鎖をもつセグメントである。このセグメントはC、N、O及びSから選択される原子の配列により形成される。A基とB基に連結される主鎖における原子間の結合数は最低10から最大60までである。「主鎖」なる用語はA基とB基を最短距離で連結する分子鎖を意味するものである。末端A基及びB基に連結される主鎖における原子間の結合数は好ましくは最低12、より好ましくは最低15である。末端A基及びB基に連結される主鎖における原子間の結合数は好ましくは最低50、より好ましくは最低40である。
細胞接着因子に結合した細胞を培養するためにはコポリマー主鎖と細胞接着因子の間に所定の最小距離が必要であることが判明した。本発明ではスペーサー単位の存在によりこの距離を提供するが、最低結合数10により与えられる距離が必要であることが分かった。結合数が10未満の長さでは十分な細胞増殖が得られないことが判明した。
L基の好ましい例は、
スペーサー単位がこれらの型のL基を含むとき、A基、B基、連結基及び細胞接着因子の種類と寸法に関係なく、特に安定な細胞増殖が確保される。
別の態様によると、本発明はオリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを濃度1.2〜3.0mg/mLで含有するハイドロゲルを含む細胞培養液を提供し、前記コポリイソシアノペプチドは、
i)オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドの第1のコモノマーと、
オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化され、グラフトしていないイソシアノペプチドの第2のコモノマーを、
前記第1のコモノマーと前記第2のコモノマーのモル比が1:500〜1:30となるように共重合する工程と、
ii)工程i)により得られたコポリマーにスペーサー単位と細胞接着因子の反応体を加える工程により製造され、前記スペーサー単位は一般式A−L−Bにより表され、
前記式中、前記連結基とA基は相互に反応して第1のカップリングを形成するように選択され、前記細胞接着因子とB基は相互に反応して第2のカップリングを形成するように選択され、
前記第1のカップリング及び前記第2のカップリングは独立してアルキン−アジドカップリング、ジベンゾシクロオクチン−アジドカップリング、オキサノルボルナジエン系アジドカップリング、ビニルスルホン−チオールカップリング、マレイミド−チオールカップリング、メタクリル酸メチル−チオールカップリング、エーテルカップリング、チオエーテルカップリング、ビオチン−ストレプトアビジンカップリング、アミン−カルボン酸カップリングによるアミド結合、アルコール−カルボン酸カップリングによるエステル結合、及びNHSエステル(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)−アミンカップリングから構成される群から選択され、
L基は主鎖におけるC、N、O及びSから選択される原子間の結合数が10〜60である直鎖セグメントである。
細胞接着因子の濃度が低過ぎると、細胞は十分にハイドロゲルに接着しないため、細胞を培養できなくなる。細胞接着因子の濃度が高過ぎると、細胞はゲル内で増殖しない。
第1のコモノマーの1例を式(I)に示す(式中、連結基はアジドである。)。
式(I)
式(II)
スペーサー単位を介して細胞接着因子をコポリマーに結合する。先ず、スペーサー単位と細胞接着因子の反応体を作製する。スペーサー単位の1例を式(III)に示す。
式(III)
本例においてA基は
細胞接着因子の1例を式(IV)に示すが、これはグリシン、L−アルギニン、グリシン、L−アスパラギン酸及びセリンから構成されるペンタペプチド(GRGDS)である。
細胞接着単位はスペーサー単位の使用によりイソシアノペプチドポリマー主鎖から所定の距離に配置される。
好ましくは、ハイドロゲルはプレート間レオロジー実験により測定した場合に35℃において10〜5000Pa、好ましくは100〜1000Paの範囲の弾性率を有する。こうすると、細胞は移動・増殖して細胞網目構造を形成し、例えば血管前駆細胞系等の三次元構造体を形成できる。
本発明は選択的剛性及び温度応答性を備え、空間分布と細胞接着点密度が制御されたハイドロゲルの細胞培養液を提供する。共重合の結果、第1のコモノマーと第2のコモノマーの比のコポリマーに沿って細胞接着基の統計的分布が得られる。第1のコモノマーと第2のコモノマーの比を調整し、ポリイソシアノペプチドのポリマー主鎖に沿う細胞接着因子間の距離を制御することができる。ポリマー主鎖に沿う細胞接着因子間の平均距離は例えば1.1〜60nmとすることができる。細胞接着因子間の距離をこの範囲にすると、培養する細胞を細胞培養液に定着させるのに適している。より好ましくは、細胞接着因子間の平均距離は8〜30nmである。
ハイドロゲルは種々の細胞培養培地を含むことができ、細胞培養液は複雑な生物学的足場の形成を可能にすることが判明した。
本発明の細胞培養液は培養細胞の回収が容易であると言う点で極めて有利である。細胞培養液で使用するハイドロゲルは温度応答性であり、即ちゲル化温度よりも低温まで冷却することにより液化する。従って、細胞培養液を冷却するだけで培養細胞の回収を行うことができる。ハイドロゲルの液化後、培養細胞に損傷を与えずに細胞を液体から回収することができる。
十分な結合を維持するようにオリゴアルキレングリコールで官能基化されたイソシアノペプチドに細胞接着因子を直接結合することはできないと判断された。これは本発明に従ってスペーサーを使用することにより解決された。本発明により使用するスペーサー単位は細胞接着因子をイソシアノペプチドのポリマー主鎖から分離し、立体的な妨害を排除する。スペーサーはポリマー主鎖から細胞接着因子の移動を阻止し、移動の阻止により、細胞接着因子はインテグリン結合ポケットに効率的に入り込むことができる。スペーサーは極性、水溶性、生体適合性でインテグリンの活性部位に対して非結合性でなければならないが、補助的な結合を助長できなければならない。第1のモノマーは先ず第2のモノマーを作製してこれを連結基とグラフトすることにより作製することができる。あるいは、第1のモノマーと第2のモノマーを別経路で作製してもよい。
好ましくは、オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドはゲル化温度が18〜40℃である。ゲル化温度はハイドロゲル中のポリマー濃度に依存しない。他方、ポリマーの側鎖におけるオリゴアルキレングリコール単位数に依存する。
コモノマー
オリゴ(アルキレングリコール)単位によるイソシアノペプチドの官能基化。
前記モノマーはC末端を目的のオリゴ(アルキレングリコール)分子鎖で置換したジ、トリ、テトラ又はそれ以上のペプチドモチーフを基礎とすることが好ましい。前記分子鎖は直鎖、分岐鎖又はデンドロナイズドオリゴ(アルキレンオキシド)を基礎とすることができる。好ましくは、前記分子鎖は直鎖であり、エチレングリコールから構成される。
ペプチドセグメントは天然もしくは非天然アミノ酸及び拡張アミノ酸又はその混合物の配列により決定される種々の組成とすることができる。
前記モノマーは適切なオリゴ(アルキレングリコール)断片から誘導される。多段階ペプチドカップリングストラテジーを使用し、目的のアミノ酸を順次導入する。目的のペプチド配列の導入後、ペプチドセグメントのN末端を適切なホルミル化法でホルミル化する。このホルミル化としては、ホルミル塩、ギ酸、又は他のホルミル化剤による生成物の処理が挙げられる。
ホルミル化ストラテジーの数例を挙げると、ギ酸塩(例えばギ酸ナトリウム又はギ酸カリウム)、ギ酸アルキル(例えばギ酸メチル、ギ酸エチル又はギ酸プロピル)、ギ酸、クロラール及び誘導体を利用することができる。次にホルムアミドを適切な脱水剤で処理することによりイソシアニドを形成する。脱水ストラテジーの1例を挙げると、ジホスゲンを使用する。同じく使用することができる脱水剤の数例を挙げると、ホスゲン及び誘導体(ジホスゲン、トリホスゲン)、カルボジイミド、塩化トシル、オキシ塩化リン、トリフェニルホスフィン/四塩化炭素が挙げられる[M.B.Smith and J.March“March’s advanced organic chemistry”5th edition,Wiley & Son eds.,2001,New York,USA,pp1350−1351及びその引用文献]。
適切なアルキレングリコールの例は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール又はペンチレングリコールである。アルキレングリコールはエチレングリコールが好ましい。
有利なオリゴエチレングリコール単位を以下に示す。一般に、オリゴなる用語は<10の数を意味する。
本発明の第2のコモノマーはグラフトしていない上記のようなオリゴ(アルキレングリコール)イソシアノペプチドである。
第1のコモノマーはアルキレングリコール単位数が同数のイソシアノペプチドから構成してもよいし、アルキレングリコール単位数の異なるイソシアノペプチドの混合物でもよい。同様に、第2のコモノマーはアルキレングリコール単位数が同数のイソシアノペプチドから構成してもよいし、アルキレングリコール単位数の異なるイソシアノペプチドの混合物でもよい。
第1のコモノマー及び第2のコモノマーはオリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたイソシアノペプチドであり、即ちイソシアノペプチド上のアルキレングリコール単位数は1〜10である。好ましくは、第1のコモノマー及び第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は最低3から最大4までである。
第1のコモノマー及び第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位の平均はアルキレングリコール単位数の異なるイソシアノペプチドの混合物を第2のコモノマーとして使用することにより調整するのが一般的である。好ましい実施形態において、第1のコモノマーはアルキレングリコール単位数3のイソシアノペプチドであり、第2のコモノマーはアルキレングリコール単位数3のイソシアノペプチドとアルキレングリコール単位数4のイソシアノペプチドの混合物である。
第1のコモノマー及び第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は3とすることができる。その場合には通常では15〜25℃のゲル化温度が得られる。第1のコモノマー及び第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は>3から最大3.5まででもよい。その場合には通常では18〜35℃のゲル化温度が得られる。第1のコモノマー及び第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は>3.5から最大5まででもよい。その場合には通常では25〜50℃のゲル化温度が得られる。
好ましくは、オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドはレオロジー測定により測定した場合に温度35℃における弾性率が10〜5000Pa、好ましくは100〜1000Paである。第1のコモノマー及び第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均が最低3から最大5までであるとき、ハイドロゲルはこのような剛性度をもつ。
連結基とグラフトしたオリゴ(アルキレングリコール)イソシアノペプチドモノマー(第1のコモノマー)と、連結基とグラフトしていないオリゴ(アルキレングリコール)イソシアノペプチドモノマー(第2のコモノマー)を混合した後、共重合する。
共重合は非極性溶媒の存在下で実施することが好ましい。適切な非極性溶媒は飽和炭化水素溶媒及び芳香族炭化水素溶媒又はその混合物から構成される群から選択することができる。非極性溶媒の例は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、2−メチルブタン、2−メチルヘキサン、シクロヘキサン、及びトルエン、ベンゼンキシレン又はその混合物である。トルエンを重合で使用することが好ましい。オリゴ(エチレングリコール)部分のエチレングリコール単位数が最低3であるオリゴ(エチレングリコール)イソシアノペプチドの重合法にはトルエンを選択することが好ましい。
重合は触媒の存在下で実施することが好ましい。触媒はニッケル(II)塩が好ましい。Ni(II)塩の例はハロゲン化ニッケル(II)(例えば塩化ニッケル(II))、過塩素酸ニッケル(II)又は過塩素酸テトラキス(tert−ブチルイソシアニド)ニッケル(II)である。
重合媒体に可溶性であるか又は重合媒体に混和性の適切な溶媒に最初から溶解しているのであれば、他の錯体及びニッケル塩を使用してもよい。オリゴ(アルキレングリコール)イソシアノペプチドを重合するために使用することができる所定の触媒系に関する一般情報については、Suginome M.;Ito Y;Adv Polym SC1 2004,171,77−136;Nolte R.J.M.;Chem.Soc.Rev.1994,23(1),11−19を参照することができる。
30mmol/Lを上回るようにモノマー濃度を選択し、1/100〜1/10000となるように触媒/モノマー比を選択することが好ましい。ニッケル(II)の量が少ないほど(触媒/モノマー比<1/1000)、その後にポリマーをマクロハイドロゲル化剤として利用するのに望ましい実質重合度[平均DP>500]を示す材料を製造することができる。
代表的な1例では、触媒対モノマーのモル比が1:50から1:100,000までとなるように、モノマーを非極性有機溶媒又は混合溶媒に溶解したミリモル溶液をニッケル(II)触媒の極性溶媒溶液に加える。密閉雰囲気下で混合液を2〜24時間激しく撹拌する。完了したら反応混合液を蒸発させ、粗生成物を有機溶媒に溶解し、ジエチルエーテル又は同様の非相溶性有機溶媒で沈殿させ、目的の生成物を得る。
スペーサー単位
末端A基及びB基は脱保護又は活性化工程の必要なしにその後の化合物の合成が可能となるように選択することが好ましい。
スペーサー単位のA基の好ましい例としては、アジド(例えば、オキサノルボルナジエン系アジド)、アルキン(例えば、ジベンゾシクロオクチン)、チオール、ビニルスルホン、マレイミド、メタクリル酸メチル、エーテル、ビオチン、ストレプトアビジン、NH2、COOH、OH、NHSエステルが挙げられる。特にアルキンが好ましい。
スペーサー単位のB基の好ましい例としては、アジド(例えばオキサノルボルナジエン系アジド)、アルキン(例えばジベンゾシクロオクチン)、チオール、ビニルスルホン、マレイミド、メタクリル酸メチル、エーテル、ビオチン、ストレプトアビジン、NH2、COOH、OH、NHSエステルが挙げられる。特にNHSエステル又はマレイミドが好ましい。
好ましくは、スペーサー単位のA基は式(VII):
式(VII)
nは0〜8であり;
R3は[(L)p−Q]、水素、ハロゲン、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており、前記アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基、C3−C12シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される1以上の置換基で独立して場合により置換されており、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており、前記シリル基は式(R4)3Si−により表され、前記式中、R4は独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基及びC3−C12シクロアルキルオキシ基から構成される群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており;
R1は独立して水素、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され;
R2は独立してハロゲン、−OR6、−NO2、−CN、−S(O)2R6、C1−C12アルキル基、C1−C12アリール基、C1−C12アルキルアリール基及びC1−C12アリールアルキル基から構成される群から選択され、ここでR6は上記の通りであり、前記アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は場合により置換されている。
好ましくは、n=0である。
好ましくは、R1は水素である。
好ましくは、R3は水素である。
好ましくは、スペーサー単位のB基は式(VIII):
式(VIII)
好ましくは、スペーサー単位は式(VII)のA基と式(VIII)のB基を含む。
適切なスペーサー単位の例としては、式(IX):
式(IX)
式中、R1、R2、R3及びnは上記の通りであり、
Lは好ましくは式(X−1)、(X−2)、(X−3):
式(X−1)
式(X−2)
式(X−3)
により表される基から選択される。
好ましくは、スペーサー単位は式(XI):
は式(XI)
適切なスペーサー単位の他の例としては、本願に援用するWO2011/136645に記載されている縮合シクロオクチン化合物が挙げられる。従って、可能なスペーサー単位は式(IIa)、(IIb)又は(IIc):
nは0〜8であり;
pは0又は1であり;
R3は[(L)p−Q]、水素、ハロゲン、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており、前記アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基、C3−C12シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される1以上の置換基で独立して場合により置換されており、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており、前記シリル基は式(R4)3Si−により表され、前記式中、R4は独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基及びC3−C12シクロアルキルオキシ基から構成される群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており;
Lは直鎖又は分岐鎖C1−C24アルキレン基、C2−C24アルケニレン基、C2−C24アルキニレン基、C3−C24シクロアルキレン基、C5−C24シクロアルケニレン基、C8−C24シクロアルキニレン基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリーレン基、C7−C24(ヘテロ)アリールアルキレン基、C8−C24(ヘテロ)アリールアルケニレン基、C9−C24(ヘテロ)アリールアルキニレン基から選択される連結基であり、前記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキル(ヘテロ)アリーレン基、(ヘテロ)アリールアルキレン基、(ヘテロ)アリールアルケニレン基及び(ヘテロ)アリールアルキニレン基は場合により独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C5−C12シクロアルケニル基、C8−C12シクロアルキニル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基、C3−C12シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される1以上の置換基で置換されており、前記シリル基は式(R4)3Si−により表すことができ、前記式中、R4は上記の通りであり;
Qは水素、ハロゲン、R6、−CH=C(R6)2、−C≡CR6、−[C(R6)2C(R6)2O]q−R6(式中、qは〜200の範囲である。)、−CN、−N3、−NCX、−XCN、−XR6、−N(R6)2、−+N(R6)3、−C(X)N(R6)2、−C(R6)2XR6、−C(X)R6、−C(X)XR6、−S(O)R6、−S(O)2R6、−S(O)OR6、−S(O)2OR6、−S(O)N(R6)2、−S(O)2N(R6)2、−OS(O)R6、−OS(O)2R6、−OS(O)OR6、−OS(O)2OR6、−P(O)(R6)(OR6)、−P(O)(OR6)2、−OP(O)(OR6)2、−Si(R6)3、−XC(X)R6、−XC(X)XR6、−XC(X)N(R6)2、−N(R6)C(X)R6、−N(R6)C(X)XR6及び−N(R6)C(X)N(R6)2から構成される群から選択される官能基であり、ここでXは酸素又は硫黄であり、R6は独立して水素、ハロゲン、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され;
R1は独立して水素、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され;
R2は独立してハロゲン、−OR6、−NO2、−CN、−S(O)2R6、C1−C12アルキル基、C1−C12アリール基、C1−C12アルキルアリール基及びC1−C12アリールアルキル基から構成される群から選択され、ここでR6は上記の通りであり、前記アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は場合により置換されている。
細胞接着因子は細胞がゲルに結合するのを助ける。細胞接着因子はアミノ酸配列が好ましい。本発明で有利に使用することができるアミノ酸の例はN−保護アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンである。適切なアミノ酸配列としては、RGD、GRGDS、IKVAV、KQAGDV及びGRGDSP等のペプチドが挙げられる。細胞接着因子はVGEFやBFGF等の成長因子でもよい。細胞接着因子は糖タンパク質やムチンでもよい。
スペーサー単位と細胞接着因子を反応させる。銅フリーSPAAC反応により反応体をコポリマーの連結基にグラフトすることができる。
本発明で使用するポリイソシアノペプチドは明確な構造を示し、例えば図1のようにオリゴ(アルキレングリコール)で被覆された完全なβシート螺旋構造を示す。この構造は実質的に各窒素がペプチドペンダント基で置換された螺旋ポリ(イミン)コアを含む。ポリ(イミン)主鎖の疑似41螺旋対称性により、n番目の窒素にグラフトした全ペンダント基はn+4番目の位置にグラフトした対応するペンダント基による分子内βシート様充填に関与する。ペプチドセグメントは更に、前記構造の外側シェルを形成するオリゴ(アルキレングリコール)置換基を付けられている。得られる材料の水溶解度は適切なオリゴ(エチレングリコール)置換基の選択に直接相関する。最後に、ポリマー鎖の螺旋の向きはイミン基に結合したアミノ酸のキラリティーにより決定される。
本発明で使用するポリイソシアノペプチドは得られるポリマーに構造欠陥が最小限又は皆無である。最小限なる用語はポリマー主鎖に正しく結合している正しい側鎖が96%を上回るという意味に解釈すべきであり、例えば97%、98%、99%、99.5%又は更には100%である。
換言するならば、官能基化されたモノマーの直接重合により、得られる材料では側鎖のグラフト密度に関する構造欠陥の発生が最小限になる。
本発明で使用するポリイソシアノペプチドは重合度が高く、[DP]>500であり、持続長が長く、均質で安定な水溶性螺旋ポリマーとすることができる。
本発明はオリゴアルキレンで官能基化されたポリイソシアノペプチドを含む均質なハイドロゲルと共に、エチレングリコール単位数の異なるオリゴアルキレンで官能基化されたポリイソシアノペプチドの混合物を含む不均質なハイドロゲルも提供する。
こうして得られるオリゴアルキレンで官能基化されたポリイソシアノペプチドはゲル化温度を調整可能な高強度の熱可逆性ハイドロゲルを形成することが可能である。水を物理的にゲル化するために、本発明のポリ[オリゴ(エチレングリコール)]イソシアノペプチドは重合度[DP]>500であることが好ましい。
適切な細胞培養培地でゲル化することにより得られるコポリマーからハイドロゲルを作製する。前記ハイドロゲルは三次元ハイドロゲルである。ハイドロゲル中のポリマー濃度は1.2〜3.0mg/mLとする。ハイドロゲル中のポリマー濃度が低過ぎると、ハイドロゲルは脆弱過ぎて細胞三次元網目構造の成長を助長できない。ハイドロゲル中のポリマー濃度が高過ぎると、ハイドロゲルは過度に剛性になり、細胞がゲル内を移動・増殖できなくなる。
好ましくは、ハイドロゲルはレオロジー実験により測定した場合に35℃における弾性率が10〜5000Paである。こうすると、細胞は移動・増殖して例えば血管前駆細胞系等の三次元細胞構造体を形成できる。
本発明で使用するオリゴ(アルキレングリコール)ポリイソシアノペプチドから得られるハイドロゲルはゲル化後に形成される網目構造が高度に構造化されている点において、従来報告されているポリマー系のハイドロゲルの大半と相違する。この網目構造は横方向に凝集したポリマー鎖のねじれた束から構成される。この構成は低分子量ハイドロゲル化剤のゲル化後に形成されるフィブリル状の網目構造の構造に似ている。この現象はポリイソシアノペプチドの持続長が長く、元の会合方法に好都合であるためであると推定される。会合はオリゴ(アルキレングリコール)側鎖親水性の温度誘導性調節により誘発され、このような調節は完全に可逆的な現象であるため、オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたポリイソシアノペプチドの完全に熱可逆的な凝集/分離を生じる。
物理的ポリマーハイドロゲルの古典的説明としては、高濃度溶液中における絡み合い網目構造鎖の形成、スピノーダル分解による浸透網目構造の形成、微結晶形成、及びオリゴ(アルキレングリコール)ポリイソシアノペプチドの推定会合方法とは一見異なるミセル網目構造又はラメラ構造の形成が記載されている。
オリゴ(アルキレングリコール)ポリイソシアノペプチドから得られるハイドロゲルは、直径約5nmのポリマー繊維が横方向に会合してねじれた束となり、ポリマーハイドロゲル網目構造の基盤を形成することにより得られる。この結果、高度に多孔質の構造となり、細孔寸法を直径50nmまで広げることができる。
エチレングリコール側鎖の温度感受性挙動により、本発明で使用するポリマーは明白なLCST転移を示す。所定のオリゴ(アルキレングリコール)ポリイソシアノペプチドでは、溶液のイオン強度を変える(塩効果)ことにより、あるいはより一般的にはポリマーの全体的な溶媒和状態を調節することが可能な任意化合物の添加によりこの温度を調節することができる。酸又は主鎖螺旋の高次構造変化を生じることが可能な任意化合物を利用してポリ(イソシアニド)主鎖、即ちその高次構造に働きかけることにより、材料のLCSTを更に調節することができる。
ポリマーのLCSTを調節する別の方法は異なるオリゴ(アルキレングリコール)側鎖をもつモノマーを共重合する方法である。例えば、トリ(エチレングリコール)イソシアノジアラニンとテトラ(エチレングリコール)イソシアノジアラニンの比を変えて混合物を重合すると、ミリQ水中で得られるコポリマーのゲル化温度を22℃から60℃の間で調節することができた。
ポリマー鎖長はゲル化に影響を与えることが分かっている。重合度の低い分子鎖ほどゲルを形成するよりも沈降する傾向が強かった。これは分子鎖の一般構造を変えずに親水性を変化させることができる剛性又は半可撓性ポリマーの一般的な効果であると予想される(即ち剛性構造では、分子鎖は崩壊せず、他の分子鎖と横方向に凝集してより長い繊維を形成する)。
得られるゲルの光学的性質についてもポリマー長の影響があることが認められた。重合度の低い分子鎖から製造したハイドロゲルほど濁り易い、即ち不透明になり易いことが分かった。平均重合度が上がると、ハイドロゲルの不透明度は低下し、最終的に完全に光学的に透明な材料が得られた。
ゲル温度はある程度まで調節することができ、25℃で安定な構造化ゲルを形成することができるので、酵素又は細胞を封入してその活性を生体外で維持するために使用することができる新規バイオミメティックマトリックスが得られる。
本発明で使用するポリマーは何らかの興味深い有利な性質をもつように思われた。ポリマーの長さと剛性により、ゲルは場合によっては99.00〜99.98%が水から構成された。これは大きな体積にするためにほんの僅かな材料しか必要としないことを意味する。ポリマー鎖1本は直径約4ナノメートル及び分子量2,500,000Daであると思われた。多分散指数(PDI)は1.6であり、平均鎖長は500nm〜2μmであった。これらのポリマーはどちらかというと剛性であり、持続長70〜90nmであった。ペプチド断片キラリティーに応じて左巻きと右巻きの螺旋を得ることも可能であった(光学活性材料)。本発明者らは細孔寸法をポリマー濃度により100〜250nmにまで制御した明確なフィブリル網目構造を作製することもできた。分子鎖に反応性側基を効率的に導入することも可能であった。従って、これらのポリマーは生体分子の足場として使用することができる。本発明者らは細孔寸法が濃度により制御されることを見出した。
生体分子の例は生体物質、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、糖類、炭水化物、リポタンパク質、脂質、糖脂質、シリカ、薬物、核酸、DNA、RNA、ビタミン、栄養素、加水分解物、多糖類、単糖類、組換えペプチド、ムチン、酵素、生物有機化合物、組換え生体分子、抗体、ホルモン、成長因子、受容体、造影剤、サイトカイン、並びにその断片及び修飾物である。
本発明の細胞培養液は上記のようなハイドロゲルを含む。細胞培養液は三次元多孔質足場である。
本発明は更に本発明の細胞培養液の作製方法を提供し、前記方法は、
a)オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを準備する工程と
b)前記オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを細胞培養培地と混合し、ハイドロゲルを得る工程を含む。
細胞培養液は原則として(動物)細胞の培養に適した任意型の細胞培養培地で作製することができる。適切な細胞培養培地は本発明の方法で使用する細胞の増殖と分化を助長する。
細胞培養培地と細胞培養条件を選択するためのガイドラインは周知であり、例えばFreshney,R.I.Culture of animal cells(a manual of basic techniques),4th edition 2000,Wiley−Lissの第8章及び第9章と、Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.Cell & Tissue culture:Laboratory Procedures 1993,John Wiley & Sonsに記載されている。
一般に、(哺乳動物)細胞用細胞培養培地は塩類、アミノ酸、ビタミン、脂質、界面活性剤、緩衝剤、成長因子、ホルモン、サイトカイン、微量元素、炭水化物及び他の有機栄養物を緩衝生理食塩水に溶解したものである。塩類の例としては、マグネシウム塩(例えばMgCl2・6H2O、MgSO4及びMgSO4・7H2O)、鉄塩(例えばFeSO4・7H2O)、カリウム塩(例えばKH2PO4、KCl)、ナトリウム塩(例えばNaH2PO4、Na2HPO4)及びカルシウム塩(例えばCaCl2・2H2O)が挙げられる。アミノ酸の例はタンパク質を構成する全20種の公知アミノ酸(例えばヒスチジン、グルタミン、スレオニン、セリン、メチオニン)である。ビタミンの例としては、アスコルビン酸塩、ビオチン、塩化コリン、ミオイノシトール、D−パントテン酸塩、リボフラビンが挙げられる。脂質の例としては、脂肪酸(例えばリノール酸及びオレイン酸)、大豆ペプトン及びエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、Tween 80とPluronic F68が挙げられる。緩衝剤の1例はHEPESである。成長因子/ホルモン/サイトカインの例としては、IGF、ヒドロコルチゾン及び(組換え)インスリンが挙げられる。微量元素の例は当業者に公知であり、Zn、Mg及びSeが挙げられる。炭水化物の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース及びピルビン酸塩が挙げられる。
培地には成長因子、代謝物等を添加してもよい。
適切な培地の例としては、胎仔ウシ血清、ヒドロコルチゾン、hFGF−B、VEGF、R3−IGF−1、アスコルビン酸、hEGF及びGA−1000を添加済みの内皮細胞増殖培地(EGM−2,Lonza,Walkersville,USA)と、胎仔ウシ血清、平滑筋細胞増殖サプリメント及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むサプリメントを添加した平滑筋細胞培地(SMCM,ScienCell,Carlsbad,USA)が挙げられる。
細胞を培養する最適条件は当業者が容易に決定することができる。例えば、細胞培養培地のpH、温度、溶存酸素濃度及び浸透圧は原則として限定されず、選択する細胞の種類によって異なる。細胞の増殖と生産性に最適となるようにpH、温度、溶存酸素濃度及び浸透圧を選択することが好ましい。最適なpH、温度、溶存酸素濃度及び浸透圧を決定する方法は当業者に公知である。通常では、最適pHは6.6〜7.6であり、最適温度は30〜39℃、例えば温度36〜38℃、好ましくは温度約37℃であり、最適浸透圧は260〜400mOsm/kgである。
本発明は更に細胞の培養方法を提供し、前記方法は、
a)本発明の細胞培養液を準備する工程と、
b)ハイドロゲルのゲル化温度よりも低温で前記細胞培養液に細胞を加える工程と、
c)前記細胞を培養する工程を含む。
1態様によると、本発明はオリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを含有するハイドロゲルと、内皮細胞及び平滑筋細胞の少なくとも1種を含む細胞培養液を提供する。
前記細胞は内皮細胞と平滑筋細胞の共培養物であることが好ましい。前記細胞の濃度は例えば2,000個/mL〜1,000,000個/mLとすることができる。その結果、例えば血管系等の三次元構造体を得ることができる。
本発明は更に血管前駆細胞系の作製用としての本発明の細胞培養液の使用を提供する。
以上、例証の目的で本発明を詳細に説明したが、当然のことながら、以上の詳細な説明は単に例証を目的とし、特許請求の範囲に記載する発明の趣旨と範囲から逸脱しない限り、当業者は変更を加えることができる。
なお、本発明は本願に記載する構成要素の可能な全ての組合せに関するが、特許請求の範囲に記載する構成要素の組合せが特に好ましい。
また、「含む」なる用語は他の要素の存在を排除するものではない。しかし、当然のことながら、所定の成分を含む生成物に関する記載はこれらの成分から構成される生成物も開示するものである。同様に、当然のことながら、所定の工程を含む方法に関する記載はこれらの工程から構成される方法も開示するものである。
材料:トルエンはナトリウムを用いて蒸留した。ジクロロメタンは五酸化リンを用いて蒸留した。N−メチルモルホリンは使用前にナトリウムを用いて新たに蒸留した。水はMillipore MilliQシステムで精製した(ミリQ水18.2MΩ)。他の全薬品は入手時の状態で使用した。カラムクロマトグラフィーはBaker社製シリカゲル(0.060〜0.200mm)を使用して実施した。薄層クロマトグラフィー(TLC)分析はMerck社製のシリカ60F254をコーティングしたガラスで実施し、ニンヒドリン又は塩基性KMnO4水溶液を使用して化合物を可視化した。全ガラス器具類は使用前に0.5M NaOHに浸した。
(1)コポリマーの製造
(1.1)第1のコモノマーの製造
図2のスキームに従い、連結基とグラフトした第1のコモノマーを合成した。
テトラエチレングリコール(28.5mL,164.3mmol)をピリジン50mLに溶解した。次に溶液を撹拌下に0℃まで冷却した。アルゴンを溶液に15分間バブリングした。溶液に撹拌下に塩化トシル(21.93g,115mmol)を少量ずつ加えた。混合液を更に室温で12時間撹拌した。反応混合液を10%クエン酸50mLで希釈した。混合液をクロロホルム250mLで3回抽出した。有機層を合わせて無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させた。得られた黄色油状物をカラムクロマトグラフィー(SiO2,0.060〜0.200mm;溶離液酢酸エチル)により精製し、S1を淡黄色油状物として得た(11.69g,33.6mmol,29%);Rf=0.4(酢酸エチル)。
FT−IR(cm-1,ATR)3442(O−H),2870(C−H),1597(N−H),1453(C−H),1352(S=O),1175(S=O),1096(C−O);1H NMR δH(300MHz;CDCl3;Me4Si)7.80(dd,J=7.81Hz,2H,−CHAr−),7.33(d,J=7.35Hz,2H,−CHAr−S),4.17(m,2H,O−CH2−CH2−),3.65(m,16H,−CH2−),2.45(s,3H,−CH3);13C NMR δC(75MHz;CDCl3;Me4Si)21.16(1C,CCH3),61.0(1C,COH),68.13(1C,COS),69.0(1C,OCH2),70.0,70.1,70.1,70.2(4C,OCH2),70.8,72.0(2C,OCH2),127.5(2C,CHCCH),129.5(2C,CHCCH),139.7(1C,CCH3),144.5(1C,CHCS)。
新たに蒸留したCH2Cl2 25mLに化合物S1(5.23g,15.01mmol)、N−Boc−(L)−アラニン(2.86g,15.01mmol)及びDMAP(0.198g,1.65mmol)を溶解し、撹拌下に0℃まで冷却した。DCC(3.12g,15.01mmol)を少量ずつ加えた。混合液は黄変し、0℃で1時間撹拌後、室温で3時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾別し、酢酸エチル(3×20mL)で洗浄した。有機層を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー(SiO2,0.060〜0.200mm;溶離液1%MeOH/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、S2を薄いオレンジ色の油状物として得た(5.49g,11.4mmol,76%);Rf=0.4(10% MeOH/CH2Cl2)。
FT−IR(cm-1,ATR)2924(C−H),1745(C=Oエステル),1712(C=Oアミド),1597(N−H),1452(C−H),1352(S=O),1173(S=O),1120(C−O);1H NMR δH(300MHz;CDCl3;Me4Si)7.79(d,J=8.4Hz,2H,−CHAr−),7.33(d,J=8.1Hz,2H,−CHAr−),5.02(s,1H,−NH−),4.28(m,3H,−CH(CH3)−,COOCH2−),4.15(m,2H,O−CH2−CH2−),3.69(m,14H,O−CH2−CH2−),2.44(s,3H,−CH3),1.44(s,9H,−OC(CH3)3),1.37(d,J=7.2Hz,3H,−CH(CH3)−);13C NMR δC(75MHz;CDCl3;Me4Si)18.8(1C,CHCH3),21.7(1C,CCH3),28.4(3C,C(CH3)3),49.4(1C,O(C=O)CHNH),64.5(1C,Boc−OCH2),68.9(2C,OCH2),69.4(1C,OCH2),70.7(4C,OCH2),80.3(1C,C(CH3)3),128.2(2C,CHCCH),130.0(2C,CHCCH),145.0(1C,CCH3),155.4(1C,CHCS),173.6(1C,CH(C=O)NH),176.7(1C,CH(C=O)O);MS(ESI)m/z[M+Na]+計算値542.2;実測値542.2。
化合物S2(5.94g,11.4mmol)をHCl飽和酢酸エチル60mLに溶解し、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、CH2Cl2 30mLとn−BuOH 1mLを加えた後に蒸発させることにより過剰のHClを除去した。CH2Cl2 3×30mLとの共沸蒸留により残留n−BuOHを除去した。得られたS2のHCl塩、N−Boc−(D)−アラニン(2.14g,11.4mmol)及びN−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(1.74g,11.4mmol)を新たに蒸留したCH2Cl2 40mLに溶解した。DIPEA(2mL,11.4mmol)を滴下し、全成分が溶解するまで混合液を室温で撹拌した。溶液を0℃まで冷却し、DCC(2.35g,11.4mmol)を少量ずつ加えた。白色沈殿が形成され、混合液を0℃で1時間撹拌後、室温で3時間撹拌した。沈殿を濾別し、酢酸エチル(3×30mL)で洗浄し、溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(SiO2,0.060〜0.200mm;溶離液2%MeOH/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、S3を淡黄色油状物として得た(3.37g,5.7mmol,52%);Rf=0.3(10% MeOH/CH2Cl2)。
FT−IR(cm-1,ATR)2876(C−H),1740(C=Oエステル),1718(C=Oアミド),1667(N−H),1522(N−H),1452(C−H),1365(S=O),1161(S=O),1105(C−O);1H NMR δH(300MHz;CDCl3;Me4Si)7.80(d,J=8.4,2H,−CHAr−C−S),7.36(d,J=8.1,2H,−CHAr−),6.91(s,1H,−NH),5.00(s,1H,−NH),4.58(m,1H,−NHCH(CH3)−),4.28(m,2H,−COOCH2−),4.14(m,2H,O−CH2−CH2−),3.61(m,12H,−C(O)OCH2CH2O(CH2CH2O)3−),2.45(s,3H,−CH3),1.45(s,9H,−OC(CH3)3),1.40(d,J=7.2,3H,−CH(CH3)−),1.35(d,J=7.2,3H,−CH(CH3)−);13C NMR δC(75MHz;CDCl3;Me4Si)18.2(2C,CHCH3),21.7(1C,CCH3),28.4(3C,C(CH3)3),47.2(1C,NCH),50.0(1C,NCH),64.5(1C,Boc−OCH2),68.7(2C,OCH2),69.3(1C,OCH2),70.6(4C,OCH2),80.2(1C,C(CH3)3),128.0(2C,CHCCH),129.9(2C,CHCCH),133.1(1C CCH3),144.9(1C,CHCS),172.7(2C,C=O);MS(ESI)m/z[M+Na]+計算値613.2;実測値613.1。
化合物S2について記載したと同一手順に従って化合物S3(1.70g,2.85mmol)を脱保護し、それ以上精製せずに使用した。粗生成物をギ酸エチル25mLに溶解した。ギ酸ナトリウム(0.97g,14.25mmol)を加え、混合液を66℃に8時間加熱した。混合液を室温まで冷却し、固形分を濾別した。溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(SiO2,0.060〜0.200mm;溶離液4% MeOH/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、S4を薄黄色油状物として得た(0.79g,1.52mmol,54%);Rf=0.3(10% MeOH/CH2Cl2)。
FT−IR(cm-1,ATR)2873(C−H),1738(C=O),1653(N−H),1532(N−H),1452(C−H),1352(S=O),1174(S=O),1097(C−O);1H NMR δH(300MHz;CDCl3;Me4Si)8.18(s,1H,HC(O)NH−),7.79(d,J=8.4,2H,−CHAr−C−S),7.35(d,J=8.7,2H,−CHAr−),6.78(s,1H,−NH),6.55(s,1H,−NH),4.55(m,2H,−NHCH(CH3)−),4.30(m,2H,−COOCH2−),4.13(m,2H,O−CH2−CH2−),3.61(m,12H,−(CH2CH2O)3−),2.44(s,3H,−CH3),1.42(m,6H,−CH(CH3)−);13CNMR δC(75MHz;CDCl3;Me4Si)17.9(1C,CHCH3),18.2(1C,CHCH3),21.7(1C,CCH3),47.2(1C,O(C=O)HNCH),48.1(1C,HNHC(C=O)),64.5(1C,OCH2),68.7(2C,OCH2),69.3(1C,OCH2),70.6(4C,OCH2),128.0(2C,CHCCH),129.9(2C,CHCCH),133.1(1C,CCH3),144.9(1C,CHCCH),161.0(1C,H(C=O)NH)),172.6(1C,CH(C=O)NH),173.2(1C,CH(C=O)O);MS(ESI)m/z[M+Na]+計算値541.2;実測値541.2。
化合物S4(0.550g,1.06mmol)を無水EtOH 40mLに溶解した。アジ化ナトリウム(0.38g,5.9mmol)を加え、混合液を一晩還流した。室温まで冷却したら、固形分を濾別し、濾液を減圧乾燥した。カラムクロマトグラフィー(SiO2,0.060〜0.200mm;溶離液4% MeOH/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、S5を淡いオレンジ色の油状物として得た(0.32g,0.82mmol,78%);Rf=0.4(10% MeOH/CH2Cl2)。
FT−IR(cm-1,ATR)3309(N−H),2875(C−H),2105(N3),1737(C=O),1651(N−H),1529(N−H),1453(C−H),1133(C−O);1H NMR δH(300MHz;CDCl3;Me4Si)8.20(s,1H,HC(O)NH−),6.84(s,1H,−NH),6.60(s,1H,−NH),4.60(m,2H,NHCH(CH3)),4.26(m,2H,−C(O)OCH2−),3.68(m,12H,(CH2CH2O)3−),3.40(m,2H,N3CH2−),1.42(m,6H,−CH(CH3)−);13C NMR δC(75MHz;CDCl3;Me4Si)17.9(1C,CH3),18.2(1C,CH3),47.4(1C,CH2N3),48.4(1C,H(C=O)HNCH),50.7(1C,HNC(CH3)C=O),69.0(1C,CH2CH2O),70.1(1C,OCH2CH2),70.6(2C,OCH2),70.7(2C,OCH2),161.4(1C,H(C=O)NH),172.7(1C,CH(C=O)NH),172.9(1C,CH(C=O)O);MS(ESI)m/z[M+Na]+計算値412.2;実測値412.2。
新たに蒸留したCH2Cl2 150mLに化合物S5(221mg,0.57mmol)とN−メチルモルホリン(0.24mL,2.27mmol)を溶解し、アルゴン雰囲気下で−40℃(ドライアセトン浴)まで冷却した。新たに蒸留したCH2Cl2 10mLに溶解したジホスゲン(0.048mL,0.398mmol)の溶液をアルゴン下で1時間かけて滴下した。ジホスゲンを加えながら混合液を撹拌し、厳密に−40℃に維持した。混合液が黄変し始めたら、過剰の重炭酸ナトリウム(5g)で反応を迅速にクエンチした。クエンチした混合液を−40℃で5分間撹拌した。反応混合液をショートシリカカラムプラグ(SiO2,0.060〜0.200mm)に通した。プラグにはCH2Cl2を充填したが、目的化合物はCH2Cl2/アセトニトリル(3:1)で溶出させ、1を淡黄色油状物として得た(48.1mg,0.48mmol,27%);Rf=0.5(10% MeOH/CH2Cl2)。
FT−IR(cm1,ATR)3318(N−H),2875(C−H),2142(C≡N),2105(N3),1744(C=O),1540(N−H),1453(C−H),1123(C−O);1H NMR δH(300MHz;CDCl3;Me4Si)7.00(bd,1H,−NH−),4.59(m,1H,−NHCH(CH3)C(O)O−),4.32(m,3H,(−C(O)OCH2CH2O−),−C≡NCH(CH3)C(O)NH−),3.67(m,12H,−(OCH2CH2)3),3.39(m,2H,N3CH2−),1.65(d,J=7.2,3H,C≡NCH(CH3)C(O)−),1.48(d,J=7.2,3H,C≡NCH(CH3)C(O)−);13C NMR δC(75MHz;CDCl3;Me4Si)170.69(1C,CH(CH3)C(O)OCH2),165.72(1C,CH(CH3)C(O)NH),70.69,70.65,70.61,70.56,70.02,68.81(1C,CH2CH2O),50.66(1C,CH2N3),48.56(C≡NCH),19.66,18.04(1C,CH(CH3)CO);MS(ESI)m/z[M+Na]+(C15H25N5O6Na),計算値394.17;実測値394.1。
図3のスキームに従い、連結基とグラフトしていない第2のコモノマーを合成した。
2.1.1 2−アミノプロパン酸2−(2−(2−メトキシエトキシ)エトキシ)エチル(S6)の合成
メトキシトリエチレングリコール(25ml,156.21mmol)、L−アラニン(21.85g,245.25mmol)、p−トルエンスルホン酸(32.69g,171.83mmol)及びトルエン250mlを丸底フラスコに加えた。反応混合液を126℃で4時間還流した。固形沈殿を濾別し、溶媒を減圧蒸発させた。次に生成物をクロロホルム300mlに溶解し、有機層をNaHCO3(飽和)で3回抽出した。その後、水層をクロロホルムで2回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧蒸発させ、収率62%で22.69gのS6を得た。
2.1.2 2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)プロパン酸2−(2−(2−メトキシエトキシ)エトキシ)エチル(S7)の合成
Boc−D−Ala−OH(18.25g,96.44mmol)、DMAP(0.1g,0.8mmol)、DiPEA(1.7ml,9.64mmol),HoBt(14.77g,96.44mmol)、DCC(21.89g,106.08mmol)、S6(22.69g,96.44mmol)及びCH2Cl2 250mlを混合し、氷浴で0℃まで冷却し、3時間撹拌した。その後、混合液を室温まで昇温し、15時間撹拌した。固形分を濾別し、生成物をクロロホルム200mlに溶解し、溶液をクエン酸で3回抽出した。水層をクロロホルム(1×200ml)で洗浄した。有機層を飽和NaHCO3溶液で2回洗浄し、水層をクロロホルムで更に2回抽出した。有機層を合わせてNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(2% MeOH/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、収率52%で20.4gのS7を得た。
Rf=0.53(10% MeOH/CH2Cl2)1H NMR(CDCl3,400MHz):δ=6.77(s,1H,−NHCH−);5.09(s,1H,−NHCH)−;4.60(q,1H,−NHCH(CH3)−);4.31−4.28(m,3H,−C(O)OCH2CH2O−,−CH(CH3)COO−);3.70−3.56(m,10H,−C(O)OCH2CH2O(CH2CH2O)2−);3.38(s,1H,−OCH3);1.46(s,9H,−OC(CH3)3);1.41(d,3H,−NHCH(CH3)−;1.38(d,3H,−NHCH(CH3)−)。
S7(13.15g,32.35mmol)を酢酸エチル20mlに溶解し、4M HClジオキサン溶液20mlで処理した。混合液を室温で1時間撹拌した。TLCにより出発化合物をチェックした後、4M HClジオキサン溶液を更に20ml加え、溶液を室温で更に1時間撹拌した。DCM 20mLを加えて残留t−BuOHを除去し、減圧除去した。この手順を3回繰返した。
S7のHCl塩(13.15g,32.33mmol)とギ酸ナトリウム(8.76g,129.33mmol)をギ酸エチル250mlに溶解した。反応混合液を66℃で14時間煮沸した。沈殿を濾別し、溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(4% MeOH/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、収率56%で6.04gのS8を得た。
Rf=0.54(10% MeOH/CH2Cl2)1H NMR(CDCl3,400MHz):δ=8.23(s,1H,HC(O)NH−);6.94(d,1H,−NHCH−);6.79(d,1H,−NHCH−;4.57(m,2H,NHCH(CH3)−,−NHCH(CH3)−);4.26(m,2H,−C(O)OCH2−);3.67−3.54(m,10H,−C(O)OCH2CH2O(CH2CH2O)3−);3.43(s,3H,−OCH3);1.45(t,6H,−NHCH(CH3)−,−NHCH(CH3)−。
S8(6.04g,18.06mmol)をN2で1時間脱気した。次に新たに蒸留したCH2Cl2(50ml)にNMM(5ml,45.15mmol)を溶解し、溶液に加えた。反応混合液を−40℃(ドライアイス/イソプロパノール)まで冷却した。ジホスゲン(1.52ml,12.64mmol)のCH2Cl2(50ml)溶液を2時間かけて滴下した。黄色−オレンジ色になるまで反応混合液を撹拌し、NaHCO3(3g)でクエンチした。カラムクロマトグラフィー(1:2 ACN/CH2Cl2)を使用して粗生成物を精製し、収率51%で3.34gの2を得た。
Rf=0.50(10% MeOH/CH2Cl2)1H NMR(CDCl3,400MHz):δ=7.00(d,1H,−NH−);4.58(m,1H,C≡NCH(CH3)C(O)NH−);4.28(m,2H,−C(O)OCH2CH2O−);4.26(m,1H,−NHCH(CH3)C(O)O−);3.74−3.53(m,10H,−OCH2CH2(OCH2CH2)3OCH3);3.41(s,3H,−OCH3);1.67(d,3H,C≡NCH(CH3)C(O)−);1.49(d,3H,−NHCH(CH3)C(O)O−)。
蒸留したトルエン2mLに化合物2(例えば100当量)と化合物1(1当量)を溶解した。Ni(Cl2O4)2・6H2O 39mgを無水エタノール10mLとトルエン90mLに溶解することにより1mMの触媒ストック溶液を調製した。合計モノマーモル×10-4に等しい体積をピペットでモノマーに加えた。モノマーの最終濃度が25mg/mLとなるように、蒸留したトルエンで混合液を希釈した。乾燥用CaCl2管を取付けたフラスコで混合液を室温で72時間撹拌した。ポリマーをジイソプロピルエーテルで沈殿させて単離した。この沈殿サイクルを3回繰返し、収率44〜92%を得た。固有粘度、レオロジー(G’)及び円二色性を測定することによりポリマーを分析し、溶液からマイカ上にドロップキャストし、AFMにより可視化した。
ペプチド(GRGDS)をpH8.4の硼酸緩衝液に最終濃度2mg/mLまで溶解した。式(III)により表されるスペーサー単位(BCN−NHS)をペプチド溶液に対して1:1のモル比で加え、18℃で300rpmにて1時間混合後、100μLずつ凍結した。式(V)により表されるBCN−GRGDSが得られた。MS計算値[C39H62N10O15]:910.4;実測値:911.5。
前工程で得られたポリイソシアニド(PIC)をACNに2mg/mLの濃度で溶解した。ポリイソシアニド主鎖中のアジドコモノマーのモル当量に対して適切な体積のBCN−GRGDSをこのPIC溶液に加えた。混合液を4℃で72時間撹拌した。PIC−ペプチドをジイソプロピルエーテルで沈殿させることにより精製した。沈殿剤をデカントし、ポリイソシアニド−ペプチドを再溶解し、DCMからジイソプロピルエーテルに沈殿させた。
この時点以降は、ポリイソシアノペプチドが無菌状態に維持されるように注意した。全器具は使用前にエタノールをスプレーした。PIC−ペプチドコンジュゲートを滅菌遠心管に直接配量した。紫外線を5分間照射することにより遠心管を更に滅菌した。培地中のポリマーの最終希釈濃度が3.2mg/mLとなるようにPIC−ペプチドを滅菌細胞培養培地で覆い、4℃で24時間膨潤させた。24時間後に、遠心管の底に膨潤したゲル様物質が得られた。膨潤したPIC−ペプチドコンジュゲートを4℃で72時間撹拌後、均質な溶液が得られた。得られた溶液は臨界温度を越えると急激な粘度変化を示した。
培地中のPIC−ペプチドコンジュゲートは4〜7℃で20カ月まで安定であり、凍結した場合には更に長期間となった。
適切な剛性度と濃度の脈管新生誘導コンストラクトを作製するために、目的の最終ポリマー濃度である2.0mg/mLとするのに適切な量の培地で3.2mg/mLのゲルのストック溶液を希釈した。
(6−1)細胞を含む細胞培地の調製
胎仔ウシ血清、ヒドロコルチゾン、hFGF−B、VEGF、R3−IGF−1、アスコルビン酸、hEGF及びGA−1000を添加済みの内皮細胞増殖培地(EGM−2,Lonza,Walkersville,USA)でHUVEC(ACTT,PCS−100−010,USA)を増殖させた。胎仔ウシ血清、平滑筋細胞増殖サプリメント及びペニシリン/ストレプトマイシン9を含むサプリメントを添加した平滑筋細胞培地(SMCM,ScienCell,Carlsbad,USA)でHbSMC(ScienCell,4310,Carlsbad,USA)を増殖させた。これらの2種類の細胞種をT75フラスコ(Corning Incorporated,Corning,USA)で5% CO2下に37℃にて増殖させた。培地を週3回交換し、細胞をトリプシン処理により回収した。HbSMCの8継代培養物とHUVECの9継代培養物を全実験で使用した。
(6−2)細胞を含む細胞培地とハイドロゲルの混合
脈管新生誘導コンストラクトを作製するために、工程(B)で得られた温度応答性PIC−ペプチドコンジュゲートの溶液の温度を0℃まで低下させ、ゲルから液体への転移を誘導した。次に、工程(6−1)で得られたHUVECとHbSMCの両者を含む細胞懸濁液と液化ゲルのアリコートを細胞500,000個/mlの目的濃度となるように混合した。次にこれらのゲル−細胞懸濁液の200μlアリコートを24ウェルインサート(メンブレン細孔寸法0.2μm)に移し、37℃に30分間保温し、ゲルを固化させた。
細胞は3日以内にハイドロゲルに付着し、7日以内に脈管新生が認められることが確認された。
作製した脈管新生誘導コンストラクトを適切な混合培地で5% CO2下に37℃で14日間培養した。脈管新生コンストラクトの進行が認められた。
工程(5)におけるポリマー濃度を2.0mg/mLではなく1.0mg/mLとした以外は実施例1と同様に実施した。
工程(7)では、ゲルの固化後に細胞は24ウェルインサートの底に徐々に沈んだ。細胞の発芽の多少の群発が認められたが、形成された構造体は品質が不良であった。3日後に実験を終了した。血管前駆細胞系は形成されなかった。
工程(5)におけるポリマー濃度を2.0mg/mLではなく3.2mg/mLとした以外は実施例1と同様に実施した。
工程(7)では、非常にゆっくりであったが、脈管新生コンストラクトの進行が認められた。細胞は24ウェルインサートに懸濁したままであった。細胞は1〜7日目は球形のままであり、その後、発芽の開始が認められた。14日後に実験を終了した。形成された細胞構造体は品質が不良なようであり、血管前駆細胞系は形成されなかった。ハイドロゲルの剛性度が高いため、これらの特定細胞はゲル内で効率的に移動/増殖できないものと思われた。
実施例1と比較実験2及び3を比較すると、脈管新生コンストラクトの形成にはハイドロゲルにおけるコポリマーの濃度が重要であると結論することができる。適切な濃度範囲は1.2〜3.0mg/mLである。
工程(3)にける化合物1と化合物2の比を1:100ではなく1:550とした以外は実施例1と同様に実施した。
工程(7)では、ゲルの固化後に細胞は長期間球形のままであり、発芽はあまり認められず、21日後に脈管新生誘導は完了しなかった。血管前駆細胞系は形成されなかった。
工程(3)における化合物2と化合物1の比を1:100ではなく1:25とした以外は実施例1と同様に実施した。
工程(7)では、ゲルの固化後に無制御で無統制の細胞増殖が認められ、形成された構造体は血管前駆細胞系に相当しなかった。
工程(3)における化合物2と化合物1の比を1:100ではなく1:10とした以外は実施例1と同様に実施した。
工程(5)では、PIC−ペプチドを無菌細胞培養培地で覆った後にゲル様物質が得られず、実験を終了した。
実施例1と比較実験4及び5を比較すると、脈管新生コンストラクトの形成にはGRGDSとグラフト重合したコモノマーの比が重要であると結論することができる。適切な比は1:550〜1:50である。
実施例1の工程5で得られたハイドロゲルの弾性率を次のように測定した。
機器。レオロジー測定はペルチェ素子による温度制御付き≒20mLクエット構成のTA Instruments Ares G2レオメーターを使用して実施した。脱イオン水(20mL)に適量のポリマーを混合し、均質な溶液が得られるまで時間をかけて(最低24時間)混合液を通常通りにボルテックスすることにより試料を調製した。早期ゲル形成を避けるように冷蔵(4℃)条件下でPIC溶液を調製した。0.5〜5Hzの種々の周波数で4%の歪み下に直線応答レジームの測定を実施した。原稿に表示されたデータを1Hzで記録した。昇温速度2℃/分で温度スキャンを記録した。生物学的に相応する培地における測定はTA Instruments Discovery HR−1で40mmアルミニウム平行プレートを使用し、ギャップ750μm及び試料1mLに設定して実施した。ペルチェ素子と蒸発ガードを使用して温度制御した。DMEMに適量のポリマーを混合し、均質な溶液が得られるまで(最低48時間)4℃で通常通りに連続的に撹拌することによりPIC試料を調製した。PIC溶液を直接使用するか又は、試料メモリー効果を避けるように測定を実施できるようになるまで凍結した。マトリゲルは業者から入手したまま使用し、フィブリンゲルはFBSを添加したDMEMにフィブリノーゲンを溶解することにより調製し、測定前に37℃で2時間ゲル化させた。1Hz〜の種々の周波数で2%の歪み下に直線応答レジームの測定を実施した。昇温又は降温速度2℃/分で温度スキャンを記録した。
弾性率は5〜15℃の温度範囲で実質的に一定であり、測定値は1Pa前後であった。弾性率は23℃までに100Pa前後まで増加した。弾性率は35℃までに500Pa前後まで増加した。
Claims (15)
- オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチドの製造方法であって、
i)オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドの第1のコモノマーと、
オリゴ(アルキレングリコール)で官能基化され、グラフトしていないイソシアノペプチドの第2のコモノマーを、
前記第1のコモノマーと前記第2のコモノマーのモル比が1:500〜1:30となるように共重合する工程と、
ii)工程i)により得られたコポリマーにスペーサー単位と細胞接着因子の反応体を加える工程を含み、前記スペーサー単位は一般式A−L−Bにより表され、
前記式中、前記連結基とA基は相互に反応して第1のカップリングを形成するように選択され、前記細胞接着因子とB基は相互に反応して第2のカップリングを形成するように選択され、
前記第1のカップリング及び前記第2のカップリングは独立してアルキン−アジドカップリング、ジベンゾシクロオクチン−アジドカップリング、オキサノルボルナジエン系アジドカップリング、ビニルスルホン−チオールカップリング、マレイミド−チオールカップリング、メタクリル酸メチル−チオールカップリング、エーテルカップリング、チオエーテルカップリング、ビオチン−ストレプトアビジンカップリング、アミン−カルボン酸カップリングによるアミド結合、アルコール−カルボン酸カップリングによるエステル結合、及びNHSエステル(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)−アミンカップリングから構成される群から選択され、
L基は主鎖におけるC、N、O及びSから選択される原子間の結合数が10〜60である直鎖セグメントである前記方法。 - L基が、
- 前記第1のカップリングがアルキン−アジドカップリングである請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第2のカップリングがNHSエステル(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)−アミンカップリング又はマレイミド−アミンカップリングである請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- A基が式(VII):
式(VII)
nは0〜8であり;
R3は[(L)p−Q]、水素、ハロゲン、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており、前記アルキル基、(ヘテロ)アリール基、アルキル(ヘテロ)アリール基及び(ヘテロ)アリールアルキル基は独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基、C3−C12シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される1以上の置換基で独立して場合により置換されており、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており、前記シリル基は式(R4)3Si−により表され、前記式中、R4は独立してC1−C12アルキル基、C2−C12アルケニル基、C2−C12アルキニル基、C3−C12シクロアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C2−C12アルケニルオキシ基、C2−C12アルキニルオキシ基及びC3−C12シクロアルキルオキシ基から構成される群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりO、N及びSから構成される群から選択される1以上のヘテロ原子が介在しており;
R1は独立して水素、C1−C24アルキル基、C6−C24(ヘテロ)アリール基、C7−C24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC7−C24(ヘテロ)アリールアルキル基から構成される群から選択され;
R2は独立してハロゲン、−OR6、−NO2、−CN、−S(O)2R6、C1−C12アルキル基、C1−C12アリール基、C1−C12アルキルアリール基及びC1−C12アリールアルキル基から構成される群から選択され、ここでR6は上記の通りであり、前記アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は場合により置換されている請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記スペーサー単位が式(IX):
式(IX)
R1、R2、R3及びnは上記の通りであり、
Lは式(X):
式(X)
- 前記スペーサー単位が式(XI):
式(XI)
- 前記細胞接着因子がRGDやGRGDS等のアミノ酸配列から構成される群から選択される請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のコモノマー及び前記第2のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均が最低3から最大4までである請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の方法により獲得可能なオリゴ(アルキレングリコール)で官能基化されたコポリイソシアノペプチド。
- 請求項10に記載のコポリイソシアノペプチドを1.2〜3.0mg/mLの濃度で含有するハイドロゲルを含み、前記コポリイソシアノペプチドのゲル化温度が18〜40℃である細胞培養液。
- 前記細胞培養液が内皮細胞と平滑筋細胞の少なくとも1種を含む請求項11に記載の細胞培養液。
- a)請求項11に記載の細胞培養液を準備する工程と;
b)前記ハイドロゲルのゲル化温度よりも低温で前記細胞培養液に細胞を加える工程と;
c)前記細胞を培養する工程を含む細胞培養方法。 - 前記細胞が内皮細胞及び筋細胞である請求項13に記載の方法。
- 血管前駆細胞系の作製用としての請求項12に記載の細胞培養液の使用。
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Citations (6)
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---|---|---|---|---|
JP2007509479A (ja) * | 2003-10-20 | 2007-04-12 | カタリーナ・フィリッピーナ・ヤンセン | 電子流発生用懸濁液並びに該懸濁液の使用及び製法 |
WO2010064251A1 (en) * | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Technion Research & Development Foundation Ltd | Hydrogel sponges, methods of producing them and uses thereof |
US20100215731A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Maastricht University | Method for improving cartilage repair and/or preventing cartilage degeneration in a joint |
WO2011007012A1 (en) * | 2009-07-16 | 2011-01-20 | Stichting Katholieke Universiteit | Method for the preparation of high molecular weight oligo(alkylene glycol) functionalized polyisocyanopeptides |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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KOEPF, M. ET AL.: "Preparation and characterization of non-linear poly(ethylene glycol) analogs from oligo(ethylene gly", EUROPEAN POLYMER JOURNAL, vol. 49, JPN6018015257, 6 February 2013 (2013-02-06), pages 1510 - 1522, XP028562644, ISSN: 0003788014, DOI: 10.1016/j.eurpolymj.2013.01.009 * |
KOUWER, P. H. ET AL.: "Responsive biomimetic networks from polyisocyanopeptide hydrogels", NATURE, vol. 493, JPN6018015256, 31 January 2013 (2013-01-31), pages 651 - 655, ISSN: 0003788013 * |
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