CN105596586A - 一种红花石蒜总碱的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种操作简单，设备要求不高的红花石蒜总碱的制备方法，包括以下步骤：将红花石蒜药材粉碎后用乙醇回流提取两次，合并提取液后用纱布过滤除去沉淀，将上清液减压浓缩得到流浸膏；将流浸膏用去离子水混悬分散后用石油醚萃取脱脂4次，萃取之后的水层再使用二氯甲烷萃取4次，将最后留下的水层用纱布过滤，弃掉滤液并保留滤渣；将滤渣用乙醇混悬分散，搅拌后用滤纸过滤并弃去滤液保留滤渣，重复3次最终得到红花石蒜总碱粗品；将红花石蒜总碱粗品用去离子水混悬，煮沸溶解后用滤膜过滤并收集滤液，将所述滤液减压浓缩至小体积后放置室温下析出粉末，之后再用去离子水淋洗，抽干，减压干燥至恒重即为红花石蒜总碱。

Description

一种红花石蒜总碱的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种红花石蒜总碱的制备方法及其应用。

背景技术

生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物，是许多中草药的有效成分，是自然界中存在的一类重要物质。石蒜别名老鸦蒜、蒜头草、蜂螂花，来源为石蒜科植物石蒜Lycorisradiata(L.Her.)Herb的鳞茎，其性温、味辛甘、有毒，具有消肿，解毒，催吐的功效。研究表明，石蒜总生物碱是其主要有效部位，从石蒜的不同部位分离得到了化学成分含石蒜碱(lycorine)、加兰他敏(galanthamine)、石蒜胺碱(lycora-mine)、石蒜伦碱(Lycorenine)、多花水仙碱(Tazettine)、伪石蒜碱(Pseudolycorine)、二氢石蒜碱(dihydrolycorine)等，临床主要用于疗疮肿毒、食物中毒、痰涎奎塞、黄疽、水肿腹水等的治疗。

红花石蒜(Lycorisradiatavar.radiata)是石蒜的一个变种。现阶段，中药生物碱的提取工艺已较成熟，但这些方法步骤繁琐、有机溶剂用量大并且大设备无法实现，不能在大生产中应用。

红花石蒜总碱在治疗慢性附睾炎药物的制备中的应用也未见报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种操作简单，设备要求不高的红花石蒜总碱的制备方法。

本发明的另一目的是提供红花石蒜总碱在制备慢性附睾炎药物中的应用。

本发明的一种红花石蒜总碱的制备方法，包括以下工艺步骤：

步骤①：将红花石蒜药材粉碎成粗粉后用乙醇回流提取1-3次，合并两次提取液后用纱布过滤除去沉淀，将过滤后的上清液减压浓缩得到流浸膏；

步骤②：将步骤①中的流浸膏用去离子水混悬分散后用石油醚萃取脱脂3-5次，萃取之后的水层再使用二氯甲烷萃取3-5次，将最后留下的水层用纱布过滤，弃掉滤液并保留滤渣；

步骤③：将步骤②中的滤渣用乙醇混悬分散，搅拌后用滤纸过滤并弃去滤液保留滤渣，重复上述操作2-4次最终得到红花石蒜总碱粗品；

步骤④：将步骤③中的红花石蒜总碱粗品用去离子水混悬，煮沸溶解后用滤膜过滤并收集滤液，将所述滤液减压浓缩至小体积后放置室温下析出粉末，之后再用去离子水淋洗，抽干，减压干燥至恒重即为红花石蒜总碱。

所述步骤①和步骤③中的乙醇浓度为75％。

所述步骤①中第一次回流提取时红花石蒜药材粗粉与乙醇的投料比为1：10～1：14(w/v),第二次回流提取时红花石蒜药材粗粉与乙醇的投料比为1：8～1：12(w/v)。

所述步骤①中两次回流提取时间分别为120～240分钟。

所述步骤③中滤渣用乙醇混悬分散时每10g滤渣加75％乙醇10ml～30ml；

所述步骤④中红花石蒜总碱粗品用去离子水混悬时，每10g红花石蒜总碱粗品加水3500～4500ml。

所述步骤④中的滤膜孔径为0.45μm。

所述步骤④中滤液减压浓缩至小体积时，每10g红花石蒜总碱保留80～120ml溶液。

所述步骤④中减压干燥具体为60℃温度减压干燥24小时。

红花石蒜总碱在治疗慢性附睾炎的药物制备中的应用。

本发明相对于现有技术具有以下优点：

1、本发明的一种红花石蒜总碱的制备方法操作简单，所需仪器设备要求不高，可以用于大批量的提取红花石蒜总碱。

2、本发明的红花石蒜总碱在制备慢性附睾炎药物中的应用，为中药治疗慢性附睾炎提供了一个新的有效途径。

3、本发明为红花石蒜总碱进一步的利用和开发奠定了基础。

4、本发明为将来从红花石蒜寻求治疗附睾炎的药物先导化合物提供了研究资料和物质基础。

5、本发明采用雄兔整体动物模型做实验，证明了红花石蒜生物总碱作为药物成分对附睾炎治疗具有显著效果。

附图说明

图1为本发明的制备方法流程图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明的一种红花石蒜总碱的制备方法及其应用做进一步的详细说明。

如图1所示，本发明的一种红花石蒜总碱的制备方法，包括以下工艺步骤：

步骤①：将红花石蒜药材1kg，粉碎成20目粗粉后用75％乙醇回流提取两次，第一次12倍量，第二次10倍量，每次180分钟，合并两次提取液后用纱布过滤除去沉淀，将过滤后的上清液减压浓缩得到流浸膏；

步骤②：将步骤①中的流浸膏用200ml去离子水混悬分散后用石油醚萃取脱脂4次(每次200ml)，萃取之后的水层再使用二氯甲烷萃取4次(每次200ml)，将最后留下的水层用纱布过滤，弃掉滤液并保留滤渣；

步骤③：将步骤②中的滤渣用75％乙醇混悬分散(每10g滤渣加75％乙醇20ml)搅拌后用滤纸过滤并弃去滤液保留滤渣，重复上述操作3次最终得到红花石蒜总碱粗品；

步骤④：将步骤③中的红花石蒜总碱粗品用去离子水混悬(每10g总碱粗品加水4000ml)，煮沸溶解后用0.45μm滤膜过滤并收集滤液，将滤液减压浓缩至小体积(每10g总碱保留100ml溶液)后放置室温下析出黄色粉末，之后再用去离子水淋洗，抽干，60℃温度减压干燥24小时至恒重即为红花石蒜总碱。

红花石蒜总碱在治疗慢性附睾炎的药物制备中的应用，具体实验方案如下：

一、方法

新西兰雄性白兔40只，随机分为4组，每组10只。分别为对照组，空白组，生物碱组，西药组。对照组不予造模，另外3组用同样方法实施造模。造模方法：40只实验兔术前禁食8h以上，称重后，3％戊巴比妥钠lml/kg，耳缘静脉注射，麻醉成功后，仰卧位固定于兔鼠解剖台上，手术野常规剪毛，8％硫化钠褪毛，碘伏消毒皮肤，充分暴露雄兔两侧阴囊，取阴囊正中切口，逐层分离组织直至睾丸鞘膜脏层后，即可提出睾丸，在睾丸下极可找到附睾尾部，左手固定附睾尾部，右手持注射器，将注射器针头朝与附睾管约45°方向，斜向刺入附睾，直至针尖有落空感后，边向外抽拉针尖，边注入用注射器注入冰乙酸0.2ml，注射完毕后，按压注射部位片刻。在保证饮水条件下，普通块状饲料喂养。按照原分组情况分别放回笼中。麻醉失效后按常规饲养，观察雄兔阴囊部伤口3天。于造模后第3天后分别从每组中随机抽取2只雄兔，将8只雄兔空气栓塞处死，做好标记后快速解剖其附睾尾部，观察其附睾尾部组织的色泽、与周围组织粘连情况，取出附睾尾部组织称重后光镜下观察，并做病理切片，鉴定慢性附睾炎雄兔模型造模是否成功。本试验中6只白兔均附睾尾部组织明显增大，颜色相对较暗，与周围组织有轻度粘连，附睾腔内组织充血水肿明显，腔内分泌物增多，部分组织纤维化明显，附睾管腔狭窄甚至闭塞，出现明显的炎症反应，病理切片中可见较多炎症细胞，说明造模已成功。对照组2只雄兔附睾尾部组织呈淡红色，与周围组织无粘连，且未见明显炎症反应，病理切片中未见明显炎症细胞。

二、给药方法

将生物碱、头孢曲松粉末各100mg分别溶解于100ml蒸馏水，于造模后第5天开始，4组按以下方法剂量分别给予灌药：

(1)对照组：蒸馏水30ml/kg，连续灌胃4周；

(2)空白组：蒸馏水30ml/kg，连续灌胃4周；

(3)生物碱组：每天备生物碱溶液30ml/kg，连续灌胃4周；

(4)西药抗生素组：每天予头孢曲松粉碎调和溶液30ml/kg，连续灌胃4周；

三、标本采集与制备方法

末次给药后24h，称雄兔体重，然后将所有雄兔行空气栓塞处死，常规切开阴囊，分别取出每只大雄兔睾尾部组织，按原来分组称重后标记，并观察记录四组附睾尾部的体积、颜色、重量后，附睾尾部组织放入10％中性福尔马林液，送病理科固定48h，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，常规切片4um，HE染色，用普通光镜观察雄兔附睾尾部组织间质充血、水肿、炎细胞浸润、组织纤维化及上皮组织增生等形态学方面的病理学改变，两侧附睾头部和体部组织取下后放入1ml生理盐水中，用剪刀剪碎使精子充分逸出，取一小滴置于血细胞计数板中，在显微镜下计数。以每ml稀释液中的精子数量计数。精子活力观察：处死兔子后取下两侧附睾头、体部放入1ml精子获能液中，剪碎制成精子悬液，记录活动精子数目及运动表现能力。

四、观察指标与检测方法

(一)肉眼观察附睾尾部组织

末次给药后24h，称雄兔体重，然后将所有雄兔行耳缘静脉空气栓塞处死，常规切开阴囊，分别取出每只雄兔附睾尾部组织，肉眼下观察附睾尾部组织表面色泽，附睾尾部体积大小，体积，查看有无灰白色结节及周围组织粘连情况。

(二)附睾尾部组织湿重测定

使用日本岛津AEU-210型电子称称取各大鼠附睾尾部组织湿重并记录。

(三)附睾尾部组织病理改变观察

在光学显微镜下观察附睾尾部腔内分泌物多少、炎细胞浸润、纤维及上皮组织增生情况。

(四)精子数量、精子活率、活动度观察

两侧附睾头部和体部组织取下后放入1ml生理盐水中，用剪刀剪碎使精子充分逸出，取一小滴置于血细胞计数板中，在显微镜下计数。精子活力观察：处死兔子后取下两侧附睾头、体部放入1ml精子获能液中，剪碎制成精子悬液，在37℃下孵育20min，取一小滴置于血细胞计数板中，在显微镜下观察200个精子，记录活动精子数目及运动表现能力。

精子计数：以每ml稀释液中的精子数量计数。

精子活动率＝活动精子数/(活动精子+不活动精子)。

精子活力：精子运动活泼，呈直线运动为活动良好，运动较活泼但方向不定，不成直线运动为活动一般，精子运动迟缓，原地转动或摆动为活动不良，原地静止不动为静止。

(五)数据统计

所有实验数据应用统计软件SPSSl9.0进行处理，计量资料采用单因素方差分析，计数资料的比较采用x2检验，以均数±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义，结果如下：

表1：对照组、空白组和生物碱组、西药组雄兔造模前体重的比较

注：经方差分析，P>0.05,四组动物实验造模前体重方面无显著差异。

表2：对照组、空白组和生物碱组、西药组雄兔造模4天后体重的比较

注：经方差分析，P>0.05,四组动物实验造模4天后体重方面无显著差异。

表3：对照组、空白组和生物碱组、西药组雄兔用药4周后体重的比较

注：经方差分析，P>0.05,四组动物实验用药4周后体重方面无显著差异。

表4：对照组、空白组和生物碱组、西药组雄兔用药4周附睾尾部组织湿重的比较(g)

注：生物碱组与西药抗生素组、空白组、对照组附睾尾部组织湿重比较P<0.05。

从表1、表2、表3中可见，各组雄兔造模前后体重比较均无显著性差异(P>0.05)，不具有可比性。表4中可见，生物碱组动物附睾尾部组织湿重比空白组、西药抗生素组要轻，有显著性差异，但较对照组重。以上表明生物碱在控制附睾尾部组织湿重方面较西药抗生素有一定优势。

附睾尾部组织肉眼观察

对照组附睾尾部组织表明光滑淡红，质地稍韧，未见灰白色结节及周围组织粘连。其余3组附睾尾部组织均可见颜色变暗，单纯不治疗模型对照组颜色改变最为明显，其次为西药抗生素组；造模组附睾尾部组织局部均有不同程度的灰白色结节，腺体与周围组织有不同程度粘连，附睾尾部组织体积均有不同程度增大。

附睾尾部组织病理改变观察

光镜下观察可见，对照组中雄兔附睾尾部组织由不同高度的主细胞和其下方的基细胞组成，还有移动的淋巴细胞。无炎性细胞浸润，无纤维及上皮组织增生；生物碱组中可见少量淋巴细胞和浆细胞浸润，轻度纤维及上皮组织增生。空白组中可见雄兔附睾尾部组织内大量纤维及上皮组织增生，疤痕形成，附睾小管闭塞，组织坏死较多，大量淋巴细胞和浆细胞浸润。西药抗生素组中可见附睾尾部组织内疤痕形成，附睾小管闭塞，大量淋巴细胞和浆细胞浸润。各组雄兔附睾尾部组织病理对比如表5所列。

表5各组雄兔附睾尾部组织病理对比

注:附睾尾部组织病理学观察标准为：

淋巴细胞、浆细胞浸润：无(-)，轻度(-)(+)，较明显(+)，显著(++)或者(+++)；

纤维、上皮组织增生：无(-)，少许(-)(+)，少量(+)，大量(++)或者(+++)。精子数量、精子活率、活动度观察

注：造模各组之间比较精子数量、精子活率、精子活动度比较均P>0.05，造模各组精子数量与正常组比较*P>0.05，精子活率与正常组比较*P<0.05，造模各组精子活动度与正常组比较*P<0.05。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：

步骤①：将红花石蒜药材粉碎成粗粉后用乙醇回流提取1-3次，合并提取液后用纱布过滤除去沉淀，将过滤后的上清液减压浓缩得到流浸膏；

步骤②：将所述步骤①中的流浸膏用去离子水混悬分散后用石油醚萃取脱脂3-5次，萃取之后的水层再使用二氯甲烷萃取3-5次，将最后留下的水层用纱布过滤，弃掉滤液并保留滤渣；

步骤③：将所述步骤②中的滤渣用乙醇混悬分散，搅拌后用滤纸过滤并弃去滤液保留滤渣，重复上述操作2-4次最终得到红花石蒜总碱粗品；

步骤④：将所述步骤③中的红花石蒜总碱粗品用去离子水混悬，煮沸溶解后用滤膜过滤并收集滤液，将所述滤液减压浓缩至小体积后放置室温下析出粉末，之后再用去离子水淋洗，抽干，减压干燥至恒重即为红花石蒜总碱。

2.如权利要求1所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤①和步骤③中的乙醇浓度为75％。

3.如权利要求2所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤①中第一次回流提取时红花石蒜药材粗粉与乙醇的投料比为1：10～1：14(w/v)，第二次回流提取时红花石蒜药材粗粉与乙醇的投料比为1：8～1：12(w/v)。

4.如权利要求3所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤①中两次回流提取时间分别为120～240分钟。

5.如权利要求4所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤③中滤渣用乙醇混悬分散时每10g滤渣加75％乙醇10ml～30ml。

6.如权利要求5所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤④中红花石蒜总碱粗品用去离子水混悬时，每10g红花石蒜总碱粗品加水3500～4500ml。

7.如权利要求6所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤④中的滤膜孔径为0.45μm。

8.如权利要求7所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤④中滤液减压浓缩至小体积时，每10g红花石蒜总碱保留80～120ml溶液。

9.如权利要求8所述的一种红花石蒜总碱的制备方法，其特征在于，所述步骤④中减压干燥具体为60℃温度减压干燥24小时。

10.红花石蒜总碱在治疗慢性附睾炎的药物制备中的应用。