CN102188621B - 玫瑰石斛总生物碱制备治疗急慢性炎症、急慢性关节炎或类风湿性关节炎疾病药物的应用 - Google Patents
玫瑰石斛总生物碱制备治疗急慢性炎症、急慢性关节炎或类风湿性关节炎疾病药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种玫瑰石斛总生物碱在制备治疗急慢性炎症、急慢性关节炎或类风湿性关节炎的药物中的应用,玫瑰石斛总生物碱含量在80-91%;发明人通过大量实验证明该玫瑰石斛总生物碱对于炎症治疗有很好效果。本发明的玫瑰石斛总生物碱具有较好的稳定性和良好的抗炎活性,可以用于制备治疗相应疾病的药物。本发明活性明确、实验材料来自原植物,成本低。
Description
技术领域
本发明涉及涉及玫瑰石斛提取物,特别涉及玫瑰石斛总生物碱制备治疗急慢性炎症、急慢性关节炎或类风湿性关节炎疾病药物的应用。
背景技术
仅见在上个世纪50年代国外学者曾对玫瑰石斛的化学成分进行了少量的研究报道,从中分离鉴定了5个生物碱类成分(见下图Magnus Elander et al,Studies on Orichidaceae Alkaloids,Acta Chenical Scandinavica 27(1973):1907-1913),未见任何有关药材及其单体物质的活性报道。
发明内容
本发明的目的在于:一种具有作为治疗急慢性炎症、急慢性关节炎或类风湿性关节炎的药物用途的中药材玫瑰石斛总生物。
本发明涉及本发明的玫瑰石斛总生物碱由中药材玫瑰石斛经醇水提取、离子交换树脂柱富集或有机溶剂萃取而成,其玫瑰石斛总生物碱含量在80-91%,以石斛碱作为标准品进行测定。本发明得到的玫瑰石斛总生物碱可以用于治疗急慢性炎症、急慢性关节炎或类风湿性关节炎等用途。
有益效果.
1、本发明玫瑰石斛是常用中药材石斛的药用植物来源之一,文献报道石斛常用于滋阴清热、生津益胃,没有任何文献报道玫瑰石斛可用于炎症治疗。发明人通过大量实验证明该玫瑰石斛总生物碱对于炎症治疗有很好效果。本发明的玫瑰石斛总生物碱具有较好的稳定性和良好的抗炎活性,可以用于制备治疗相应疾病的药物。
2、本发明活性明确、实验材料来自原植物,成本低。
附图说明
图1玫瑰石斛总生物碱对小鼠肝组织的影响;A为空白组小鼠的肝细胞,B为全数致死量组小鼠的肝细胞;动物在给药1d内死亡。给药后出现呼吸困难、全身抽搐、竖尾的异常表现,死亡动物剖检未见明显的异常表现,组织病理切片显示死亡动物的心、脾、肺及肾没有形态学差异,而肝脏有形态学差异,表现为肝细胞呈现中度至重度水肿,提示药物可引起肝脏轻度损伤。玫瑰石斛总生物碱的LD50=0.98g/kg-1,95%的平均可信限为0.98±0.2g/kg-1。
图2玫瑰石斛总碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(x±s,n=10),其中A:空白组;B、C、D:玫瑰石斛总碱200、400、600mg·kg-1组;E:吲哚美辛20mg·kg-1组;
图3-1玫瑰石斛总碱对角叉菜胶致小鼠气囊肿中PGE2的影响(x±s,n=10);其中A:空白组;B:吲哚美辛10mg·kg-1组;C、D、E:玫瑰石斛总碱200、400、600mg·kg-1组;F:模型组。与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;
图3-2玫瑰石斛总碱对角叉菜胶致小鼠气囊肿中白细胞渗出数目的影响(x±s,n=10);其中A:空白组;B:吲哚美辛10mg·kg-1组;C、D、E:玫瑰石斛总碱200、400、600mg·kg-1组;F:模型组。与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;
图4玫瑰石斛总碱对棉球致小鼠肉芽肿的影响(x±s,n=10);A:空白组;B:吲哚美辛20mg·kg-1组;C-E:玫瑰石斛总碱200、400、600mg·kg-1组,与空白组比较**P<0.01,*P<0.05。
具体实施方式
一、一种制备玫瑰石斛总生物碱的方法
实施例1
粉碎干燥的玫瑰石斛药材,用10倍量乙醇-水混合溶剂(90∶10)提取3次,提取时间分别为3、3、2h,过滤,滤液浓缩至干,用5%盐酸-水溶液浸渍,调pH至弱酸性(pH=4~5),水溶液过强酸苯乙烯型阳离子交换树脂柱(型号:001×7),用3倍量60%乙醇水混合溶剂除去杂质,然后用2倍量的氨水-乙醇溶剂(1∶8)洗脱,用盐酸调洗脱液pH值至中性,浓缩得玫瑰石斛总生物碱。采用酸性染料比色法测定玫瑰石斛总生物碱的含量。测定方法如下,所的总生物碱含量为80%。
测定方法
标准溶液制备称取干燥至恒重石斛碱(crepidine)对照品2.04mg,氯仿溶解并定容至100mL,作为标准溶液。
标准曲线制备吸取石斛碱标准溶液3.0、4.5、6.0、7.5、9.0mL分别置于分液漏斗中,加氯仿至10.0mL,再加入pH值4.5的缓冲溶液5.0mL和0.04%的溴甲酚绿溶液1.0mL后剧烈振摇3min,静置30min,用氯仿浸泡处理并干燥的脱脂棉过滤,取续滤液6.0mL,加0.01mol/L的NaOH无水乙醇溶液1.0mL,摇匀。依同法以氯仿制备空白对照。于波长620nm处测定吸光度,绘制标准曲线。
样品溶液制备称取供试品1mg,加氯仿溶解于10mL容量瓶中并定容至刻度,再从中吸取2.5mL置25mL容量瓶中以氯仿定容,摇匀作为样品液。
样品中总生物碱含量测定,吸取样品液10mL,按标准曲线制备步骤操作,测定吸收度。
实施例2
方法b.粉碎的玫瑰石斛药材,用10倍量95%乙醇回流提取3次,每次提取时间分别为3、3、2h,然后用10倍量75%乙醇回流提取1次,2h,减压回收溶剂得浓缩液,用等体积石油醚(60-90℃)萃取1次,弃去有机层,加0.3倍量的5%盐酸,搅拌并过滤,收集滤液,滤液用氨水调pH值至9~10(可见沉淀析出),用等体积氯仿提取3次,氯仿萃取液浓缩成红棕色浸膏,得玫瑰石斛总生物碱,按照实施例1方法测定总生物碱含量,本方法制备得到总碱含量为86%。
实施例3
方法c.粉碎的玫瑰石斛药材,用8倍量的85%乙醇浸泡24h,渗漉,渗漉液合并,减压回收乙醇浓缩,得浓水提取液,用等体积石油醚萃取1次,在萃取后水液中加入5%盐酸至pH为2-3,过滤,于滤液内加入饱和碳酸钠溶液至pH 9-10,等体积氯仿提取2次,提取液用水洗过,减压蒸干,得玫瑰石斛总生物碱。按照实施例1方法测定总生物碱含量,本方法制备得到总碱含量为83%。
实施例4
方法d.粉碎的玫瑰石斛药材,用3倍量稀酸水溶液(pH=5~6)浸渍24h,过滤,滤液用氨水调pH至中性,浓缩,浓缩液调PH至碱性(pH=10~11),用等体积的乙酸乙酯有机性溶剂萃取3次,合并,有机相浓缩至干,用5倍量乙醇溶解,过滤,滤液浓缩至干得玫瑰石斛总生物碱,按照实施例1方法测定总生物碱含量,本方法制备得到总碱含量为85%。
实施例5
方法e.粉碎干燥的玫瑰石斛药材,用10倍量95%乙醇浸泡过夜提取二次,每次3h,再用75%乙醇提取1h,合并醇提液。用5%盐酸溶解,过滤,滤液用氨水调pH至9-10,用等量氯仿萃取。合并萃取液,减压回收溶剂得玫瑰石斛总生物碱,按照实施例1方法测定总生物碱含量,本方法制备得到总碱含量为91%。
二、玫瑰石斛总生物碱的对急慢性炎症或类风湿性关节炎等病症作用
下述实施例6-11中所述的玫瑰石斛总生物碱为实施例2所得玫瑰石斛总生物碱。
实施例6
玫瑰石斛总生物碱对小鼠的急性毒性实验:取清洁级小鼠50只,雌雄各半,体重20~22g,以全数致死量(Dm)和全不致死量(Dn)的浓度作为实验的最高和最低浓度组,高低剂量比值(1∶K)为0.76,随机分为5个剂量组,给药量分别为1.800,1.368,1.039,0.790,0.601g/kg。实验前24h前禁食不禁水,分别按组给以不同浓度的玫瑰石斛总碱溶液,给药后连续观察7d,并详细记录其死亡数目、死亡时间及活动情况。
动物在给药1d内死亡。给药后出现呼吸困难、全身抽搐、竖尾的异常表现,死亡动物剖检未见明显的异常表现,组织病理切片显示死亡动物的心、脾、肺及肾没有形态学差异,而肝脏有形态学差异,表现为肝细胞呈现中度至重度水肿,提示药物可引起肝脏轻度损伤,结果见图1。玫瑰石斛总生物碱的LD50=0.98g/kg-1,95%的平均可信限为(0.98±0.2)g/kg-1。
实施例7
玫瑰石斛总生物碱对二甲苯致小鼠耳肿胀模型的作用:清洁级小鼠50只,体重18~22g,随机分为玫瑰石斛总碱高、中、低3个剂量组(600,400,200mg·kg-1)、阳性对照吲哚美辛组(20mg·kg-1)和空白对照组,分别灌胃给药连续3d,1次/d。各组末次给药后1h,乙醚麻醉,每只小鼠右耳正背面以微量移液器滴涂致炎剂-100%二甲苯20μl/只,左耳不作处理。1h后将小鼠断颈处死,沿耳廓基线剪下双耳,用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片,称重。每鼠的右耳片减去左耳片的重量即为肿胀程度。计算各组肿胀度之均值、标准差。玫瑰石斛总碱的高、中、低剂量均可抑制二甲苯诱导的小鼠耳郭肿胀。结果见表1,图2。
表1 玫瑰石斛总生物碱对二甲苯致小鼠耳郭肿胀的影响(X±S)
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
实施例8
玫瑰石斛总生物碱对小鼠角叉菜胶致气囊肿的作用:清洁级小鼠70只,体重18~22g,随机分为玫瑰石斛总碱高、中、低3个剂量组(600,400,200mg·kg-1),阳性对照吲哚美辛组(10mg·kg-1),模型对照组及空白对照组。各鼠背部皮下注射空气5ml(事先滤过无菌),分别于3d及6d再次注入空气3ml,维持气囊膨胀。首次注入空气当天,分别灌胃给药,连续6天,1次/d。第6日给药2h后,每鼠气囊内注入1%角叉菜胶1ml,空白对照组注入生理盐水1ml,6h后处死,气囊内注入冰生理盐水(含肝素50U/ml)2.5ml,轻轻按压,吸出渗出液约2ml,2500r·min-1离心15min(4℃)。取上清液0.3ml于一试管中,加入0.5mol·L-1的KOH甲醇溶液1.0ml,50℃水浴20min异构化,加甲醇2.5ml,紫外分光光度法,波长278nm比色,以吸光度值表示PGE2含量,沉淀以生理盐水稀释,作白细胞计数。小鼠背部注入空气,并以角叉菜胶刺激引发了以渗出性为主要表现的炎症模型,表现为炎性细胞浸润和前列腺素样炎性介质增加。经口服给予玫瑰石斛总碱,可有效抑制炎症反应,明显减少病灶中白细胞渗出数目,同时也显著降低炎性渗出液中COX代谢前列腺素样炎性介质PGE2含量。结果见表2、图3-1、3-2。
表2 对角叉菜胶致小鼠气囊肿的影响(n=10)
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
实施例9
玫瑰石斛总生物碱对小鼠棉球植入引起肉芽肿的作用清洁级小鼠50只,体重25~28g,随机分为玫瑰石斛总碱高、中、低3个剂量组(600,400,200mg·kg-1),阳性对照地塞米松组(5mg·kg-1),模型对照组及空白对照组,灌胃给药,连续7d,1次/d。称取10mg脱脂棉球,高压灭菌后,每个棉球滴1%青霉素钠双蒸水溶液20μL,50℃烘干。小鼠右下腹部去毛,给药1h后,小鼠腹腔注射乌拉坦15mg/kg,麻醉,右下腹部剪0.5cm长的小口,埋入脱脂棉球,缝合。造模后第8天颈椎脱臼处死小鼠,取出棉球,60℃1h烘干,称重。肉芽肿的重量(mg/100g)=(烘干后棉球重量-棉球本身重量)/小鼠体重×100。小鼠植入棉球,刺激局部炎性增生,导致了肉芽肿的形成,玫瑰石斛总碱能显著抑制局部炎性反应,实验结果见表3、图4。
表3 对小鼠棉球肉芽肿的影响(X±S,n=10)
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
实施例10
玫瑰石斛总生物碱对大鼠佐剂致原发性关节炎的影响清洁级大鼠60只,雌雄各半随机均分为6组:(1)正常对照组;(2)模型组;(3)-(5)玫瑰石斛总碱低、中、高剂量组;(6)雷公藤片组。用容积法测量各组大鼠右足容积,各给药组灌胃相应药的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液,正常对照组和模型组灌胃0.05%的羧甲基纤维素钠溶液,给药体积均为2ml/100g。每日1次,连续10日,除正常对照组外,给药第三天给各组大鼠右后足跖皮内注射Ferunds完全佐剂0.1ml,致炎,同时观察致炎后第2日、4日、6日和8日各组大鼠右后足踢肿胀度,并进行统计学处理,结果见表5。
模型组大鼠足容积自致炎第2天开始增大,第4天最严重,与正常组比较,第2天至第6天足容积有显著差异,各给药组也有不同的肿胀,但第6天、第8天的足容积与模型组比较,均有显著差异。在试验过程中观察到各致炎组大鼠右足肿胀程度于致炎后的第3天和第4天最严重,观察到明显的红肿,与模型组比较,各给药组的红肿相对较轻。
表5 玫瑰石斛总碱对大鼠做给致原发性关节炎的影响
与模型组相比较,*P<0.05,**P<0.01
实施例11
玫瑰石斛总生物碱对大鼠佐剂致继发性关节炎的影响:清洁级大鼠60只,雌雄各半,随机均分为6组:(1)正常对照组;(2)模型组;(3)-(5)玫瑰石斛总碱低、中、高剂量组;(6)雷公藤片组。用容积法测量各组大鼠左右足容积,除正常对照组外,给各组大鼠右后足跖皮内注射Ferunds完全佐剂0.1mli致炎。第5天同量再加强注射一次。致炎后第8天开始,各给药组灌胃相应药的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液,正常对照组和模型组灌胃0.5%的羧甲基纤维素钠溶液,给药体积均为2耐1009。每日1次,一直给到第26天。同时观察记录致炎后第12日、15日、18日、21日和24日各组大鼠左后足拓肿胀度,并进行统计学处理,结果见表6。在第一次致炎后第26天取其右后足关节上1cm以下部位,剪碎后放入盛有5ml生理盐水的具塞离心管中,过夜,离心,分取上清液,转移至5ml,离心管中,置超低温冰箱,用于测定关节组织
模型组大鼠足容积自致炎第5天起有明显的肿胀,其中第18天时最严重,各给药组也有不同的肿胀,但第21天至第24天的足容积与模型组比较,基本上都有显著差异。在试验过程中观察到各致炎组大鼠左右足踢继发性肿胀开始的时间不完全一致,少数在第12天开始肿胀,以后逐渐增多,第18天时基本上全部都见到肿胀。按照试剂盒说明操作,在放射免疫测定仪上测定佐剂性关节炎大鼠关节组织中肿瘤坏死因子的含量,结果见表。佐剂性关节炎大鼠关节组织中水平明显提高。玫瑰石斛总生物碱高、中、低剂量和雷公藤片对佐剂性关节炎大鼠关节组织中均表现出明显的降低作用,其中高、中2个剂量组的药效更突出。
表6 玫瑰石斛总生物碱对大鼠佐剂致继发性足肿胀的影响
与模型组相比较,*P<0.05,**P<0.01
表7 玫瑰石斛总生物碱对佐剂性关节炎大鼠组织中含量的影响(n=10)
注:与对照组相比,▲P<0.01;与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01
Claims (3)
1.一种玫瑰石斛总生物碱制备治疗急慢性炎症药物的应用,其中玫瑰石斛总生物碱的含量为80-91%。
2.根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛总生物碱制备治疗急慢性炎症药物的应用,其特征在于所述的急慢性炎症为急慢性关节炎。
3.根据权利要求2所述的一种玫瑰石斛总生物碱制备治疗急慢性炎症药物的应用,其特征在于所述的急慢性关节炎为类风湿性关节炎。
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