CN105594979A - 一种提高大豆分离蛋白水解产物中αα＇亚基的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高大豆分离蛋白水解产物中αα′亚基含量的方法；其包括以下工艺步骤：将大豆蛋白粉放入反应容器中，加入蒸馏水，调整至溶液状态；在大豆蛋白溶液中加入胃蛋白酶酶解；酶解完毕后，灭酶，并冷却至25～28℃，调pH值至4.5，离心，收集沉淀；将沉淀复溶，进行冷冻干燥或喷雾干燥，即为高αα′亚基含量的大豆蛋白水解产物。本发明具有成本低，产率高，制备时间短，反应全过程所用试剂和原料均无毒无害等优点，克服了传统柱层析分离纯化得到αα′亚基的方法成本高，时间长，产率低，可能存在有毒有害试剂残留的缺陷，且本发明可直接应用于食品或药品领域，具有良好的发展前景。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种提高大豆分离蛋白水解产物中αα′亚基含量的方法。
背景技术
大豆是全世界主要的油料作物和人类最经济的蛋白质来源之一，同时是世界贸易中重要战略物质。大豆蛋白作为大豆中的最主要成分，含量达到了30～50％。大豆蛋白主要由大豆球蛋白(11S)和β-大豆伴球蛋白(7S)组成。大豆球蛋白是由酸性亚基A和碱性亚基B构成，β-大豆伴球蛋白是由α′、α和β三个亚基构成的。天然大豆蛋白具有较好的乳化性、凝胶性、持水性、持油性等功能性质。对大豆蛋白进行改性处理，可以进一步改善其功能特性，从而拓宽其应用范围和提高其具体的实用价值。
酶解改性技术经常应用在蛋白质改性领域，酶解改性是利用蛋白酶的外切或内切作用，将蛋白质降解成多肽、寡肽以及分子量更小的氨基酸的过程。选择性酶解技术是从近几年才开始逐渐兴起和趋于成熟的酶解方法，这种技术的核心在于可以只选择性地水解掉一部分蛋白亚基，而留下研究者想留下的蛋白亚基。在大豆蛋白亚基制备方面，目前主要是采用变性剂脲和还原剂β-巯基乙醇先解聚大豆蛋白，在还原条件下通过DEAE琼脂糖凝胶F阴离子交换层析分离纯化大豆蛋白亚基，并对制备的亚基进行复性，从而制备出大豆蛋白亚基的方法。各项研究表明，大豆α′亚基具有显著降低胆固醇和甘油三酯血浆水平的功效；同时，α、α′亚基加热后易形成可溶性聚集体，样品中α亚基含量越高，其水溶性和乳化性越好。但是上述应用柱层析分离纯化大豆蛋白亚基的方法具有成本高、时间长、产率低等缺陷。
发明内容
选择性酶解的方法是21世纪初才开始兴起和正在发展完善的方法，该方法具有成本低、时间短、得率高、安全无污染等优点，而且产品可直接应用于食品或药品等领域，故本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种提高大豆蛋白水解产物中αα′亚基含量的方法。
为解决上述技术问题，本提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法包括以下工艺步骤：
步骤(1)溶解——将大豆分离蛋白加入到反应容器中，添加蒸馏水，调整至溶液状态，调整pH至2.0～2.5，即得大豆分离蛋白溶液；
步骤(2)酶解——对步骤(1)制得的大豆分离蛋白溶液进行酶解处理，即得大豆分离蛋白酶解液；
步骤(3)分离——步骤(2)酶解完毕后，对步骤(2)制得的大豆分离蛋白酶解液进行灭酶，将灭酶后的大豆分离蛋白酶解液冷却至25～28℃，调整该酶解液的pH值至4.5，离心，收集沉淀，即得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤(4)纯化——将步骤(3)制得大豆分离蛋白水解产物沉淀添加蒸馏水复溶，调整pH至6.5～8.0，然后进行冷冻干燥或喷雾干燥，即得。
作为优化方案，以重量份计，步骤(1)所述大豆分离蛋白与蒸馏水添加量的比例为1∶11.5～99；pH值调整试剂为2mol/L的盐酸。
作为优化方案，步骤(2)所述酶解处理的具体方法为，以重量份计，将酶活为3900units/mg的胃蛋白酶与大豆分离蛋白按照2.5∶100的比例配成溶液，在pH＝2.0～2.5、反应温度35～40℃的调节下，酶解反应35～45min。
作为优化方案，步骤(3)所述灭酶的具体方法为，将步骤(2)制得的大豆分离蛋白酶解液的pH值自调整至6.5～8.0，于90～100℃水浴中保温5～20min；步骤(3)所述离心步骤的离心力为5000～10000g，离心时间为10～20min。
作为优化方案，以重量份计，步骤(4)所述大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水添加量按照1∶9～99的比例配成溶液，pH值调整试剂为2mol/L的NaOH；步骤(4)所述冷冻干燥条件为，物料的厚度为45mm、预冻温度为-45℃、预冻时间为2h、冻干温度为-25℃、冻干时间为24h、解吸温度为35℃、解吸时间为10h；步骤(4)所述喷雾干燥条件为，气体压力为0.1MPa、进风温度为180℃、出风温度为70℃。
上述大豆分离蛋白为山东临邑禹王植物蛋白有限公司购得，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％；胃蛋白酶为美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg。
本提高大豆分离蛋白水解产物中αα'亚基的方法与现有技术相比有以下优点和有益效果：
(1)应用选择性酶解技术，获得高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物，水解产物的乳化性和乳化稳定性有明显改善，适用于肉制品或乳制品等加工领域应用；
(2)以蒸馏水为反应介质，参与反应的原料和试剂容易获得，安全无毒，可直接应用于食品或药品中；
(3)与传统柱层析方法分离纯化大豆分离蛋白α、α′亚基的方法比较，本方法的工艺简单快速、得率高，成本低，产品生产过程中被污染的可能性低。
本发明一种提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法具有成本低，产率高，制备时间短，反应全过程所用试剂和原料均无毒无害等优点，克服了传统柱层析分离纯化得到αα′亚基的方法成本高，时间长，产率低，可能存在有毒有害试剂残留的缺陷，且本发明可直接应用于食品或药品领域，具有良好的发展前景。
附图说明
下面结合附图对本发明一种提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法作进一步说明：
图1是本提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法制得的高αα′亚基含量的改性大豆蛋白水解产物和天然大豆蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
图2是本提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法制得的高αα′亚基含量的改性大豆蛋白水解产物和天然大豆蛋白的乳化活性比较图
图3是本提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法制得的高αα′亚基含量的改性大豆蛋白水解产物和天然大豆蛋白的乳化稳定性比较图。
具体实施方式
涉及本发明效果的相关检测评价方法如下所述：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离胶质量浓度为12％，浓缩胶质量浓度为5％。点样前将蛋白样品和含有β-巯基乙醇的样品处理液混合震荡3min，然后用沸水加热3～5min；上样浓度为3mg/mL，上样量为15～20μL，凝胶电泳于恒流模式下进行，在浓缩胶过程中电泳电流为15mA，分离胶过程中电泳电流为40mA。电泳完毕后，将电泳胶放入染色液中染色1h，然后放入脱色液中脱色，最后在凝胶成像系统中对电泳胶进行成像处理，得到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。如图1所示。
乳化活性：准确称取0.018g蛋白样品，加入18mL蒸馏水，6mL大豆油，在均质机线速度为20m/s条件下均质1min，分别于均质后0min和10min取底层乳液100μL加入到10mL质量分数为0.1％的十二烷基磺酸钠水溶液中，以质量分数为0.1％的十二烷基磺酸钠水溶液做空白，在500nm波长下测定吸光值。并采用以下公式计算乳化活性及乳化稳定性：
公式如下：
EAI：乳化活性(m2/g)；c：样品溶液中蛋白质浓度(g/mL)；EAImin：乳浊液放置10min后的EAI值；①：油相所占的分数，本实验为1/4；EAImax：乳浊液形成后最大的EAI，本实验中指0min时的EAI值；L：比色皿的光径(10-2m)；ES：乳化稳定性。如图2、3所示。
实施例1：
步骤1)：称取大豆分离蛋白(山东临邑禹王植物蛋白有限公司，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％)溶解于蒸馏水中，配制质量浓度为8％的大豆分离蛋白溶液，用2mol/L的盐酸将溶液的pH值调至2.5；
步骤2)：胃蛋白酶(美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg)与大豆分离蛋白按质量比为2.5∶100进行酶解反应，酶解反应温度为35℃，酶解反应时间为35min；
步骤3)：酶解反应完毕后，立即用2mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH值至7.0，在95℃水浴中加热10min，然后将溶液冷却至25～28℃，调节溶液pH值至4.5，接着将溶液放在4℃条件下静置2h，然后放入离心机中离心分离，离心力为7000g，离心时间为10min，得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤4)：将离心后的大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水按照质量比为1∶12配成溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至6.5，然后放入冷冻干燥机(德国Christ公司，ALPHA1-2LDplus型)中冷冻干燥(物料的厚度为45mm，预冻温度为-45℃，预冻时间为2h；冻干制品温度为-25℃，冻干时间为24h；解吸温度为35℃，解吸时间为10h)，得到高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物粉末，产品得率为85％。
实施例2：
步骤1)：称取大豆分离蛋白(山东临邑禹王植物蛋白有限公司，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％)溶解于蒸馏水中，配制质量浓度为5％的大豆分离蛋白溶液，用2mol/L的盐酸将溶液的pH值调至2.0；
步骤2)：胃蛋白酶(美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg)与大豆分离蛋白按质量比为2.5∶100进行酶解反应，酶解反应温度为35℃，酶解反应时间为40min；
步骤3)：酶解反应完毕后，立即用2mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH值至8.0，在100℃水浴中加热15min，然后将溶液冷却至25～28℃，调节溶液pH值至4.5，接着将溶液放在4℃条件下静置2h，然后放入离心机中离心分离，离心力为5500g，离心时间为10min，得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤4)：将离心后的大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水按照质量比为1∶99配成溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至7.0，然后放入喷雾干燥机(北京北化研石化设计院，QP-3kg型)中喷雾干燥(气体压力为0.1MPa，进风温度为180℃，出风温度为70℃)，得到高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物粉末，产品得率为88％。
实施例3
步骤1)：称取大豆分离蛋白(山东临邑禹王植物蛋白有限公司，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％)溶解于蒸馏水中，配制质量浓度为8％的大豆分离蛋白溶液，用2mol/L的盐酸将溶液的pH值调至2.5；
步骤2)：胃蛋白酶(美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg)与大豆分离蛋白按质量比为2.5∶100进行酶解反应，酶解反应温度为40℃，酶解反应时间为45min；
步骤3)：酶解反应完毕后，立即用2mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH值至7.0，在95℃水浴中加热15min，然后将溶液冷却至25～28℃，调节溶液pH值至4.5，接着将溶液放在4℃条件下静置2h，然后放入离心机中离心分离，离心力为8000g，离心时间为10min，得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤4)：将离心后的大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水按照质量比为1∶99配成溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至6.5，然后放入冷冻干燥机(德国Christ公司，ALPHA1-2LDplus型)中冷冻干燥(物料的厚度为45mm，预冻温度为-45℃，预冻时间为2h；冻干制品温度为-25℃，冻干时间为24h；解吸温度为35℃，解吸时间为10h)，得到高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物粉末，产品得率为86.5％。
实施例4
步骤1)：称取大豆分离蛋白(山东临邑禹王植物蛋白有限公司，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％)溶解于蒸馏水中，配制质量浓度为2％的大豆分离蛋白溶液，用2mol/L的盐酸将溶液的pH值调至2.2；
步骤2)：胃蛋白酶(美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg)与大豆分离蛋白按质量比为2.5∶100进行酶解反应，酶解反应温度为35℃，酶解反应时间为45min；
步骤3)：酶解反应完毕后，立即用2mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH值至6.5，在100℃水浴中加热10min，然后将溶液冷却至25～28℃，调节溶液pH值至4.5，接着将溶液放在4℃条件下静置2h，然后放入离心机中离心分离，离心力为10000g，离心时间为10min，得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤4)：将离心后的大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水按照质量比为1∶95配成溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至7.5，然后放入喷雾干燥机(北京北化研石化设计院，QP-3kg型)中喷雾干燥(气体压力为0.1MPa，进风温度为180℃，出风温度为70℃)，得到高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物粉末，产品得率为84％。
实施例5
步骤1)：称取大豆分离蛋白(山东临邑禹王植物蛋白有限公司，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％)溶解于蒸馏水中，配制质量浓度为2％的大豆分离蛋白溶液，用2mol/L的盐酸将溶液的pH值调至2.4；
步骤2)：胃蛋白酶(美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg)与大豆分离蛋白按质量比为2.5∶100进行酶解反应，酶解反应温度为35℃，酶解反应时间为45min；
步骤3)：酶解反应完毕后，立即用2mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH值至7.5，在95℃水浴中加热10min，然后将溶液冷却至25～28℃，调节溶液pH值至4.5，接着将溶液放在4℃条件下静置2h，然后放入离心机中离心分离，离心力为6000g，离心时间为10min，得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤4)：将离心后的大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水按照质量比为1∶20配成溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至7.0，然后放入冷冻干燥机(德国Christ公司，ALPHA1-2LDplus型)中冷冻干燥(物料的厚度为45mm，预冻温度为-45℃，预冻时间为2h；冻干制品温度为-25℃，冻干时间为24h；解吸温度为35℃，解吸时间为10h)，得到高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物粉末，产品得率为83.7％。
实施例6
步骤1)：称取大豆分离蛋白(山东临邑禹王植物蛋白有限公司，蛋白质含量为89.8％，氮溶解指数为66.1％)溶解于蒸馏水中，配制质量浓度为7％的大豆分离蛋白溶液，用2mol/L的盐酸将溶液的pH值调至2.2；
步骤2)：胃蛋白酶(美国SIGMA公司，酶活为3900units/mg)与大豆分离蛋白按质量比为2.5∶100进行酶解反应，酶解反应温度为35℃，酶解反应时间为40min；
步骤3)：酶解反应完毕后，立即用2mol/L的NaOH溶液调节酶解液的pH值至7.0，在100℃水浴中加热10min，然后将溶液冷却至25～28℃，调节溶液pH值至4.5，接着将溶液放在4℃条件下静置2h，然后放入离心机中离心分离，离心力为7000g，离心时间为15min，得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤4)：将离心后的大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水按照质量比为1∶99配成溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至7.5，然后放入喷雾干燥机(北京北化研石化设计院，QP-3kg型)中喷雾干燥(气体压力为0.1MPa，进风温度为180℃，出风温度为70℃)，得到高αα′亚基含量的大豆分离蛋白水解产物粉末，产品得率为89.5％。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法，其特征是：该方法包括以下工艺步骤：
步骤(1)溶解——将大豆分离蛋白加入到反应容器中，添加蒸馏水，调整至溶液状态，调整pH至2.0～2.5，即得大豆分离蛋白溶液；
步骤(2)酶解——对步骤(1)制得的大豆分离蛋白溶液进行酶解处理，即得大豆分离蛋白酶解液；
步骤(3)分离——步骤(2)酶解完毕后，对步骤(2)制得的大豆分离蛋白酶解液进行灭酶，将灭酶后的大豆分离蛋白酶解液冷却至25～28℃，调整该酶解液的pH值至4.5，离心，收集沉淀，即得大豆分离蛋白水解产物沉淀；
步骤(4)纯化——将步骤(3)制得大豆分离蛋白水解产物沉淀添加蒸馏水复溶，调整pH至6.5～8.0，然后进行冷冻干燥或喷雾干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法，其特征是：以重量份计，步骤(1)所述大豆分离蛋白与蒸馏水添加量的比例为1∶11.5～99；pH值调整试剂为2mol/L的盐酸。
3.根据权利要求1所述的提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法，其特征是：步骤(2)所述酶解处理的具体方法为，以重量份计，将酶活为3900units/mg的胃蛋白酶与大豆分离蛋白按照2.5∶100的比例配成溶液，在pH＝2.0～2.5、反应温度35～40℃的调节下，酶解反应35～45min。
4.根据权利要求3所述的提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法，其特征是：步骤(3)所述灭酶的具体方法为，将步骤(2)制得的大豆分离蛋白酶解液的pH值自调整至6.5～8.0，于90～100℃水浴中保温5～20min；步骤(3)所述离心步骤的离心力为5000～10000g，离心时间为10～20min。
5.根据权利要求1所述的提高大豆分离蛋白水解产物中αα’亚基的方法，其特征是：以重量份计，步骤(4)所述大豆分离蛋白水解产物沉淀与蒸馏水添加量按照1∶9～99的比例配成溶液，pH值调整试剂为2mol/L的NaOH；步骤(4)所述冷冻干燥条件为，物料的厚度为45mm、预冻温度为-45℃、预冻时间为2h、冻干温度为-25℃、冻干时间为24h、解吸温度为35℃、解吸时间为10h；步骤(4)所述喷雾干燥条件为，气体压力为0.1MPa、进风温度为180℃、出风温度为70℃。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107212149A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-09-29 | 江南大学 | 一种提高大豆蛋白酶法改性中水解得率的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003259810A (ja) * | 2002-03-06 | 2003-09-16 | Society For Techno-Innovation Of Agriculture Forestry & Fisheries | 分画大豆蛋白の製造方法 |
| CN102150742A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-08-17 | 华南理工大学 | 一种大豆蛋白的改性方法 |
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2016
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2003259810A (ja) * | 2002-03-06 | 2003-09-16 | Society For Techno-Innovation Of Agriculture Forestry & Fisheries | 分画大豆蛋白の製造方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107212149A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-09-29 | 江南大学 | 一种提高大豆蛋白酶法改性中水解得率的方法 |
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